Summary
לוציפראז מקודדים גנטית הוא עיתונאי לא פולשנית הפופולרי של ביטוי גנים. שימוש לוציפראז האורך אוטומטית הדמיה מקליט גז, טמפרטורה-אופטימיזציה (תנין) מאפשר הקלטה אורכית מתאי זוהרים תחת מגוון רחב של מצבים. הנה אנחנו מראים איך תנין עשוי לשמש בהקשר של מחקר השעון הביולוגי.
Abstract
מבוסס לוציפראז כתבים של ביטוי גנים הסלולר נמצאים בשימוש נרחב עבור שניהם האורך, מבחני מובילים של פעילות ביולוגית. במחקר השעון הביולוגי, לדוגמה, שעון fusions ג'ין עם גחלילית לוציפראז להצמיח מקצבים חזקים ב ביולומינסנציה הסלולר אשר נמשכות ימים רבים. מגבלות טכניות הקשורות האופטיקה צינורות (PMT) או שיטות קונבנציונליות מבוסס מיקרוסקופיה על כימות ביולומינסנציה בדרך כלל דרשו כי תאים ורקמות להישמר בתנאים די הלא-פיזיולוגיים במהלך הקלטה, עם פשרה בין רגישות והתפוקה. כאן, אנחנו מדווחים עידון של שיטות מוקדמת מאפשרת הדמיה ביולומינסנציה לטווח ארוך עם רגישות גבוהה ותפוקת אשר תומכת במגוון רחב של תנאי תרבות, כולל בקרת לחות, והגז משתנה ומקבל את זה רבים שונים תרביות רקמה צלחות ומנות. לוציפראז האורך אוטומטיות זה הדמיה מקליט גז, טמפרטורה-אופטימיזציה (תנין) גם מאפשר התבוננות וריאציות המרחבי בביטוי לוציפראז דרך חד שכבתי תאים או רקמות, אשר לא יכול בקלות להיות שנצפו על ידי מסורתי שיטות. אנחנו מדגישים כמה התנין מספק גמישות ומעמד איתור פעילות לוציפראז בהשוואה שיטות קיימות.
Introduction
השימוש luciferases ככתבים של ביטוי גנים, פעילות החלבון הפך טכניקה פופולרית במחקר הביולוגיה המולקולרית, התאית. זה נכון בשדה היממה, איפה קינטיקה של גחלילית לוציפראז סינתזה, איון קטליטי מותאמים במיוחד גם דיווח על האורך שינויים בביטוי הגנים המתרחשים לאורך המחזור כ 24 שעות היממה h. ככזה, לוציפראז הוא מועסק בתור כתבת היממה על פני מגוון רחב של אורגניזמים, כולל פטריות, צמחים, זבובים יונקים1,2,3,4.
כאשר לכימות ג'ין היממה ביטוי במבחנה, צינור האופטיקה (PMT) משמש בדרך כלל כדי להקליט את האות זוהרים. מדידות מבוסס-PMT מוגבלת גמישות לעומת זאת, בדרך כלל מוגבלת לחור בגודל צלחת או תבשיל שנקבע מראש. . זה גם לא אפשרי לאסוף מידע מרחבי מדגימות פיקוח באמצעות PMT, אשר יכול להוביל לאובדן של מידע כאשר הדמיה דוגמאות המציגות וריאציה המרחבי בביטוי לוציפראז יתר על כן, כפי PMT ואלקטרוניקה המשויך נוטים תקלה כאשר הם נחשפים הסביבה humidified של חממה התרבות תאים סטנדרטית, הקלטה אורכית לוציפראז באמצעות PMTs תמיד מתבצע על חממות שאינם humidified. וכתוצאה מכך תא תרבות מנות חייבים להיות אטומים לאוויר כדי למנוע אובדן לחות על-ידי התאדות, התקשורת תרבות ולכן חייב לאגור עם 3 - חומצה propanesulfonic (N- מורפולינו) (MOPS) או 4-(2-hydroxyethyl)-1- חומצה piperazineethanesulfonic (HEPES), ולא את /bicarbonate2CO אגירה מערכת מתפקדת ויוו ומשמשת באופן שגרתי בתרבות רקמה יונקים.
בשל מגבלות אלו, מדידה של ביולומינסנציה מאת PMTs בדרך כלל ממקמת הגבלות קפדניות על התנאים בהם תאים נשמרים במהלך הניסויים. כדי להתגבר על בעיות אלה, וגם כדי להגדיל את מגוון תנאי הניסוי אפשרי, אנו משתמשים על תקן CO2/N2 170 L תרביות רקמה חממה זה הותאם על ידי הוספת מקורר מים אלקטרון-הכפלת המצלמה תשלום מצמידים מכשיר (EMCCD) עם ערפל נגד אופטיקה ובקרה דיגיטלית של רמות טמפרטורה וגז. זה מכונה אוטומטית האורך לוציפראז הדמיה גז, Temperature-Optimized מקליט, או תנין. התנין מאפשר גמישות מוגברת באופן משמעותי של ביולומנאסן הדמיה, הן עבור תפוקה גבוהה הדמיה של תרביות רקמה סטנדרטי צלחות (עד 6 x 96 - או 384-ובכן פלטות בו זמנית), גם עבור מערכות תרביות רקמה שאינם סטנדרטיים, כזה כתאים perfused גדל microfluidic התקנים. כלי זה מאפשר גם הדמיה להתרחש בתנאים humidified ועם שליטה משתנה הן CO2 לחץ חלקי של2 O וכן טמפרטורה.
להלן הפרוטוקול מתאר שיטה עבור ההקלטה ביולומנאסן בתרבית של תאים ומערכות תרביות רקמה באמצעות תנין (המכונה מעתה 'ביולומינסנציה חממה'). יצוין, עם זאת, כי המערכת תהיה מתאימה כדי ביולומנאסן הדמיה וגם, עם כמה שינויים, פלורסנט הדמיה, במספר מערכות ביולוגיות והקשרים אחרים.
Protocol
1. זריעה, טמפרטורה Entrainment של תאים
הערה: פרוטוקול זה בקפדנות נבדקו באמצעות העכבר הראשי מונצחים fibroblasts לבטא את החלבון פיוז'ן PERIOD2::LUCIFERASE (PER2::LUC)4. התאמות ייתכן שתצטרך להתבצע עבור ניסויים באמצעות שורות תאים אחרים.
- לפני תחילת תרבית תאים, המקום הבא לתוך אמבט מים 37 ° C כדי לחמם: מלוחים PBS (PBS) (pH 7.4), בתוספת מ מ 0.68 חומצה ethylenediaminetetraacetic, pH 7.2 (PBS + EDTA), מדיה התרבות תאים מתאים, למשל, באגירה פוספט בינוני (DMEM ששינה הנשר של Dulbecco) בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS), פניצילין U/mL 100, סטרפטומיצין µg/mL 100 ו 0.25% טריפסין פתרון.
- לדלל טריפסין 1:3 עם פתרון PBS + EDTA מראש ומחוממת וחוזרים לאמבט המים.
- לקחת בקבוקון2 ס מ 125 תאים המבטאים לוציפראז שהם 70-90% confluent. האחות התקשורת. להוסיף 10 מ ל PBS ומחוממת מראש.
- מחוק לגמרי מגניב. להוסיף 2.5 מ ל מראש ומחוממת טריפסין-EDTA וחוזרים את הבקבוקון חממה 37 º C למשך 5 דקות.
- הסר את התאים החממה והצג תחת מיקרוסקופ. ברגע המכריע של תאים יש תלושים מהחלק התחתון של הבקבוק, המשך לשלב הבא. אם רוב התאים יישארו מחוברים בתחתית הבקבוק, להחזיר אותה החממה עד רוב התאים ההשעיה.
- להוסיף נוספת של 7.5 mL תא סטנדרטי תרבות בינוני הבקבוק. באופן אופציונלי, להסיר 1 מ"ל זה למעבר נוסף של תאי, כנדרש.
- לספור את צפיפות התאים הנותרים באמצעות hemocytometer trypan blue. לדלל את התאים עוד יותר, לפי הצורך עבור קו תא זה.
הערה: עבור הניסויים להלן, PERIOD2::LUC fibroblasts היו נזרע בין 6 x 103 תאים/cm2 עונה 1 פרק 104 תאים/cm2 צלחות 96-ובכן, מנות 35 מ מ או שקופיות ערוץ. - תאי הזרע לתוך מנות תרביות רקמה או צלחות שישמש עבור הקלטה.
הערה: השימוש לוחות דו-צדדית, עם תחתית נקי שחור מומלץ כמו זה מאפשר לתרבות הבריאות לפנות לבדיקה לפני הקלטות מתחיל תוך צמצום הפרעות בין הבארות במהלך ההקלטה. היכן ביולומינסנציה רמות מאוד נמוכות, מנות לבן/צלחות אמור לשמש כדי למקסם את גילוי האור, למרות אנא שימו לב: זרחורנות יכול להוביל גדל אות רקע אשר נמשך מספר שעות. - להחזיר את הצלחות החממה ולאפשר monolayers להגיע למפגש 100% (כ- 7 ימים).
הערה: ברגע confluent, שורות תאים אשר מנע מגע יכול להישמר עד שלושה שבועות לפני ניסויים ובלבד התקשורת ירוענן באופן קבוע (כל 5-7 ימים). - ברגע confluent, לסנכרן מקצבים הסלולר באמצעות מחזורי טמפרטורה יישומית (12 h ב 32 ° C, h 12 ב 37 מעלות צלזיוס) למשך תקופה מינימלית של 72 h מייד לפני ניסויים5,6 (באמצעות חממה אופניים מחיישנים, נשלט על-ידי המחשב מחובר החממה דרך יציאה טורית RS-232).
הערה: מספר מחזורי טמפרטורה הנדרש עבור סינכרון של מקצבים הסלולר עשויים להשתנות בין שורות תאים, לכן ייתכן שתצטרך להיות אופטימיזציה עבור שורות תאים אחרים. חריפה גירוי תרופתי באמצעות forskolin או דקסמתזון גם שימש בעבר לסינכרון מקצבים הסלולר7,8.
2. NS21 הכנה
הערה: NS21 היא תוספת ללא סרום לתחזוקת של תרביות תאים עצביים ועוד. . זה זיקוק של תוספת דומה המכונה B27, אשר זמינים מסחרית, יכול לשמש כתחליף סרום במהלך היממה ביולומינסנציה הקלטות9 גם תוספת ניתן להשתמש לסירוגין בתקשורת הקלטה עבור הפרוטוקולים ניסיוני המתוארים להלן. . זה די ריאלי חסכוניות כדי להפוך NS21 ללא צורך במיקור חוץ, כמו צ'ן. et al. 10, ולא כפי שמתואר כאן.
- Equilibrate כל הרכיבים המתוארות בטבלה 1 בטמפרטורת החדר במשך h 1 לפני תחילתו.
- להמיס 50 גרם אלבומין שור בינוני הבזליים 324 mL (למשל, neurobasal) על קרח. מערבבים את התערובת מעט ככל האפשר.
- להוסיף את כל שאר הרכיבים, זע מינימלית לאחר כל רכיב אבל עדיין הבטחת ערבוב יסודי. במטרה לפזר את כל הרכיבים בתוך 90 דקות של מתחיל.
- Aliquot התערובת הסופית, חנות ב-20 ° C עד הנדרש. הימנע מחזורים ההקפאה חוזרות ונשנות-הפשרה.
הערה: התערובת צמיגה יותר מדי כדי לסנן בשלב זה, אך עקר יסוננו כאשר מדולל עם מדיה לפני הוספתו לתאים.
3. הקלטת מדיה הכנה
הערה: יתרון ראשוני של החממה ביולומינסנציה על ציוד אחר להקלטת ביולומינסנציה האורך הוא זה, בזכות היכולת ללחלוח החממה, משתנים הלחצים חלקית של O2 ו- CO2, זה ניתן להשתמש מגוון רחב יותר של תנאים מדיה עבור הקלטה ביולומינסנציה — לרבות תנאים אשר דומות יותר מקרוב את הנישה פיזיולוגיים שנכבשו על ידי תאים שונים סוגי ויוו. להלן נתאר ניסוח של הקלטת מדיה משנת הייסטינגס. et al. 9, השתמשנו באופן שגרתי עם תרבותי fibroblasts, סוגי תאים אחרים. הראשונה היא תרבות אטומה לתנאי (ללא חילוף הגזים), השני הוא עבור תנאים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית, אמור לשמש בתנאים humidified עם 5% CO2.וריאציות רבות אחרות הן ניתן ורצוי, בהתאם יישום מדויק של סוג התא.
- הכנה מדיה באגירה MOPS גלוקוז גבוהות
הערה: במניה פתרון (1 ליטר): אבקת DMEM (8.3 g/L), גלוקוז 5 מ"ג/מ"ל 0.35 מ"ג/מ"ל סודיום ביקרבונט, , M 0.02 נקודות מגבים, מכשירי, פניצילין U/mL 100, 100 סטרפטומיצין µg/mL.- לפזר אבקת DMEM 8.3 g במים הנדסה גנטית 900 מל ב גליל מדידה 1000 מ"ל ומערבבים למשך 30 דקות, עד כל החלקיקים הם התפרקה.
- מוסיפים 50 מ של תמיסת גלוקוז (100 גרם/ליטר), 20 מ של המגבים (1 מ', pH 7.6), 10 מ של 100 x עט/סטרפ פתרון, ומערבבים במשך 10 דקות נוספות.
- הוספת 4.7 מ ל 7.5% סודיום ביקרבונט פתרון ומערבבים במשך 5 דקות נוספות.
- התאם את רמת החומציות של מדיה 7.6 (אם בטמפרטורת החדר) או 7.4 (37 ° C) עם HCl/NaOH.
- מוסיפים מים הנדסה גנטית לייצר נפח סופי של 1,000 מ.
- לחטא על-ידי סינון דרך מסנן מיקרומטר 0.22 החנות ב 4 ° C עד הנדרש.
- לפני ניסויים, תוספת אמצעי אחסון המתאים של פתרון מניות עם סרום 10%, 2 מ מ- alanyl-L-גלוטמין, luciferin 2% NS21, ו- 1 מ מ להכין מלאי עבודה. עוברים את המניה מסנן סטרילי 0.22 מיקרומטר.
- למדוד osmolality של המדיה באמצעות של osmometer.
- הפעל את osmometer.
- כיילו את osmometer, תחילה עם מים הנדסה גנטית. מוסיפים מים µL 50 לחלק התחתון של כלי מדידה. ודא שישנם אין בועות בתוך הנוזל. קליפ הספינה על החללית. לחצו על 'אפס' ולהוריד בקפידה את הזרוע osmometer אל הנקודה הנמוכה ביותר. חכו עד הקריאה יושלם ירוק 'תוצאה' דולקת לפני גיוס בזרוע והסרה של הספינה.
- חזור כדי לכייל את osmometer ל 300 mOsmol/ק ג באמצעות תקן כיול µL 50. הקש 'קאל' לפני שמורידים את הזרוע.
- למדוד את osmolality לדוגמה על-ידי הוספת µL 50 של המדיה בתחתית כלי מדידה ולמדוד כמפורט לעיל. הקש 'לטעום' לפני שמורידים את הזרוע osmometer.
- התאם את osmolality כדי mOsmol 350 באמצעות 5 M NaCl.
- HCO3-באגירה גלוקוז נמוך מדיה (זלוף בינוני) הכנה
הערה: במניה פתרון (1 ליטר): אבקת DMEM (8.3 g/L), 3.7 מ"ג/מ"ל סודיום ביקרבונט, גלוקוז 1 מ"ג/מ"ל, פניצילין U/mL 100, 100 סטרפטומיצין µg/mL.- לפזר אבקת DMEM 8.3 g במים הנדסה גנטית 900 מל ב גליל מדידה 1000 מ"ל ומערבבים למשך 30 דקות, עד כל החלקיקים הם התפרקה.
- מוסיפים 50 מ של תמיסת גלוקוז (100 גרם/ליטר), 10 מ של 100 x עט/סטרפ פתרון ומערבבים במשך 10 דקות נוספות.
- הוספת 49.4 mL 7.5% סודיום ביקרבונט פתרון ומערבבים במשך 5 דקות נוספות.
- התאם את רמת החומציות של מדיה 7.6 (בטמפרטורת החדר) או 7.4 (37 ° C) עם HCl/NaOH.
- מוסיפים מים הנדסה גנטית כדי לתת נפח סופי של 1,000 מ.
- עוברים את הפתרון דרך מסנן סטרילי מיקרומטר 0.22 החנות ב 4 ° C עד השימוש.
- לפני ניסויים, תוספת אמצעי אחסון המתאים של פתרון מניות עם 2% סרום, 2 מ מ- alanyl-L-גלוטמין, 2% NS21 ל- 1 מ מ luciferin כדי להפוך מלאי עבודה. עוברים את המניה מסנן סטרילי 0.22 מיקרומטר.
- למדוד ולהתאים את osmolality כדי mOsmol 350 באמצעות 5 M NaCl, באשר התקשורת באגירה המגבים.
הערה: ריכוז Luciferin צריך להיות נחוש מדעית לכל סוג התא או את הקשר. לקבלת מידע נוסף ראה פיני. et al. ריכוזי 11 סרום ו- NS21 (או B27 אם נעשה שימוש) יכולים להיות מגוונים בהתאם ליישום. עם זאת, אנו ממליצים כי, אלא אם כן נבדק מדעית כדי להראות אחרת, סרום, NS21 (או תוספת ללא סרום חלופי) לשמש, כמו אלה לקדם את הישרדות cell וקובץ מצורף. שורות תאים לא לפנות לעכב. ובכן, זה ייתכן שיהיה צורך להוריד את ריכוז סרום בתקשורת הקלטה כדי למנוע תופעות מבלבלים של התפשטות, אשר מקדמים גם סרום.
4. הקלטה
- לפני תחילת ההקלטות, מקם את מלאי מדיה עבודה המתאים (מתוך שלב 3.1 או 3.2 בהתאם הניסוי) באמבט מים 37 ° C כדי לחמם.
- בעוד התקשורת מתחמם, למקד את המצלמה בחממה ביולומינסנציה.
- לפרק את מסנן מים-אטום, מחוממת דחיסות נייטרלית, מניחים בצד.
- להגדיר את התוכנה כדי להקליט וידאו עם קצב רכישה גבוה. לחץ על "רכישת | רכישת להגדרת". הגדר 'בזמן חשיפה' 0.2 s, זמן מחזור קינטי 0.3 שניות. ודא כי רווח EM כבוי.
- סגור את החלון 'רכישה ההתקנה' ולחץ על הסמל "לקחת וידאו".
- באמצעות התמקדות גליל, סובב את עדשת המצלמה עד פריטים על המדף בגובה שיירשמו הם בבירור בפוקוס וידאו.
- לעצור את הוידאו על-ידי לחיצה על הסמל 'עצור וידאו'.
- בורג למסנן דחיסות נייטרלית מחוממת סמיכה; כך תגרום נזק למצלמה EM-CCD ו/או אדים של המטרה עקב עיבוי.
- מוגדר התנאים ניסיוני הרצוי באמצעות לוח הבקרה של בחלק הקדמי של החממה ביולומינסנציה O2CO2, טמפרטורה.
הערה: אם ביצוע perfused תרבית תאים להמשיך ישירות אל סעיף 5 בשלב זה. - הסר את התאים תרביות רקמה ואז לשאוב את התקשורת. החלף את התקשורת עם מלאי עבודה מראש ומחוממת.
- אם החממה ביולומינסנציה לא כדי להיות humidified במהלך הניסוי, ואז לאטום את מנות וצלחות חותם גז-אטום.
הערה: לחות מושגת על ידי ממלא את המגש מים בבסיס של החממה.
- לחץ על "רכישת | רכישת להגדרת".
- בחלונית ' 'המצלמה הגדרת' ', הגדר: 'רכישת מצב' כדי "קינטית"; 'בזמן חשיפה' כדי הרצוי זמן החשיפה, תוך שניות (ראה הערה להלן); 'הצטברויות' 1; 'אורך סדרת קינטי"מספר מחזורי רכישה הרצוי; 'זמן מחזור קינטי' מרווח ההדמיה הרצויה (להבטיח כי זה גדול יותר זמן חשיפה); 'להעביר מהירות' 4.33 µsecs; 'להרוויח' 1; ולמשפחה לקבל ' אל הרצוי רמה (ראה הערה להלן)
- בחלונית ' 'שמירה אוטומטית' ', הגדר את סוג הקובץ .sif או. tif. לספק שם קובץ, שמירת מיקום מתאים.
- בחלונית ' 'הדפסה ברקע' ', הגדר את סוג הקובץ על tiff. לספק שם קובץ, שמירת מיקום מתאים. סגור את חלון הגדרת רכישה.
הערה: כפי החממה ביולומינסנציה יכול לשמש עבור מספר גדול של תאים שונים, סוגי רקמות, אשר כולם יהיו רמות שונות של ביולומינסנציה, זמן החשיפה הנדרש כדי לאסוף אות ביולומנאסן המתאים משתנה בין ניסויים. אפשרי גם לגוון את הרווח (EM) הכפלת אלקטרונים של הדמיה על מנת להגביר את עוצמת האות שנאספו. עבור יישומים חדשים של הבהירות לא ידוע, אנו מציעים קודם לוקח תמונה אחת עם זמן חשיפה קצרה יחסית (בסביבות 10 דקות) ללא רווח EM והתאמת לאחר מכן בזמן חשיפה והן EM לצבור עד התנאים הקלטה הרצוי להגיע. ברוב המקרים, אות אכזרי של 10-20% של עוצמת פיקסל אפשרי המרבי עבור המצלמה הוא ברמה טובה לכוון. ברגע ערכה המתאימה של פרמטרים ההקלטה הגיעה, להתחיל האורך רכישת תמונות, כמתואר לעיל.
5. perfused תרביות רקמה (אופציונלי)
הערה: כפי שתואר במבוא, החממה ביולומינסנציה מתאים הדמיה של מערכות תרביות רקמה לא סטנדרטית. דוגמה לכך הוא הפיתוח של מערכת עבור תרבית תאים perfused.
- הזרע התאים אל ערוץ אחד שקופיות עם סכינים סטריליים מחברים עם עומק ערוץ של 0.6 או 0.8 מ מ, DMEM עם 10% FBS, עט/דלקת, כמתואר בסעיף 1. להפוך את המדיה זלוף כפי שמתואר בשלב 3.2.
- לפני הקלטה, להכין צינורות למערכת זלוף נדרש שימוש 1 מ"מ קוטר פנימי (ז) אבובים ETFE 1 מ"מ זהות סיליקון אבובים, מרפק, זכר ונקבה סכינים סטריליים ריהוט, כפי שמוצג באיור 2A.
הערה: הרוב המכריע של אורך הצנרת היא ETFE אבובים, עם מקטעי צינורות סיליקון המשמשים להתחברות הצנרת ETFE ואביזרים סכינים סטריליים, אשר לאחר מכן קישור לתוך שקופיות ערוץ 2 ס מ. - לעקר את הצנרת על ידי שטיפה עם 70% אתנול, ואחריו PBS סטרילי.
- הסר את תרביות תאים בשקופיות ערוץ החממה. האחות התקשורת והחלף זלוף מראש ומחוממת מדיה.
- ממלאים מזרק 20 מ"ל התקשורת זלוף ומחוממת מראש.
- חיבור הצנרת למאגר שקופית (ראה איור 2). אבל אל השקופית המכילה תאים, ותורידי על אבובים והחלק עם זלוף מדיה (3-5 מ"ל).
- התחבר השקופית המכילה תאים, ריקון המערכת כולה עם 1 מ ל נוספות של מדיה כדי להסיר את כל בועות האוויר.
- להעביר את המערכת כולה ביולומינסנציה החממה.
- התאם מזרקים מלאים מדיה כדי המזרק משאבה ללא התנתקות מהצנרת ותורידי נוספת של 1 מ"ל התקשורת באמצעות המערכת כולה באמצעות המשאבה על מנת להבטיח שם הם אין בועות אוויר בתוך המערכת.
- הגדר את הקוטר המשאבה לזה של המזרק בשימוש.
הערה: עבור מזרקים 20 מ"ל המשמש כאן, הקוטר הוא 19.13 מ מ. - הגדר את קצב הזרימה של המשאבה µL 50/h ולהתחיל את פעולתו.
- להבטיח כי אין בועות בכל השקופיות או אבובים לפני תחילת הקלטה, כמו אלה ישפיעו לוציפראז ביטוי כאשר הם עוברים על פני חד שכבתי התא. במידת הצורך, ריקון נוסף מדיה על-פני התאים כדי להשיג זאת.
- . סגור את הדלת חממה ביולומינסנציה ולהמשיך כמו שלב 4.7 להתחיל ההקלטה.
6. טיפול במהלך ההקלטה
הערה: לפעמים רצוי להתייחס תאים באמצע הקלטה, שיהיה עם סוכנים תרופתי או הורמונלי. במקרים כאלה, זה הכרחי כי התאים מטופלות בקפידה כדי למנוע את תנודה הסלולר של איפוס במהלך הטיפול. מסיבה זו, זה חשיבות מיוחדת כי התאים נשמרים בטמפרטורה קבועה, כמו זה רמז entraining העיקריים עבור מקצבים השעון הביולוגי הסלולר5,6.
- להכין את כל מרכיבי הטיפול לפני הפסקת הקלטה.
- להכין משטח איזותרמי כימיים ב 37 º C.
- לעצור את מכשיר ההקלטה, להסיר את הכלים כדי להיות מטופלים ומניחים על משטח חום איזותרמי.
- פנקו את התרבויות ככל הנדרש ולחזור החממה ביולומינסנציה באותו מיקום כמו בעבר.
- הפעל מחדש את ההקלטה.
7. ניתוח
הערה: החממה ביולומינסנציה מפיק נתונים בצורה של סדרה של תמונות בודדות.אנחנו בעיקר השתמש פיג'י12 לניהול תמונות אלה ולאחר מכן לייצא את הנתונים עוצמת פיקסל רשע עבור כל אזור-של-ריבית (ROI) לצורך ניתוח נוסף.
- פתח של אוסף התמונות בפיג'י, להתאים את הבהירות והניגודיות על-ידי לחיצה על "תמונה | התאם | בהירות/ניגוד', התאמת פסי הזזה עד תמונות נמצאים במרחק טווח המתאים לצפייה האות זוהרים.
- לבחור תחומי עניין באמצעות מנהל רועי זמין תחת "נתח | כלים | רועי מנהל".
- ייצוא אות רע עבור האזור שנבחר על-ידי לחיצה על "מנהל רועי | יותר | Multimeasure".
- להעתיק את הנתונים המתקבלים ניתוח תוכנה.
- כוונן באופן ידני את בסיס הזמן של נתונים מרווח הזמן של הדמיה, (דהיינו, מרווחי מינימום 15, 30 או 60, מתואר 0.25, 0.5 או 1 h) במקום מספר התמונה מסופק על ידי פיג'י.
הערה: ניתוח נוסף ניתן כעת לבצע, כגון קביעת תקופה. בשביל זה, המשוואה הבאה משמש לביצוע ניתוח רגרסיה ליניארי:
איפה האות y x הזמן המקביל, m הוא מעבר הצבע של קו המגמה, c הוא חיתוך y של קו המגמה, משרעת זה הגובה של פסגת waveform מעל לקו המגמה, k הוא קבוע הדעיכה או שיעור של המתלים (כך 1 /k הוא half-life), שלב המשמרת ב- x של הגל קוסינוס, תקופת הזמן ליטול את הטבלייה במשך מחזור שלם להתרחש13. ערך2 R משמשת כאינדיקציה לאל-של-fit. שיטות ניתוח אחרות הינן גם אפשריות. לא להיות כלולים 24 השעות הראשונות של רכישת ניתוח, כפי bioluminesence הסלולר עשוי להפגין שינויים ארעי, שאינו בחברת בתקופה זו. זו היא תוצאה מתגובה חריפה לשינוי מדיה.
Representative Results
מאמר זה מתאר פרוטוקול עבור ההדמיה ביולומנאסן של בתרבית של תאים באמצעות תנין (ביולומינסנציה חממה). טכניקה זו מאפשרת גמישות התקנה פיזי ותנאי חוץ-תאית כאשר מייצרים אור מערכות הדמיה. שיטות פשוטות תרביות רקמה סטטי (איור 1, 1 וידאו משלימים) וגם תרבית תאים perfused (איור 2, משלים סרטון 2) מתוארים, אך רבים כיוונונים אחרים יכול לדימות באמצעות מערכת זו. כל הנתונים היו לכמת בשיטות המתוארות בסעיף 7.
איור 1A מציג דוגמה וידאו של ביולומינסנציה הקלטה מ- 6 x 96-ובכן צלחות המכיל fibroblasts PER2::LUC4. הבארות החיצוני ביותר אינם מכילים תאים ככל שהיו לא נדרש עבור ניסוי זה. התאים עברו entrainment טמפרטורה דיפרנציאלית, לפיה הם עוברים בכל טמפרטורה מעגל של 12 שעות, ב 32 ° C ואחריו 12 שעות 37 ° C 72 h או היפוכה (h 12, ב 37 ° C ואחריו h 12, 32 מעלות צלזיוס במשך 72 h), לפני מוחזק קבוע-37 ° C עבור הקלטה. 60 דקות חשיפות נלקחו כל שעה. שני תנאים אלה הם לכמת ב איור 1B.
איור 2A מראה סכימטי של ההתקנה של מערכת עבור תרביות רקמה perfused. זה מורכב שתי שקופיות ערוץ מחובר עם אבובים. מדיה מונעת על-פני התאים על ידי מזרק משאבה. הראשון של שקופיות אלה מעשים כמו מלכודת בועות חדיר גז (מאגר שקופיות) ומכיל אין תאים, עם השני המכילות את התאים שמהם ביולומינסנציה נרשם. נציג להקליט וידאו ממערכת זו מוצג באיור 2B. 15 דקות חשיפות נלקחו כל 15 דקות. כאן, תאים נשמרים בתנאים זלוף רגיל או בנוכחות מעכבי קינאז קזאין PF670462, אשר הוכח בעבר להאריך תקופת היממה ולהפחית את משרעת של מקצבים ביטוי גנים השעון בתרבותי תאים בתרבית של14. ההשפעה על הביטוי PER2::LUC מוצג באיור 2C (החלונית העליונה) נגד תאים שטופלו עם ריכוז זהה של סמים בתנאים תרבות תא סטטית תקן שמוצג באיור 2C (פאנל התחתונה), כימות של התקופה באיור איור דו-ממדי. זה ברור מזה כי הטיפול עם PF670462 השפעות PER2::LUC ביטוי תחת שתי קבוצות של תנאים. עם זאת, בעוד תאים שטופלו PF670462 תחת תנאים perfused הצג תקופת הארכה של-3 שעות (3h ±0.9), תאים בתנאים סטטי מטופלים עם התרופה מראים הארכת תקופת מבוטל לתקופה של > 48 שעות. זה יכול להתאים על ידי הקוסינוס לח, כפי שמתואר בסעיף 7, (תוספת-sum-של-ריבועים F בדיקה לעומת קו ישר, p < 0.0001). מעניין, סדר הגודל של הארכת תקופת תחת זלוף הוא הרבה יותר קרוב לזה שנצפה ויוו14.
איור 1: נתוני דוגמה. (א) דוגמה תמונת וידאו של ביולומינסנציה מ מונצחים PER2::LUC ב 6 x 96 טוב צלחות בחממה ביולומינסנציה. בארות כדי ניתן לכמת הודגשו בצהוב 1 וידאו משלימים. (B) כימות ביולומינסנציה מ א שני סטים של צלחות 3 תאים היו entrained באמצעות מחזורי טמפרטורה (12 h, ב- 32 מעלות צלזיוס; 12 h, ב 37 מעלות צלזיוס) היו אנטי-phasic אחד לשני כדי לייצר מול שלבי ביטוי חלבון PER2 (n = 6, כלומר ± SEM). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: זלוף עם מעכבי CK1δ. תיאור סכמטי של מערכת זלוף (A). דוגמה (B) תמונת וידאו של ביולומינסנציה הקלטה מ PER2::LUC תאים תחת זלוף. אזור הדגימה של כימות מסומן בצהוב. (ג) כימות ביולומינסנציה של PER2::LUC fibroblasts תחת זלוף, בתנאים סטטי עם ובלי מיקרומטר 3 CK1 מעכב PF670462 (n = 3, כלומר ± SEM). יש כבר מנורמל ביולומינסנציה ערכי המינימום והמקסימום. (ד) ניתוח של התקופה (ANOVA דו-כיווני, מבחן השוואות מרובות של הולם-Sidak).אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| רכיב | ריכוז סופי בינוני (μM) | מניות (mg/mL) | עבור 400 מ ל NS21 |
| אלבומין שור | 37 | - | 50 גרם |
| קטלאז | 0.01 | - | 50 מ ג |
| גלוטתיון | 3.2 | - | 20 מ ג |
| אינסולין | 0.6 | 10 | 8 מ |
| סופראוקסיד דיסמוטאז | 0.077 | - | 50 מ ג |
| ההולוגרפי-transferrin | 0.062 | - | 100 מ ג |
| T3 (triiodo-L-thyronine) | 0.0026 | 2 | 20 ΜL |
| לקרניטין | 12 | - | 40 מ ג |
| Ethanolamine | 16 | נוזל (1 g/ml) | 20 ΜL |
| D (+)-גלקטוז | 83 | - | 300 מ ג |
| Putrescine | 183 | - | 322 מ ג |
| סודיום סלניט | 0.083 | 1 | 280 ΜL |
| Corticosterone | 0.058 | 2 | 0.2 מ |
| חומצה לינולאית | 3.5 | 100 | 0.2 מ |
| לינולנית | 3.5 | 100 | 0.2 מ |
| חומצה ליפואית | 0.2 | 4.7 | 0.2 מ |
| פרוגסטרון | 0.02 | 3.2 | 0.04 מ |
| אצטט רטינול | 0.2 | 20 | 0.1 מ"ל |
| רטינול, כל טרנס | 0.3 | 10 | 0.2 מ |
| D, L-אלפא-טוקופרול- | 2.3 | 100 | 0. 2 מ |
| D, L-אלפא-טוקופרול אצטט | 2.1 | 100 | 0.2 מ |
טבלה 1: NS21 הכנה.
המשלים 1 וידאו: וידאו דוגמה של ביולומינסנציה של צלחות טוב. דוגמה תמונת וידאו של ביולומינסנציה מ מונצחים PER2::LUC ב 6 x 96 צלחות טוב בחממה ביולומינסנציה. בארות כדי ניתן לכמת מסומנים בצהוב. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
משלים 2 וידאו: דוגמה תמונת וידאו של ביולומינסנציה הקלטה מ PER2::LUC תאים תחת זלוף. אזור הדגימה של כימות מסומן בצהוב. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
Discussion
פרוטוקול המתואר כאן הוא לתרבות בתרבית של תאים, שניהם תחת תנאים perfused וסטטיים. עם זאת, התנין בקלות ניתן להתאים למערכות אחרות מודל. ואכן, כבר הוכח כדי לספק פלטפורמה מצוינת לפיקוח הסימולטניות של גפיים, שינה ומקצבים ביטוי גנים היקפי ב- דרוזופילה melanogaster מתוחזקים תחת חשיכה מתמדת15. הוא גם ציין כי, בהתאם ליישום, סוגי המצלמה חוץ מזה שהוזכרו כאן עשוי להיות מתאים. אנחנו הסתברותיות כי עם המסננים המתאימים, גירסה שונה של הכיוונון הנוכחי יכול המנהל לשמש על ידי קרינה פלואורסצנטית כימות.
היישומים רק עבורם התנין לא הולמת הם אלה אשר רזולוציה מרחבית גבוהה במיוחד נדרש, כגון הדמיה של הארגון ייתכן הביטוי PER2::LUC organotypic פרוסות של מידע יונקים העל-תצלובתי או לפרוסות קטנות רקמות אחרות.
התנין מאפשר ניסויים רבים שיש לבצע, כי עד כה לא היו השגה בקלות על ידי טכניקות הקלטה קונבנציונלי. לעומת שיטות לשקילת ביולומינסנציה, התנין מספק גמישות הן סוג של מאכל התרבות התא או שקופיות שניתן להשתמש בהם, מדיה חיצוני תנאים, רגישות ו processivity.
זה רלוונטי במיוחד בכל פעם כאשר יש מהלך מן תא 2D סטנדרטי מודלים תרבות כלפי מערכות התרבות תלת-ממד של תא צורב וזרימה. ככזה, הוא צפוי כי התנין תספק שיטת וישימה שבאמצעותו ניתן למדוד ביולומינסנציה במשך ימים ושבועות רבים תחת מגוון רחב של מצבים.
Disclosures
אין ניגודי עניינים קיים.
Acknowledgments
ברצוננו להודות Cairn מחקר על העבודה המשותפת אתנו במטרה לפתח מערכת זו, בפרט מארק הנסון, ג'רמי גרהאם, ז'ואו להכיר. אנחנו גם תודה דוד ולשי ו מיכל ירקוני Reddy לדיון חשוב במהלך שלב העיצוב, כמו גם פיטר לסקי (לשעבר של המלונות בהם צפיתי) הסדרת ההלוואה של המצלמה הדגמה דיוויד וונג עבור הקלט הקריטי שלו כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM (1x) + GlutaMAX | Gibco | 31966-021 | |
| Hyclone FetalClone III Serum | GE Healthcare | SH30109.03 | |
| Neurobasal medium | Thermofisher | 21103049 | basal medium |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A4919 | |
| Catalase | Sigma | C40 | |
| Glutathione | Sigma | G6013 | |
| Insulin | Sigma | I1882 | |
| Superoxide Dismutase | Sigma | S5395 | |
| Holo-transferrin | Calbiochem | 616424 | |
| T3 (triiodo-L-thyronine | Sigma | T6397 | |
| L-Carnitine | Sigma | C7518 | |
| Ethanolamine | Sigma | E9508 | |
| D (+)-Galactose | Sigma | G0625 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | |
| Sodium Selenite | Sigma | S9133 | |
| Corticosterone | Sigma | C2505 | |
| Linoleic Acid | Sigma | L1012 | |
| Linolenic Acid | Sigma | L2376 | |
| Lipoic Acid | Sigma | T1395 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Retinol Acetate | Sigma | R7882 | |
| Retinol, all trans | Sigma | 95144 | |
| D,L-alpha-Tocopherol | Sigma | 95240 | |
| D,L-alpha-Tocopherol acetate | Sigma | T3001 | |
| Sodium Bicarbonate Solution | Sigma | S8761-100ML | |
| GlutaMAX (100x) | Gibco | 35050-038 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Galaxy 170R incubator | Eppendorf | CO17301001 | |
| Luciferin | Biosynth | L-8220 | |
| D -(+)-Glucose solution | Sigma | G8644-100ML | |
| DMEM powder | Sigma | D5030 | |
| MOPS | Sigma | PHG0007 | |
| 1 mm I.D. silicone tubing | GE Healthcare | 19-4692-01 | |
| Elbow luer connector | Ibidi | 10802 | |
| Male luer fittings | Ibidi | 10826 | |
| Female luer fittings | Ibidi | 10825 | |
| µ-slide luer I 0.6 | Ibidi | 80196 | |
| BD plastipak 20ml syringe | Becton Dickinson | 300613 | |
| 1mm I.D. ETFE tubing | GE Healthcare | 18-1142-38 | |
| PF670462 | Sigma | SML0795 | |
| B27 Supplement (50x) | ThermoFisher | 17504044 | |
| iXon Ultra EMCCD camera | Andor | iXon 888 | |
| Fiji | ImageJ | N/A | |
| Prism 7.0 | Graphpad Software | N/A | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| Deltaphase Isothermal Pad | Braintree Scientific | 39DP | |
| Heated neutral density filter | Cairn Research | Custom item | |
| Osmomat 030 | Gonotech | Discontinued | |
| 300 mOsmol/kg calibration standard | Gonotech | 30.9.0020 | |
| Measuring vessel | Gonotech | 30.9.0010 | |
| Focusing cylinder | Cairn Research | Custom item | |
| NE-1600 programmable syringe pump | Pump Systems inc. | NE-1600 | |
| Andor Solis Software | Andor | N/A |
References
- Morgan, L. W., Greene, A. V., Bell-Pedersen, D. Circadian and light-induced expression of luciferase in Neurospora crassa. Fungal Genet. and Biol. 38 (3), 327-332 (2003).
- Millar, A. J. A Novel Circadian Phenotype Based on Firefly Luciferase Expression in Transgenic Plants. Plant Cell Online. 4 (9), 1075-1087 (1992).
- Yu, W., Hardin, P. E. Use of Firefly Luciferase Activity Assays to Monitor Circadian Molecular Rhythms In Vivo and In Vitro. Circadian Rhythms: Methods and Protocols. , 465-480 (2007).
- Yoo, S. -H., et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc Natl Acad Sci. 101 (15), 5339-5346 (2004).
- Buhr, D. E., Yoo, S. -H., Takahashi, J. S. Temperature as a universal resetting cue for mammalian circadian oscillators. Science. 330 (6002), 379-385 (2010).
- Brown, S. A., Zumbrunn, G., Fleury-Olela, F., Preitner, N., Schibler, U. Rhythms of mammalian body temperature can sustain peripheral circadian clocks. Current Biology. 12 (18), 1574-1583 (2002).
- Balsalobre, A., et al. Resetting of circadian time in peripheral tissues by glucocorticoid signaling. Science. 289 (5488), 2344-2347 (2000).
- Balsalobre, A., Marcacci, L., Schibler, U. Multiple signaling pathways elicit circadian gene expression in cultured Rat-1 fibroblasts. Curr. Biol. CB. 10 (20), 1291-1294 (2000).
- Hastings, M. H., Reddy, A. B., McMahon, D. G., Maywood, E. S. Analysis of circadian mechanisms in the suprachiasmatic nucleus by transgenesis and biolistic transfection. Methods Enzymol. 393, 579-592 (2005).
- Chen, Y., Stevens, B., Chang, J., Milbrandt, J., Ba Barres,, Hell, J. W. NS21: re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures. J. Neurosci Methods. 171 (2), 239-247 (2008).
- Feeney, K. A., Putker, M., Brancaccio, M., ONeill, J. S. In-depth Characterization of Firefly Luciferase as a Reporter of Circadian Gene Expression in Mammalian Cells. J. Biol. Rhythms. 31 (6), 540-550 (2016).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Hirota, T., Lewis, W. G., Liu, A. C., Lee, J. W., Schultz, P. G., Kay, S. A. A chemical biology approach reveals period shortening of the mammalian circadian clock by specific inhibition of GSK-3beta. Proc Natl Acad Sci. 105 (52), 20746-20751 (2008).
- Meng, Q., Maywood, E. S., Bechtold, D. A., Lu, W., Li, J., Gibbs, J. E. Entrainment of disrupted circadian behavior through inhibition of casein kinase 1 ( CK1 ) enzymes. Proc Natl Acad Sci. 1, 1-6 (2010).
- Khabirova, E., Chen, K. -F., O'Neill, J. S., Crowther, D. C. Flyglow: Single-fly observations of simultaneous molecular and behavioural circadian oscillations in controls and an Alzheimer's model. Sci. Rep. 6, 33759 (2016).
