Summary
Genetisch gecodeerde luciferase is een populaire niet-invasieve verslaggever van genexpressie. Gebruik van een geautomatiseerde longitudinale luciferase imaging gas - en temperatuur-geoptimaliseerde recorder (ALLIGATOR) staat longitudinale opname van bioluminescente cellen onder een brede waaier van voorwaarden stelt. Hier laten we zien hoe ALLIGATOR kan worden gebruikt in het kader van circadiane ritmen onderzoek.
Abstract
Luciferase gebaseerde verslaggevers van cellulaire genexpressie zijn op grote schaal gebruikt voor zowel longitudinale en eindpunt testen van biologische activiteit. In de circadiane ritmen onderzoek, bijvoorbeeld geven klok gen fusies met firefly luciferase aanleiding tot robuuste ritmes in cellulaire bioluminescentie die vele dagen aanhouden. Technische beperkingen die verband houden met fotomultiplicator buizen (PMT) of conventionele microscopie gebaseerde methoden voor bioluminescentie kwantificering meestal hebben geëist dat cellen en weefsels worden gehandhaafd onder heel niet-fysiologische omstandigheden tijdens opname, met een trade-off tussen de gevoeligheid en de doorvoer. Hier, rapporteren we een verfijning van de voorafgaande methoden waarmee op lange termijn bioluminescentie imaging met hoge gevoeligheid en doorvoer die steunt een breed scala aan cultuur voorwaarden, met inbegrip van variabele gas en controle van de vochtigheid, en accepteert dat veel verschillende Weefselkweek platen en gerechten. Deze geautomatiseerde longitudinale luciferase imaging gas - en temperatuur-geoptimaliseerde recorder (ALLIGATOR) ook kunt de observatie van ruimtelijke variaties in luciferase expressie in een cel enkelgelaagde of weefsel, dat niet gemakkelijk worden waargenomen door traditionele methoden. We benadrukken hoe de ALLIGATOR biedt enorm toegenomen flexibiliteit voor de detectie van luciferase activiteit in vergelijking met bestaande methoden.
Introduction
Het gebruik van luciferases als verslaggevers van genexpressie en eiwit activiteit is uitgegroeid tot een populaire techniek in de moleculaire en cellulaire biologie onderzoek. Dit geldt in het circadiane veld, waar de kinetiek van firefly luciferase synthese en katalytische inactivatie zijn bijzonder geschikt voor het melden van de longitudinale wijzigingen in genexpressie die optreden via de circa 24 h circadiane cyclus. Luciferase is als zodanig werkzaam als een circadiane verslaggever in een breed scala aan organismen, met inbegrip van schimmels, planten, vliegen en zoogdieren1,,2,,3,4.
Wanneer kwantificeren circadiane gen expressie in vitro, wordt een fotomultiplicator (PMT) vaak gebruikt om te registreren de bioluminescente signaal. Bet gebaseerde metingen hebben beperkte flexibiliteit echter meestal beperkt tot een vooraf bepaald formaat bord of schotel. Het is ook niet mogelijk om te verzamelen geen ruimtelijke informatie van monsters gecontroleerd met behulp van een bet, wat tot een verlies van informatie leiden kan wanneer imaging monsters die ruimtelijke variatie in luciferase expressie weergeven. Bovendien, als de bet en de bijbehorende elektronica gevoelig zijn voor storing wanneer blootgesteld aan het bevochtigde milieu van een standaard cel cultuur incubator, met PMTs van de opname van de longitudinale luciferase wordt altijd uitgevoerd in de niet-bevochtigde incubators. Bijgevolg, cel cultuur gerechten moeten worden verzegeld luchtdichte te voorkomen vochtverlies door verdamping en de cultuur-media moet daarom worden gebufferd met 3-(N- morfolino) propanesulfonic zuur (MOPS) of 4-(2-hydroxyethyl) -1- piperazineethanesulfonic zuur (HEPES), in plaats van de CO-2/bicarbonate systeem dat werkt in vivo en routinematig wordt gebruikt in zoogdieren weefselkweek bufferen.
Als gevolg van deze beperkingen legt meting van bioluminescentie door PMTs meestal strenge beperkingen op de voorwaarden waaronder cellen worden gehandhaafd tijdens experimenten. Om deze problemen te overwinnen, en ook te vergroten van het bereik van mogelijke experimentele omstandigheden, we gebruiken een standaard CO2/n2 170 L weefselkweek incubator dat is aangepast door de toevoeging van een water-gekoeld elektron-vermenigvuldigen Charge - coupled apparaat (EMCCD) camera met anti-nevel optica en digitale controle van temperatuur en gas niveaus. Dit is een geautomatiseerde longitudinale Luciferase Imaging Gas en Temperature-Optimized Recorder of ALLIGATOR dubbed. De ALLIGATOR zorgt voor aanzienlijk toegenomen flexibiliteit van bioluminescente imaging, zowel voor high-throughput beeldvorming van standaard weefselkweek platen (tot 6 x 96 - of 384-well platen tegelijk) en ook voor niet-standaard weefselkweek systemen, dergelijke Als geperfundeerd cellen gekweekt in microfluidic apparaten. Dit instrument voorziet ook in imaging moet worden uitgevoerd met variabele controle van zowel CO2 en O2 gedeeltelijke druk als temperatuur en bevochtigde voorwaarden.
Het onderstaande protocol beschrijft een methode voor de bioluminescente opname van zoogdiercellen en weefselkweek systemen met behulp van een ALLIGATOR (voortaan 'bioluminescentie incubator' genoemd). Opgemerkt moet worden, maar dat zou het systeem geschikt aan bioluminescente imaging en ook met enige aanpassing, TL beeldvorming, in een aantal andere biologische systemen en contexten.
Protocol
1. zaaien en temperatuur Entrainment van cellen
Opmerking: Dit protocol is grondig getest met behulp van primaire en vereeuwigd muis fibroblasten uiting geven aan de PERIOD2::LUCIFERASE (PER2::LUC) fusion eiwit4. Aanpassingen mogelijk moet worden voorzien in experimenten met behulp van andere cellijnen.
- Voorafgaand aan het begin van celkweek, plaats het volgende in een waterbad 37 ° C te warm: fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) (pH 7.4), PBS aangevuld met 0.68 mM ethyleendiamminetetra zuur, pH 7,2 (PBS + EDTA), gewenste cel cultuurmedia, b.v. Dulbecco van bewerkt Eagle's Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS), 100 U/mL penicilline en 100 µg/mL streptomycine, 0,25% trypsine oplossing.
- Verdun trypsine 1:3 met voorverwarmde PBS + EDTA-oplossing en terug te keren naar het waterbad.
- Neem een 125 cm2 kolf luciferase-uiten cellen die 70-90 zijn % confluent. De media gecombineerd. Voeg toe 10 mL voorverwarmde PBS.
- De PBS gecombineerd. 2,5 mL voorverwarmde trypsine-EDTA toevoegen en de erlenmeyer terugkeren naar een incubator 37 ° C gedurende 5 minuten.
- Verwijder de cellen uit de incubator en weergave onder een microscoop. Zodra de meerderheid van de cellen hebben losgemaakt van de bodem van de kolf, verder met de volgende stap. Als de meeste cellen gekoppeld aan de onderkant van de kolf blijven, terug naar de incubator totdat de meeste cellen in suspensie zijn.
- Een verdere 7,5 mL van de standaard cel kweekmedium Voeg aan de maatkolf. U kunt desgewenst verwijderen 1 mL van deze voor verdere passage van de cellen, zoals vereist.
- Tellen de dichtheid van de resterende cellen met behulp van een hemocytometer en de trypan blauwe. Verdun de cellen verder, voorzover van toepassing voor die cellijn.
Opmerking: Voor de experimenten hieronder, werden PERIOD2::LUC fibroblasten overgeënt tussen 6 x 103 cellen/cm2 en 1 x 104 cellen/cm2 in 96-wells-platen, 35 mm gerechten of kanaal dia's. - Zaad-cellen op de weefselkweek gerechten of platen die zal worden gebruikt voor de opname.
Opmerking: Gebruik van zwarte dubbelzijdig, duidelijk bodem platen wordt aanbevolen aangezien hierdoor cultuur gezondheid worden beoordeeld voordat de opnamen beginnen terwijl vermindering van de interferentie tussen putten tijdens het opnemen. Waar bioluminescentie niveaus zeer laag zijn, moet witte gerechten/platen worden gebruikt voor het maximaliseren van de detectie van het licht, hoewel alstublieft rekening mee dat fosforescentie tot leiden kan verhoogd achtergrond signaal dat enkele uren of langer aanhoudt. - De platen terug te keren naar de incubator en laat monolayers te bereiken 100% samenvloeiing (ongeveer 7 dagen).
Opmerking: Zodra confluente, cellijnen die een remmende werking contact kunnen worden gehandhaafd voor maximaal drie weken voorafgaand aan experimenten op voorwaarde dat de media wordt regelmatig vernieuwd (elke 5-7 dagen). - Zodra confluente, synchroniseren cellulaire ritmes met behulp van de toegepaste temperatuur cycli (12 h bij 32 ° C, 12 h bij 37 ° C) gedurende ten minste 72 uur vóór experimenten5,6 (met behulp van een voorgeprogrammeerde fietsen incubator, bestuurd door een computer verbonden met de incubator via een seriële poort voor RS-232).
Opmerking: Het aantal cycli van temperatuur vereist voor de synchronisatie van cellulaire ritmes kan variëren tussen cellen lijnen en wellicht daarom worden geoptimaliseerd voor andere cellijnen. Acute farmacologische stimulatie via forskolin of dexamethason heeft ook eerder is gebruikt voor het synchroniseren van cellulaire ritmes7,8.
2. NS21 voorbereiding
Opmerking: NS21 is een serumvrij supplement voor het onderhoud van neuronale en andere celculturen. Het is een verfijning van vergelijkbare bijvoederen B27, die commercieel beschikbaar is en kan worden gebruikt als een vervanging van het serum tijdens circadiane bioluminescentie opnames9genoemd. Beide supplement kan onderling verwisselbaar worden gebruikt in de opnamemedia voor de experimentele protocollen die hieronder worden beschreven. Het is heel haalbaar en kosteneffectief te maken NS21 in-house, zoals Chen et al. in 10, en zoals hier is beschreven.
- Equilibreer alle onderdelen beschreven in tabel 1 bij kamertemperatuur gedurende 1 uur voor aanvang.
- Los 50 g boviene albumine in 324 mL Basaal medium (bijvoorbeeld, neurobasal) op het ijs. Roer het mengsel zo weinig mogelijk.
- Alle andere onderdelen, roeren minimaal na elk onderdeel, maar nog steeds zorgen homogenisatie van het mengsel toe te voegen. Doel te ontbinden van alle componenten binnen 90 min te starten.
- Aliquot het uiteindelijke mengsel en opslag bij-20 ° C totdat vereist. Vermijd het herhaaldelijk bevriezen-ontdooien cycli.
Opmerking: Het mengsel is al te visceus filteren in dit stadium, maar zal worden steriele gefilterd wanneer verdund met media voordat u deze toevoegt aan de cellen.
3. opname Media voorbereiding
Opmerking: Een primaire voordeel van de Bioluminescentie incubator ten opzichte van andere apparatuur voor het opnemen van de longitudinale bioluminescentie is dat, op grond van kunnend humidify de incubator en variëren van de partiële druk van O2 en CO2, het kunt u gebruik maken van een bredere waaier van media voorwaarden voor opname bioluminescentie — met inbegrip van voorwaarden die meer nauw bij benadering de fysiologische niche bezet door andere cel typt in vivo. Hieronder beschrijven wij de formulering van de opnamemedia van Hastings et al. aangepast 9, die we regelmatig met gekweekte fibroblasten en andere celtypes gebruikt hebben. De eerste is voor verzegelde kweekomstandigheden (zonder gasuitwisseling), en de tweede is fysiologisch relevante voorwaarden en bevochtigde omstandigheden met 5% CO2moet worden gebruikt.Veel andere varianten zijn zowel mogelijk en wenselijk is, afhankelijk van de exacte toepassing en celtype.
- Hoge glucose MOPS-gebufferd media voorbereiding
Opmerking: Stockoplossing (1 L): DMEM poeder (8.3 g/L), 0.35 mg/mL natriumbicarbonaat,, 5 mg/mL glucose, 0,02 M WIPES, 100 U/mL penicilline, 100 µg/mL streptomycine.- Los 8.3 g DMEM poeder in 900 mL ultrazuiver water in een maatcylinder van 1000 mL en roer gedurende 30 minuten totdat alle deeltjes zijn opgelost.
- Voeg 50 mL glucose-oplossing (100 g/L), 20 mL MOPS (1 M, pH 7,6) 10 mL voor 100 x pen/strep oplossing, en roer gedurende een verdere 10 min.
- Voeg 4,7 mL 7,5% natriumbicarbonaat oplossing en roer voor een verdere 5 min.
- Breng de pH van de media op 7.6 (als het bij kamertemperatuur) of 7.4 (37 ° C) met HCl/NaOH.
- Ultrazuiver water tot een eindvolume van 1000 mL toevoegen.
- Steriliseren door filtratie door een 0,22 µm filter en bewaren bij 4 ° C totdat vereist.
- Voorafgaand aan experimenten, een aanvulling op een juiste volume van de stockoplossing met 10% serum, 2 mM L-alanyl-L-glutamine, 2% NS21 en 1 mM luciferine om een werkende voorraad. Deze voorraad passeren door een 0,22 µm steriele filter.
- De osmolaliteit van de maatregel van de media met behulp van een osmometer.
- Inschakelen van de osmometer.
- Kalibreren van het osmometer, eerst met ultrazuiver water. Voeg 50 µL water naar de bodem van een meetinstrument vaartuig. Zorg ervoor er geen luchtbellen in de vloeistof. Clip van het schip over de sonde. Druk op 'Nul' en zorgvuldig lager de osmometer arm naar het laagste punt. Wacht tot lezing voltooid is en groene 'resultaat' licht brandt voordat het verhogen van de arm en het verwijderen van het vaartuig.
- Herhaal deze stappen om te kalibreren van het osmometer tot 300 mOsmol/kg met 50 µL ijkstandaard. Druk op 'Cal' vóór het verlagen van de arm.
- Meet de osmolaliteit van het monster door 50 µL van media toe te voegen aan de onderkant van een meetinstrument vaartuig en maatregel zoals hierboven. Druk op 'samplen' vóór het verlagen van de osmometer-arm.
- Pas de osmolaliteit aan 350 mOsmol met 5 M NaCl.
- HCO3-gebufferd lage glucose media (perfusie medium) voorbereiding
Opmerking: Stockoplossing (1 L): DMEM poeder (8.3 g/L), 3.7 mg/mL natriumbicarbonaat, 1 mg/mL glucose, 100 U/mL penicilline, 100 µg/mL streptomycine.- Los 8.3 g DMEM poeder in 900 mL ultrazuiver water in een maatcylinder van 1000 mL en roer gedurende 30 minuten totdat alle deeltjes zijn opgelost.
- Voeg 50 mL glucose oplossing (100 g/L), 10 mL 100 x pen/strep oplossing en roer gedurende een verdere 10 min.
- Voeg 49.4 mL 7,5% natriumbicarbonaat oplossing en roer voor een verdere 5 min.
- Breng de pH van de media op 7.6 (op kamertemperatuur) of 7.4 (37 ° C) met HCl/NaOH.
- Voeg ultrazuiver water geven een eindvolume van 1000 mL.
- Laat de oplossing door een 0,22 µm steriele filter en bewaren bij 4 ° C tot gebruik.
- Voorafgaand aan experimenten, een aanvulling op een juiste volume van de stockoplossing met 2% serum, 2 mM L-alanyl-L-glutamine, 2% NS21 en 1 mM luciferine om een werkende voorraad. Deze voorraad passeren door een 0,22 µm steriele filter.
- Meten en aanpassen van de osmolaliteit aan 350 mOsmol met 5 M NaCl, wat betreft de MOPS-gebufferd media.
Opmerking: Luciferine concentratie moet empirisch bepaald worden voor elk celtype en context. Voor meer informatie zie Feeney et al. 11 serum en NS21 (of B27 als gebruikt) concentraties kunnen gevarieerd worden afhankelijk van de toepassing. Echter raden wij dat, tenzij empirisch getest om aan te geven anders, serum en NS21 (of alternatieve serumvrij supplement) worden gebruikt, zoals deze bevordering van overleving van de cel en bijlage. In cellijnen die Contacteer niet remmen goed, kan het nodig zijn om te lager de serumconcentratie in de opnamemedia ter voorkoming van storende effecten van de proliferatie, die ook wordt bevorderd door serum.
4. opname
- Voorafgaand aan het begin van de opname, plaats u de passende werken media voorraad (uit stap 3.1 of 3.2 afhankelijk van het experiment) in een waterbad 37 ° C te warm.
- Terwijl de media is opwarming van de aarde, richten de camera in de Bioluminescentie incubator.
- Schroef het water-ondoordringbaar, verwarmde neutrale-opaciteitsfilter en zet opzij.
- De software voor het registreren van een video met een hoge acquisitie-tarief instellen Klik op "acquisitie | Overname Setup". 'Belichtingstijd' instelt op 0,2 s en kinetische cyclustijd naar 0,3 seconden. Zorg ervoor dat EM winst is uitgeschakeld.
- Sluit het venster 'Overname-instellingen' en klik op het pictogram "take video".
- Met behulp van de focus cilinder, draai de cameralens totdat items op de plank op de hoogte worden geregistreerd duidelijk in beeld in de video zijn.
- De video stoppen door te klikken op het pictogram 'stop video'.
- Schroef de verwarmde neutrale-opaciteitsfilter terug op zijn plaats; niet te doen zal resulteren in schade aan de EM-CCD-camera en/of vernevelen van de doelstelling als gevolg van condensatie.
- O2, CO2en temperatuur instellen door de gewenste experimentele omstandigheden via het bedieningspaneel aan de voorzijde van de Bioluminescentie incubator.
Opmerking: Als het uitvoeren van perfused celkweek gaan rechtstreeks naar de sectie 5 in dit stadium. - De cellen uit de weefselkweek incubator en aspirate uit de media verwijderen. Vervang de media met voorverwarmde werken voorraad.
- Als de Bioluminescentie incubator is niet te worden bevochtigde tijdens het experiment, dan zegel de gerechten en de platen met een gas-ondoordringbare zegel.
Opmerking: Bevochtiging wordt bereikt door het invullen van het Dienblad van het water aan de voet van de incubator.
- Klik op "acquisitie | Overname Setup".
- Stel in het deelvenster 'Camera Setup': 'Acquisitie-modus' naar 'Kinetische'; 'Belichtingstijd' te wensen over blootstellingstijd, in seconden (zie hieronder nota); 'Accumulations' naar 1; 'Kinetic serie lengte' aantal overname cycli gewenst; 'Kinetische cyclustijd' naar het gewenste interval op imaging (ervoor zorgen dat dit meer is dan de blootstellingstijd); 'Snelheid 'naar verschuiven 4.33 µsecs; 'Krijgen' tot 1; en 'EM krijgen ' naar het gewenste niveau (zie hieronder nota)
- In het deelvenster 'Autosave' ingesteld u het bestandstype op sif of .tif. Een bestandsnaam opgeven en passende locatie op te slaan.
- Stel in het deelvenster 'Spooling' het bestandstype voor tiff. Een bestandsnaam opgeven en passende locatie op te slaan. Sluit het venster overname-instellingen.
Opmerking: Als de Bioluminescentie incubator kan worden gebruikt voor een groot aantal verschillende cel en weefselsoorten, die allemaal verschillende niveaus van bioluminescentie hebben zullen, de blootstellingstijd die nodig is voor het verzamelen van een passend bioluminescente lichtsignaal zal variëren tussen experimenten. Het is ook mogelijk om te variëren van de elektron-vermenigvuldigen (EM) winst van imaging teneinde de omvang van het signaal verzameld. Voor nieuwe toepassingen van onbekende helderheid raden we eerst een enkele afbeelding met een relatief korte belichtingstijd (ongeveer 10 min) zonder EM winst nemen en vervolgens aan te passen zowel belichtingstijd en EM krijgen totdat de gewenste opname-voorwaarden bereikt. In de meeste gevallen is een gemiddelde signaal van 10-20% van de maximale mogelijke pixel intensiteit voor de camera een goed niveau te streven naar. Zodra een passende set van opnameparameters heeft bereikt, beginnen longitudinale verwerving van beelden, zoals hierboven beschreven.
5. geperfundeerd weefselkweek (optioneel)
Opmerking: Zoals beschreven in de inleiding, de Bioluminescentie incubator is geschikt voor beeldvorming van genormaliseerde weefselkweek systemen. Dit wordt geïllustreerd in de ontwikkeling van een systeem voor geperfundeerd celkweek.
- Zaad de cellen op één kanaal dia's met Luer connectoren met een diepte van het kanaal van 0,6 of 0,8 mm, in DMEM met 10% FBS en pen/strep, zoals beschreven in sectie 1. Maken de perfusie-media zoals beschreven in stap 3.2.
- Voorafgaand aan de opname, het bereiden van buizen voor de vereiste perfusie-systeem met behulp van 1 mm binnendiameter (I.D.) ETFE buis en 1 mm I.D. silicone slangen, elleboog, mannelijke en vrouwelijke Luer hulpstukken daarvoor, zoals weergegeven in figuur 2A.
Opmerking: De meerderheid van de lengte van de slang is ETFE buis, met 2 cm secties van Siliconen slang gebruikt de ETFE-buizen verbinden met de Luer-armaturen, die vervolgens in de kanaal-dia's koppelen. - Het steriliseren van de buis door te spoelen met 70% ethanol, gevolgd door steriel PBS.
- Verwijder de celculturen in kanaal dia's uit de incubator. De media gecombineerd en vervangen met voorverwarmde perfusie media.
- Vul een 20 mL spuit met de voorverwarmde perfusie-media.
- Sluit de slang aan de buffer schuif (Zie Figuur 2) maar niet naar de cel-bevattende dia, en spoel de buizen en dia met perfusie media (3-5 mL).
- Sluit de cel-bevattende dia en spoelen van het hele systeem met nogmaals 1 mL van media om eventuele luchtbellen te verwijderen.
- Het hele systeem naar de Bioluminescentie incubator overbrengen.
- Fit de media gevulde injectiespuiten aan de injectiespuit pompen zonder loskoppelen van de slang en spoel nogmaals 1 mL media via het hele systeem met behulp van de pomp om ervoor te zorgen er zijn geen luchtbellen in het systeem.
- De diameter wordt aangezet door de pomp aan die van de spuit wordt gebruikt.
Opmerking: Voor de 20 mL spuiten hier gebruikt, de diameter is 19.13 mm. - Het debiet van de pomp ingesteld op 50 µL/h en beginnen draaien.
- Ervoor zorgen dat er geen luchtbellen in alle dia's of de buis vóór het begin van de opname, zoals dit invloed op luciferase expressie hebben zal als ze in de cel enkelgelaagde passeren. Indien nodig, spoel verder media over de cellen om dit te bereiken.
- Sluit de Bioluminescentie incubator deur en blijven zoals in stap 4.7 om te beginnen met opnemen.
6. behandeling tijdens het opnemen
Opmerking: Soms is het wenselijk voor de behandeling van de cellen een opname, halverwege het worden met farmacologische en hormonale agenten. In dergelijke gevallen is het noodzakelijk dat de cellen worden behandeld met zorg om te voorkomen dat de cellulaire trilling van het resetten tijdens de behandeling. Om deze reden is het van bijzonder belang dat de cellen worden gehandhaafd op een constante temperatuur, zoals dit een grote entraining cue voor cellulaire circadiane ritmen5,6 is.
- Alle onderdelen van de behandeling voor het stoppen van de opname voor te bereiden.
- Bereiden van een chemische isothermische pad bij 37 ° C.
- Stop de opname apparaat, verwijdert u de gerechten om te worden behandeld en plaats op de isothermische warmte pad.
- Trakteer de culturen als vereist en terug te keren op de Bioluminescentie incubator op dezelfde locatie als vóór.
- Opnieuw beginnen met opnemen.
7. analyse
Opmerking: De Bioluminescentie incubator produceert gegevens in de vorm van een reeks van individuele beelden.We gebruiken voornamelijk Fiji12 voor het beheer van deze beelden en Exporteer gemiddelde intensiteit pixelgegevens voor elke regio-of-interest (ROI) voor verdere analyse.
- Open de afbeeldingsstapel in Fiji en de helderheid en het contrast aanpassen door te klikken op "afbeelding | Aanpassen | Helderheid/Contrast"en de glijdende balken aan te passen totdat beelden binnen een geschikt bereik zijn voor het bekijken van de bioluminescente signaal.
- Selecteer gebieden van belang gebruikend de manager van de ROI beschikbaar onder "Analyze | Tools | ROI-Manager".
- De gemiddelde signaal uitvoer voor het geselecteerde gebied door te klikken op "ROI manager | Meer | Multimeasure".
- De resulterende gegevens kopiëren naar analysesoftware.
- Handmatig aanpassen de basis van de tijd van gegevens aan het tijdsinterval van beeldvorming, (dat wil zeggen, 15, 30 of 60 minuten intervallen, beschreven als 0,25, 0,5 of 1 h) in plaats van de beeldnummer geboden door Fiji.
Opmerking: Nadere analyse kan nu worden uitgevoerd, zoals bepaling van de periode. Hiervoor wordt de volgende vergelijking gebruikt voor het uitvoeren van niet-lineaire regressie-analyse:
waar y is het signaal, x de bijbehorende tijd, m is het verloop van de trendlijn c is het y-snijpunt van de trendlijn, Amplitude is de hoogte van de piek van de golfvorm boven de trendlijn, k is de verval-constante of percentage demping (zodanig dat 1 /k is de halfwaardetijd), fase is de verschuiving in de x van de cosinus Golf en de periode is de tijd die nodig is voor een volledige cyclus13optreden. R2 -waarde wordt gebruikt als een indicator van goedheid-van-fit. Andere analysemethoden zijn ook mogelijk. De eerste 24 h van de overname moet worden uitgesloten van de analyses, cellulaire bioluminesence kan tijdelijk, niet-circadiane veranderingen vertonen gedurende deze tijd. Dit is het resultaat van een acute reactie op media wijzigen.
Representative Results
Dit artikel schetst een protocol voor de bioluminescente beeldvorming van zoogdiercellen met behulp van een ALLIGATOR (bioluminescentie incubator). Deze techniek zorgt voor flexibiliteit van fysieke installatie en extracellulaire voorwaarden wanneer beeldvormende bioluminescente systemen. Methoden voor zowel de eenvoudige statische weefselkweek (Figuur 1, aanvullende Video 1) en de cultuur van de cel geperfundeerd (Figuur 2, aanvullende Video 2) worden beschreven, maar vele andere opstellingen kunnen worden beeld met behulp van dit systeem. Alle gegevens werden gekwantificeerd aan de hand van de methoden die worden beschreven in sectie 7.
Figuur 1A ziet u een voorbeeld van een opname van 6 x 96-wells-platen met PER2::LUC fibroblasten4bioluminescentie video. De buitenste wells bevatten geen cellen zoals deze niet vereist voor dit experiment waren. Cellen hebben ondergaan differentiële temperatuur entrainment, waarbij ze beide temperatuur cyclus van 12 h, op 32 ° C, gevolgd door 12 h 37 ° C gedurende 72 uur of het omgekeerde (12 h, bij 37 ° C, gevolgd door 12 h, op 32 ° C gedurende 72 uur), ondergaan voordat het wordt gehouden bij constante 37 ° C voor opname. 60 min posities werden genomen elk uur. Twee van deze voorwaarden worden gekwantificeerd in figuur 1B.
Figuur 2A toont een schema van de installatie van een systeem voor weefselkweek geperfundeerd. Dit bestaat uit twee kanaal dia's die zijn verbonden met leidingen. Media wordt gedreven over de cellen door een spuitpomp. De eerste van deze dia's fungeert als een permeabele waterventiel gas (buffer dia) en geen cellen, met de tweede bevat met de cellen waaruit de Bioluminescentie is opgenomen. Een vertegenwoordiger van de opname van de video van dit systeem is afgebeeld in figuur 2B. 15 min posities werden genomen om 15 min. Hier, de cellen worden gehandhaafd onder standaard perfusie voorwaarden of in de aanwezigheid van caseïne kinase inhibitor PF670462, die eerder is aangetoond dat het circadiane periode verlengen en verminderen de amplitude van het klok gen expressie ritmes in gekweekte zoogdiercellen14. Het effect op de PER2::LUC expressie wordt weergegeven in figuur 2C (bovenzijde) tegen cellen behandeld met dezelfde concentratie van de drug onder standaard statische cel kweekomstandigheden weergegeven in figuur 2C (onderste paneel), met kwantificering van de periode weergegeven in figuur 2D. Het is duidelijk uit deze dat behandeling met PF670462 PER2::LUC expressie onder beide sets voorwaarden beïnvloedt. Echter, terwijl cellen behandeld met PF670462 onder geperfundeerd voorwaarden Toon periode verlenging van ongeveer 3 h (3 ±0.9-h), cellen in statische toestand behandeld met het geneesmiddel Toon aanzienlijk grotere periode verlengen tot een periode van > 48 h. Dit kan worden passen door een gedempte cosinus, zoals beschreven in sectie 7, (extra som-van-kwadraten F testen ten opzichte van een rechte lijn, p < 0.0001). Interessant is dat is de omvang van de periode verlengen onder perfusie veel dichter bij die in vivo14waargenomen.
Afbeelding 1: voorbeeld van de gegevens. (A) voorbeeld video momentopname van bioluminescentie van vereeuwigd PER2::LUC in 6 x 96 goed in de Bioluminescentie incubator platen. Putten worden gekwantificeerd zijn gemarkeerd in geel in de aanvullende Video 1. (B) kwantificering van bioluminescentie van A. Twee sets van 3 platen van cellen werden entrained met behulp van temperatuur cycli (12 h, op 32 ° C, 12 h, bij 37° C), die anti-phasic aan elkaar waren te produceren tegenover fasen van PER2 eiwit expressie (n = 6, ± SEM te betekenen). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: perfusie met CK1δ remmers. (A) schema van perfusie systeem. (B) voorbeeld video momentopname van een opname uit PER2::LUC bioluminescentie onder perfusie cellen. Een samplegebied van lenen wordt geel gemarkeerd. (C) kwantificering van bioluminescentie van PER2::LUC fibroblasten onder perfusie en in statische toestand met en zonder 3 µM CK1 inhibitor PF670462 (n = 3, ± SEM te betekenen). Bioluminescentie heeft op minimale en maximale waarden zijn genormaliseerd. (D) analyse van periode (Two-way ANOVA, Holm-Sidak van meerdere vergelijkingen test).Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Component | Middellange eindconcentratie (μM) | Voorraad (mg/mL) | Voor 400 mL NS21 |
| Boviene albumine | 37 | - | 50 g |
| Katalase | 0,01 | - | 50 mg |
| Glutathion | 3.2 | - | 20 mg |
| Insuline | 0.6 | 10 | 8 mL |
| Superoxide dismutase | 0.077 | - | 50 mg |
| Holo-transferrine | 0.062 | - | 100 mg |
| T3 (triiodo-L-thyronine) | 0.0026 | 2 | 20 ΜL |
| L-Carnitine | 12 | - | 40 mg |
| Ethanolamine | 16 | Vloeistof (1 g/ml) | 20 ΜL |
| D (+)-Galactose | 83 | - | 300 mg |
| Als putrescine | 183 | - | 322 mg |
| Natriumseleniet | 0.083 | 1 | 280 ΜL |
| Corticosterone | 0.058 | 2 | 0,2 mL |
| Linolzuur | 3.5 | 100 | 0,2 mL |
| Linoleenzuur | 3.5 | 100 | 0,2 mL |
| Liponzuur | 0.2 | 4.7 | 0,2 mL |
| Progesteron | 0.02 | 3.2 | 0,04 mL |
| Retinol acetaat | 0.2 | 20 | 0,1 mL |
| Retinol, alle trans | 0.3 | 10 | 0,2 mL |
| D, L-alpha-Tocopherol | 2.3 | 100 | 0. 2 mL |
| D, L-alpha-tocoferolacetaat | 2.1 | 100 | 0,2 mL |
Tabel 1: NS21 voorbereiding.
Aanvullende Video 1: voorbeeld video van bioluminescentie uit goed platen. In het volgende voorbeeld video momentopname van bioluminescentie van vereeuwigd PER2::LUC in 6 x 96 goed platen in de Bioluminescentie incubator. Putten worden gekwantificeerd worden benadrukt in geel. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende Video 2: voorbeeld video momentopname van een opname uit PER2::LUC bioluminescentie cellen onder perfusie. Een samplegebied van lenen wordt geel gemarkeerd. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
Het protocol hier beschreven is voor zoogdieren celcultuur, beide onder geperfundeerd en statische omstandigheden. De ALLIGATOR kan echter gemakkelijk worden aangepast aan andere modelsystemen. Inderdaad, het is reeds aangetoond vormen een uitstekend platform voor de gelijktijdige bewaking van motoriek, slaap, en perifere gen expressie ritmes in Drosophila melanogaster gehandhaafd onder constante duisternis15. Ook wordt opgemerkt dat, afhankelijk van de toepassing, camera typen dan die hier genoemd kunnen dienstig zijn. Wij willen dat met de juiste filters, een gewijzigde versie van de huidige setup kan in principe worden gebruikt voor fluorescentie kwantificering.
De enige toepassingen waarvoor de ALLIGATOR niet thuishoren in zijn degenen waarvoor met name hoge ruimtelijke resolutie vereist, zoals beeldvorming van Spatio organisatie van PER2::LUC expressie in organotypic plakjes van de zoogdieren is suprachiasmatic nucleus, of andere kleine weefsel segmenten.
De ALLIGATOR maakt het mogelijk vele experimenten worden uitgevoerd die tot nu toe niet gemakkelijk haalbaar door conventionele technieken hebben. Vergeleken met de huidige methoden voor het meten van bioluminescentie, biedt de ALLIGATOR meer flexibiliteit in zowel het type cel cultuur schotel of dia die kan worden gebruikt, de externe media voorwaarden, gevoeligheid en processivity.
Dit is vooral belangrijk op een moment wanneer er een beweging weg van standaard 2D cel cultuur modellen naar 3D organoid en stroom cultuur systemen. Als zodanig, verwacht wordt dat de ALLIGATOR zorgt voor een flexibele methode waarmee bioluminescentie vele dagen en weken onder een brede waaier van voorwaarden kan worden gemeten.
Disclosures
Geen tegenstrijdige belangen bestaan.
Acknowledgments
We zouden graag bedanken Cairn onderzoek voor het werken met ons tot het ontwikkelen van dit systeem, in het bijzonder Mark Henson, Jeremy Graham en Joao Correia. Wij danken ook David Welsh en Akhilesh Reddy voor waardevolle discussie tijdens de ontwerpfase, evenals Peter Laskey (voorheen van Hamamatsu) voor het regelen van de lening van een demo-camera en David Wong voor zijn kritische inbreng in het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM (1x) + GlutaMAX | Gibco | 31966-021 | |
| Hyclone FetalClone III Serum | GE Healthcare | SH30109.03 | |
| Neurobasal medium | Thermofisher | 21103049 | basal medium |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A4919 | |
| Catalase | Sigma | C40 | |
| Glutathione | Sigma | G6013 | |
| Insulin | Sigma | I1882 | |
| Superoxide Dismutase | Sigma | S5395 | |
| Holo-transferrin | Calbiochem | 616424 | |
| T3 (triiodo-L-thyronine | Sigma | T6397 | |
| L-Carnitine | Sigma | C7518 | |
| Ethanolamine | Sigma | E9508 | |
| D (+)-Galactose | Sigma | G0625 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | |
| Sodium Selenite | Sigma | S9133 | |
| Corticosterone | Sigma | C2505 | |
| Linoleic Acid | Sigma | L1012 | |
| Linolenic Acid | Sigma | L2376 | |
| Lipoic Acid | Sigma | T1395 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Retinol Acetate | Sigma | R7882 | |
| Retinol, all trans | Sigma | 95144 | |
| D,L-alpha-Tocopherol | Sigma | 95240 | |
| D,L-alpha-Tocopherol acetate | Sigma | T3001 | |
| Sodium Bicarbonate Solution | Sigma | S8761-100ML | |
| GlutaMAX (100x) | Gibco | 35050-038 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Galaxy 170R incubator | Eppendorf | CO17301001 | |
| Luciferin | Biosynth | L-8220 | |
| D -(+)-Glucose solution | Sigma | G8644-100ML | |
| DMEM powder | Sigma | D5030 | |
| MOPS | Sigma | PHG0007 | |
| 1 mm I.D. silicone tubing | GE Healthcare | 19-4692-01 | |
| Elbow luer connector | Ibidi | 10802 | |
| Male luer fittings | Ibidi | 10826 | |
| Female luer fittings | Ibidi | 10825 | |
| µ-slide luer I 0.6 | Ibidi | 80196 | |
| BD plastipak 20ml syringe | Becton Dickinson | 300613 | |
| 1mm I.D. ETFE tubing | GE Healthcare | 18-1142-38 | |
| PF670462 | Sigma | SML0795 | |
| B27 Supplement (50x) | ThermoFisher | 17504044 | |
| iXon Ultra EMCCD camera | Andor | iXon 888 | |
| Fiji | ImageJ | N/A | |
| Prism 7.0 | Graphpad Software | N/A | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| Deltaphase Isothermal Pad | Braintree Scientific | 39DP | |
| Heated neutral density filter | Cairn Research | Custom item | |
| Osmomat 030 | Gonotech | Discontinued | |
| 300 mOsmol/kg calibration standard | Gonotech | 30.9.0020 | |
| Measuring vessel | Gonotech | 30.9.0010 | |
| Focusing cylinder | Cairn Research | Custom item | |
| NE-1600 programmable syringe pump | Pump Systems inc. | NE-1600 | |
| Andor Solis Software | Andor | N/A |
References
- Morgan, L. W., Greene, A. V., Bell-Pedersen, D. Circadian and light-induced expression of luciferase in Neurospora crassa. Fungal Genet. and Biol. 38 (3), 327-332 (2003).
- Millar, A. J. A Novel Circadian Phenotype Based on Firefly Luciferase Expression in Transgenic Plants. Plant Cell Online. 4 (9), 1075-1087 (1992).
- Yu, W., Hardin, P. E. Use of Firefly Luciferase Activity Assays to Monitor Circadian Molecular Rhythms In Vivo and In Vitro. Circadian Rhythms: Methods and Protocols. , 465-480 (2007).
- Yoo, S. -H., et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc Natl Acad Sci. 101 (15), 5339-5346 (2004).
- Buhr, D. E., Yoo, S. -H., Takahashi, J. S. Temperature as a universal resetting cue for mammalian circadian oscillators. Science. 330 (6002), 379-385 (2010).
- Brown, S. A., Zumbrunn, G., Fleury-Olela, F., Preitner, N., Schibler, U. Rhythms of mammalian body temperature can sustain peripheral circadian clocks. Current Biology. 12 (18), 1574-1583 (2002).
- Balsalobre, A., et al. Resetting of circadian time in peripheral tissues by glucocorticoid signaling. Science. 289 (5488), 2344-2347 (2000).
- Balsalobre, A., Marcacci, L., Schibler, U. Multiple signaling pathways elicit circadian gene expression in cultured Rat-1 fibroblasts. Curr. Biol. CB. 10 (20), 1291-1294 (2000).
- Hastings, M. H., Reddy, A. B., McMahon, D. G., Maywood, E. S. Analysis of circadian mechanisms in the suprachiasmatic nucleus by transgenesis and biolistic transfection. Methods Enzymol. 393, 579-592 (2005).
- Chen, Y., Stevens, B., Chang, J., Milbrandt, J., Ba Barres,, Hell, J. W. NS21: re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures. J. Neurosci Methods. 171 (2), 239-247 (2008).
- Feeney, K. A., Putker, M., Brancaccio, M., ONeill, J. S. In-depth Characterization of Firefly Luciferase as a Reporter of Circadian Gene Expression in Mammalian Cells. J. Biol. Rhythms. 31 (6), 540-550 (2016).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Hirota, T., Lewis, W. G., Liu, A. C., Lee, J. W., Schultz, P. G., Kay, S. A. A chemical biology approach reveals period shortening of the mammalian circadian clock by specific inhibition of GSK-3beta. Proc Natl Acad Sci. 105 (52), 20746-20751 (2008).
- Meng, Q., Maywood, E. S., Bechtold, D. A., Lu, W., Li, J., Gibbs, J. E. Entrainment of disrupted circadian behavior through inhibition of casein kinase 1 ( CK1 ) enzymes. Proc Natl Acad Sci. 1, 1-6 (2010).
- Khabirova, E., Chen, K. -F., O'Neill, J. S., Crowther, D. C. Flyglow: Single-fly observations of simultaneous molecular and behavioural circadian oscillations in controls and an Alzheimer's model. Sci. Rep. 6, 33759 (2016).
