Summary
Vätska-utfodring insekter har förmågan att förvärva små mängder vätskor från porösa ytor. Det här protokollet beskriver en metod för att direkt fastställa möjligheten för insekter att förtära vätskor från porösa ytor med utfodring lösningar med fluorescerande, magnetiska nanopartiklar.
Abstract
Vätska-utfodring insekter äter en mängd olika vätskor, som finns i miljön som pooler, filmer, eller begränsas till små porer. Studier av flytande förvärv kräver bedömning av mouthpart struktur och funktion relationer; flytande upptag mekanismer är emellertid historiskt slutsatsen från observationer av strukturella arkitektur, ibland ensamkommande med experimentella bevis. Vi rapporterar här, en ny metod för att bedöma vätska-upptag förmågor med fjärilar (Lepidoptera) och flugor (Diptera) använder små mängder av vätskor. Insekter har utfodrats med en 20% sackaroslösning blandat med fluorescerande, magnetiska nanopartiklar från filtrerpapper av specifika porstorlek. Grödan (inre struktur används för att lagra vätskor) tas bort från insekten och placeras på en confocal Mikroskop. En magnet är vinkade av grödan att bestämma förekomsten av nanopartiklar, som indikerar om insekter ska kunna svälja vätskor. Denna metod används för att avslöja en utbredd utfodring mekanism (kapillärkraften och flytande bro bildning) som är potentiellt delas bland Lepidoptera och Diptera när utfodring från porösa ytor. Dessutom, denna metod kan användas för studier av utfodring mekanismer bland en mängd vätska-utfodring insekter, inklusive de viktiga i sjukdomsspridning och Biomimetik och eventuellt andra studier som involverar nano - eller micro-storlek conduits där flytande transport kräver verifiering.
Introduction
Många insekt grupper har mouthparts (proboscises) anpassad för utfodring på vätskor, såsom nektar, ruttnande frukt, sap flöden (t.ex. Diptera1, Lepidoptera2, Hymenoptera3), xylem (Hemiptera4), tårar (Lepidoptera ( 5), och blod (Phthiraptera6, Siphonaptera7, Diptera7, Hemiptera8, Lepidoptera9). Förmågan hos insekter att mata på vätskor är relevant för ekosystem hälsa (t.ex. pollinering10), sjukdom överföring4,11, biodiversification2,12och studier konvergent evolution13. Trots det stora utbudet av födokällor är ett tema bland vissa vätska-utfodring insekter förmågan att förvärva små mängder vätska, som kunde begränsas till mikro - eller nano-storlek droppar, flytande filmer eller porösa ytor.
Med tanke på den omfattande mångfalden av vätska-utfodring insekter (mer än 20% av alla djurarter14,15) och deras förmåga att livnära sig på en mängd matkällor, förstå deras utfodring beteenden och vätska-upptag mekanismer är viktigt på många områden. Insekt mouthpart funktionalitet, till exempel, har spelat en roll i utvecklingen av biomimetiska teknik, t.ex., ultrakalla enheter som kan utföra uppgifter såsom förvärv av små mängder vätskor enligt metoder liknar de anställda av insekter16. Ett grundläggande problem i studierna av vätska upptag mekanismer, dock är att bestämma inte bara hur insekter livnär sig på vätskor, men förvärva experimentella bevis som stöder mekanismen. Enbart använder beteende (t.ex. sondering med Snabel12,17) som en indikator för utfodring är otillräcklig eftersom den inte bekräftar det framgångsrika upptaget av vätska, och inte heller ger ett sätt att bestämma rutten som vätskor resa när de passerar genom insekten. Dessutom representerar utför experiment med små mängder vätskor bättre naturlig utfodring scenarier där vätskor är en begränsande resurs2,12.
Röntga fas kontrast imaging användes med Monarkfjärilen (Danaus plexippus L.) för att bedöma hur fjärilar livnär sig på små mängder vätskor från porösa ytor12. Monarch fjärilar använda kapillärkraften via blanksteg mellan cuticular prognoser (dorsala legulae) längs snabel för att få vätskor begränsas till små porer i mat kanalen. De inkommande vätskorna bildar en film på mat canal väggen som växer och kollapsar i en flytande bro av platån instabilitet12,18, som sedan transporteras till fjärilens gut genom åtgärder av sugande pump i huvudet. Även om röntgenfotografering fas kontrast är ett optimalt verktyg för att visualisera vätskeflöde inuti insekter12,19,20,21, tekniken är inte lätt tillgänglig och en bekvämare metoden är nödvändig för snabb bedömning av en insekts förmåga att upptag vätskor och äter dem.
Att avgöra om utfodring mekanismen för D. plexippus gäller andra Lepidoptera och även flugor (Diptera) (båda grupper foder på vätskor från porösa ytor), Lehnert o.a. 13 tillämpat en teknik för att bedöma en insekts förmåga att livnära sig på små mängder vätskor från porösa ytor, som redovisas i detalj här. Även om protokollet som beskrivs här är för studier som använder befuktas och porösa ytor, kan metoden ändras för andra studier, exempelvis adressering pool-utfodring mekanismer. Dessutom utvidga program till andra områden, inklusive mikrofluidik och bioinspired teknik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. insektsarter, beredning av lösningar och utfodring Station Setup
Obs: kål fjärilar (Pieris rapae L., vitfjärilar) väljs som arter av representant Lepidoptera eftersom de har använts i tidigare studier av vätska-upptag förmågor och mouthpart morfologi22,23. Hus flugor (Musca domestica L., husflugor) och blå flaska flugor (Calliphora vomitoria L., om spyflugor) används eftersom de är ofta observeras utfodring på porösa ytor13.
- Ordning P. rapae som larver från en insekt leverantör och bakre dem på artificiella kost (se Tabell för material) tills de förpuppas och dyka upp som vuxna i en klimatkammare värdet 23 ° C och en 18 L: 6 d fotoperiod. Beställ M. domestica och C. vomitoria som puppor och föda upp dem på samma miljöförhållanden som P. rapae. Mata inte vuxna fjärilar och flugor när de dyker upp från the puppor före utfodring experimenten.
- Bered en 20% sackaroslösning (kontroll) och en 20% sackaroslösning nanopartiklar att testa för flytande upptag. Förbereda nanopartiklar lösningen genom att lägga till fluorescerande magnetiska nanopartiklar (järnoxid med polyakryl syra beläggning, ca 20 nm i diameter)24 till en 20% sackaroslösning (1 mg/mL dH2O nanopartiklar med 20% sackaros Lösning 1:1). Bered en 1 x fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) (10 x spädd till 1 x i dH2O, pH 7,4), som används för dissektioner.
- Ställa in en utfodringsplatsen som består av en manuell manipulator med en klämma och ett separat matning Stadium (en platt plattform) (figur 1). Placera en konkav bild på utfodring scenen och har nylon nät filter med pore storlek diametrar av 11, 20, 30, 41 eller 60 µm och membran filter med porer storlek diametrar på 1, 5, 8 eller 10 µm i närheten för utfodring experiment.
2. utfodring protokoll
- Linda insektsvaxer organ, ben och vingar i en hopvikt mjukpapper. Placera insekten så att bara huvudet och mouthparts utsätts. Placera vingar av insekten mellan två objektglas, som rymms tillsammans av klämman på manipulatorn så att insekten är upphängd ovanför utfodring scenen (figur 1).
- Administrera en 30 µL droplet av antingen 20% sackaros eller lösningen 20% sackaros nanopartiklar med en mikropipett till mitten av konkava bilden. Placera ett enda filter papper av en viss porstorlek in i konkava bilden så att mitten av pappersfiltret justeras med droplet-programmet av nanopartiklar lösningen. Kontakten mellan droplet-programmet och pappersfiltret resulterar i lösningen sprids längs pappersfiltret, fylla porerna (figur 1).
Obs: Filterpappret placeras ovanpå droplet-programmet, i stället för tvärtom, för att minimera den potentiella förekomsten av nanopartiklar ovanpå filtret pappersmatning där insekterna. - Placera insekten med manipulatorn så att endast de distala regionerna av mouthparts kan kontakta det fuktade filterpappret på utfodring scenen (figur 1). Använda en insekt pin att utvidga mouthparts på pappersfiltret och tillåta insekten att mata för 45 s.
- För att minimera risken för insekter livnär sig på flytande filmer som kan förekomma på ytan av pappersfiltret, placera mouthparts så att de är i kontakt med en del av pappersfiltret som vidrör den platta delen av bilden (dvs. inte direkt ovanför den konkava delen av bilden). Om insekten inte uttrycker intresset för utfodring, kan mouthparts hållas till pappersfiltret med insekt pin för varaktigheten av utfodringen tiden.
3. dissektioner
- Placera den PBS-lösningen i ett 50 mm urglas så att det finns tillräckligt lösning att täcka den insektens kropp. Placera klockan glaset under ett stereoskop och position insekt dissekera utrustning (våren micro dissekera saxen, insekt pins, fin punkt dissekera tången) bredvid stereoskop.
- Efter utfodring, ta bort insekten från mjukpapper och håll den med vingar stängd. Ta bort den huvud, ben och vingar av insekten med våren micro dissekera saxen och placera insekten i PBS lösningen i urglas (figur 2).
- Om det behövs, söva insekter innan dissektioner. Använda pincett för att hålla insekt av nagelbanden nära regionen distala i buken. Med dominerande hand, Använd våren mikro dissekera saxen för att skära nagelbanden i en främre riktning längs den laterala sidan av buken, starta med den bakre, tills bröstkorgen nås. Var särskilt försiktig så att endast nagelband klipps och att matsmältningskanalen inuti insekten inte är skadade (figur 2).
- Göra ytterligare nedskärningar av nagelband med dissekera saxen att öppna buken avslöja matsmältningskanalen inuti (figur 2). Ta bort buken nagelbanden, fett kroppen och andra strukturer med hjälp av insekt pins och omplacera dem utanför watch glaset för bortskaffande, lämnar endast bröstkorg och matsmältningskanalen i urglas.
Obs: Dissekering kommer att avslöja den gröda, som är en sac-liknande struktur (en förlängning av matsmältningskanalen) belägna nära gränsen av bröstkorg och buk. - Om grödan inte är utsatt, göra ytterligare snitt in i bröstkorgen med saxen tills grödan avslöjas. När grödan är synliga, skär bort de resterande delarna av insekten lämnar endast matsmältningskanalen med grödan i watch glas (figur 2).
Obs: Fjärilsarter grödan är nästan genomskinlig och cellofan-liknande karaktär, som kan vara svårt att känna igen om det inte är fylld med vätska och utvidgas eller om det är klippt under dissektion. - Använd fin punkt dissekera pincett för att placera grödan på ett täckglas (24 x 24 mm) för efterföljande imaging (figur 2).
4. bestämning av förtärda nanopartiklar
- Ställning grödan på täckglaset med fin punkt dissekera pincett med hand att förhindra spricker grödan. Använda CY3 kanal (eller faskontrast) på en inverterad confocal Mikroskop för imaging på 20 X förstoring. Bild grödan omedelbart efter dissektion till hindra den från att torka ut.
- Håll en magnetisk uppståndelse bar (41,3 mm i längd och 8 mm i diameter) i handen som inte är i kontroll av mikroskopet operativa fas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Studien av mönster i vätska-upptag förmågor bland vätska-utfodring insekter kräver bestämning av när utfodring sker. Protokollet som beskrivs här används för att testa begränsande pore storlek hypotesen bland Lepidoptera och Diptera13. Begränsande pore storlek hypotesen säger att vätska-utfodring insekter inte kan foder från vattenfyllda porer om por storlek diameter är mindre än diametern på den matande ledningar12. Inkommande vätska från den porösa ytan måste utgöra en stabil flytande bro, via Plateau instabilitet18, att övervinna det kapillära trycket att hålla vätskorna i porerna och ger en flytande yta för suger pumpen att agera på. Insekter med utfodring conduits i olika storlekar (figur 3) förutsägs skiljer sig åt i minsta porstorlek som de kan mata.
Begränsande porstorlek för varje art beräknas baserat på möjligheten för 50% av de testa individerna att livnära sig på en viss porstorlek av filterpapper13. Insekter som utfodras 20% sackaros lösningen (kontroll) har inte nanopartiklar i sina grödor. Efter insekter var dissekeras för att bedöma om nanopartiklar var förtärts, var sin mouthparts avbildas med en confocal Mikroskop för att mäta conduits i regionerna distala och proximala (figur 3). Distala och proximala mätningar gjordes eftersom det kan tjäna som en indikator på den kritiska läge där vätskor anger mouthparts, dvs, en nära relation mellan mouthpart conduit storlekar och begränsa porstorlek kunde ge indirekta bevis för mouthpart strukturer som underlättar kapillärkraften. Diametrarna av kanalen mat för proboscises av P. rapae mättes nära regionen tip (distala mätning) och 30% av snabel längden (proximala region). Fem pseudotracheae genomsnittlig diameter användes som distala mätningen och muntliga öppnandet diameter mättes som proximala mätningen för varje fluga exemplar.
Detta protokoll avslöjade en nära relation mellan distala mouthpart conduit storlekar och minsta porstorlek som insekter kan mata (figur 4). Bevis anges att vätska upptaget för sorgmyggor arten först inträffar i pseudotracheae (distala mouthpart mätning) snarare än den orala öppning (proximala mouthpart mätning) vid matning från porösa ytor (figur 4). Intressant, den strukturella arkitekturen i pseudotracheae är liknande till det av fjärilsarter mouthparts och består av cuticular strukturer som kan främja vätska upptag genom kapillärkraft, ett exempel på konvergent evolution13. Det nära sambandet mellan den begränsande porstorlek och mouthpart conduit storlekar ger bevis som stöder kapillärkraften som en viktig komponent för flytande upptag bland Lepidoptera och Diptera.
Figur 1: Experimental setup och utfodringsplats. (A), installationen består av inslagning insekten i ett silkespapper (tp) och placera den insektsvaxer vingar mellan två bilder (sl), som hålls samman av en klämma (cl) bifogas en manipulator (ma) med justerbar knoppar (ak). Den insektsvaxer Snabel (pr) sänks till utfodring etapp (st), som har ett filterpapper (fp) som är placerad på en droplet (dr) av nanopartiklar lösningen som administreras till en konkav bild (cs). (B) Schematisk visar placeringen av droplet och filterpapper på den konkava objektglas. (C), droplet-programmet av nanopartikelportföljen lösning sprider (pilar) genom filter papperet via kapillärkraft att skapa en porös utfodring yta. (D) fluorescerande Mikroskop bild av dorsala vy av isopore filter visar porer (po) (10 µm) med nanopartiklar lösning (20 X förstoring, CY3-kanal). Ingen flytande film observerades på ytan. (E) Confocal z-stack Mikroskopbilden visar nanopartiklar lösning (ns) i porerna i filtret isopore (10 µm). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: identifiering av dissektion och nanopartiklar. (A) pincett (fo) används för att säkra insekt (M. domestica visas här, fl). (B) insektens vingar, huvudet och benen tas bort. (C) sax (sc) används för att skära öppna den laterala sidan av buken. (D) reproduktiva strukturer (ägg, t.ex.) och onödiga delar av matsmältningskanalen tas bort med ytterligare pincett. (E) ytterligare strukturer tas bort för att isolera grödan (SP). (F) isolerade beskära redo för att upptäcka förekomsten av nanopartiklar. (G) grödan placeras på ett täckglas (cs) och flyttas till en inverterad confocal mikroskopet. En magnetisk uppståndelse bar (ma) är vinkade nära grödan att orsaka nanopartiklar rörelse. (H) nanopartiklar rörelse (markerad med röda cirklar) i grödan av C. vomitoria med fas kontrast mikroskopi. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Lepidoperan och sorgmyggor mouthpart strukturer. (A) Laser ablation tomografi bild visar de fjärilsarter Snabel (pr), som består av två avlånga maxillary galeae som tillsammans genom att länka strukturer (legulae) som skapar en mat kanal (fc) för flytande upptag. Infällt (confocal Mikroskopbilden) visar den dorsala legulae (dl) nära regionen distala på proboscis. Mellanrummen mellan de dorsala legulae ge kapillärkraften för att få vätska in i mat-kanalen. (B) varje C-formad galea har luftstrupen (tr), nerv, och inneboende muskulatur (im). (C) sorgmyggor mouthparts består av en talarstol (ro), haustellum och en distala labellum (lb) som har små conduits, pseudotracheae (pt) (visas i confocal bild i infälld), som strålar ut från en central muntliga öppning (op).Laser ablation tomografi bilden visar också förening ögat (ce) och de maxillary palpitationer (mp). (D), maten kanalen, som ansluter till den muntliga öppna består delvis av labrum (la) och labium (lm). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: förhållandet mellan insekt mouthparts och pore storlekar från som de kan mata. Begränsande porstorlek är relaterad till diameter (medelvärde ± SEM) de distala mouthpart kanaler i stället för proximala mat kanalerna. Musca domestica visas nedan C. vomitoria. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Insekt mouthpart funktionalitet är historiskt härledas från studier av brutto morfologi (t.ex., fjärilsarter snabel funktioner relaterade till en dricka sugrör25,26); dock har senaste studierna som införlivar experimentella bevis resulterat i ett paradigmskifte i vår förståelse av komplexiteten i insekt mouthparts och struktur och funktion relationer2,12,13 , 22 , 27. även om moderna avbildningstekniker, såsom scanning electron microscopy23, konfokalmikroskopi22, micro datortomografi (mikro-CT)28och laser ablation tomografi (figur 3), ger möjligheter för detaljerade studier av morfologi, bevis för funktionalitet bör åtföljas med experiment.
Den metod som beskrivs här avslöjar att kapillaritet kan vara en mycket viktig mekanism som anställd av insekter när utfodring från befuktas porösa ytor. Använda utfodring beteende (t.ex., sondering12,17) ensam skulle inte ha avslöjat detta utfodring mekanism, som vissa individer som trotsat ytor med sin mouthparts kunnat foder, särskilt de som tillhandahålls filtrerpapper med por storlek diameter mindre än diametern på de mouthpart ledningarna. Dessutom, inspektion av grödan att avgöra om det var vätska fylld också skulle vara otillräcklig, eftersom mängden vätskor intas i dessa experiment var för liten för visuell bedömning, dvs., grödorna av vissa insekter verkade deflateras, men nanopartiklar var fortfarande närvarande som anger att vätskor var förtäras.
Möjlighet att hantera små insekter, manipulera sin mouthparts med en insekt pin och utföra noggranna dissektioner representerar några av de kritiska steg och begränsningar av metoden som beskrivs. Det fanns tillfällen, till exempel där dissektioner resulterade i skära grödan, som oanvändbar insekten för studien eftersom innehållet i grödan (möjligen innehåller nanopartiklar lösningen) blandat med PBS lösningen i urglas, vilket gör det svårt att verifiera intag av nanopartiklar. Dessutom kan auto fluorescensen av insekt nagelband störa med fluorescerande mikroskopi som det enda sättet för att visualisera nanopartiklarna; dock confocal imaging med faskontrast elimineras problemet och ett annat medel som föreskrivs visuell bedömning (figur 2), som också belyser Varför använda magnetiska nanopartiklar är optimal i motsats till endast fluorescerande nanopartiklar. Även om detta protokoll ger en möjlighet att bedöma förmågan för insekter att förtära vätskor, är en av begränsningarna att det inte ger ett sätt att visualisera nanopartiklarna medan de håller på att förtäras; Därför eliminera möjligheten för att studera fluiddynamik under processen upptag.
Den teknik som beskrivs här ger en metod för att bedöma förmågan hos insekter att äter små mängder vätskor. Med tanke på den enorma mångfalden av vätska-utfodring insekter, kan detta protokoll användas i andra studier av insekter med mikro - och nano-storlek conduits i sin mouthparts. Dessutom kan framtida studier använda en liknande teknik för att fastställa sökvägen som vätskor resa genom matsmältningskanalen, t.ex., förbi grödan som observerats i vissa blod-utfodring insekter, eller studier som undersöker hur länge vätskor fortfarande särskilt strukturer, såsom midgut eller hindgut, så länge som tiden mellan utfodring, dissektioner, och imaging beaktas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Science Foundation (NSF) bevilja nr. IOS 1354956. Vi tackar Dr. Andrew D. Warren (McGuire Center för Lepidoptera och biologisk mångfald, Florida Museum of Natural History, University of Florida) om tillstånd att använda fjäril bilder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20% sucrose solution | Domino Sugar | Sugar needed to produce the sucrose solution with dH2O | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P5493 | 10X concentration diluted to 1X in dH2O for insect dissections |
| Single depression concave slide | AmScope | BS-C6 | Slide is necessary for feeding stage setup |
| Filter paper | EMD Millipore | NY6004700 (60 µm) | Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding |
| Filter paper | EMD Millipore | NY4104700 (41 µm) | Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding |
| Filter paper | EMD Millipore | NY3004700 (30 µm) | Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding |
| Filter paper | EMD Millipore | NY2004700 (20 µm) | Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding |
| Filter paper | EMD Millipore | NY1104700 (11 µm) | Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding |
| Filter paper | EMD Millipore | TCTP04700 (10 µm) | Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding |
| Filter paper | EMD Millipore | TETP04700 (8 µm) | Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding |
| Filter paper | EMD Millipore | TMTP04700 (5 µm) | Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding |
| Filter paper | EMD Millipore | RTTP04700 (1 µm) | Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding |
| Iris microdissecting scissors | Carolina Biological Supply Company | 623555 | Scissors used for dissections |
| Insect pins (#1) | Bioquip Products | 1208B1 | Pins used during dissections and feeding trials |
| Extra-fine point dissecting forceps | Carolina Biological Supply Company | 624684 | Dissecting equipment |
| Leica M205 C Stereoscope | Leica Microsystems | M205 C | Stereoscope used for dissections |
| Inverted confocal microscope | Olympus | IX81 | Fluorescent microscope used to detect magnetic nanoparticles |
| Fisherbrand PTFE Disposable Stir Bar | Fisherscientific | S68067 | Magnet used to detect nanoparticles |
| Kimtech Science Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | 34155 | Tissues used to secure insects during feeding trials |
| House fly (Musca domestica) pupae | Mantisplace.com | insects for experiments | |
| Blue bottle fly (Calliphora vomitoria) pupae | Mantisplace.com | insects for experiments | |
| Cabbage butterfly (Pieris rapae) larvae | Carolina Biological Supply Company | 144102 | insects for experiments |
| Finnpipette F1 | ThermoFisher Scientific | 4641080N | micropipette for dispensing liquids |
| Finntip 250 pipette tips | ThermoFisher Scientific | 9400250 | micropipette tips |
| Microscope Glass cover slides (=coverslips) (24 x 24 mm) | AmScope | CS-S24-100 | coverslips for viewing the insect's crop on confocal microscope |
References
- Vijaysegaran, S., Walter, G. H., Drew, R. A. I. Mouthpart structure, feeding mechanisms, and natural food sources of adult Bactrocera (Diptera: Tephritidae). Ann Entomol Soc Am. 90, 184-201 (1997).
- Lehnert, M. S., Monaenkova, D., Andrukh, T., Beard, C. E., Adler, P. H., Kornev, K. G. Hydrophobic-hydrophilic dichotomy of the butterfly proboscis. J R Soc Interface. 10, 1-10 (2013).
- Zhao, J., Wu, J., Yan, S. Erection mechanism of glossal hairs during honeybee feeding. J Theor biol. 386, 62-68 (2015).
- Redak, R. A., Purcell, A. H., Lopes, J. R. S., Blua, M. J., Mizell, R. F. 3rd, Andersen, P. C. The biology of xylem fluid-feeding insect vectors of Xylella fastidiosa and their relation to disease epidemiology. Ann. Review Entomol. 49, 243-270 (2004).
- Büttiker, W., Krenn, H. W., Putterill, J. F. The proboscis of eye-frequenting and piercing Lepidoptera (Insecta). Zoomorphology. 116, 77-83 (1996).
- Light, J. E., Smith, V. S., Allen, J. M., Durden, L. A., Reed, D. L. Evolutionary history of mammalian sucking lice (Phthiraptera: Anoplura). BMC Evol Biol. 10, (2010).
- Krenn, H. W., Aspock, H. Form, function and evolution of the mouthparts of blood-feeding Arthropoda. Arthropod Struct Dev. 41, 101-118 (2012).
- Lehnert, M. P., Pereira, R. M., Koehler, P. G., Walker, W., Lehnert, M. S. Control of Cimex lectularius using heat combined with dichlorvos resin strips. Med Vet Entomol. 25, 460-464 (2011).
- Zaspel, J. M., Kononenko, V. S., Goldstein, P. Z. Another blood feeder? Experimental feeding of a fruit-piercing moth species on human blood in the Primorye Territory of far eastern Russia (Lepidoptera: Noctuidae: Calpinae). J Insect Behav. 20, 437-451 (2007).
- Barth, F. G. Insects and flowers: the biology of a partnership. , Princeton University Press. Princeton. (1991).
- Foil, L. D., Adams, W. V., McManus, J. M., Issel, C. J. Bloodmeal residues on mouthparts of Tabanus fuscicostatus (Diptera: Tabanidae) and the potential for mechanical transmission of pathogens. J Med Entomol. 24, 613-616 (1987).
- Monaenkova, D., et al. Butterfly proboscis: combining a drinking straw with a nanosponge facilitated diversification of feeding habits. J R Soc Interface. 9, 720-726 (2012).
- Lehnert, M. S., et al. Mouthpart conduit sizes of fluid-feeding insects determine the ability to feed from pores. Proc. R. Soc. B. 284, (2017).
- Grimaldi, D., Engel, M. S. Evolution of the insects. , Cambridge University Press. New York, NY. (2005).
- Adler, P. H., Foottit, R. G. Insect biodiversity: science and society. , Wiley Blackwell. Chichester, UK. (2009).
- Tsai, C. C., et al. Nanoporous artificial proboscis for probing minute amount of liquids. Nanoscale. 3, (2011).
- Krenn, H. W. Proboscis sensilla in Vanessa cardui (Nympahlidae, Lepidoptera): Functional morphology and significance of flower-probing. Zoomorphology. 118, 23-30 (1998).
- Plateau, J. A. F. Experimental and theoretical researches on the figures of equilibrium of liquid mass withdrawn from the action of gravity. (Transl). Annual Report of the Board Regents Smithsonian Institution. , Government Printing Office. Washington, DC. 207-285 (1863).
- Socha, J. J., Westneat, M. W., Harrison, J. F., Waters, J. S., Lee, W. -K. Real-time phase-contrast x-ray imaging: a new technique for the study of animal form and function. BMC Biol. 5, 6 (2007).
- Westneat, M. W., Socha, J. J., Lee, W. -K. Advances in biological structure, function and physiology using synchrotron x-ray imaging. Annu Rev Physiol. 70, 119-142 (2008).
- Lee, W. -K., Socha, J. J. Direct visualization of hemolymph flow in the heart of a grasshopper (Schistocerca americana). BMC Physiology. 9, 2 (2009).
- Lehnert, M. S., Mulvane, C. P., Brother, A. Mouthpart separation does not impede butterfly feeding. Arthropod Struct Dev. 43, 97-102 (2014).
- Lehnert, M. S., Beard, C. E., Gerard, P. D., Kornev, K. G., Adler, P. H. Structure of the lepidopteran proboscis in relation to feeding guild. J Morphol. 277, 167-182 (2016).
- Yan, H., Sung, B., Kim, M. -H., Kim, C. A novel strategy for functionalizable photoluminescent magnetic nanoparticles. Mater. Res. Express. 1, 045032 (2014).
- Kingsolver, J. G., Daniel, T. L. On the mechanics and energetics of nectar feeding in butterflies. J Theor Biol. 76, 167-179 (1979).
- Krenn, H. W. Feeding mechanisms of adult Lepidoptera: Structure, function, and evolution of the mouthparts. Ann Rev Entomol. 55, 307-327 (2010).
- Tsai, C. -C., Monaenkova, D., Beard, C. E., Adler, P. H., Kornev, K. G. Paradox of the drinking-straw model of the butterfly proboscis. J Exp Biol. 217, 2130-2138 (2014).
- Bauder, J. A. S., Handschuh, S., Metscher, B. D., Krenn, H. W. Functional morphology of the feeding apparatus and evolution of proboscis length in metalmark butterflies (Lepidoptera: Riodinidae). Biol J Linn Soc. 110, 291-304 (2013).
