Summary
האכלה נוזל חרקים יש את היכולת לרכוש כמויות הנוזלים משטחים נקבוביים דקה. פרוטוקול זה מתאר שיטה לקביעת ישירות את היכולת של חרקים לבלוע הנוזלים משטחים נקבוביים באמצעות פתרונות הזנה עם חלקיקים פלורסנט, מגנטי.
Abstract
האכלה נוזל חרקים להבלע מגוון של נוזלים, אשר נמצאים בסביבה כמו בריכות, סרטים, או נכלאים נקבוביות קטנות. מחקרים של רכישת נוזלי לדרוש הערכת היחסים מבנה ותפקוד mouthpart; עם זאת, מנגנון ספיגת נוזלים הם היסטורית להסיק מן התצפיות של אדריכלות מבנית, לפעמים ללא ליווי עם ראיות. כאן, אנו מדווחים על שיטה להערכת יכולות ספיגת הנוזלים עם פרפרים (פרפראים) וזבובים (Diptera) באמצעות כמויות קטנות של נוזלים. חרקים ניזונים מ- 20% סוכרוז פתרון מעורבב עם חלקיקים פלורסנט, מגנטי של מסנן ניירות בגדלים נקבובית ספציפיים. החיתוך (המבנה הפנימי משמש לאחסון נוזלים) להסיר את החרק, מניחים על מיקרוסקופ קונפוקלי. מגנט הוא נופף מאת החיתוך כדי לקבוע הנוכחות של חלקיקים, אשר מציינות אם החרקים מסוגלים לבלוע נוזלים. מתודולוגיה זו משמשת כדי לחשוף נרחבת האכלה מנגנון (נימיות ויצירת גשר נוזלי) שעשוי להיות משותף בין פרפראים Diptera בעת האכלה משטחים נקבוביים. בנוסף, ניתן להשתמש בשיטה זו עבור מחקרים של האכלה מנגנונים בין מגוון רחב של חרקים האכלה נוזל, כולל אלה חשוב העברת מחלות, ביומימטיקה מחקרים אחרים שעלולים המערבות תעלות או מיקרו-בגודל ננו איפה תחבורה נוזלי מחייב אימות.
Introduction
הרבה קבוצות החרקים יש mouthparts (proboscises) מותאם ניזון נוזלים, כגון צוף, נרקב פרי, sap זורם (למשל Diptera1, פרפראים2, דבוראים3), עצה (פשפשאים4), דמעות (פרפראים 5), ודם (Phthiraptera6, Siphonaptera7, Diptera7, פשפשאים8, פרפראים9). היכולת של חרקים ניזונים נוזלים רלוונטית בריאות המערכת האקולוגית (למשל האבקה10), מחלת שידור4,11,2,biodiversification12, מחקרים אבולוציה מתכנסת13. למרות המגוון הרחב של מקורות המזון, ערכת נושא בין חרקים מסויימים האכלה נוזל היא היכולת לרכוש כמויות קטנות של נוזלים, אשר יכול להיות מבודד טיפות מיקרו - או בגודל ננו, סרטים נוזלי או משטחים נקבוביים.
לאור המגוון הנרחב של חרקים האכלה נוזל (יותר מ 20% של כל מיני בעלי חיים14,15) ואת יכולתם להאכיל על מגוון של מקורות המזון, הבנה ההזנה שלהם התנהגויות ומנגנונים ספיגת הנוזלים הוא חשוב בתחומים רבים. Mouthpart חרק פונקציונליות, למשל, מילא תפקיד בפיתוח של טכנולוגיה ביונים, למשל, microfluidic מכשירים המסוגלים לבצע משימות כגון הרכישה של כמויות קטנות של נוזלים בשיטות דומות לאלו המועסקים על ידי חרקים16. בעיה יסודית במחקרים של מנגנונים ספיגת נוזלים, עם זאת, לקבוע לא רק כמה חרקים ניזונים נוזלים, אבל השגת ראיות התומך את המנגנון. אך ורק באמצעות התנהגות (למשל, חיטוט עם ה12,חוטם17) כפי מחוון האכלה אינה מספיקה, כי זה לא מאשרת את ספיגת נוזלים מוצלחת, ואינה מספקת אמצעי כדי לקבוע את הנתיב זה נוזלים נסיעות כפי שהם עוברים החרק. בנוסף, ביצוע ניסויים עם כמויות קטנות של נוזלים יותר מייצג טבעי תרחישים האכלה איפה נוזלים2,הגבלת משאבים12.
רנטגן שלב ניגודיות הדמיה נעשה שימוש עם פרפר המונרך (plexippus דאנאוס ל') כדי להעריך כמה פרפרים ניזונים כמויות קטנות של נוזלים בין משטחים נקבוביים12. פרפרים המונרך השימוש נימיות באמצעות רווחים בין תחזיות cuticular (legulae הגבי) לאורך החדק להביא הנוזלים נכלאים נקבוביות קטנות לתוך התעלה מזון. הנוזלים נכנסות בצורת סרט על הקיר תעלת המזון גדל והוא מתמוטט לתוך גשר נוזלי על ידי מישור אי יציבות12,18, אשר מועבר מכן כדי הבטן הפרפר על ידי פעולה של המשאבה יניקה בראש. למרות רנטגן שלב ניגודיות הדמיה הוא כלי מעולה להמחשת זרימת נוזל בתוך חרקים12,19,20,21, הטכניקה אינה זמינה יותר ונוח השיטה יש צורך עבור הערכה מהירה של יכולת ספיגת הנוזלים של חרק, לבלוע אותם.
כדי לקבוע אם מנגנון האכילה plexippus ד מחיל פרפראים אחרים וגם כדי זבובים (Diptera) (שתי קבוצות ניזונים נוזלים מן משטחים נקבוביים), Lehnert. et al. 13 ליישם טכניקה להערכת היכולת של חרק לאכול כמויות קטנות של נוזלים מן משטחים נקבוביים, אשר מדווח בהרחבה כאן. אמנם הפרוטוקול שמפורטות כאן מחקרים המשתמשים שנרטבו, משטחים נקבוביים, ניתן לשנות את המתודולוגיה ללימודים אחרים, כגון אלה כתובות מנגנונים האכלה בבריכת. בנוסף, להרחיב היישומים בתחומים אחרים, כולל מיקרופלואידיקה וטכנולוגיית bioinspired.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. חרקים מינים, ההכנה של פתרונות, התקנת תחנת האכלה
הערה: פרפרי כרוב (rapae לבנין ל', Pieridae) נבחרים כמו המין של פרפראים נציג כי הם השתמשו במחקרים קודמים של יכולות ספיגת הנוזלים mouthpart מורפולוגיה22,23. זבובים הבית (זבוב דומסטיקה ל', Muscidae) וזבובים בבקבוק כחול (Calliphora vomitoria ל', Calliphoridae) משמשים כי הם לעיתים קרובות הם נצפו ניזונים משטחים נקבוביים13.
- סדר rapae פ כמו הזחלים הספק חרקים ומאחור אותם על מלאכותי דיאטה (ראה טבלה של חומרים) עד שהם pupate, להגיח כבוגרים תא סביבתיים מוגדר 23 ° C ו של L 18: 6D photoperiod. סדר מ'. דומסטיקה ו vomitoria ג כמו גלמים, אחורי אותם באותם תנאים סביבתיים כמו rapae פ. אל תאכילו למבוגרים פרפרים, זבובים לאחר הם מגיחים הגלמים לפני הניסויים האכלה.
- להכין פתרון 20% סוכרוז (בקרה) 20% סוכרוז nanoparticle פתרון כדי לבדוק את ספיגת הנוזלים. להכין את הפתרון ננו-חלקיק על-ידי הוספת חלקיקים מגנטיים פלורסנט (תחמוצת ברזל עם ציפוי חומצה polyacrylic, כ-20 ננומטר בקוטר)24 20% סוכרוז לפתרון (1 מ"ג/מ"ל dH2O חלקיקים עם 20% סוכרוז פתרון, 1:1). להכין פתרון 1 x תמיסת פוספט buffered (PBS) (מדולל ל- x 1 dH2O, pH 7.4 x 10), המשמשים והניתוחים.
- להקים תחנת האכלה המורכב תחמן ידנית עם מלחציים, שלב האכלה נפרד (משטח שטוח) (איור 1). מקום שקופית קעורה על הבמה האכלה, מסננים רשת ניילון עם קטרים גודל הנקבוביות של 11, 20, 30, 41 או מיקרומטר 60 ומסננים קרום עם נקבוביות בגודל קטרים של 1, 5, 8, או 10 מיקרומטר בקרבת מקום עבור הניסויים האכלה.
2. האכלה פרוטוקול
- גלישת גוף החרק, רגליים וכנפיים לתוך רקמת נייר מקופל. מקם את החרק כך רק את הראש ואת mouthparts חשופים. מקם את הכנפיים של החרק בין שתי שקופיות מיקרוסקופ, אשר מוחזקות ביחד על ידי המלחציים על manipulator כך החרק מושהה מעל הבמה האכלה (איור 1).
- לנהל droplet 30 µL של הפתרון סוכרוז 20% או 20% סוכרוז nanoparticle פתרון עם micropipette למרכז השקופית קעורה. מניחים נייר סינון אחד של גודל הנקבוביות ספציפי על גבי השקופית קעורה כך במרכז נייר הסינון מיושר עם ה-droplet של הפתרון nanoparticle. הקשר בין ה-droplet נייר הסינון תוצאות הפתרון מתפשט לאורך נייר הסינון, ממלא את הנקבוביות (איור 1).
הערה: נייר הסינון מונחת על גבי ה-droplet, ולא להיפך, לצמצם נוכחות אפשרית של חלקיקים על גבי נייר הסינון בו החרקים להאכיל. - מקם את החרק עם manipulator כך רק את האזורים דיסטלי של mouthparts יכולים ליצור קשר עם נייר הסינון wetted על הבמה האכלה (איור 1). השתמש pin של החרקים להרחיב את mouthparts על גבי נייר הסינון ולאפשר את החרק להאכיל עבור 45 s.
- כדי למזער את הסיכוי של חרקים ניזונים נוזלי סרטים שעשויים להיות נוכח על פני השטח של נייר הסינון, מקם את mouthparts כך הם נמצאים בקשר עם חלק נייר הסינון זה נוגע החלק השטוח של השקופית (כלומר. לא ישירות מעל החלק קעורה של השקופית). אם החרק לא הביעו עניין להאכיל mouthparts וניתן החזיק נייר הסינון עם הפין חרקים משך הזמן האכלה.
3. ניתוח
- המקום הפתרון PBS בכוס watch 50 מ מ, כך יש פתרון מספיק כדי לכסות את גופו של החרק. במקום הזכוכית watch תחת חרק סטריאוסקופ והמיקום לנתח ציוד (מיקרו האביב לנתח מספריים, סיכות חרקים, הצבע בסדר לנתח מלקחיים) ליד סטריאוסקופ.
- לאחר האכלה, להסיר נייר טישו החרק והחזק אותו עם כנפיים עצומות. להסיר את הראש, רגליים וכנפיים של החרק עם המספריים ויבתר מיקרו האביב ולמקם את החרק הפתרון PBS בכוס watch (איור 2).
- אם יש צורך, עזים ומתנגד חרקים לפני ניתוח. להשתמש מלקחיים להחזיק את החרק על-ידי הקוטיקולה ליד האזור דיסטלי של הבטן. עם היד הדומיננטית, השתמש המיקרו האביב לנתח מספריים כדי לגזור את הקוטיקולה בכיוון anterior לאורך הצד הלטראלי של הבטן, החל בקצה האחורי, עד בית החזה. לקחת טיפול מיוחד כדי להבטיח רק את הקוטיקולה היא לחתוך כי ונפתח פנימה החרק אינו ניזוק (איור 2).
- קיצוצים נוספים הקוטיקולה עם המספריים ויבתר לפתיחת הבטן כדי לחשוף את הטבעת בתוך (איור 2). הסר את הקוטיקולה הבטן, הגוף השמן ו מבנים אחרים בסיוע סיכות חרקים, להעביר אותם מחוץ הזכוכית watch עבור סילוק עוקבות, עוזב רק על החזה ועל ונפתח בכוס השעון.
הערה: הקרע תחשוף את היבול, אשר הוא מבנה דמוי שק (שלוחה של הטבעת) הממוקמים ואחריותה של בית החזה, הבטן. - אם היבול לא נחשף, לבצע חתכים נוספים אל בית החזה עם המספריים עד היבול מתגלה. לאחר החיתוך הוא גלוי, לחתוך את החלקים הנותרים של החרק עוזב רק ונפתח עם החיתוך בכוס watch (איור 2).
הערה: היבול lepidopteran היא כמעט שקוף, צלופן, כמו בטבע, אשר עשוי להיות קשה לזהות אם לא מלא נוזלים, מורחב או אם הוא נחתך בזמן. - להשתמש הצבע בסדר לנתח מלקחיים כדי למקם את היבול אל coverslip (24 מ"מ x 24 מ"מ) עבור הדמיה עוקבות (איור 2).
4. קביעת חלקיקים בלע
- מיקום החיתוך על coverslip עם הצבע בסדר ויבתר מלקחיים באמצעות טיפול למניעת קריעה על היבול. השתמש ערוץ CY3 (או שלב ניגודיות) במיקרוסקופ קונפוקלי הפוך עבור הדמיה בהגדלה X 20. תמונה היבול מיד לאחר ניתוח כדי למנוע את זה ממנו להתייבש.
- החזק למהומה מגנטי בר (41.3 מ"מ אורך ו- 8 מ מ קוטר) ביד שאינה בשליטה של השלב ההפעלה של המיקרוסקופ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
המחקר של דפוסי ביכולות ספיגת הנוזלים בין חרקים האכלה נוזל מחייב קביעת כאשר האכלה מתרחש. פרוטוקול שמפורטות כאן משמש לבדיקת ההשערה גודל הנקבוביות המגביל בין פרפראים, Diptera13. ההשערה גודל הנקבוביות מגביל קובע כי האכלה נוזל חרקים לא יכולים להאכיל מתוך נקבוביות מלאות נוזל אם הקוטר גודל הנקבוביות קטן יותר הקוטר של תעלות הזנה12. נוזלים נכנסות מפני השטח הנקבובי חייב להקים גשר נוזלי יציב, דרך מישור אי יציבות18, כדי להתגבר על הלחץ נימי לשמור את הנוזלים בתוך הנקבוביות וכדי לספק משטח נוזלי על המשאבה יניקה לפעול. חרקים עם האכלה תעלות בגדלים שונים (איור 3) הם חזו את נבדלים בגודל נקבובית הקטן ביותר שממנו הם יכולים להאכיל.
גודל הנקבוביות המגביל כל הזנים מחושב בהתבסס על היכולת של 50% של אנשים שנבדקו להאכיל על גודל הנקבוביות ספציפית נייר סינון13. חרקים להאכיל את הפתרון 20% סוכרוז (בקרה) לא היו חלקיקים בגידולים שלהם. לאחר חרקים היו גזור כדי להעריך אם חלקיקים היו בולעים אותם, mouthparts שלהם היו עם תמונה עם מיקרוסקופ קונפוקלי למדוד המוליכים באזורים הדיסטלי, צינתור (איור 3). נעשו מדידות הדיסטלי, מקורב כי הוא עשוי לשמש כמחוון של המיקום קריטי איפה נוזלים להזין את mouthparts, דהיינו, ההדוק בין גדלי צינור mouthpart, הגבלת גודל הנקבוביות יכול לספק עקיף ראיות עבור מבנים mouthpart המאפשרים נימיות. הקוטר של התעלה מזון עבור proboscises של rapae פ נמדדו ליד האזור עצה (דיסטלי מדידה) ו- 30% של אורך חוטם (proximal אזור). הקוטר אכזרי של חמישה pseudotracheae שימש את המדידה הדיסטלי, הקוטר של פתיחת הפה נמדדה גם המידה proximal עבור כל דגימה לעוף.
פרוטוקול זה התגלה קשר קרוב בין mouthpart דיסטלי conduit גדלים גודל הנקבוביות הקטן ביותר שממנו חרקים יכול להאכיל (איור 4). הראיות ציין את ספיגת נוזלים עבור המין dipteran הראשון מופיע ב pseudotracheae (דיסטלי mouthpart מדידה) ולא אורלי פתיחת (mouthpart הפרוקסימלית מדידה) בעת האכלה משטחים נקבוביים (איור 4). מעניין, הארכיטקטורה מבנית של pseudotracheae דומה לזה של lepidopteran mouthparts והיא מורכבת מבנים cuticular עשוי לקדם את ספיגת נוזלים דרך פעולה נימי, דוגמה של אבולוציה מתכנסת13. הקשר ההדוק בין הגבלת גודל הנקבוביות ומספק גדלים צינור mouthpart ראיה התומכת נימיות בתור מרכיב חשוב עבור ספיגת נוזלים בין פרפראים Diptera.
איור 1: הגדרת הניסוי ואת תחנת האכלה. (א) ההתקנה מורכב עוטף את החרק בממחטת נייר (tp) והצבת כנפיים החרק בין שתי שקופיות (sl), אשר בהם מוחזקים יחד באמצעות מלחציים (cl) מצורף תחמן (תואר שני) עם ידיות מתכווננות (אי קאי). חוטם החרק (pr) הוא הוריד את שלב האכלה (st), שבו יש נייר סינון (fp) הממוקמים על גבי droplet (ד ר) של הפתרון nanoparticle המנוהלת על שקופית קעורה (cs). מפרטים טכניים (B) מציג את המיקום של רביב, נייר סינון על גבי השקופית קעורה. (ג) ה-droplet של ננו-חלקיק פתרון מתפשט (חיצים) דרך נייר הסינון דרך פעולה נימי כדי ליצור משטח האכלה נקבובי. תמונת מיקרוסקופ פלואורסצנטי (D) של תצוגת הגבי של isopore לסנן מראה נקבוביות (po) (10 מיקרומטר) עם פתרון ננו-חלקיק (20 X הגדלה, ערוץ CY3). אין סרט נוזלי נצפתה על פני השטח. (E) מיקרוסקופ קונפוקלי z-מחסנית תמונה המציגה פתרון ננו-חלקיק (ns) בתוך הנקבוביות של המסנן ' isopore ' (10 מיקרומטר). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: זיהוי לנתיחה, nanoparticle. מלקחיים (A) (fo) משמשים כדי לאבטח את החרק (מ דומסטיקה המוצגת כאן, fl). כנפיים, בראש וברגליים (ב') החרק של יוסרו. (ג) מספריים (sc) משמשים כדי לפתוח הצד הלטראלי של הבטן. (ד) הרבייה מבנים (ביצים, למשל) שאינם נחוצים חלקי ונפתח יוסרו עם מלקחיים נוספים. מבנים נוספים (E) מוסרות כדי לבודד את היבול (cr). (F) מבודד לחתוך מוכן גילוי הנוכחות של חלקיקים. (G) היבול מושם על תגית כיסוי (cs), מועבר מיקרוסקופ קונפוקלי הפוכה. בר מערבבים מגנטי (תואר שני) הוא נופף ליד החיתוך כדי לגרום nanoparticle התנועה. (H) תנועה ננו-חלקיק (המתוארים עיגולים אדומים) היבול של vomitoria ג עם שלב ניגודיות מיקרוסקופ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: Lepidoperan ומבנים dipteran mouthpart. (א) לייזר אבלציה טומוגרפיה התמונה שתציג את החדק lepidopteran (pr), המורכב משילוב של שני galeae בלסת העליונה מוארך שמגיעים יחד על-ידי קישור מבנים (legulae) שיוצרים תעלה מזון (fc) עבור ספיגת נוזלים. שיבוץ (מיקרוסקופ קונפוקלי תמונה) מציג את legulae הגבי (dl) ליד האזור דיסטלי של החדק. החללים בין legulae הגבי מספקים נימיות להכניס נוזלים לתוך התעלה מזון. (B) בצורת C כל galea יש קנה הנשימה (tr), העצבים, השרירים מהותי (im). Mouthparts Dipteran (ג) מורכב על פניו (ro), haustellum ו- labellum הדיסטלי (lb) כי יש תעלות קטנות, pseudotracheae (pt) (מוצג בתמונת וידאו בשיבוץ), אשר מקרינים מפתיחת אוראלי המרכזית (op).התמונה טומוגרפיה אבלציה לייזר גם מראה העין תרכובת (ce) את palpi בלסת העליונה (mp). (ד) האוכל תעלה, אשר מתחבר אל אוראלי פתיחת מורכב חלקית את labrum (la), את ליפ קונטור (lm). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: הקשר בין חרקים mouthparts נקבובית מידות מ אשר הם יכולים להאכיל. הגבלת גודל הנקבוביות קשורה הקוטר (זאת אומרת ± SEM) של המוליכים mouthpart דיסטלי יותר מאשר התעלות מזון הפרוקסימלית. זבוב דומסטיקה מוצג להלן vomitoria ג. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mouthpart חרק פונקציונליות מבחינה היסטורית היא להסיק מחקרים של מורפולוגיה ברוטו (למשל., חוטם lepidopteran פונקציונליות הקשורים קש25,שתייה26); עם זאת, מחקרים שנעשו לאחרונה המשלבים ראיות גרמו שינוי פרדיגמה בהבנתנו המורכבות של חרקים mouthparts, מבנה פונקציה יחסים2,12,13 , 22 , 27. למרות טכניקות הדמיה מודרניים, כגון סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים23, מיקרוסקופיה קונפוקלית22, מיקרו טומוגרפיה (מיקרו-CT)28, טומוגרפיה אבלציה לייזר (איור 3), לספק הזדמנויות מפורט מחקרים של מורפולוגיה, ראיות עבור פונקציונליות צריך להיות מלווה עם ניסויים.
השיטה המתוארת כאן מגלה כי קפילריות עשוי להיות מועסק על ידי חרקים בעת האכלה שנרטבו משטחים נקבוביים כמנגנון חיוני. באמצעות האכלה התנהגות (למשל., חיטוט12,17) לבד לא חשפו זה האכלה מנגנון, כמו אנשים מסוימים זה נחקר משטחים עם mouthparts שלהם לא הצליחו להאכיל, במיוחד לאלה הניתנים מסנן המסמכים עם הנקבוביות קטרים גודל קטן יותר הקוטר של התעלות mouthpart. בנוסף, בדיקה של החיתוך כדי לקבוע אם זה היה נוזל מילא גם יהיה מספיק, כמו כמות נוזלים לגוף דרך ניסויים אלה היו קטנות מדי להערכה ויזואלית, קרי, היבולים של חרקים מסויימים הופיע מנוכה, אבל חלקיקים עדיין נכחו, המציין כי נוזלים היו בלע.
היכולת להתמודד עם חרקים קטנים, לתמרן שלהם mouthparts עם הסיכה חרקים, ולבצע זהיר והניתוחים מייצגים חלק מהשלבים הקריטיים ואת המגבלות של המתודולוגיה המתוארת. היו מקרים, למשל, איפה והניתוחים הביא גזירה על היבול, אשר עיבוד החרק שמיש עבור המחקר כי התוכן של החיתוך (מכיל ואולי הפתרון nanoparticle) מעורבב עם הפתרון PBS בכוס השעון, ומקשה לוודא הבליעה של חלקיקים. בנוסף, פלורסצנטיות אוטומטי של הקוטיקולה חרקים יכולים להפריע באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כאמצעי היחיד לדמיין על חלקיקים; עם זאת, הדמיה קונאפוקלית עם ניגודיות שלב לחסל את הבעיה וסיפק אמצעי נוסף להערכה ויזואלית (איור 2), אשר גם מדגיש למה באמצעות חלקיקים מגנטיים הוא אופטימלי ולא רק פלורסנט חלקיקים. למרות פרוטוקול זה מספק אמצעים כדי להעריך את היכולת של חרקים לבלוע נוזלים, אחת המגבלות היא כי הוא אינו מספק אמצעי כדי להמחיש חלקיקים בעוד הם להיות בלע; לכן, ביטול האפשרות ללמוד את הדינמיקה נוזל במהלך תהליך ספיגת.
בטכניקה המתוארת כאן מספק שיטה להערכת היכולת של חרקים לבלוע כמויות קטנות של נוזלים. לאור המגוון העצום של חרקים האכלה נוזל, פרוטוקול זה יכול להיות מועסק במחקרים אחרים של חרקים עם מיקרו - ו בגודל ננו תעלות ב mouthparts שלהם. בנוסף, מחקרים עתידיים יכול להשתמש בטכניקה דומה כדי לקבוע את הנתיב בו נוזלים לנסוע דרך הטבעת, למשל, לעקוף את היבול כפי שנצפתה חרקים מסויימים מדם, או מחקרים לבחון נוזלים כמה זמן יישארו בפרט מבנים, כגון פיתול או hindgut, כל עוד הזמן בין האכלה, והניתוחים, והדמיה נלקחים בחשבון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי קרן המדע הלאומית (NSF) להעניק. לא. IOS 1354956. אנו מודים ד ר אנדרו ד וורן (מרכז מקגוויר פרפראים, המגוון הביולוגי, פלורידה המוזיאון להיסטוריה של הטבע, אוניברסיטת פלורידה) רשות להשתמש בתמונות פרפר.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20% sucrose solution | Domino Sugar | Sugar needed to produce the sucrose solution with dH2O | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P5493 | 10X concentration diluted to 1X in dH2O for insect dissections |
| Single depression concave slide | AmScope | BS-C6 | Slide is necessary for feeding stage setup |
| Filter paper | EMD Millipore | NY6004700 (60 µm) | Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding |
| Filter paper | EMD Millipore | NY4104700 (41 µm) | Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding |
| Filter paper | EMD Millipore | NY3004700 (30 µm) | Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding |
| Filter paper | EMD Millipore | NY2004700 (20 µm) | Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding |
| Filter paper | EMD Millipore | NY1104700 (11 µm) | Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding |
| Filter paper | EMD Millipore | TCTP04700 (10 µm) | Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding |
| Filter paper | EMD Millipore | TETP04700 (8 µm) | Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding |
| Filter paper | EMD Millipore | TMTP04700 (5 µm) | Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding |
| Filter paper | EMD Millipore | RTTP04700 (1 µm) | Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding |
| Iris microdissecting scissors | Carolina Biological Supply Company | 623555 | Scissors used for dissections |
| Insect pins (#1) | Bioquip Products | 1208B1 | Pins used during dissections and feeding trials |
| Extra-fine point dissecting forceps | Carolina Biological Supply Company | 624684 | Dissecting equipment |
| Leica M205 C Stereoscope | Leica Microsystems | M205 C | Stereoscope used for dissections |
| Inverted confocal microscope | Olympus | IX81 | Fluorescent microscope used to detect magnetic nanoparticles |
| Fisherbrand PTFE Disposable Stir Bar | Fisherscientific | S68067 | Magnet used to detect nanoparticles |
| Kimtech Science Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | 34155 | Tissues used to secure insects during feeding trials |
| House fly (Musca domestica) pupae | Mantisplace.com | insects for experiments | |
| Blue bottle fly (Calliphora vomitoria) pupae | Mantisplace.com | insects for experiments | |
| Cabbage butterfly (Pieris rapae) larvae | Carolina Biological Supply Company | 144102 | insects for experiments |
| Finnpipette F1 | ThermoFisher Scientific | 4641080N | micropipette for dispensing liquids |
| Finntip 250 pipette tips | ThermoFisher Scientific | 9400250 | micropipette tips |
| Microscope Glass cover slides (=coverslips) (24 x 24 mm) | AmScope | CS-S24-100 | coverslips for viewing the insect's crop on confocal microscope |
References
- Vijaysegaran, S., Walter, G. H., Drew, R. A. I. Mouthpart structure, feeding mechanisms, and natural food sources of adult Bactrocera (Diptera: Tephritidae). Ann Entomol Soc Am. 90, 184-201 (1997).
- Lehnert, M. S., Monaenkova, D., Andrukh, T., Beard, C. E., Adler, P. H., Kornev, K. G. Hydrophobic-hydrophilic dichotomy of the butterfly proboscis. J R Soc Interface. 10, 1-10 (2013).
- Zhao, J., Wu, J., Yan, S. Erection mechanism of glossal hairs during honeybee feeding. J Theor biol. 386, 62-68 (2015).
- Redak, R. A., Purcell, A. H., Lopes, J. R. S., Blua, M. J., Mizell, R. F. 3rd, Andersen, P. C. The biology of xylem fluid-feeding insect vectors of Xylella fastidiosa and their relation to disease epidemiology. Ann. Review Entomol. 49, 243-270 (2004).
- Büttiker, W., Krenn, H. W., Putterill, J. F. The proboscis of eye-frequenting and piercing Lepidoptera (Insecta). Zoomorphology. 116, 77-83 (1996).
- Light, J. E., Smith, V. S., Allen, J. M., Durden, L. A., Reed, D. L. Evolutionary history of mammalian sucking lice (Phthiraptera: Anoplura). BMC Evol Biol. 10, (2010).
- Krenn, H. W., Aspock, H. Form, function and evolution of the mouthparts of blood-feeding Arthropoda. Arthropod Struct Dev. 41, 101-118 (2012).
- Lehnert, M. P., Pereira, R. M., Koehler, P. G., Walker, W., Lehnert, M. S. Control of Cimex lectularius using heat combined with dichlorvos resin strips. Med Vet Entomol. 25, 460-464 (2011).
- Zaspel, J. M., Kononenko, V. S., Goldstein, P. Z. Another blood feeder? Experimental feeding of a fruit-piercing moth species on human blood in the Primorye Territory of far eastern Russia (Lepidoptera: Noctuidae: Calpinae). J Insect Behav. 20, 437-451 (2007).
- Barth, F. G. Insects and flowers: the biology of a partnership. , Princeton University Press. Princeton. (1991).
- Foil, L. D., Adams, W. V., McManus, J. M., Issel, C. J. Bloodmeal residues on mouthparts of Tabanus fuscicostatus (Diptera: Tabanidae) and the potential for mechanical transmission of pathogens. J Med Entomol. 24, 613-616 (1987).
- Monaenkova, D., et al. Butterfly proboscis: combining a drinking straw with a nanosponge facilitated diversification of feeding habits. J R Soc Interface. 9, 720-726 (2012).
- Lehnert, M. S., et al. Mouthpart conduit sizes of fluid-feeding insects determine the ability to feed from pores. Proc. R. Soc. B. 284, (2017).
- Grimaldi, D., Engel, M. S. Evolution of the insects. , Cambridge University Press. New York, NY. (2005).
- Adler, P. H., Foottit, R. G. Insect biodiversity: science and society. , Wiley Blackwell. Chichester, UK. (2009).
- Tsai, C. C., et al. Nanoporous artificial proboscis for probing minute amount of liquids. Nanoscale. 3, (2011).
- Krenn, H. W. Proboscis sensilla in Vanessa cardui (Nympahlidae, Lepidoptera): Functional morphology and significance of flower-probing. Zoomorphology. 118, 23-30 (1998).
- Plateau, J. A. F. Experimental and theoretical researches on the figures of equilibrium of liquid mass withdrawn from the action of gravity. (Transl). Annual Report of the Board Regents Smithsonian Institution. , Government Printing Office. Washington, DC. 207-285 (1863).
- Socha, J. J., Westneat, M. W., Harrison, J. F., Waters, J. S., Lee, W. -K. Real-time phase-contrast x-ray imaging: a new technique for the study of animal form and function. BMC Biol. 5, 6 (2007).
- Westneat, M. W., Socha, J. J., Lee, W. -K. Advances in biological structure, function and physiology using synchrotron x-ray imaging. Annu Rev Physiol. 70, 119-142 (2008).
- Lee, W. -K., Socha, J. J. Direct visualization of hemolymph flow in the heart of a grasshopper (Schistocerca americana). BMC Physiology. 9, 2 (2009).
- Lehnert, M. S., Mulvane, C. P., Brother, A. Mouthpart separation does not impede butterfly feeding. Arthropod Struct Dev. 43, 97-102 (2014).
- Lehnert, M. S., Beard, C. E., Gerard, P. D., Kornev, K. G., Adler, P. H. Structure of the lepidopteran proboscis in relation to feeding guild. J Morphol. 277, 167-182 (2016).
- Yan, H., Sung, B., Kim, M. -H., Kim, C. A novel strategy for functionalizable photoluminescent magnetic nanoparticles. Mater. Res. Express. 1, 045032 (2014).
- Kingsolver, J. G., Daniel, T. L. On the mechanics and energetics of nectar feeding in butterflies. J Theor Biol. 76, 167-179 (1979).
- Krenn, H. W. Feeding mechanisms of adult Lepidoptera: Structure, function, and evolution of the mouthparts. Ann Rev Entomol. 55, 307-327 (2010).
- Tsai, C. -C., Monaenkova, D., Beard, C. E., Adler, P. H., Kornev, K. G. Paradox of the drinking-straw model of the butterfly proboscis. J Exp Biol. 217, 2130-2138 (2014).
- Bauder, J. A. S., Handschuh, S., Metscher, B. D., Krenn, H. W. Functional morphology of the feeding apparatus and evolution of proboscis length in metalmark butterflies (Lepidoptera: Riodinidae). Biol J Linn Soc. 110, 291-304 (2013).
