Summary
لوسيفراس المشفرة وراثيا مراسل غير الغازية شعبية للتعبير الجيني. استخدام لوسيفراس طولية الآلي التصوير مسجل الغاز ودرجة الحرارة الأمثل (التمساح) يتيح تسجيل طولية من الخلايا طرحه تحت طائفة واسعة من الظروف. هنا نعرض كيف يمكن استخدام التمساح في سياق البحوث إيقاعات سيركاديان.
Abstract
على أساس لوسيفراس الصحفيين للتعبير الجيني الخلوية في الاستخدام الواسع النطاق لكلا طولية وفحوصات نقطة النهاية للنشاط البيولوجي. في إيقاعات circadian للبحث، على سبيل المثال، اندماج الجينات على مدار الساعة مع لوسيفراس اليراع تثير إيقاعات قوية في الإضاءة الحيوية الخلوية التي تستمر على مدى عدة أيام. القيود التقنية المرتبطة بأنابيب ضوئي (PMT) أو الأساليب التقليدية المستندة إلى الفحص المجهري لتحديد مقدار الإضاءة الحيوية عادة طالبوا بالإبقاء على الخلايا والأنسجة تحت ظروف غير الفسيولوجية تماما خلال تسجيل، مع الموازنة بين الحساسية والإنتاجية. هنا، نحن تقرير صقل أساليب مسبق يسمح التصوير بالإضاءة الحيوية طويلة الأمد مع حساسية عالية والإنتاجية التي تدعم طائفة واسعة من الظروف الثقافة، بما في ذلك الغاز متغير ومراقبة الرطوبة، وأن يقبل كثير مختلفة لوحات زراعة الأنسجة والاطباق. لوسيفراس طولية الآلي هذا التصوير مسجل الغاز ودرجة الحرارة الأمثل (التمساح) كما يسمح بملاحظة التغيرات المكانية في التعبير لوسيفراس عبر الخلية أحادي الطبقة أو الأنسجة، والتي لا يسهل أن يراعيها التقليدية أساليب. نسلط الضوء على كيفية التمساح يوفر إلى حد كبير زيادة المرونة للكشف عن النشاط لوسيفراس بالمقارنة مع الأساليب القائمة.
Introduction
وقد أصبح استخدام لوسيفيراسيس كالصحفيين للتعبير الجيني ونشاط البروتين تقنية شعبية في بحوث البيولوجيا الجزيئية والخلوية. وهذا صحيح في ميدان الإيقاعية، وبشكل خاص يناسب للإبلاغ عن التغيرات الطولية في التعبير الجيني التي تحدث على مدى دورة الإيقاعية ح حوالي 24 فيها حركية اليراع لوسيفراس التوليف والمنظمة الحفاز. على هذا النحو، لوسيفراس يعمل كمراسل الإيقاعية عبر طائفة واسعة من الكائنات الحية، بما في ذلك الفطريات والنباتات، والذباب، والثدييات1،2،،من34.
عند التحديد الكمي للجينات الإيقاعية التعبير في المختبر، أنبوب ضوئي (PMT) يستخدم عادة لتسجيل إشارة طرحه. القياسات PMT محدودة المرونة ولكن عادة ما تقتصر على حجم لوحة أو صحن سلفا. ليس من الممكن أيضا جمع المعلومات المكانية أي من عينات مراقبة استخدام PMT، الذي يمكن أن يؤدي إلى فقدان المعلومات عند تصوير العينات التي تظهر التباين المكاني في التعبير لوسيفراس. PMT والإلكترونيات المرتبطة بها هي المعرضة لعطل عند التعرض لبيئة حاضنة الثقافة خلية قياسية هوميديفيد، وعلاوة على ذلك، يتم دائماً تنفيذ تسجيل لوسيفراس طولية باستخدام بمتس في حاضنات غير هوميديفيد. ونتيجة لذلك، يجب أن تكون مختومة خلية ثقافة الأطباق الغلق لمنع فقدان الرطوبة من خلال التبخر ووسائط الثقافة يجب ولذلك يجب تخزينها مؤقتاً مع 3-حمض بروبانيسولفونيك (N-morpholino) (والمماسح) أو (2-هيدروكسيثيل)-1-4- حمض بيبيرازينيثانيسولفونيك (هيبيس)، بدلاً من/bicarbonate2شركة التخزين المؤقت للنظام الذي يعمل في فيفو ، وتستخدم بشكل روتيني في زراعة أنسجة الثدييات.
ونتيجة لهذه القيود، أماكن قياس الإضاءة الحيوية التي بمتس عادة فرض قيود مشددة على الشروط التي يتم الاحتفاظ الخلايا أثناء التجارب. للتغلب على هذه المشاكل، وأيضا لزيادة نطاق الظروف التجريبية الممكنة، نحن نستخدم معيار CO2/N2 ل 170 زراعة الأنسجة حاضنة التي تكيفت بإضافة المياه المبردة إلكترون-ضرب كاميرا جهاز اقتران (امككد) مع بصريات المضادة الضباب والتحكم الرقمي لمستويات درجة الحرارة والغاز. هذا وقد أطلق عليها الآلي الغاز التصوير لوسيفراس طولية ومسجل تيمبيراتوريوبتيميزيد، أو التمساح. التمساح يسمح بالمرونة إلى حد كبير زيادة التصوير طرحه، سواء بالنسبة للتصوير الفائق من لوحات قياسية زراعة الأنسجة (ألواح ما يصل إلى 6 س 96-أو 384-جيدا في نفس الوقت) وأيضا لأنظمة زراعة الأنسجة غير قياسي، مثل ك perfused خلايا تزرع في أجهزة موائع جزيئية. كما يسمح هذا الصك للتصوير تحدث تحت ظروف هوميديفيد ومع التحكم المتغير CO2 والضغط الجزئي2 س فضلا عن درجة الحرارة.
البروتوكول أدناه وصف أسلوب لتسجيل طرحه لخلايا الثدييات ونظم زراعة الأنسجة باستخدام التمساح (يشار إليها من الآن فصاعدا 'حاضنة الإضاءة الحيوية'). ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن النظام سيكون مناسبة تماما للتصوير بطرحه، وأيضا، مع بعض التعديل، فلوري التصوير، في عدد من النظم البيولوجية وسياقات أخرى.
Protocol
1-البذر ودرجة الحرارة الرائعة للخلايا
ملاحظة: هذا البروتوكول تم دقة اختبار باستخدام الماوس الأساسي ومخلدة الليفية معربا عن البروتين الانصهار PERIOD2::LUCIFERASE (PER2::LUC)4. قد تحتاج تعديلات لتجارب باستخدام خطوط الخلايا الأخرى.
- قبل البدء في زراعة الخلايا، ضع ما يلي في حمام مائي 37 درجة مئوية الحارة: الفوسفات مخزنة المالحة PBS (PBS) (الرقم الهيدروجيني 7.4)، وتستكمل مع حمض الإيثيلين 0.68 مم، الرقم الهيدروجيني 7.2 (برنامج تلفزيوني + يدتا)، الخلية المناسبة ثقافة وسائل الإعلام، مثلاً، المتوسطة (دميم "تعديل النسر" دولبيكو) وتستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS) 100 يو/مليلتر البنسلين و 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين والحل التربسين 0.25%.
- تمييع التربسين 1:3 مع حرارة قبل برنامج تلفزيوني + يدتا الحل والعودة إلى حمام الماء.
- تأخذ قارورة 125 سم2 للتعبير عن لوسيفراس الخلايا التي هي 70-90% المتلاقية. نضح وسائط الإعلام. إضافة 10 مل المعالجون مسبقاً برنامج تلفزيوني.
- نضح في برنامج تلفزيوني. إضافة 2.5 مل المعالجون مسبقاً التربسين-يدتا والرجوع قارورة حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- إزالة الخلايا من الحاضنة ورأى تحت مجهر. بمجرد فصل غالبية خلايا من القاعدة إلى القمة لقارورة، الاستمرار في الخطوة التالية. إذا كان معظم الخلايا لا تزال تعلق على الجزء السفلي قارورة، إعادته إلى الحاضنة حتى يتم معظم الخلايا في التعليق.
- إضافة مل 7.5 مزيد من مستنبت الخلية القياسية قارورة. بشكل اختياري، قم بإزالة 1 مل هذا لمرور المزيد من الخلايا، كما هو مطلوب.
- حساب كثافة الخلايا المتبقية باستخدام هيموسيتوميتير وتريبان الأزرق. تمييع الخلايا كذلك، حسب الاقتضاء لأن خط الخلية.
ملاحظة: لتجارب أدناه، كانت تبذر الليفية PERIOD2::LUC بين 6 × 103 خلايا/سم2 و 1 × 104 خلايا/سم2 في لوحات 96-جيدا، والاطباق 35 مم، أو الشرائح القناة. - خلايا البذور على أطباق زراعة الأنسجة أو اللوحات التي سيتم استخدامها للتسجيل.
ملاحظة: ينصح باستخدام لوحات الجانب ومسح القاع الأسود كما يسمح هذا الثقافة الصحية تقييم قبل التسجيلات تبدأ حين تقليل التداخل بين الآبار أثناء التسجيل. حيث الإضاءة الحيوية مستويات منخفضة للغاية، الأطباق/لوحات بيضاء ينبغي أن تستخدم إلى أقصى حد ممكن الكشف عن الضوء، على الرغم من أن يرجى ملاحظة فسفورية التي يمكن أن تؤدي إلى زيادة الإشارات الخلفية التي استمرت لعدة ساعات. - العودة اللوحات للحاضنة والسماح مونولاييرس للوصول إلى التقاء 100% (حوالي 7 أيام).
ملاحظة: حالما المتلاقية، خطوط الخلايا التي تمنع الاتصال يمكن الحفاظ عليه لمدة تصل إلى ثلاثة أسابيع قبل التجريب شريطة أن يتم تحديث وسائل الإعلام بانتظام (كل 5-7 أيام). - مجرد المتلاقية، مزامنة إيقاعات الخلوية باستخدام درجة الحرارة التطبيقية دورات (12 ح عند 32 درجة مئوية، ح 12 عند 37 درجة مئوية) للحد ني ح 72 فورا قبل التجريب5،6 (استخدام حاضنة ركوب مبرمجة مسبقاً، يسيطر الكمبيوتر متصل بالحاضنة من خلال منفذ تسلسلي في جمهورية صربسكا-232.)
ملاحظة: عدد دورات درجة الحرارة المطلوبة لمزامنة إيقاعات الخلوية قد تختلف بين خطوط الخلايا وقد ولذلك تحتاج إلى أن يكون الأمثل لخطوط الخلايا الأخرى. التحفيز الدوائي الحاد باستخدام فورسكولين أو الديكساميتازون استخدمت أيضا سابقا لمزامنة الهاتف الخلوي إيقاعات7،8.
2. إعداد NS21
ملاحظة: NS21 تكملة خالية من المصل للحفاظ على الثقافات الخلايا العصبية وغيرها. وهو صقل تكملة مماثلة تعرف باسم B27، وهو متاح تجارياً ويمكن استخدامها كبديل مصل أثناء الإضاءة الحيوية الإيقاعية تسجيلات9. أما الملحق يمكن استخدامها بالتبادل في تسجيل وسائط للبروتوكولات التجريبية المبينة أدناه. أنها مجدية جداً وفعالة من حيث التكلفة لجعل NS21 داخلية، كما هو الحال في تشن et al. 10، وكما هو موضح هنا.
- حجته جميع العناصر المبينة في الجدول 1 في درجة حرارة الغرفة ح 1 قبل بداية.
- حل 50 غ الزلال البقري في متوسطة القاعدية مل 324 (مثلاً، نيوروباسال) على الجليد. يحرك الخليط بأقل قدر ممكن.
- إضافة كافة المكونات الأخرى، إثارة الحد الأدنى بعد كل عنصر ولكن لا يزال ضمان خلط دقيق. وتهدف إلى حل كافة المكونات داخل 90 دقيقة من بدء تشغيل.
- قاسمة الخليط النهائي ومخزن في-20 درجة مئوية حتى المطلوبة. تجنب دورات تجميد أذاب المتكررة.
ملاحظة: الخليط لزج جداً للتصفية في هذه المرحلة، ولكن سوف تكون عقيمة تصفيته عندما تضعف مع وسائل الإعلام قبل إضافتها إلى الخلايا.
3-تسجيل إعداد الوسائط
ملاحظة: ميزة الأولية للحاضنة الإضاءة الحيوية على معدات أخرى لتسجيل الإضاءة الحيوية الطولي، بحكم كونه قادراً على يرطب الحاضنة وتختلف الضغوط الجزئية س2 وأول أكسيد الكربون2، أنه يمكن استخدام مجموعة واسعة من وسائل الإعلام ظروف الإضاءة الحيوية تسجيل — بما في ذلك ظروف أكثر تقريب مكانة الفسيولوجية تشغلها الخلية مختلفة الأنواع في فيفو. فيما يلي يصف لنا وضع تسجيل الوسائط مقتبس من هاستينغز et al. 9، وقد استخدمنا بشكل روتيني مع الليفية مثقف وأنواع الخلايا الأخرى. الأول لظروف الثقافة مختومة (بدون تبادل الغازات)، والثاني للشروط الفيزيولوجية ذات الصلة، وينبغي أن تستخدم تحت ظروف هوميديفيد مع شركة 5%2.العديد من الاختلافات الأخرى من الممكن والمستحسن، اعتماداً على التطبيق الدقيق ونوع الخلية.
- إعداد الوسائط مخزنة والمماسح الجلوكوز عالية
ملاحظة: الأسهم الحل (1 لتر): مسحوق دميم (8.3 غرام/لتر)، 0.35 ملغ/مل جلوكوز 5 ملغ/مل بيكربونات الصوديوم، ، اجتماعات 0.02 م، 100 يو/مليلتر البنسلين، 100 ميكروغرام/مل والستربتوميسين.- حل مسحوق دميم ز 8.3 في 900 مل ماء عالي النقاوة في اسطوانة قياس مل 1,000 ويقلب لمدة 30 دقيقة حتى يتم حل جميع الجزيئات.
- إضافة 50 مل من محلول الجلوكوز (100 غرام/لتر)، 20 مل والمماسح (1 م، ودرجة الحموضة 7.6) 10 مل 100 × الحل القلم/بكتيريا، ويقلب لدقيقة 10 أخرى.
- إضافة مل 4.7 7.5% حل بيكربونات الصوديوم ويقلب لدقيقة أخرى 5.
- قم بضبط درجة الحموضة وسائل الإعلام إلى 7.6 (إذا كان في درجة حرارة الغرفة) أو 7.4 (37 درجة مئوية) مع HCl/هيدروكسيد الصوديوم.
- إضافة الماء عالي النقاوة لإنتاج وحدة تخزين نهائي لمل 1,000.
- تعقيم بالترشيح من خلال 0.22 ميكرومتر التصفية ومخزن في 4 درجات مئوية حتى المطلوبة.
- قبل التجريب، الملحق بحجم الأسهم الحل مع المصل 10 ٪، 2 مم L-alanyl-L-الجلوتامين، لوسيفرين 2% NS21، و 1 مم جعل الأوراق المالية العاملة مناسبة. تمرير هذا المخزون من خلال عامل تصفية عقيمة 0.22 ميكرومتر.
- قياس أوسمولاليتي لوسائل الإعلام باستخدام أوسموميتير.
- قم بتشغيل في أوسموميتير.
- معايرة أوسموميتير، أولاً مع الماء عالي النقاوة. إضافة 50 ميليلتر الماء إلى الجزء السفلي من وعاء قياس. ضمان وجود لا فقاعات في السائل. كليب السفينة خلال التحقيق. اضغط 'صفر' وخفض الذراع أوسموميتير إلى أدنى نقطة لها بعناية. انتظر حتى اكتمال القراءة ويضيء الضوء الأخضر 'النتيجة' قبل رفع الذراع وإزالة السفينة.
- تكرار لمعايرة أوسموميتير إلى 300 كيلوجرام موسمول استخدام 50 ميليلتر المعايرة القياسية. اضغط 'Cal' قبل خفض الذراع.
- قياس osmolality العينة بإضافة 50 ميليلتر من وسائل الإعلام إلى أسفل لقياس السفينة والتدبير كما ذكر أعلاه. اضغط 'نموذج' قبل خفض الذراع أوسموميتير.
- ضبط osmolality إلى 350 موسمول باستخدام كلوريد الصوديوم م 5.
- HCO3-مخزنة الجلوكوز منخفض إعداد الوسائط (نضح المتوسطة)
ملاحظة: الأسهم الحل (1 لتر): مسحوق دميم (8.3 غرام/لتر)، بيكربونات الصوديوم 3.7 مغ/مل، 100 مل/يو البنسلين 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين، الجلوكوز 1 ملغ/مل.- حل مسحوق دميم ز 8.3 في 900 مل ماء عالي النقاوة في اسطوانة قياس مل 1,000 ويقلب لمدة 30 دقيقة حتى يتم حل جميع الجزيئات.
- إضافة 50 مل من محلول الجلوكوز (100 غرام/لتر)، 10 مل حل القلم/بكتيريا x 100 ويقلب لدقيقة 10 أخرى.
- إضافة مل 49.4 7.5% حل بيكربونات الصوديوم ويقلب لدقيقة 5 مزيد.
- قم بضبط درجة الحموضة وسائل الإعلام إلى 7.6 (في درجة حرارة الغرفة) أو 7.4 (37 درجة مئوية) مع HCl/هيدروكسيد الصوديوم.
- إضافة الماء عالي النقاوة لإعطاء وحدة تخزين نهائي لمل 1,000.
- قم بتمرير الحل من خلال 0.22 ميكرومتر تصفية العقيمة ومخزن في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
- قبل التجريب، الملحق بحجم الأسهم الحل مع المصل 2%, 2 مم L-alanyl-L-الجلوتامين، 2% NS21 ولوسيفرين 1 مم جعل أسهم عامل مناسبة. تمرير هذا المخزون من خلال عامل تصفية عقيمة 0.22 ميكرومتر.
- قياس وضبط osmolality إلى 350 موسمول باستخدام كلوريد الصوديوم م 5، أما بالنسبة لوسائل الإعلام والمماسح مخزنة.
ملاحظة: تركيز لوسيفرين ينبغي أن يحدد تجريبيا لكل نوع من الخلايا والسياق. للحصول على مزيد من المعلومات انظر فيني et al. يمكن أن تختلف تركيزات 11 المصل و NS21 (أو B27 إذا استخدمت) اعتماداً على التطبيق. ومع ذلك، ننصح أنه ما لم تختبر تجريبيا لإظهار خلاف ذلك، المصل و NS21 (أو الملحق بديلة خالية من المصل) استخدام، هذه تعزز بقاء الخلية ومرفق. في خطوط الخلايا أن الاتصال لم تمنع جيدا، وقد يكون من الضروري لخفض تركيز المصل في تسجيل وسائط الإعلام لمنع التباس آثار الانتشار الذي يتعزز أيضا عن طريق المصل.
4-التسجيل
- قبل البدء في التسجيل، ضع الأسهم وسائل الإعلام العاملة المناسبة (من الخطوة 3.1 أو 3.2 اعتماداً على التجربة) في حمام مائي 37 درجة مئوية الحارة.
- بينما الاحترار وسائط الإعلام، وهو تركيز الكاميرا في الحاضنة الإضاءة الحيوية.
- فك تصفية المياه كتيمة، حامية محايدة الكثافة وتوضع جانبا.
- تعيين البرنامج لتسجيل فيديو بمعدل اقتناء عالية. انقر فوق "شراء | الحصول على برنامج الإعداد ". تعيين 'وقت التعرض' إلى 0.2 s ومدة دورة الحركية إلى 0.3 ثانية. تأكد من أنه تم إيقاف تشغيل مكسب م.
- قم بإغلاق إطار '"اقتناء الإعداد"' وانقر فوق الرمز "أخذ فيديو".
- استخدام الاسطوانة التركيز، قم بتدوير عدسة الكاميرا حتى البنود على الرف في الارتفاع إلى أن تسجل بوضوح في التركيز في الفيديو.
- إيقاف الفيديو عن طريق النقر فوق رمز 'إيقاف الفيديو'.
- برغي مرشح الكثافة محايدة ساخنة مرة أخرى في الموقف؛ سيؤدي الفشل في القيام بذلك الضرر الكاميرا م-اتفاقية مكافحة التصحر و/أو التعفير للهدف بسبب التكثيف.
- تعيين س2وأول أكسيد الكربون2ودرجة الحرارة الظروف التجريبية المطلوبة باستخدام لوحة التحكم على الجانب الأمامي حاضنة الإضاءة الحيوية.
ملاحظة: إذا كان أداء perfused خلية ثقافة الانتقال مباشرة إلى القسم 5 في هذه المرحلة. - إزالة الخلايا من حاضنة استنبات الأنسجة و aspirate من وسائل الإعلام. استبدال وسائط الإعلام بحرارة قبل العامل المخزون.
- إذا كانت الحاضنة الإضاءة الحيوية لا يكون هوميديفيد أثناء التجربة، ثم ختم بالاطباق ولوحات مع ختم غاز كتيمة.
ملاحظة: يتحقق الترطيب عن طريق ملء علبة المياه في قاعدة الحاضنة.
- انقر فوق "شراء | الحصول على برنامج الإعداد ".
- في لوحة '"إعداد الكاميرا"'، قم بتعيين: 'اكتساب وضع' إلى 'حركية'؛ المطلوب 'وقت التعرض' لزمن التعرض للضوء، في ثوان (راجع الملاحظة أدناه)؛ 'تراكمات' إلى 1؛ 'طول السلسلة الحركية' لعدد من دورات اكتساب المطلوب؛ 'الوقت دورة الحركية' للفاصل الزمني المطلوب للتصوير (ضمان أن هذا أكبر من وقت التعرض)؛ 'سرعة التحول' إلى 4.33 µsecs؛ 'كسب' إلى 1؛ و 'م الحصول على' أن المطلوب من المستوى (انظر الملاحظة أدناه)
- في لوحة 'حفظ تلقائي'، تعيين نوع الملف.sif أو.tif. توفير اسم ملف والمناسبة حفظ الموقع.
- في لوحة 'التخزين المؤقت'، قم بتعيين نوع الملف tiff. توفير اسم ملف والمناسبة حفظ الموقع. قم بإغلاق إطار الإعداد اقتناء.
ملاحظة: كما يمكن استخدام حاضنة الإضاءة الحيوية لعدد كبير من الخلايا المختلفة وأنواع الأنسجة، التي سيكون لها مستويات مختلفة من الإضاءة الحيوية، التعرض الوقت المطلوب لجمع إشارة مناسبة طرحه سوف تختلف بين التجارب. من الممكن أيضا تختلف المكسب (م) ضرب إلكترون للتصوير من أجل زيادة حجم الإشارات التي تم جمعها. للحصول على تطبيقات جديدة للسطوع غير معروف، فإننا نقترح أولاً أخذ صورة واحدة مع وقت تعرض قصير نسبيا (حوالي 10 دقائق) دون مكسب م وبعد ذلك ضبط وقت التعرض وم كسب حتى يتم شروط التسجيل المطلوب الذي تم التوصل إليه. وفي معظم الحالات، إشارة يعني من 10-20% كثافة بكسل ممكن الحد الأقصى للكاميرا مستوى جيد بهدف. متى تم التوصل إلى مجموعة مناسبة من معلمات التسجيل، تبدأ طولية اقتناء الصور، كما هو موضح أعلاه.
5-perfused زراعة الأنسجة (اختياري)
ملاحظة: كما ورد في المقدمة، حاضنة الإضاءة الحيوية مناسبة لتصوير أنظمة زراعة الأنسجة غير قياسي. ويتمثل ذلك في تطوير نظام لثقافة الخلية perfused.
- بذور الخلايا على قناة واحدة الشرائح مع موصلات اللوير مع عمق قناة من 0.6 أو 0.8 ملم، في دميم مع 10% FBS والقلم/بكتيريا، كما هو موضح في المقطع 1. جعل الوسائط التروية كما هو موضح في الخطوة 3، 2.
- قبل التسجيل، إعداد أنابيب للنظام نضح المطلوبة باستخدام 1 مم قطر داخلي (معرف) ETFE الأنابيب وأنابيب سيليكون 1 ملم معرف، وتجهيزات اللوير الكوع، من الذكور والإناث، كما هو مبين في الشكل 2 ألف.
ملاحظة: أن غالبية طول الأنابيب من أنابيب ETFE، مع أقسام 2 سم من أنابيب سيليكون يستخدم لتوصيل أنابيب ETFE التركيبات اللوير، الذي ربط في وقت لاحق إلى الشرائح قناة. - تعقيم الأنبوب بالتنظيف مع الإيثانول 70 في المائة، تليها PBS العقيمة.
- إزالة الثقافات الخلية في قناة الشرائح من الحاضنة. نضح وسائط الإعلام واستبدال وسائط نضح المعالجون مسبقاً.
- ملء المحاقن 20 مل مع وسائط الإعلام نضح المعالجون مسبقاً.
- توصيل الأنابيب للمخزن المؤقت الشريحة (انظر الشكل 2) ولكن ليس إلى الشريحة التي تحتوي على الخلايا، وتدفق الأنابيب والشريحة مع نضح وسائط الإعلام (3-5 مل).
- قم بتوصيل الشريحة التي تحتوي على الخلايا ومسح النظام بأكمله مع 1 مل مزيد من وسائل الإعلام لإزالة أي فقاعات الهواء.
- نقل النظام بأكمله للحاضنة الإضاءة الحيوية.
- لا تناسب المحاقن مليئة بوسائل الإعلام للمحاقن مضخة دون قطع الاتصال من الأنابيب وتدفق مل 1 مزيد من وسائل الإعلام من خلال النظام بأكمله باستخدام المضخة لضمان وجود لا فقاعات الهواء في النظام.
- تعيين القطر على مضخة للمحاقن المستخدمة.
ملاحظة: للحقن 20 مل المستخدمة هنا، القطر 19.13 مم. - تعيين معدل تدفق المضخة إلى 50 ميليلتر/ح وبدء تشغيله.
- التأكد من أن توجد لا فقاعات في أي الشرائح أو الأنابيب قبل بدء التسجيل، كهذه ستؤثر على التعبير لوسيفراس عند مرورها عبر أحادي الطبقة الخلية. مسح إذا لزم الأمر، كذلك وسائل الإعلام عبر الخلايا تحقيق هذا الهدف.
- إغلاق الباب حاضنة الإضاءة الحيوية والاستمرار كما في الخطوة 4، 7 لبدء التسجيل.
6-المعاملة أثناء التسجيل
ملاحظة: في بعض الأحيان من المستصوب لعلاج الخلايا في منتصف الطريق من خلال تسجيل، سواء كان ذلك مع وكلاء الدوائية أو الهرمونية. وفي مثل هذه الحالات، من الضروري أن الخلايا يتم التعامل معها بحذر لمنع التذبذب الخلوية من إعادة تعيين أثناء فترة العلاج. لهذا السبب، أنها ذات أهمية خاصة هي الحفاظ على الخلايا عند درجة حرارة ثابتة، هذا هو رمز انترينينج رئيسية للهاتف الخلوي circadian إيقاعات5،6.
- إعداد كافة مكونات العلاج قبل إيقاف التسجيل.
- إعداد لوحة متحاور كيميائية عند 37 درجة مئوية.
- إيقاف تسجيل الجهاز، إزالة الأطباق لتعامل ومكان على لوحة الحرارة متحاور.
- علاج الثقافات حسب الاقتضاء والعودة إلى الحاضنة الإضاءة الحيوية في نفس الموقع مثل قبل.
- إعادة بدء التسجيل.
7-تحليل
ملاحظة: حاضنة الإضاءة الحيوية تنتج البيانات في شكل سلسلة من الصور الفردية.ونحن أساسا استخدام فيجي12 لإدارة هذه الصور وثم تصدير البيانات كثافة بكسل يعني لكل المنطقة من الفائدة (ROI) لمزيد من التحليل.
- افتح المكدس الصورة في فيجي، وضبط السطوع والتباين بواسطة النقر فوق "الصورة | ضبط | السطوع/"وضبط أشرطة الانزلاق حتى الصور ضمن طائفة مناسبة لعرض إشارة طرحه.
- حدد مجالات الاهتمام باستخدام إدارة عائدات الاستثمار المتاحة في إطار "تحليل | أدوات | إدارة العائد على الاستثمار ".
- إشارة يعني التصدير للمنطقة المحددة بواسطة النقر فوق "إدارة العائد على الاستثمار | أكثر | مولتيميسوري ".
- نسخ البيانات الناتجة في تحليل البرمجيات.
- ضبط قاعدة البيانات إلى الفاصل الزمني للتصوير، (أي، فترات 15 أو 30 أو 60 دقيقة، وصفت 0.25 أو 0.5 أو 1 ح) الوقت يدوياً بدلاً من عدد الصور المقدمة من فيجي.
ملاحظة: مزيد من التحليل يمكن الآن إجراء، مثل تحديد فترة. لذلك، يتم استخدام المعادلة التالية لإجراء تحليل الانحدار غير الخطي:
حيث y هو الإشارة، x الوقت المقابل، m هو تدرج خط الاتجاه، ج هو التقاطع y لخط الاتجاه، السعة هو ارتفاع ذروة الموجي فوق خط الاتجاه، k هو ثابت الانحلال أو نسبة التخميد (مثل أن 1ك هو نصف العمر) وهي مرحلة التحول في العاشر موجه جيب التمام، والفترة من الوقت الذي يستغرقه لدورة كاملة تحدث13. يتم استخدام قيمة2 R كمؤشر للخير لصالح. أساليب التحليل الأخرى أيضا ممكنة. أول 24 ساعة من اقتناء ينبغي أن تستبعد من التحليل، كما قد يحمل بيولومينيسينسي الخلوية عابر، غير الإيقاعية تغييرات خلال هذا الوقت. هذا هو نتيجة لاستجابة حادة لتغيير الوسائط.
Representative Results
توضح هذه المقالة بروتوكول لتصوير طرحه لخلايا الثدييات استخدام التمساح (حاضنة الإضاءة الحيوية). هذا الأسلوب يتيح المرونة للإعداد المادي وظروف خارج الخلية عند طرحه نظم التصوير. يتم وصف طرق زراعة الأنسجة ثابتة بسيطة (الشكل 1، التكميلي فيديو 1) والثقافة perfused الخلية (الشكل 2، التكميلي فيديو 2)، ولكن يمكن تصويرها العديد من الأجهزة الأخرى باستخدام هذا النظام. كانت كمياً كافة البيانات باستخدام الأساليب الموضحة في المادة 7.
يبين الشكل 1A مثال الفيديو للإضاءة الحيوية تسجيل من 6 × 96-جيدا لوحات تحتوي على PER2::LUC الليفية4. الآبار الأبعد لا تحتوي على خلايا كهذه لم تكن مطلوبة من أجل هذه التجربة. مرت الخلايا الرائعة فرق درجة الحرارة، حيث أنها تمر بدوره ح 12، عند 32 درجة مئوية تليها 12 ح 37 درجة مئوية ح 72 أو العكس (12 ح، في 37 درجة مئوية تليها ح 12، عند 32 درجة مئوية ح 72)، أما درجة الحرارة قبل محتجزين في ثابت 37 درجة مئوية لتسجيل. وقد اتخذت التعرض 60 دقيقة كل ساعة. اثنان من هذه الشروط تحدد كمياً في الشكل 1B.
ويبين الشكل 2 ألف تخطيطي لإعداد نظام لزراعة الأنسجة perfused. وهذا يتكون من شريحتين قناة متصلة بالأنابيب. وسائل الإعلام تحركها عبر الخلايا مضخة الحقن. وأول هذه الشرائح بمثابة فخ فقاعة نفاذية غاز (الشرائح العازلة) ويحتوي على أي من الخلايا، مع الثانية التي تحتوي على الخلايا التي يتم تسجيلها الإضاءة الحيوية. ويبين الشكل 2Bممثل تسجيل الفيديو من هذا النظام. وقد اتخذت التعرض 15 دقيقة كل 15 دقيقة. هنا، يتم الاحتفاظ بالخلايا تحت ظروف نضح القياسية أو حضور الكازين kinase مثبط PF670462، هو ما ثبت سابقا إطالة فترة الإيقاعية، والحد من السعة لإيقاعات التعبير الجيني على مدار الساعة في مثقف 14من خلايا الثدييات. يبين الشكل 2 (اللوحة العلوية) أثر على التعبير PER2::LUC ضد الخلايا تعامل مع نفس تركيز المخدرات تحت ظروف ثقافة الخلية ثابت قياسي هو مبين في الشكل 2 (أسفل اللوحة)، مع التحديد الكمي للفترة ويبين الشكل 2D. هو واضح من هذا أن المعاملة مع PF670462 التأثيرات التعبير PER2::LUC تحت كلتا المجموعتين من الشروط. ومع ذلك، بينما الخلايا تعامل مع PF670462 تحت ظروف perfused إظهار إطالة الفترة من حوالي 3 ح (ح ±0.9 3)، الخلايا في ظروف ثابتة تعامل مع المخدرات إظهار إطالة فترة أكبر بكثير لفترة > ح 48. هذا يمكن أن يكون لائقاً بتمام ثبط كما هو موضح في القسم 7، (مبلغ إضافي من المربعات و اختبار مقابل خط مستقيم، ف < 0.0001). من المثير للاهتمام، حجم إطالة الفترة تحت نضح أقرب بكثير إلى أنه لاحظ في فيفو14.
رقم 1: بيانات المثال. (أ) على سبيل المثال لقطة فيديو للإضاءة الحيوية من PER2::LUC مخلدة في 6 × 96 ألواح جيدا في الحاضنة الإضاءة الحيوية. وقد أبرزت الآبار كمياً باللون الأصفر في التكميلي فيديو 1. (ب) التحديد الكمي للإضاءة الحيوية من ألف كانت العالق مجموعتين من 3 ألواح الخلايا باستخدام دورات درجة الحرارة (12 ح، عند 32 درجة مئوية؛ 12 ح، في 37 درجة مئوية) التي كانت طورية مضادة بعضها البعض لإنتاج مقابل مراحل التعبير البروتين PER2 (n = 6، يعني ± ووزارة شؤون المرأة). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: التروية مع مثبطات CK1δ. (أ) التخطيطي لنظام التروية. (ب) على سبيل المثال لقطة فيديو للإضاءة الحيوية تسجيل من PER2::LUC الخلايا تحت التروية. يتم تمييز منطقة عينة للقياس الكمي باللون الأصفر. (ج) التحديد الكمي للإضاءة الحيوية من PER2::LUC الليفية تحت التروية وفي ظروف ثابتة مع أو بدون 3 ميكرومتر CK1 مثبط PF670462 (n = 3، يعني ± ووزارة شؤون المرأة). وقد تم تطبيع الإضاءة الحيوية إلى قيم الحد الأدنى والحد الأقصى. (د) تحليل للفترة (ANOVA المزدوج، اختبار المقارنات المتعددة هولم-صداق).الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
| المكون | التركيز المتوسط النهائي (ميكرومتر) | الأوراق المالية (mg/mL) | ل NS21 400 مل |
| ألبومين البقري | 37 | - | 50 غ |
| الكاتلاز | 0.01 | - | 50 ملغ |
| الجلوتاثيون | 3.2 | - | 20 ملغ |
| الأنسولين | 0.6 | 10 | 8 مل |
| فائق أكسيد الفاءق | 0.077 | - | 50 ملغ |
| ترانسفيرين هولو | 0.062 | - | 100 ملغ |
| T3 (triiodo-L-ثيرونيني) | 0.0026 | 2 | 20 ميليلتر |
| ل Carnitine | 12 | - | 40 ملغ |
| ايثانولامين | 16 | سائل (1 g/ml) | 20 ميليلتر |
| د (+)-اللبن | 83 | - | 300 ملغ |
| بوتريسسيني | 183 | - | مغ 322 |
| سيلينيت الصوديوم | 0.083 | 1 | ميليلتر 280 |
| القشري | 0.058 | 2 | 0.2 مل |
| حمض اللينوليك | 3.5 | 100 | 0.2 مل |
| حمض لينولينيك | 3.5 | 100 | 0.2 مل |
| حمض ليبويك | 0.2 | 4.7 | 0.2 مل |
| البروجسترون | 0.02 | 3.2 | مل 0.04 |
| خلات الريتينول | 0.2 | 20 | 0.1 مل |
| الريتينول، عبر جميع | 0.3 | 10 | 0.2 مل |
| د، لالفا-توكوفيرول | 2.3 | 100 | 0-2 مل |
| د، لالفا توكوفيرول خلات | 2.1 | 100 | 0.2 مل |
الجدول 1: إعداد NS21.
التكميلية 1 الفيديو: فيديو مثال للإضاءة الحيوية من لوحات جيدا. مثال على لقطة فيديو للإضاءة الحيوية من PER2::LUC مخلدة في لوحات 6 × 96 جيدا في الحاضنة الإضاءة الحيوية. يتم تمييز الآبار كمياً باللون الأصفر. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
التكميلية الفيديو 2: مثال على لقطة فيديو للإضاءة الحيوية تسجيل من PER2::LUC الخلايا تحت التروية. يتم تمييز منطقة عينة للقياس الكمي باللون الأصفر. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Discussion
بروتوكول الموصوفة هنا للثقافة خلية الثدييات، وكلاهما تحت ظروف perfused وثابتة. ومع ذلك، يمكن بسهولة أن التمساح تكييف الأنظمة النموذجية الأخرى. والواقع أن الفعل قد ثبت أن توفر منبرا ممتازا للرصد المتزامن للحركة والنوم وايقاعات تعبير الجينات المحيطية في melanogaster المورفولوجية الإبقاء تحت الظلام المستمر15. من الملاحظ أيضا أن، اعتماداً على التطبيق، أنواع الكاميرا غير تلك المذكورة هنا قد تكون مناسبة. أننا نتصور أن مع عوامل التصفية المناسبة، نسخة معدلة من الإعداد الحالي في رأس مال يمكن للتقدير الكمي الأسفار.
فقط التطبيقات التي التمساح قد لا يكون مناسباً هي تلك التي لا سيما عالية الدقة المكانية المطلوبة، مثل تصوير المنظمة الزمانية المكانية للتعبير PER2::LUC شرائح أورجانوتيبيك من الثدييات نواة suprachiasmatic، أو شرائح النسيج الصغيرة الأخرى.
التمساح تمكن العديد من التجارب التي يمكن القيام بها حتى الآن لم تكن سهولة يمكن تحقيقه بأساليب تسجيل التقليدية. بالمقارنة مع الأساليب الحالية لقياس الإضاءة الحيوية، التمساح يوفر المزيد من المرونة في كل نوع من خلية ثقافة طبق أو الشريحة التي يمكن استخدامها، وظروف وسائل الإعلام الخارجية، وحساسية، و [بروسسيفيتي].
ولهذا أهمية خاصة في وقت عندما يكون هناك الابتعاد عن نماذج ثقافة الخلية 2D القياسية نحو نظم الثقافة أورجانويد وتدفق 3D. على هذا النحو، فمن المتوقع أن التمساح سوف يوفر طريقة التكيف التي يمكن قياس الإضاءة الحيوية على مدى عدة أيام وأسابيع تحت طائفة واسعة من الظروف.
Disclosures
وجود لا تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نود أن نشكر "البحث العلامة" للعمل معنا لتطوير هذا النظام، وبخاصة مارك هانسون، جيريمي غراهام وكورييا جواو. ونشكر أيضا ديفيد ويلش وريدي فيجو لمناقشة قيمة أثناء مرحلة التصميم، فضلا عن بيتر لاسكيي (سابقا من هاماماتسو) لترتيب القرض لعرض الكاميرا وديفيد وونغ له مدخلاً حاسما للمخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM (1x) + GlutaMAX | Gibco | 31966-021 | |
| Hyclone FetalClone III Serum | GE Healthcare | SH30109.03 | |
| Neurobasal medium | Thermofisher | 21103049 | basal medium |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A4919 | |
| Catalase | Sigma | C40 | |
| Glutathione | Sigma | G6013 | |
| Insulin | Sigma | I1882 | |
| Superoxide Dismutase | Sigma | S5395 | |
| Holo-transferrin | Calbiochem | 616424 | |
| T3 (triiodo-L-thyronine | Sigma | T6397 | |
| L-Carnitine | Sigma | C7518 | |
| Ethanolamine | Sigma | E9508 | |
| D (+)-Galactose | Sigma | G0625 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | |
| Sodium Selenite | Sigma | S9133 | |
| Corticosterone | Sigma | C2505 | |
| Linoleic Acid | Sigma | L1012 | |
| Linolenic Acid | Sigma | L2376 | |
| Lipoic Acid | Sigma | T1395 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Retinol Acetate | Sigma | R7882 | |
| Retinol, all trans | Sigma | 95144 | |
| D,L-alpha-Tocopherol | Sigma | 95240 | |
| D,L-alpha-Tocopherol acetate | Sigma | T3001 | |
| Sodium Bicarbonate Solution | Sigma | S8761-100ML | |
| GlutaMAX (100x) | Gibco | 35050-038 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Galaxy 170R incubator | Eppendorf | CO17301001 | |
| Luciferin | Biosynth | L-8220 | |
| D -(+)-Glucose solution | Sigma | G8644-100ML | |
| DMEM powder | Sigma | D5030 | |
| MOPS | Sigma | PHG0007 | |
| 1 mm I.D. silicone tubing | GE Healthcare | 19-4692-01 | |
| Elbow luer connector | Ibidi | 10802 | |
| Male luer fittings | Ibidi | 10826 | |
| Female luer fittings | Ibidi | 10825 | |
| µ-slide luer I 0.6 | Ibidi | 80196 | |
| BD plastipak 20ml syringe | Becton Dickinson | 300613 | |
| 1mm I.D. ETFE tubing | GE Healthcare | 18-1142-38 | |
| PF670462 | Sigma | SML0795 | |
| B27 Supplement (50x) | ThermoFisher | 17504044 | |
| iXon Ultra EMCCD camera | Andor | iXon 888 | |
| Fiji | ImageJ | N/A | |
| Prism 7.0 | Graphpad Software | N/A | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| Deltaphase Isothermal Pad | Braintree Scientific | 39DP | |
| Heated neutral density filter | Cairn Research | Custom item | |
| Osmomat 030 | Gonotech | Discontinued | |
| 300 mOsmol/kg calibration standard | Gonotech | 30.9.0020 | |
| Measuring vessel | Gonotech | 30.9.0010 | |
| Focusing cylinder | Cairn Research | Custom item | |
| NE-1600 programmable syringe pump | Pump Systems inc. | NE-1600 | |
| Andor Solis Software | Andor | N/A |
References
- Morgan, L. W., Greene, A. V., Bell-Pedersen, D. Circadian and light-induced expression of luciferase in Neurospora crassa. Fungal Genet. and Biol. 38 (3), 327-332 (2003).
- Millar, A. J. A Novel Circadian Phenotype Based on Firefly Luciferase Expression in Transgenic Plants. Plant Cell Online. 4 (9), 1075-1087 (1992).
- Yu, W., Hardin, P. E. Use of Firefly Luciferase Activity Assays to Monitor Circadian Molecular Rhythms In Vivo and In Vitro. Circadian Rhythms: Methods and Protocols. , 465-480 (2007).
- Yoo, S. -H., et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc Natl Acad Sci. 101 (15), 5339-5346 (2004).
- Buhr, D. E., Yoo, S. -H., Takahashi, J. S. Temperature as a universal resetting cue for mammalian circadian oscillators. Science. 330 (6002), 379-385 (2010).
- Brown, S. A., Zumbrunn, G., Fleury-Olela, F., Preitner, N., Schibler, U. Rhythms of mammalian body temperature can sustain peripheral circadian clocks. Current Biology. 12 (18), 1574-1583 (2002).
- Balsalobre, A., et al. Resetting of circadian time in peripheral tissues by glucocorticoid signaling. Science. 289 (5488), 2344-2347 (2000).
- Balsalobre, A., Marcacci, L., Schibler, U. Multiple signaling pathways elicit circadian gene expression in cultured Rat-1 fibroblasts. Curr. Biol. CB. 10 (20), 1291-1294 (2000).
- Hastings, M. H., Reddy, A. B., McMahon, D. G., Maywood, E. S. Analysis of circadian mechanisms in the suprachiasmatic nucleus by transgenesis and biolistic transfection. Methods Enzymol. 393, 579-592 (2005).
- Chen, Y., Stevens, B., Chang, J., Milbrandt, J., Ba Barres,, Hell, J. W. NS21: re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures. J. Neurosci Methods. 171 (2), 239-247 (2008).
- Feeney, K. A., Putker, M., Brancaccio, M., ONeill, J. S. In-depth Characterization of Firefly Luciferase as a Reporter of Circadian Gene Expression in Mammalian Cells. J. Biol. Rhythms. 31 (6), 540-550 (2016).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Hirota, T., Lewis, W. G., Liu, A. C., Lee, J. W., Schultz, P. G., Kay, S. A. A chemical biology approach reveals period shortening of the mammalian circadian clock by specific inhibition of GSK-3beta. Proc Natl Acad Sci. 105 (52), 20746-20751 (2008).
- Meng, Q., Maywood, E. S., Bechtold, D. A., Lu, W., Li, J., Gibbs, J. E. Entrainment of disrupted circadian behavior through inhibition of casein kinase 1 ( CK1 ) enzymes. Proc Natl Acad Sci. 1, 1-6 (2010).
- Khabirova, E., Chen, K. -F., O'Neill, J. S., Crowther, D. C. Flyglow: Single-fly observations of simultaneous molecular and behavioural circadian oscillations in controls and an Alzheimer's model. Sci. Rep. 6, 33759 (2016).
