Summary
Genetisk kodet luciferase er en populær non-invasiv reporter af genekspression. Anvendelse af en automatiseret langsgående luciferase imaging gas - og temperatur-optimeret recorder (ALLIGATOR) gør det muligt for langsgående optagelse fra en bioluminescerende celler under en lang række betingelser. Her viser vi, hvordan ALLIGATOR kan anvendes i forbindelse med døgnrytmen forskning.
Abstract
Luciferase-baserede reportere af cellulær genekspression er i udbredt brug i både længderetningen og end-point undersøgelser vedrørende af biologisk aktivitet. I døgnrytmen forskning, for eksempel, give ur gen fusioner med firefly luciferase anledning til robust rytmer i cellulære bioluminescens, der eksisterer i mange dage. Tekniske begrænsninger forbundet med photomultiplier rør (PMT) eller konventionelle mikroskopi-baserede metoder til bioluminescens kvantificering har typisk krævet, at celler og væv opretholdes under helt ikke-fysiologiske forhold under optagelse, med en trade-off mellem følsomhed og overførselshastighed. Her rapporterer vi en videreudvikling af tidligere metoder, der giver langsigtet bioluminescens imaging med høj følsomhed og produktivitet som understøtter en bred vifte af kultur betingelser, herunder variabel gas og fugtighed kontrol, og som accepterer mange forskellige vævskultur plader og retter. Denne automatiserede langsgående luciferase imaging gas - og temperatur-optimeret recorder (ALLIGATOR) også giver mulighed for observation af rumlige variationer i luciferase udtryk på tværs af en celle éncellelag eller væv, som ikke kan let iagttages af traditionelle metoder. Vi fremhæve, hvordan ALLIGATOR giver langt større fleksibilitet til påvisning af luciferase aktivitet sammenlignet med eksisterende metoder.
Introduction
Brugen af luciferases som indberettere af genekspression og protein aktivitet er blevet en populær teknik i molekylær og cellulær biologi forskning. Dette er sandt i feltet døgnrytmen, hvor kinetik af firefly luciferase syntese og katalytisk inaktivering er særlig velegnet til rapportering af de langsgående ændringer i genekspression, der opstår over ca 24 h døgnrytmen cyklus. Som sådan er luciferase ansat som døgnrytmen reporter på tværs af en bred vifte af organismer, herunder svampe, planter, fluer og pattedyr1,2,3,4.
Når kvantificere døgnrytmen gen expression in vitro-, er en photomultiplier tube (PMT) almindeligt anvendt til at optage en bioluminescerende signalet. PMT-baserede målinger har begrænset fleksibilitet dog normalt at være begrænset til en forudbestemt tallerken eller fad størrelse. Det er heller ikke muligt at indsamle nogen geografisk information fra prøver overvåges ved hjælp af en ydelse, som kan føre til tab af oplysninger, når imaging prøver, der viser rumlige variation i luciferase udtryk. Som PMT og tilhørende elektronik er tilbøjelige til at fejl når de udsættes for fugtig miljø af en standard celle kultur inkubator, udføres langsgående luciferase optagelse ved hjælp af PMTs desuden altid i ikke-fugtet væksthuse. Følgelig, celle kultur retter skal være forseglet lufttæt til at forhindre vandtab gennem fordampning og kultur medier skal derfor være bufferet med 3-(N- morpholino) propanesulfonic syre (MOPPER) eller 4-(2-hydroxyethyl) -1- piperazineethanesulfonic syre (HEPES), snarere end CO2/bicarbonate buffer system, der fungerer i vivo og bruges rutinemæssigt i pattedyr vævskultur.
Som følge af disse begrænsninger placerer måling af bioluminescens af PMTs normalt stramme restriktioner på de betingelser, hvorunder celler bevares under eksperimenter. At overvinde disse problemer, og også at øge antallet af mulige forsøgsbetingelser, bruger vi en standard CO2/n2 170 L vævskultur inkubator, er blevet tilpasset ved tilsætning af en vand-kølet elektron-multiplikation Charge - sammen enhed (EMCCD) kamera med anti-tåge optik og digital styring af temperatur og gas niveauer. Dette er blevet døbt en automatiseret langsgående Luciferase Imaging Gas og Temperature-Optimized optager eller ALLIGATOR. ALLIGATOR giver mulighed for væsentligt øget fleksibilitet af en bioluminescerende imaging, både til høj overførselshastighed billeddannelse af standard vævskultur plader (op til 6 x 96 - eller 384-godt plader samtidig) og også for ikke-standard betalingsnumre vævskultur systemer, sådan som perfunderet celler dyrkes i mikrofluid enheder. Dette instrument giver også mulighed for imaging for at forekomme befugtet betingelser og med variabel kontrol af både CO2 og O2 partialtrykket samt temperatur.
Protokollen nedenfor beskriver en metode til en bioluminescerende optagelse af pattedyr celle og vævskultur systemer ved hjælp af en ALLIGATOR (herefter benævnt 'bioluminescens kuvøse'). Det skal bemærkes, at systemet ville være velegnet til en bioluminescerende imaging og også med nogle ændringer, fluorescerende imaging, i en række andre biologiske systemer og sammenhænge.
Protocol
1. Seedning og temperatur medrivning af celler
Bemærk: Denne protokol er blevet grundigt testet ved hjælp af primære og udødeliggjort mus fibroblaster udtrykker PERIOD2::LUCIFERASE (PER2::LUC) fusion protein4. Justeringer skal muligvis foretages eksperimenter ved hjælp af andre cellelinjer.
- Forud for begyndelsen cellekultur, placere næste i et 37 ° C vandbad til at varme: fosfatbufferet saltvand (PBS) (pH 7,4), PBS suppleret med 0,68 mM ethylendiamintetra syre, pH 7,2 (PBS + EDTA), passende celle kultur medier, f.eks. Dulbeccos modificerede Eagle Medium (DMEM) suppleret med 10% føtal bovint serum (FBS), 100 U/mL penicillin og 100 µg/mL streptomycin og 0,25% trypsin løsning.
- Fortynd trypsin 1:3 med pre varmede PBS + EDTA-oploesning og vende tilbage til et vandbad.
- Tage en 125 cm2 kolbe af luciferase-udtrykker celler, der er 70-90% sammenflydende. Opsug mediet. Tilsæt 10 mL pre varmede PBS.
- Opsug PBS. Tilføje 2,5 mL pre varmede trypsin-EDTA og vende kolben til 37 ° C inkubator i 5 min.
- Fjerne celler fra rugemaskinen, og se under et mikroskop. Når fleste celler har løsrevet fra bunden af kolben, fortsætte til næste trin. Hvis de fleste celler forbliver knyttet til bunden af kolben, returnere det til rugemaskine, indtil de fleste celler i suspension.
- Kolben tilsaettes en yderligere 7,5 mL af standard cellekulturmedium. Du kan eventuelt fjerne 1 mL af dette for yderligere passage af celler, som kræves.
- Regne massefylden af de resterende celler ved hjælp af en hemocytometer og trypan blå. Fortynd celler yderligere, som passende for den pågældende cellelinje.
Bemærk: For de eksperimenter nedenfor, PERIOD2::LUC fibroblaster var seedet mellem 6 x 103 celler/cm2 og 1 x 104 celler/cm2 i 96-brønd plader, 35 mm retter eller kanal dias. - Frø celler på vævskultur retter eller plader, der skal bruges til optagelsen.
Bemærk: Brug af sorte plader, dobbeltsidet, clear-bund anbefales som dette giver kultur sundhed vurderes, inden optagelserne begynder samtidig at reducere interferens mellem brønde under optagelsen. Hvis bioluminescens er ekstremt lavt, skal hvide retter/plader der til at maksimere lys påvisning, selvom venligst Bemærk, at Morild kan føre til øget baggrund signal, der fortsætter i flere timer. - Returnere pladerne til rugemaskine og tillade encellelag at nå 100% sammenløbet (ca. 7 dage).
Bemærk: Når sammenflydende, cellelinjer, der hæmmer kontakt kan opretholdes i op til tre uger før eksperimenter forudsat at medierne opdateres jævnligt (hvert 5-7 dage). - Når sammenflydende, synkronisere cellulære rytmer bruger anvendt temperatur cyklusser (12 h ved 32 ° C, 12 timer ved 37 ° C) til et minimum af 72 h umiddelbart før eksperimenter5,6 (ved hjælp af en præ-programmerede cykling inkubator, styret af en computer tilsluttet til rugemaskine gennem en seriel RS-232 port).
Bemærk: Antallet af temperatur cyklusser kræves til synkronisering af cellulære rytmer kan variere mellem celler linjer og kan derfor være nødvendigt at være optimeret til andre cellelinjer. Akut farmakologiske stimulation ved hjælp af forskolin eller dexamethason er også blevet brugt tidligere til at synkronisere cellulære rytmer7,8.
2. NS21 forberedelse
Bemærk: NS21 er et serumfrit supplement til vedligeholdelse af neuronal og andre cellekulturer. Det er en videreudvikling af en lignende supplement kendt som B27, som er kommercielt tilgængelig og kan bruges som et serum udskiftning i løbet af døgnrytmen bioluminescens optagelser9. Enten supplement kan bruges synonymt i indspilningsmedier for de eksperimentelle protokoller er beskrevet nedenfor. Det er helt muligt og omkostningseffektivt at gøre NS21 in-house, som Chen et al. 10, og som er beskrevet her.
- Reagensglasset alle komponenter beskrevet i tabel 1 ved stuetemperatur i 1 time før starten.
- Opløses 50 g bovin albumin i 324 mL basal medium (f.eks., neurobasal) på is. Rør blandingen så lidt som muligt.
- Tilføj alle andre komponenter, omrøring minimalt efter hver komponent men stadig sikre grundig blanding. Formålet med at opløse alle komponenter i 90 min for at starte.
- Alikvot den endelige blanding og opbevares ved-20 ° C indtil kræves. Undgå gentagne fryse-tø cykler.
Bemærk: Blandingen er for tyktflydende til at filtrere på dette stadium, men vil blive steril filtreret ved fortynding med medierne før du føjer det til celler.
3. optagelse medier forberedelse
Bemærk: En primær fordel bioluminescens rugemaskine over andet udstyr til at optage langsgående bioluminescens er, at i kraft af at kunne fugte rugemaskine og variere delvis pres fra O2 og CO2, det er muligt at bruge en bredere vifte af medier betingelser for optagelse bioluminescens — herunder betingelser, som mere ligne den fysiologiske niche besat af forskellige celle typer i vivo. Nedenfor beskriver vi formuleringen af optagelse medier tilpasset fra Hastings et al. 9, som vi har brugt rutinemæssigt med dyrkede fibroblaster og andre celletyper. Først er for lukkede kultur betingelser (uden gas exchange), og andet er til fysiologisk relevante betingelser og bør bruges på befugtet betingelser med 5% CO2.Mange andre variationer er muligt og tilrådeligt, afhængigt af den nøjagtige anvendelse og celletype.
- MOPS-buffered høje glukose media forberedelse
Bemærk: Lager opløsning (1 L): DMEM pulver (8,3 g/L), 0,35 mg/mL natriumbikarbonat, 5 mg/mL glukose, 0,02 M MOPS, 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin.- Opløse 8,3 g DMEM pulver i 900 mL ultrarent vand i en 1000 mL måleglas og omrystes i 30 min, indtil alle partikler er opløst.
- Der tilsættes 50 mL af glucose opløsning (100 g/L), 20 mL af MOPPER (1 M, pH 7,6), 10 mL af 100 x pen/strep løsning, og rør til en yderligere 10 min.
- Tilføj 4,7 mL 7,5% natriumbikarbonat løsning og rør til en yderligere 5 min.
- Justere media pH 7,6 (hvis ved stuetemperatur) eller 7.4 (37 ° C) med HCl/NaOH.
- Der tilsættes ultrarent vand for at producere en endelige mængden af 1.000 mL.
- Sterilisere ved filtrering gennem et 0,22 µm filter og opbevares ved 4 ° C indtil kræves.
- Før eksperimenter, supplere en passende mængde stamopløsning med 10% serum, 2 mM L-alanyl-L-glutamin, 2% NS21, og 1 mM luciferin at lave en arbejdsgruppe bestand. Passere denne bestand gennem et 0,22 µm sterile filter.
- Måle osmolalitet medier ved hjælp af en osmometer.
- Tænd for osmometer.
- Kalibrere osmometer, først med ultrarent vand. Tilsættes 50 µL vand til bunden af en måling fartøj. Sikre, at der er ingen bobler i væsken. Klip fartøjet over sonden. Tryk på 'Nul' og sænk forsigtigt osmometer arm til det laveste punkt. Vent indtil læsning er komplet og grønne 'resultat' lys er tændt før hæve armen og fjerne fartøjet.
- Gentag for at kalibrere osmometer til 300 mOsmol/kg ved hjælp af 50 µL kalibrering standard. Tryk på 'Cal' før sænke armen.
- Måle prøve osmolalitet ved at tilføje 50 µL af medier til bunden af en måling fartøj og foranstaltning som ovenfor. Tryk på 'prøve' før sænke osmometer arm.
- Justere osmolalitet til 350 mOsmol ved hjælp af 5 M NaCl.
- HCO3-buffered lav glucose medier (perfusion medium) forberedelse
Bemærk: Lager opløsning (1 L): DMEM pulver (8,3 g/L), 3,7 mg/mL natriumbikarbonat, 1 mg/mL glukose, 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin.- Opløse 8,3 g DMEM pulver i 900 mL ultrarent vand i en 1000 mL måleglas og omrystes i 30 min, indtil alle partikler er opløst.
- Der tilsættes 50 mL af glucose opløsning (100 g/L), 10 mL af 100 x pen/strep løsning og rør til en yderligere 10 min.
- Tilføj 49,4 mL 7,5% natriumbikarbonat løsning og rør til en yderligere 5 min.
- Justere media pH 7,6 (stuetemperatur) eller 7.4 (37 ° C) med HCl/NaOH.
- Der tilsættes ultrarent vand for at give en endelige mængden af 1.000 mL.
- Passere gennem et 0,22 µm sterile filter og opbevares ved 4 ° C indtil brug.
- Før eksperimenter, supplere en passende mængde stamopløsning med 2% serum, 2 mM L-alanyl-L-glutamin, 2% NS21 og 1 mM luciferin at lave en arbejdsgruppe bestand. Passere denne bestand gennem et 0,22 µm sterile filter.
- Måle og justere osmolalitet til 350 mOsmol ved hjælp af 5 M NaCl, hvad angår MOPS-buffered medierne.
Bemærk: Luciferin koncentration bør fastsættes empirisk for hver celletype og kontekst. For yderligere information se Feeney et al. 11 serum og NS21 (eller B27 hvis anvendt) koncentrationer kan varieres afhængigt af anvendelsen. Dog vi rådgive, at medmindre empirisk testet viser ellers, serum og NS21 (eller alternative serumfrit supplement) anvendes, da disse fremmer celle overlevelse og vedhæftet fil. I cellelinjer, der så ikke kontakt hæmme godt, kan det være nødvendigt at sænke serum koncentration i optagelsesmedier at forhindre forstyrrende virkninger af spredning, som også fremmes af serum.
4. optagelse
- Forud for begyndelsen af optagelse, skal du placere den passende arbejde media stock (fra trin 3.1 eller 3.2 afhængigt af eksperimentet) i et 37 ° C vandbad til at varme.
- Mens medierne opvarmning, fokusere kameraet i bioluminescens inkubator.
- Skru den vand-vandtætte, opvarmet neutralfiltre og der er afsat.
- Indstille software til at optage en video med en høj erhvervelse sats. Klik på "køb | Erhvervelse Setup". Indstil "Eksponeringstid" til 0,2 s og kinetic procestid til 0,3 sekunder. Sørg for at EM gevinst er slået fra.
- Luk vinduet 'Erhvervelse Setup' og klik på ikonet "tage video".
- Ved hjælp af fokusering cylinderen rotere kameralinsen indtil varer på hylden i højden til registreres er klart i fokus i videoen.
- Stop videoen ved at klikke på ikonet 'stop video'.
- Skru den opvarmede neutralfiltre tilbage i position; udeblivelse vil resultere i skader til EM-CCD kamera og/eller dug af målet på grund af kondens.
- Indstille O2, CO2og temperaturen til de ønskede eksperimentelle betingelser ved hjælp af kontrolpanelet på forsiden af bioluminescens inkubator.
Bemærk: Hvis udfører perfused cellekultur fortsætte direkte til afsnit 5 for på nuværende tidspunkt. - Fjerne celler fra vævskultur inkubator og aspirat fra medierne. Erstatte medierne med pre varmede arbejder bestand.
- Hvis bioluminescens rugemaskine er ikke at blive fugtet under eksperimentet, derefter forsegle retter og plader med en gas-vandtætte forsegling.
Bemærk: Befugtning er opnået ved at fylde bakken vand i bunden af varmeskabet.
- Klik på "køb | Erhvervelse Setup".
- Indstil i panelet 'Kamera Setup': 'Erhvervelse mode' til 'Kinetiske'; Eksponeringstiden til ønskede eksponeringstid, i sekunder (se note nedenfor); 'Ophobninger' til 1; Kinetic serie længde til antal erhvervelse cyklusser ønskes; Kinetic cyklustid til ønskede imaging interval (sikre at dette er større end eksponeringstiden); Skift hastighed til 4,33 µsecs; 'Få' til 1; og 'EM gain "til det ønskede niveau (se note nedenfor)
- Angiv filtypen .sif eller .tif i panelet 'Autosave'. Angive et filnavn og eventuelt besparelse placering.
- I panelet "Spooling" angive filtypen til tiff. Angive et filnavn og eventuelt besparelse placering. Luk vinduet erhvervelse setup.
Bemærk: Som bioluminescens inkubator kan bruges til en lang række forskellige celle og vævstyper, som alle vil have forskellige niveauer af bioluminescens, eksponeringstid at indsamle en passende en bioluminescerende signal vil variere mellem eksperimenter. Det er også muligt at variere den elektron-multiplikation (EM) gevinst af imaging for at øge størrelsen af det signal, der opsamlet. For nye anvendelser af ukendt lysstyrke foreslår vi først, at tage et enkelt billede med en forholdsvis kort eksponeringstid (ca 10 min) uden EM gevinst og efterfølgende justering af både eksponeringstid og EM få indtil de ønskede optagelse betingelser har været nået. I de fleste tilfælde er en gennemsnitlig signal på 10-20% af den maksimale mulige pixel intensitet for kameraet en god plan at tilstræbe. Når et passende sæt af optagelse parametre er nået, starte langsgående erhvervelse af billeder, som beskrevet ovenfor.
5. perfunderet vævskultur (valgfri)
Bemærk: Som beskrevet i indledningen, bioluminescens inkubator er egnet til billeddannelse af ikke-standard betalingsnumre vævskultur systemer. Dette er eksemplificeret i udviklingen af et system for perfunderet cellekultur.
- Frø celler på enkelt kanal dias med Luer stik med en kanal dybde 0,6 og 0,8 mm, i DMEM med 10% FBS og pen/strep, som beskrevet i afsnit 1. Gøre perfusion medier som beskrevet i trin 3.2.
- Før optagelse, forberede slanger for den krævede perfusion system ved hjælp af 1 mm indre diameter (I.D.) ETFE slanger og 1 mm I.D. silikoneslanger, albue, mandlige og kvindelige Luer fittings, som vist i figur 2A.
Bemærk: Fleste af længden af slangen er ETFE slangen, med 2 cm sektioner af silikoneslanger, der anvendes til at forbinde ETFE slangen til Luer fittings, som efterfølgende linker i kanal lysbilleder. - Sterilisere slangen ved gennemskylning med 70% ethanol, efterfulgt af steril PBS.
- Fjerne cellekulturer i kanal dias fra rugemaskinen. Opsug mediet og erstatte med pre varmede perfusion medier.
- Fylde en 20 mL sprøjte med pre varmede perfusion medier.
- Tilslut slangen til bufferen slide (Se figur 2), men ikke til den celle, der indeholder dias, og skyl slanger og dias med perfusion media (3-5 mL).
- Tilslut den celle, der indeholder dias og skylle hele systemet med en yderligere 1 mL af medier til at fjerne eventuelle luftbobler.
- Overføre hele systemet til bioluminescens inkubator.
- Fit media-fyldte injektionssprøjter til sprøjten pumpe uden at afbryde forbindelsen fra slangen og skylle en yderligere 1 mL af medier gennem hele systemet ved hjælp af pumpen til at sikre, at der er ingen luftbobler i systemet.
- Angiv diameter på pumpen til at sprøjte bliver brugt.
Bemærk: For 20 mL sprøjter anvendes her, diameteren er 19.13 mm. - Indstille strømningshastighed af en pumpe til 50 µL/h og starte det kører.
- Sikre, at der er ingen bobler i alle dias eller slanger før starten af optagelsen, som disse vil påvirke luciferase udtryk, når de passerer på tværs af cellen éncellelag. Hvis det er nødvendigt, skylle yderligere medier på tværs af cellerne til at opnå dette.
- Luk bioluminescens inkubator og fortsætte som i trin 4.7 at begynde indspilningen.
6. behandling under optagelse
Bemærk: Nogle gange er det ønskeligt at behandle celler midtvejs gennem en optagelse, er det med farmakologisk eller hormonal agenter. I sådanne tilfælde er det bydende nødvendigt, at cellerne er håndteret med omhu for at forhindre den cellulære svingning fra nulstilling under behandling. Af denne grund er det af særlig betydning at cellerne er opretholdt ved en konstant temperatur, da dette er en stor entraining cue for cellulære døgnrytmen5,6.
- Forberede alle komponenter i behandling forud for at stoppe optagelsen.
- Forberede en kemisk isotermisk pad ved 37 ° C.
- Stopper enheden optagelsen, fjerne retter for at blive behandlet og placere på isotermisk varme pad.
- Behandle kulturerne som kræves og retur til bioluminescens inkubator i samme sted som før.
- Re-starte optagelse.
7. analyse
Bemærk: Bioluminescens inkubator producerer data i form af en række af individuelle billeder.Vi bruger primært Fiji12 til at styre disse billeder og derefter eksportere den gennemsnitlige pixeldata intensitet for hver region af interesse (ROI) for yderligere analyse.
- Åbn billedstak i Fiji og justere lysstyrken og kontrasten ved at klikke på "billede | Justere | Lysstyrke/kontrast"og justere de glidende barer indtil billeder er inden for et passende interval for visning af en bioluminescerende signalet.
- Vælg områder af interesse ved hjælp af ROI manager findes under "Analyze | Værktøjer | ROI Manager".
- Eksport mean signal for det valgte område ved at klikke på "ROI manager | Mere | Multimeasure".
- Kopiere de resulterende data til analyse software.
- Justere manuelt tid base af data til tidsinterval på imaging, (dvs., 15, 30 eller 60 min. mellemrum, beskrevet som 0,25, 0,5 eller 1 h) snarere end det billede nummer leveres af Fiji.
Bemærk: Yderligere analyse kan nu udføres, såsom fastsættelse af tidsrum. For dette bruges følgende ligning til at udføre ikke-lineær regressionsanalyse:
hvor y er signalet, x den tilsvarende tid, m er tendenslinje gradient, c er y-aksen af tendenslinje, Amplitude er højden af toppen af bølgeform over tendenslinje, k er konstanten forfald told eller dæmpning (sådan, at 1 /k er half-life), fase er skift i x af cosinus bølge, og perioden er den tid, det tager for en komplet cyklus at forekomme13. R2 -værdien bruges som en indikator for godhed af fit. Andre analysemetoder er også muligt. De første 24 timer af erhvervelse bør udelukkes fra analyse, da cellulære bioluminesence kan udstille forbigående, ikke-døgnrytmen ændringer i løbet af denne tid. Dette er resultatet af en akut svar til medier ændring.
Representative Results
Denne artikel beskriver en protokol for en bioluminescerende billeddannelse af mammale celler ved hjælp af en ALLIGATOR (bioluminescens inkubator). Denne teknik giver mulighed for fleksibilitet for fysisk installation og ekstracellulære forhold når en bioluminescerende billedsystemer. Metoder til både simple statiske vævskultur (figur 1, supplerende Video 1) og perfunderet cellekultur (figur 2, supplerende Video 2), men mange andre opstillinger kan være afbildet ved hjælp af dette system. Alle data var kvantificeres ved hjælp af de metoder, der beskrives i afsnit 7.
Figur 1A viser et eksempel video af en bioluminescens optagelse fra 6 x 96-brønd plader der indeholder PER2::LUC fibroblaster4. De yderste brønde indeholder ikke celler, som disse ikke var påkrævet til dette eksperiment. Celler har undergået differential temperatur medrivning, hvorved de underkastes enten temperatur cyklus af 12 h, ved 32 ° C efterfulgt af 12 h 37 ° C i 72 h eller converse (12 h, ved 37 ° C efterfulgt af 12 h, ved 32 ° C i 72 timer), før der afholdes på konstant 37 ° C for optagelse. 60 min eksponeringer blev taget hver time. To af disse betingelser er kvantificeret i figur 1B.
Figur 2A viser en skematisk af opsætningen af et system for perfunderet vævskultur. Det består af to kanal dias forbundet med slanger. Medier er drevet på tværs af cellerne af en sprøjten pumpe. Først af disse dias fungerer som en gas-gennemtrængelige boble fælde (buffer dias) og indeholder ingen celler, med andet som indeholder de celler, hvorfra bioluminescens er registreret. Repræsentant optagelse af video fra dette system er vist i figur 2B. 15 min eksponeringer blev taget hver 15 min. Her vedligeholdes celler enten standard perfusion betingelser eller i nærværelse af kasein kinase inhibitor PF670462, som har tidligere vist sig at forlænge døgnrytmen periode og reducere amplitude af ur gen expression rytmer i kulturperler pattedyrceller14. Effekten på PER2::LUC udtryk er vist i figur 2 c (toppanelet) mod celler behandles med den samme koncentration af stof under standard statiske celle kultur forhold vist i figur 2 c (nederste panel), med kvantificering af periode vist i figur 2D. Det fremgår klart af det, at behandling med PF670462 påvirker PER2::LUC udtryk under begge sæt af betingelser. Men mens celler behandles med PF670462 under perfunderet betingelser vis periode forlængelse af ca 3 h (3 ±0.9 h), celler under statiske forhold behandlet med stoffet viser betydeligt større periode forlængelse til en periode af > 48 h. Dette kan være egnet af en dæmpet cosinus, som beskrevet i afsnit 7, (ekstra summen af kvadrater F test versus en lige linje, p < 0,0001). Interessant, er omfanget af perioden forlængelse under perfusion meget tættere på som observeret i vivo14.
Figur 1: Data eksempel. (A) eksempel video snapshot af bioluminescens fra udødeliggjort PER2::LUC i 6 x 96 godt plader i bioluminescens inkubator. Brønde til kvantificeres er blevet fremhævet i gult i supplerende Video 1. (B) kvantificering af bioluminescens fra A. To sæt af 3 plader af celler blev indblandede ved hjælp af temperatur cyklusser (12 h, ved 32 ° C, 12 h, ved 37° C), der var anti-phasic til hinanden for at producere overfor faser af PER2 protein udtryk (n = 6, mener ± SEM). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Perfusion med CK1δ hæmmere. (A) skematisk af perfusion system. (B) eksempel video snapshot af en bioluminescens optagelse fra PER2::LUC celler under perfusion. Et eksempelområde bestemmelsesgrænsen er fremhævet med gult. (C) kvantificering af bioluminescens af PER2::LUC fibroblaster under perfusion og under statiske forhold med og uden 3 µM CK1 hæmmer PF670462 (n = 3, mener ± SEM). Bioluminescens er blevet normaliseret til minimum-og maksimumværdierne. (D) analyse af periode (tovejs ANOVA, Holm-Sidak flere sammenligninger test).Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Komponent | Endelig Medium koncentration (μM) | Stock (mg/mL) | For 400 mL NS21 |
| Bovin Albumin | 37 | - | 50 g |
| Katalase | 0,01 | - | 50 mg |
| Glutathion | 3.2 | - | 20 mg |
| Insulin | 0,6 | 10 | 8 mL |
| Superoxiddismutase | 0.077 | - | 50 mg |
| Holo-transferrin | 0.062 | - | 100 mg |
| T3 (triiodo-L-thyronin) | 0.0026 | 2 | 20 ΜL |
| L-carnitin | 12 | - | 40 mg |
| Ethanolamin | 16 | Væske (1 g/ml) | 20 ΜL |
| D (+)-Galactose | 83 | - | 300 mg |
| Putrescine | 183 | - | 322 mg |
| Natrium Selenite | 0.083 | 1 | 280 ΜL |
| Corticosterone | 0.058 | 2 | 0,2 mL |
| Linolsyre | 3.5 | 100 | 0,2 mL |
| Linolensyre | 3.5 | 100 | 0,2 mL |
| Lipoinsyre | 0,2 | 4.7 | 0,2 mL |
| Progesteron | 0.02 | 3.2 | 0,04 mL |
| Retinol acetat | 0,2 | 20 | 0,1 mL |
| Retinol, alle trans | 0,3 | 10 | 0,2 mL |
| D, L-alfa-Tocopherol | 2.3 | 100 | 0. 2 mL |
| D, L-alfa-Tocopherol acetat | 2.1 | 100 | 0,2 mL |
Tabel 1: NS21 forberedelse.
Supplerende Video 1: eksempel video af bioluminescens fra godt plader. Eksempel video snapshot af bioluminescens fra udødeliggjort PER2::LUC i 6 x 96 godt plader i bioluminescens inkubator. Brønde til kvantificeres er fremhævet med gult. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Supplerende Video 2: eksempel video snapshot af en bioluminescens optagelse fra PER2::LUC celler under perfusion. Et eksempelområde bestemmelsesgrænsen er fremhævet med gult. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Discussion
Protokollen beskrevet her er for pattedyr cellekultur, begge perfunderet og statiske betingelser. Dog kan ALLIGATOR let tilpasses til andre modelsystemer. Faktisk, det har allerede vist sig at give en fremragende platform til samtidig overvågning af bevægelse, søvn og perifere gen expression rytmer i Drosophila melanogaster vedligeholdes under konstant mørke15. Det bemærkes også, at afhængigt af programmet, kan være et passende kamera typer end dem, der er nævnt her. Vi forestiller os, at med de passende filtre, en modificeret version af den nuværende opsætning kunne principielt anvendes til fluorescens kvantificering.
De eneste programmer som ALLIGATOR ikke ville være passende er dem som særlig stor rumlig opløsning der kræves, såsom billedbehandling af spatiotemporelle organisation af PER2::LUC udtryk i organotypic skiver af pattedyr suprachiasmatic kernen, eller andre små væv skiver.
ALLIGATOR giver mange eksperimenter skal udføres, som hidtil ikke har været let opnåelige af konventionelle optagelse teknikker. Sammenlignet med nuværende metoder til måling af bioluminescens, giver ALLIGATOR øget fleksibilitet i både typen celle kultur parabol eller dias, der kan anvendes, eksternt medie betingelser, følsomhed og processivity.
Dette er særlig relevant på et tidspunkt, når der er en bevægelse væk fra standard 2D celle kultur modeller mod 3D organoid og flow kultur systemer. Det forventes, at ALLIGATOR vil give en fleksibel metode hvorved bioluminescens kan måles over mange dage og uger under en lang række betingelser.
Disclosures
Ingen interessekonflikter findes.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Cairn forskning for at arbejde sammen med os at udvikle dette system, især Mark Henson, Jeremy Graham og Joao Correia. Vi takker også David Walisisk og Akhilesh Reddy for værdifuld diskussion under konstruktionsfasen, samt Peter Laskey (tidligere af Hamamatsu) for at arrangere lån af en demo kamera og David Wong for hans kritiske input til manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM (1x) + GlutaMAX | Gibco | 31966-021 | |
| Hyclone FetalClone III Serum | GE Healthcare | SH30109.03 | |
| Neurobasal medium | Thermofisher | 21103049 | basal medium |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A4919 | |
| Catalase | Sigma | C40 | |
| Glutathione | Sigma | G6013 | |
| Insulin | Sigma | I1882 | |
| Superoxide Dismutase | Sigma | S5395 | |
| Holo-transferrin | Calbiochem | 616424 | |
| T3 (triiodo-L-thyronine | Sigma | T6397 | |
| L-Carnitine | Sigma | C7518 | |
| Ethanolamine | Sigma | E9508 | |
| D (+)-Galactose | Sigma | G0625 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | |
| Sodium Selenite | Sigma | S9133 | |
| Corticosterone | Sigma | C2505 | |
| Linoleic Acid | Sigma | L1012 | |
| Linolenic Acid | Sigma | L2376 | |
| Lipoic Acid | Sigma | T1395 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Retinol Acetate | Sigma | R7882 | |
| Retinol, all trans | Sigma | 95144 | |
| D,L-alpha-Tocopherol | Sigma | 95240 | |
| D,L-alpha-Tocopherol acetate | Sigma | T3001 | |
| Sodium Bicarbonate Solution | Sigma | S8761-100ML | |
| GlutaMAX (100x) | Gibco | 35050-038 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Galaxy 170R incubator | Eppendorf | CO17301001 | |
| Luciferin | Biosynth | L-8220 | |
| D -(+)-Glucose solution | Sigma | G8644-100ML | |
| DMEM powder | Sigma | D5030 | |
| MOPS | Sigma | PHG0007 | |
| 1 mm I.D. silicone tubing | GE Healthcare | 19-4692-01 | |
| Elbow luer connector | Ibidi | 10802 | |
| Male luer fittings | Ibidi | 10826 | |
| Female luer fittings | Ibidi | 10825 | |
| µ-slide luer I 0.6 | Ibidi | 80196 | |
| BD plastipak 20ml syringe | Becton Dickinson | 300613 | |
| 1mm I.D. ETFE tubing | GE Healthcare | 18-1142-38 | |
| PF670462 | Sigma | SML0795 | |
| B27 Supplement (50x) | ThermoFisher | 17504044 | |
| iXon Ultra EMCCD camera | Andor | iXon 888 | |
| Fiji | ImageJ | N/A | |
| Prism 7.0 | Graphpad Software | N/A | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| Deltaphase Isothermal Pad | Braintree Scientific | 39DP | |
| Heated neutral density filter | Cairn Research | Custom item | |
| Osmomat 030 | Gonotech | Discontinued | |
| 300 mOsmol/kg calibration standard | Gonotech | 30.9.0020 | |
| Measuring vessel | Gonotech | 30.9.0010 | |
| Focusing cylinder | Cairn Research | Custom item | |
| NE-1600 programmable syringe pump | Pump Systems inc. | NE-1600 | |
| Andor Solis Software | Andor | N/A |
References
- Morgan, L. W., Greene, A. V., Bell-Pedersen, D. Circadian and light-induced expression of luciferase in Neurospora crassa. Fungal Genet. and Biol. 38 (3), 327-332 (2003).
- Millar, A. J. A Novel Circadian Phenotype Based on Firefly Luciferase Expression in Transgenic Plants. Plant Cell Online. 4 (9), 1075-1087 (1992).
- Yu, W., Hardin, P. E. Use of Firefly Luciferase Activity Assays to Monitor Circadian Molecular Rhythms In Vivo and In Vitro. Circadian Rhythms: Methods and Protocols. , 465-480 (2007).
- Yoo, S. -H., et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc Natl Acad Sci. 101 (15), 5339-5346 (2004).
- Buhr, D. E., Yoo, S. -H., Takahashi, J. S. Temperature as a universal resetting cue for mammalian circadian oscillators. Science. 330 (6002), 379-385 (2010).
- Brown, S. A., Zumbrunn, G., Fleury-Olela, F., Preitner, N., Schibler, U. Rhythms of mammalian body temperature can sustain peripheral circadian clocks. Current Biology. 12 (18), 1574-1583 (2002).
- Balsalobre, A., et al. Resetting of circadian time in peripheral tissues by glucocorticoid signaling. Science. 289 (5488), 2344-2347 (2000).
- Balsalobre, A., Marcacci, L., Schibler, U. Multiple signaling pathways elicit circadian gene expression in cultured Rat-1 fibroblasts. Curr. Biol. CB. 10 (20), 1291-1294 (2000).
- Hastings, M. H., Reddy, A. B., McMahon, D. G., Maywood, E. S. Analysis of circadian mechanisms in the suprachiasmatic nucleus by transgenesis and biolistic transfection. Methods Enzymol. 393, 579-592 (2005).
- Chen, Y., Stevens, B., Chang, J., Milbrandt, J., Ba Barres,, Hell, J. W. NS21: re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures. J. Neurosci Methods. 171 (2), 239-247 (2008).
- Feeney, K. A., Putker, M., Brancaccio, M., ONeill, J. S. In-depth Characterization of Firefly Luciferase as a Reporter of Circadian Gene Expression in Mammalian Cells. J. Biol. Rhythms. 31 (6), 540-550 (2016).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Hirota, T., Lewis, W. G., Liu, A. C., Lee, J. W., Schultz, P. G., Kay, S. A. A chemical biology approach reveals period shortening of the mammalian circadian clock by specific inhibition of GSK-3beta. Proc Natl Acad Sci. 105 (52), 20746-20751 (2008).
- Meng, Q., Maywood, E. S., Bechtold, D. A., Lu, W., Li, J., Gibbs, J. E. Entrainment of disrupted circadian behavior through inhibition of casein kinase 1 ( CK1 ) enzymes. Proc Natl Acad Sci. 1, 1-6 (2010).
- Khabirova, E., Chen, K. -F., O'Neill, J. S., Crowther, D. C. Flyglow: Single-fly observations of simultaneous molecular and behavioural circadian oscillations in controls and an Alzheimer's model. Sci. Rep. 6, 33759 (2016).
