Summary
このプロトコルでは、カスタマイズされた 3 D プリントのプラスチック金型を使用して可変サイズの自己生成組織リングを製造するためのプラットフォームについて説明します。3 D プリントされた鋳型の硬化 PDMS ネガアガロースは硬化の PDMS ネガのキャストになります。セルがどこ彼らは組織リングに集計結果の agarose 井戸にシードされます。
Abstract
設計組織は、組織の修復と交換、臨床的に使用されているし、薬剤のスクリーニングおよびひと疾患モデリングのためのツールとして開発されています。自己生成組織拡張行列蒸着、強度、機能などの足場に基づく組織工学上の利点を提供しています。ただし、セルをオンまたはサポート足場内をシードせず三次元組織を製造するためのほとんどの使用可能なメソッドがありません。以前は、非接着剤 agarose の井戸に細胞を播くことによって自己生成組織リングを製造するためのシステムを開発しました。ポリジメチルシロキサン (PDMS) 否定的な最初加工ポリカーボネート金型で鋳造されていた、アガロースはリング状の細胞播種井戸を作成する負 PDMS でゲル化し。ただし、このアプローチの多様性は、ポリカーボネート製金型の加工に使用できるツールの解像度によって限られました。ここでは、PDMS のネガを作製する加工のポリカーボネートの代替として 3 D プリントされたプラスチックが使えると紹介します。3 D プリントされた金型や改訂された金型設計は使いやすく、安価で生産するよく播いたセルあたり、大幅に少ないアガロースと PDMS を必要とし、。我々 は、さまざまな異なる種類の細胞からカスタマイズされた直径の自己生成組織のリングを作成する結果として得られるアガロース井戸を使えることを実証しました。リングは、機械的、機能的で、組織学的解析のためまたはより大きくより複雑な管状組織を製造するために、使用できます。
Introduction
携帯電話自己組織血管を製造へのアプローチ、足場ベースのアプローチに代わるです。自己組織化、スキャフォールド フリー組織があります大きい細胞密度・強化されたマトリックス析出と強度・足場ベースの組織1,2,3,4 に比べて生物学的機能の改善.ただし、特定のサイズと形状の外因性足場サポートを使用せず 3 D ティッシュを形作る課題のまま。このプロセスは時間のかかり、労働集約的な5をすることができますが、いくつかの方法は、厚い構造を形成する細胞シートの層を融合します。セルすることができます非接着剤型にシードし、許可する代わりに、回転楕円体、リング、および他の組織の形の6,7,の8に集計します。
自己生成組織リング必要より少ない細胞、培養時間の短縮と以下の試薬がより大きな鋼管設計組織しますが、まだ機械的にテスト、病理検査使用したりできる収縮性およびその他の機能テスト7,9,10,11. ティッシュ リング文化パラメーターの数が多いをスクリーニングに最適です、病モデル11として使用するための潜在性または薬剤のスクリーニングの12のツールがあるので急速に作製し、簡単にテストできます。さらに、血管や気管7,13など複雑な組織構造に融合されるリングとリングが回転楕円体14,15など他の図形よりも完全にヒューズがあります。
アガロースは、生体適合性、透水性、非細胞接着性などの自己組織を製造するための金型材として広く使用されます。たとえば、Norotteらは agarose 金型から押出棒、金型の形状や必要な専門機器15限られた制御が有効になってを作製しました。Tanらは、さまざまな図形 (ピラミッド、広場)16のカスタム ハイドロゲル金型を作製する単位の構築としてアルギン酸液滴を堆積させた。しかし、アルギン酸の回転楕円体 (300 μ m) の大口径は、低解像度の機能につながった。このような低解像度凹凸金型の表面セル集約の一貫性に悪影響を及ぼす可能性があります。また、アガロースは、滑らかな機能と特定の寸法6,7,17非接着剤金型を作成する高分子ネガにキャストできます。
以前、我々 は粉砕されたポリカーボネート型7,18PDMS 負キャストからカスタム環状 agarose 細胞播種井戸を製造するシステムを報告しました。アガロースは、PDMS 負に注ぎ、7、18を設定するを許可します。セルに播種したアガロース井戸、彼らの自己のフォームに集計、24 h7,18未満で足場無料ティッシュ リング。PDMS ネガ オートクレーブ、何度も再利用できる、ソフトで柔軟な凝固 agarose 井戸を削除する簡単です。このシステムが Gwytherらで最初に報告されたとき7PDMS のネガから投げ込まれたポリカーボネート型 (図 1 a) を粉砕します。Agarose 鋳造後、細胞播種井戸が個別にカットし、12 ウェル プレート7,18の井戸に入れる.デザインは、単一の agarose 金型 5 リングを生成する適応力 6 ウェル プレート、個々 の井戸をカットする必要がある、PDMS の agarose (図 1 b) 各リングを生成するために必要な量を減らすのも、最近では変更されました。シード トラフ幅より小さいセルは、リングの形成を達成するために必要なシードのセルの数を減らすために使用されました。これらの変更にもかかわらず解像度と型のカスタマイズが使用可能な標準エンドミル寸法に制限されていました、マイクロミは法外に高価にすることができます。さらに、時間がかかるすることができますコンピューター数値制御 (CNC) 加工との時間を予約する必要があるのため面倒な重く利用装置のカスタマイズ、追加計算機援用製造 (CAM)、コンピューター援用設計 (を変換するソフトウェアプログラム可能なツールパスと加工中にポリカーボネート部分の信頼性の高い治具を CAD) ファイル。
本研究では CNC 加工の代替として 3 D プリントの使用を検討しました。足場材料を製造、エンジニア リングのカスタム インプラントと細胞や組織スフェロイド15,19,20の直接印刷、3 D 印刷は使用されています。我々 は高解像度 3 D プリンターを使用し、特殊な 3 D 滑らかなモールドを印刷する私たちを有効に材料を印刷、光沢のある表面仕上げ (材料の表を参照してください)。私たちの技術は、PDMS ネガやアガロース井戸を鋳造に使用することができます高度なカスタマイズ、高解像度のプラスチック金型の製造のためことができます。設計イテレーションを図 1にまとめます。金型設計は金型の 3 D プリントから両方 PDMS ネガと PDMS のネガからアガロース井戸の除去を容易にするためテーパーの外側の壁と中央の穴を含むように金型の 3 D プリント バージョンでさらに変更されました。これらのテーパ機能は、標準加工では実現できません。井戸の底から型の底までの距離は、アガロースよく削除中に速報記事のリスクを軽減する記事の下基本厚い agarose の結果、この繰り返しで増加しました。図 2に模式的リングと金型作製手順を示します。
Protocol
1. 3 D プリントされた金型の準備
- 目的の寸法の金型の CAD 図面を準備します。
- CAD ファイルを高解像度 3 D プリンターに送信します。適切なプラスチック印刷の素材は、光沢のある仕上げを選択します。
- 印刷した後に、洗剤と水でカビを徹底的に洗います。
2. 鋳造 PDMS ネガ
- バランスの基本 PDMS の希望の金額を測定します。直径と 2 mm でも投稿 60 mm 型のため、25 g を使用します。
- 1:10 (w/w) に硬化剤を追加を PDMS ベース比。
- 2 つのコンポーネントを組み合わせて徹底的にまで積極的にかき混ぜます。不十分な混合不完全硬化 PDMS、「粘着性」サーフェスが得可能性があります。
- 印刷された井上 PDMS ベース層の形成が可能に、3 D プリントされた金型の境界線の所テープの部分を配置します。
- 金型に PDMS の混合物を注ぎ、解き放つガスすべての泡が解放されるまでに真空チャンバー内に金型を置きます。
- 削除する 50 ° c 2-4 h、または十分に固化するまで PDMS を治します。
- ラボ テープを外し、慎重に PDMS 負を抽出します。
- その金型は完全に硬化を確認する (後で 3 D プリントされた金型から削除) 追加 1 h 60 ° C で PDMS を孵化させなさい。
- 任意の残基を削除する洗剤と水で徹底的に PDMS を洗います。貧しいリング PDMS 負の最初の使用のための形成の不十分な洗浄があります。
3. 加工 Agarose 井戸
- アガロース井戸に細胞を播種する前に 1 日を準備します。
- DMEM でオートクレーブ 2% (w/v) アガロース溶液を作る。
- 4 mL の溶融アガロースをピペットで移しなさいオートクレーブの PDMS 負に。その後、ピペット agarose 直接 PDMS の記事にネガします。泡はよく寸法の不均一性を引き起こす可能性がありますは、ピペット先端部に空気の泡を削除します。
- 注: は; 金型を入れすぎないではないです。agarose 井戸がレベル PDMS から除去及び 6 ウェル培養皿に配置されるように、agarose の上面がフラット、必要があります。残ったアガロース可能性があります日時オートクレーブ使用されるもう一度が 2 回以上ないです。
- Agarose 冷却後 (4 mL agarose; 約 10 分大きい金型はもはや冷却時間を必要があります)、慎重に鈍い鉗子を使用して PDMS のネガからアガロース井戸を分離・ 6 ウェル プレートのウェルに転送。
- 完全な培地の agarose 井戸が水没、使用する前に、37 ° C のインキュベーターで一晩平衡します。
4. シード ティッシュ リング
- 培養ラット胸大動脈平滑筋細胞 10% 牛胎児血清 (FBS)、1% を含む DMEM の21 (RaSMCs) 1% のペニシリン-ストレプトマイシンの 70% の合流点に到達するまで、ピルビン酸ナトリウム 1%、1% 非必須アミノ酸 L-グルタミン。
注: 5% CO2 15 cm 組織培養プレートの 37 ° C は、細胞を培養する必要があります。 - 金型を平衡後 (セクション 3)、シードの RaSMCs を準備します。
- リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) の皿あたり 5 mL で 2 回プレートをすすいでください。
- 15 cm シャーレ当たり 3 mL 0.25% トリプシンを追加します。2-3 分のため、または細胞がプレートを持ち上げたまで 37 ° C の定温器にプレートを移動します。
- 完全な培地の等しいボリューム (プレートごと 3 mL) とトリプシンを中和します。群生を分割するために徹底的に細胞を再懸濁します。
- 細胞懸濁液トリパン ブルー色素を 1:1 の因数を希釈し、診断とセルをカウントします。
- 細胞のペレットを 200 x g で 5 分間細胞懸濁液の総量を遠心します。
- ML; あたり 1000 万セルの濃度で細胞を再懸濁しますこれは、50 μ L あたり 500,000 のセルになります。
メモ: 異なる種類の細胞は、異なる細胞濃度を必要があります。 - アガロース金型からすべての媒体を吸い出しなさい。井戸の底はパンクしないのに個々 の井戸からすべてのメディアを削除する注意してください。
- ピペット 50 μ L を各ウェルに懸濁液の。
- アガロース金型の外側に新鮮な培地 2 mL を慎重に追加します。Agarose の井戸に中型のオーバーフローを聞かせしないように注意します。インキュベーターを一晩でプレート (約 16 h) に配置します。
- 一晩インキュベートした後、金型の外から中を吸引し、金型とリングが完全に水中に沈む 6 ウェル プレートの各ウェルに 4.5 mL の新鮮な媒体を追加します。毎日変更中。
Representative Results
このシステムは、シンプルなリング状の 3 D の自己細胞ことができる井戸を播種 agarose セルのカスタマイズ製作設計組織。3 D 印刷より利用可能なツールのサイズに寸法を制限するあるポリカーボネートの加工金型設計で優れた解像度と柔軟性ができます。高解像度 3 D プリンター、0.254 mm と薄い壁を印刷ことができますとトラフ寸法は (これらの研究 15.2 μ m 解像度) プリンターの解像度によってのみ制限されます。通常、0.3 未満の CNC エンドミル mm 市販されていない、それより小さい幅の谷を作成することはありません。マイクロ加工の小さな機能を作り出すことができる、機器が必須は、法外に高価なまたは多くの生物医学研究所にアクセスできない可能性があります。トラフ寸法と曲率は、エンドミル先端形状によっても制限されます。また、機能のように角度、テーパー壁では不可能なや加工プロセス中に小さな機能を破る可能性があります。
CAD 図面は、3 D プリントされた金型とカスタマイズ可能な寸法の PDMS ネガを生成する簡単に変更できます。図 3では、現在 2 mm ポスト 3 D プリントされた金型、以前の設計イテレーションと比較しての大きさについて説明します。プロセスは高価です。2 mm、5 リング 3 D プリントされた金型コスト 3 d 印刷、44.67 ドル、各部分を複数の PDMS ネガを作成する使用できます。日には、単一の 3 D プリントされた金型から 30 以上の PDMS ネガを作成しました。それぞれのマイナス g (PDMS 負 2.75 ドル) あたり 0.11 ドルで PDMS の 25 g が必要です。それぞれの PDMS のマイナスは、オートクレーブ、洗剤で洗浄し、使用の頻度に応じて、いくつかの年までに再使用できます。オリジナル デザイン18と比較して、コンパクトな 3 D プリントされた金型かなり少ない PDMS と 2 mm ティッシュ リング (図 1E) あたり agarose を使用します。
セル未満 24 時間リング寸法 agarose 井戸の寸法に依存して組織リングに集計の釣合い agarose 井戸の種をまいた。ここでは、2、4、または 12 mm 径投稿 (図 4) と井戸で自己組織化ラット平滑筋細胞リングを製作可能というデモンストレーションを行った。本研究ではリングのみ 3 日間の培養、我々 は以前まで 2 週間22、hSMC リングを培養した、立体的軟骨リングまで 3 週間13。生体組織の定量的評価のための 3 Dの in vitroモデル関数11と機械的強度13,22, とモジュラー建物単位として役立つことも既報のように、リングが機能できます。チューブ状の組織構造7,13を生成します。細胞の播種条件とこれらの細胞型から設計組織リングの機能の属性は、表 1にまとめられています。
図 1: ポリカーボネート製モールド デザインします。当初、15 も金型はポリカーボネート (A) に加工されました。以降のバージョンは、5 井戸の単一のポリカーボネート型と 6 ウェル プレートのウェル 1 個以内に収まるように設計でよりコンパクトなデザイン (B) を特集しました。ここでは、機械加工されたポリカーボネート (C) によりカスタマイズ可能な代替として 3 D プリントされたプラスチックを使用してこのデザインを変更しました。(D) に示すように、最初から作製したアガロース井戸設計18 (左) (右)、現在のコンパクトな設計と比較して大幅に少ないアガロースを必要とし、ウェルズの手動分離を必要としません。(E) PDMS の agarose のデザインするたびに必要な量が表示されます。センターの記事は、直径 2 mm です。(A) の型は、6 cm × 12 cm、(B) は直径 5 cm、(C) の直径 6 cm です。スケール バーの (D) = 3 cm.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 自己生成組織のリング作製。3 D プリントされた金型を使用して、アガロース井戸 (A) をキャストするために使用、PDMS 負をキャストします。細胞、組織リング (B) に 24 h 未満で集計、アガロース井戸に直接播種しました。(B) の破線は、よく輪郭を表示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 3 D プリントされた金型 CAD 図面の 2 次元断面ビュー 。トラフ幅 (A)、トラフ高さ (B)、センター穴 (C)、総直径 (D)、外唇 (E) と外側の壁の高さ (F) の寸法が表示されます。PDMS 否定的な除去の容易さを改善するために (2 の 1 と 3、45 ° 5 ° の角度) では、外壁 (1)、(2) の井戸とセンター穴 (3) の上の部分をテーパーです。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 対応する PDMS ネガと CAD 図面と自己組織化の SMC リング 2 (A) 4 (B)、(C) 12 mm ポスト径。(A) の方向を提供するためのノッチを示します (1)、(2) 血流を改善するために中央の穴を示します、(3) PDMS のネガに直接出版社、ファイルの数です、(4) に示す外側壁をPDMS 否定的な除去を容易にするためテーパです。アガロース井戸でバーをスケール = 1 cm.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| セルの種類 | リングあたりに播種された細胞 | リング径 | 培養期間 | 実行機能の解析 |
| ラット SMC | 0.5、1、または 3 x 106 | 2、4、または 12 mm | 3 日間 | 現在の研究;N/A |
| iPSC 由来 SMC11 | 0.6 x 106 | 2 mm | 17 日間 | 収縮試験、一軸引張試験、組織学的解析 |
| 人間 SMC22 | 0.4 x 106 | 2 mm | 2、7、14 日 | 一軸引張試験、組織学的解析 |
| 人間 MSC14 | 0.4 x 106 | 2 mm | 21 日 | 一軸引張試験、組織学的解析、リングの融合、チューブの圧縮試験、軟骨への分化 |
表 1: セル番号が異なる種類の細胞からのリング作製に必要な。
Discussion
ここで我々 は、3 D プリントを使用して簡単にカスタマイズされた寸法と多彩な自己生成組織リングの迅速作製法を提案しました。本手法は、Svoronosらの報告に似ています。6, 3 D プリントされたハニカムと犬骨状のワックス金型が PDMS ネガをキャストに使用されました。ただし、金型はいくつかのユニークなデザイン機能を含むように変更されています。ノッチ (図 4 a(1)) では、各リング ラベル付けされ個別に監視できるように金型の向きを提供します。中央の穴 (図 4 a(2))、井戸に媒体の拡散を改善に役立ちます。CAD ファイルの番号は、鋳型に直接印刷します。したがって、PDMS のネガがそれぞれバージョン番号付け、ポスト直径 (図 4A3)。よく谷 (図 3(2)45 °)、および中央の穴 (図 3(3)、5 °) の上部、外側のテーパー壁 (図 3(1), 5 °) は、3 D プリントされた金型から PDMS ネガを除去を容易に、アガロース井戸が PDMS ネガから削除しやすい (図 4 a(2) A(4))。
様々 な直径や細胞の種類、プライマリのひと平滑筋細胞 (SMCs)18,22, ラット大動脈平滑筋細胞の7を含む自己組み立てられたリング状組織をでっち上げることによってこのシステムの汎用性を示しています。,23、ヒト間葉系幹細胞 (hMSCs)13、および平滑筋細胞由来の誘導多能性幹細胞 (Ips)11 (表 1)。進行中の作業では内皮細胞など追加のセル型からリングの形成を評価し、気管内の潜在的なアプリケーションの様々 なサイズの軟骨リングを融合します。完全に細胞構造に加えて、株式会社クロスリンク ゼラチン球13,22リングを作製するはこのシステムが使用されます。微粒子は追加の機械的強度を提供するために自己組織中にリング内で組み込むことができるまたはローカライズされて成長因子13,22の配信。
ティッシュ リングを作製、細胞数の最適化が異なる種類の細胞に必要なあります。サイズと細胞のタイプに応じて最小セル番号が異なる場合があります。Ips から派生した hSMCs は 600,000 セル/リング11播かれるなど、hMSCs と主な hSMCs は 400,000 セル/リング13,22、およびラット大動脈平滑筋細胞は、500,000 のセル/リング18シードで播かれます。リング形成とリング形成24に必要なセルの最小数がトラフ寸法もあります。人間の細胞と 3 D プリントされた金型の研究、トラフ幅 2 mm 使用しています。オリジナルのポリカーボネート製金型は、750,000 hSMCs 2 mm セル リング18を形成するために必要な 3.75 mm のトラフ幅を持っていた。減少トラフ幅リング25あたり 400,000 セル、46% リングの形成に必要な細胞数を減少させることができました。リングあたりに播種された細胞の量を表 1にまとめます。
3 D プリントの材料を選択すると、多くの要因と見なされる必要があります。3 D 印刷素材が十分に高いを持っている必要がありますので PDMS、通常 60 ° C で硬化させる、PDMS 硬化時に損傷を避けるために融点。本研究で使用される材料の融点 (独自の材料材料の表を参照してください) は使用できません。ただし、1 h 60 ° C で焼いたときは、材料が匂いを作り出し始めたことを観測しました。したがって、50 ° C に温度を下げるし、3 D 印刷素材を損なうことがなく、PDMS を焼くために硬化時間を長くことにしました。硬化時間の調整は、金型のフォームより大きい PDMS ネガに変更されている場合は必要かもしれません。3 D プリントされた金型から PDMS 除去後の 60 ° C で追加養生期間は、残りの 3 D プリントされた金型にさらされる温度を抑えながら、粘着性から負最終 PDMS を防ぎます。いくつかの材料が PDMS の硬化を抑制することに注意してください、選択したマテリアルが PDMS と互換性があるようにします。最後に、金型材料の毒性も考慮する必要があります。3 D プリントされた金型はできません細胞と直接接触が、金型からいくつかの残基は、硬化処理中に負の PDMS に譲渡することが不可能です。非常に徹底的な洗濯洗剤が負の PDMS から任意の残基を削除するための十分な分かった.ただし、PDMS の負の数の使用の最初の agarose 井戸の貧しいリング形成に不十分な洗浄が主導を以前見ました。他の 3 D プリントされた材料から PDMS キャストの使用は、洗剤が任意の潜在的な浸出水を含む金型の残基を削除するための十分なことを確認する追加の調査を必要があります。定期テストは必要として、時間をかけて金型を損傷し、繰り返し使用後の残基の増加を引き起こす可能性があります加熱 (50 ° C) にもサイクルを繰り返すこともあります。日には、ティッシュ リングを正常に生成するために使用されている 30 以上の PDMS ネガを生成する単一の 3 D プリントされた金型を使いました。
全体としては、3 D 印刷では、ポリカーボネートの加工より agarose 金型作製のための大きい多様性をことができます。ツーリングと可能であるよりも高い解像度を提供し、金型設計が利用できるツールの大きさによる制限はありません。これによりより柔軟なカスタマイズ、および先を細くなどの機能の追加と加工できない場合があります。このシステムは、リング6,17に加えて他の図形だけでなく、自己組織を加工に適用可能性があります。リングの製造方法を使用して、さまざまなセルタイプおよび気管組織工学13、人工血管7、およびモデリング血管疾患11の潜在的なアプリケーションのためのサイズからティッシュ リングを開発しました。
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
感謝博士エリカ スタルツ (学術研究・科学者アプリケーション、WPI 情報技術サービス) の彼女の援助 3 d 印刷、金型設計に彼らの入力について、カレン レヴィ、クリス Nycz アマンダ Zoë Reidinger 博士修士キャシー Suqui、金型設計をテストの支援ジェニファー ・ マンとマイケル ・ オキーフ撮影して彼の支援のため。 この作品は、NSF IGERT DGE 1144804 (MWR、HAS)、NIH R15 HL097332 によって支えられた MWR (TAH)、NSF REU EEC0754996 (BA)、NIH 1R01 EB023907 (MWR、HAS) と NIH R15 HL137197 (MWR、HAS)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50040 | |
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| DMEM | Corning Cellgro | 15-017-CV | |
| VeroWhite | StrataSys | RGD835 | |
| 3D printer | StrataSys | Objet 260 Connex | |
| DMEM | Corning Cellgro | 15-017-CV | |
| FBS | Thermo Fisher | 16000069 | |
| L-glutamine | Corning Cellgro | 25-015-CI | |
| Non-essential amino acids | Corning Cellgro | 25-025-CI | |
| Sodium pyruvate | Corning Cellgro | 25-000-CI | |
| Pen-strep | Corning Cellgro | 30-002-CI | |
| Trypsin | Corning Cellgro | 25-053-CI | |
| Trypan blue | Corning Cellgro | 25-900-CI | |
| PBS | Lonza | 17-516F | |
| 6-well plate | Corning | 353046 | |
| WKY 3M-22 rat aortic smooth muscle cells | Provided by T. Wight [ref 21] | N/A |
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