Summary
Genetisk kodet luciferase er populære ikke-invasiv reporter av genuttrykk. Bruk av et automatisert langsgående luciferase imaging gass - og temperatur-optimalisert opptaker (ALLIGATOR) gjør langsgående opptak fra bioluminescent cellene under en rekke forhold. Her viser vi hvordan ALLIGATOR kan brukes i forbindelse med døgnrytme forskning.
Abstract
Luciferase-baserte journalister av mobilnettet genuttrykk er i utstrakt bruk både langsgående end-point søk biologiske aktivitet. I døgnrytme forskning, for eksempel gi klokken genet fusjoner med firefly luciferase opphav til robust rytmer i mobilnettet bioluminescens som vedvarer over mange dager. Tekniske begrensninger knyttet photomultiplier rør (avdrag) eller konvensjonelle mikroskopi-baserte metoder for bioluminescens kvantifisering har vanligvis krevde at celler og vev opprettholdes under ganske ikke-fysiologiske forhold under opptak, med en avveining mellom følsomhet og gjennomstrømning. Her rapporterer vi en avgrensning av tidligere metoder som gjør at langsiktige bioluminescens bildebehandling med høy følsomhet og produksjon som støtter en rekke kultur forhold, herunder variabel gass og fuktighetskontroll, og som aksepterer mange forskjellige vev kultur platene og retter. Denne automatiserte langsgående luciferase imaging gass - og temperatur-optimalisert opptaker (ALLIGATOR) også lar observasjon av romlige variasjoner i luciferase uttrykk over en celle monolayer eller vev, som ikke kan lett observeres av tradisjonelle metoder. Vi markere hvordan ALLIGATOR gir langt større fleksibilitet for påvisning av luciferase aktivitet sammenlignet med eksisterende metoder.
Introduction
Bruk av luciferases som journalister av genuttrykk og protein aktivitet har blitt en populær teknikk i molekylær og cellulær biologi forskning. Dette gjelder i feltet circadian, hvor the kinetics av firefly luciferase syntese og katalytisk inaktivering er spesielt godt egnet til rapportering langsgående endringer i genuttrykk som oppstår over ca 24 h circadian syklusen. Slik er luciferase ansatt som circadian reporter over et bredt spekter av organismer, inkludert sopp, planter, fluer og pattedyr1,2,3,4.
Når kvantifisere circadian genet uttrykk i vitro, brukes vanligvis et photomultiplier rør (betaling) å ta opp bioluminescent signalet. AVDRAG-baserte målinger har begrenset fleksibilitet men vanligvis begrenses til en forhåndsbestemt plate eller rett størrelse. Det er heller ikke mulig å samle romlig informasjon fra prøver overvåket ved hjelp av en innbetaling, som kan føre til tap av informasjon når imaging eksempler som viser romlige variasjon i luciferase uttrykk. Som avdrag og tilknyttede elektronikk er utsatt for feil når de utsettes for fuktet miljøet i en standard celle kultur inkubator, utføres videre alltid langsgående luciferase innspilling med PMTs i ikke-fuktet inkubatorer. I følge celle kultur retter må tettes lufttett å hindre tap av fuktighet gjennom fordamping og kultur media må derfor bufres med 3-(N- morpholino) propanesulfonic syre (MOPPER) eller 4-(2-hydroxyethyl) -1- piperazineethanesulfonic syre (HEPES), i stedet for CO2/bicarbonate bufring system som fungerer i vivo og brukes rutinemessig i pattedyr vev kultur.
Som følge av disse begrensningene begrensninger måling av bioluminesens av PMTs vanligvis tett på betingelsene som vedlikeholdes celler under eksperimenter. Å overvinne disse problemene og også øker mulig eksperimentelle forhold, bruker vi en standard CO2/N2 170 L vev kultur inkubator som har blitt tilpasset ved tilsetning av en vann-kjølt elektron-multiplisere kostnad - sammen enhet (EMCCD) kameraet med anti-tåke optikk og digital kontroll av temperatur og gass. Dette har blitt kalt en automatisert langsgående Luciferase Imaging-gass og Temperature-Optimized-opptaker eller ALLIGATOR. ALLIGATOR gir betydelig økt fleksibilitet bioluminescent Imaging, både for høy gjennomstrømming avbilding av standard vev kultur plater (opptil 6 x 96 - eller 384-godt plater samtidig) og også for ikke-standard vev kultur systemer, slik som perfused celler dyrket i microfluidic enheter. Dette kan også å oppstå under fuktet forhold og variabel kontroll av både CO2 og O2 delvis trykk samt temperatur.
Protokollen nedenfor beskriver en metode for bioluminescent opptak av pattedyr celler og vev kultur-systemer som bruker en ALLIGATOR (heretter referert til som 'bioluminescens inkubator'). Det bemerkes imidlertid at systemet ville være godt egnet bioluminescent bildebehandling og også med noen endring, lysstoffrør imaging, i mange andre biologiske systemer og sammenhenger.
Protocol
1. såing og temperatur Entrainment celler
Merk: Denne protokollen har blitt grundig testet med primære og udødeliggjort musen fibroblaster uttrykke PERIOD2::LUCIFERASE (PER2::LUC) fusion protein4. Justeringer må gjøres for eksperimenter ved hjelp av andre linjer.
- Før begynnelsen cellekultur, plasserer du følgende i en 37 ° C vannbad å varme: fosfat-bufret saltvann (PBS) (pH 7.4), PBS med 0.68 mM ethylenediaminetetraacetic syre, pH 7.2 (PBS + EDTA), aktuelle cellen kultur medier, f.eks Dulbeccos endret Eagle's Medium (DMEM) med 10% fosterets bovin serum (FBS), 100 U/mL penicillin og 100 µg/mL streptomycin og 0,25% trypsin løsning.
- Fortynne trypsin 1:3 forvarmes PBS + EDTA løsning og tilbake til vannbad.
- Ta en 125 cm2 kolbe luciferase-uttrykke celler som 70-90% confluent. Sug opp media. Legge til 10 mL forvarmes PBS.
- Sug opp PBS. Legge til 2,5 mL forvarmes trypsin-EDTA og returnere flasken til en 37 ° C inkubator for 5 min.
- Fjerne celler fra inkubatoren og visningen under et mikroskop. Når fleste cellene har løsrevet fra bunnen av flasken, Fortsett til neste trinn. Hvis de fleste celler forblir festet til bunnen av flasken, returnere det til inkubator til de fleste cellene i suspensjon.
- Legge til en ytterligere 7,5 mL av standard celle kultur medium kolbe. Du kan også fjerne 1 mL av dette for videre passasje av celler, etter behov.
- Telle tettheten av de gjenværende cellene ved hjelp av en hemocytometer og trypan blå. Fortynne cellene videre, avhengig av den cellen linjen.
Merk: For eksperimentene nedenfor, PERIOD2::LUC fibroblaster var frø mellom 6 x 103 celler/cm2 og 1 x 104 celler/cm2 i 96-brønnen plater, 35 mm retter eller kanal lysbilder. - Frø celler på vev kultur retter eller platene som skal brukes for opptak.
Merk: Bruk av svart dobbelsidig, klart bunn plater anbefales som dette gjør kultur helse skal vurderes før opptak begynner samtidig redusere interferens mellom brønner under opptak. Der bioluminescens nivåer er svært lav, bør hvite retter/plater brukes til å maksimere lett oppdagelsen, men Vennligst merk at Morelden kan føre til økt bakgrunn signal som vedvarer i flere timer. - Tilbake platene til inkubator, og lar monolayers å nå 100% der (ca 7 dager).
Merk: Når confluent, linjer som hemmer kontakt kan opprettholdes i opptil tre uker før eksperimentering forutsatt at media oppdateres regelmessig (hver 5-7 dager). - Når confluent, synkronisere mobilnettet rytmer med anvendt temperatur sykluser (12 h 32 ° c, 12 h på 37 ° C) i minst 72 h umiddelbart før eksperimentering5,6 (bruker en pre-programmert sykling inkubator, kontrollert av en datamaskinen koblet til inkubator gjennom en seriell RS-232 port).
Merk: Antall temperatur sykluser kreves for synkronisering av mobilnettet rytmer kan variere mellom celler linjer og må derfor være optimalisert for andre linjer. Akutt farmakologiske stimulering bruke forskolin eller deksametason har også blitt brukt tidligere synkronisere mobilnettet rytmer7,8.
2. NS21 forberedelse
Merk: NS21 er en serum-free komplettere for vedlikehold av neuronal og andre cellekulturer. Det er en avgrensning av en lignende supplement kjent som B27, som er kommersielt tilgjengelig og kan brukes som en serum erstatning under circadian bioluminescens opptak9. Enten supplement kan brukes om hverandre i innspillingen media for eksperimentell protokollene beskrevet nedenfor. Det er ganske mulig og kostnadseffektivt å gjøre NS21 internt, som Chen et al. 10, og som beskrevet her.
- Equilibrate alle komponenter som beskrevet i tabell 1 i romtemperatur 1t før du begynner.
- Oppløse 50 g bovin albumin i 324 mL basale medium (f.eks, neurobasal) på is. Rør blandingen som mulig.
- Legge til alle andre komponenter, røring minimal etter hver komponent men fortsatt sikre grundig blande. Mål å oppløse alle komponentene i 90 min starter.
- Aliquot endelige blandingen og butikk på 20 ° C til nødvendig. Unngå gjentatte fryse-Tin sykluser.
Merk: Blandingen er også tyktflytende filtrere på dette stadiet, men sterilt filtreres når fortynnet med media før det legges til cellene.
3. opptak Media forberedelse
Merk: En viktig fordel med bioluminescens inkubator over annet utstyr for opptak langsgående bioluminescens er at, i kraft av å kunne humidify inkubator og variere delvis presset av O2 og CO2, er det mulig å bruke en rekke medier vilkårene for opptak bioluminescens, inkludert betingelser som mer tett omtrentlig fysiologiske nisje okkupert av forskjellige cellen skriver i vivo. Nedenfor beskriver vi utformingen av plater tilpasset fra Hastings et al. 9, som vi har brukt rutinemessig med kulturperler fibroblaster og andre celletyper. Først er for forseglet oppdrettsforholdene (uten gassutveksling), og andre er fysiologisk relevante vilkår og skal brukes under fuktet forhold med 5% CO2.Mange andre varianter er både mulig og tilrådelig, avhengig av nøyaktig program og celle type.
- MOPS-buffered høye glukose media forberedelse
Merk: Lagerløsning (1 L): DMEM pulver (8.3 g/L), 0,35 mg/mL natriumbikarbonat, 5 mg/mL glukose, 0.02 M MOPPER, 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin.- Oppløse 8.3 g DMEM pulver i 900 mL ultrapure vann i en 1000 mL måling sylinder og røre i 30 min til alle partikler er oppløst.
- Legge til 50 mL av glukose løsning (100 g/L), 20 mL MOPPER (1 M, pH 7.6), 10 mL av 100 x penn/strep løsning og røre for ytterligere 10 min.
- Legge til 4,7 mL 7,5% natrium bikarbonat løsning og røre for ytterligere 5 min.
- Justere media pH 7.6 (Hvis ved romtemperatur) eller 7.4 (37 ° C) med HCl/NaOH.
- Legg ultrapure vann for å produsere et endelig antall 1000 mL.
- Sterilisere ved filtrering gjennom et 0.22 µm filter og butikk på 4 ° C til nødvendig.
- Før eksperimentering, supplere en passende mengde lagerløsning med 10% serum, 2 mM L-alanyl-L-glutamin, 2% NS21, og 1 mM luciferin å gjøre en arbeider lager. Dette lager passere filtere 0.22 µm sterilt.
- Måle osmolality av medier med en osmometer.
- Slå på osmometer.
- Kalibrere osmometer, først med ultrapure vann. Legge til 50 µL vann i bunnen av en måling fartøy. Sikre det ikke finnes noen bobler i væsken. Klipp fartøyet over sonden. Trykk 'Null' og nøye lavere osmometer armen til det laveste punktet. Vent til lesing er fullført og grønne 'resultat' lampen lyser før heve armen og fjerne fartøyet.
- Gjenta for å kalibrere osmometer til 300 mOsmol/kg med 50 µL kalibrering standarden. Trykk 'Cal' før du nedgraderer armen.
- Måle eksempel osmolality ved å legge til 50 µL av medier til bunnen av en måling fartøyet og mål som ovenfor. Trykk 'eksempel' før du nedgraderer osmometer armen.
- Juster osmolality til 350 mOsmol med 5 M NaCl.
- HCO3-bufrede lav glukose media (perfusjon medium) forberedelse
Merk: Lagerløsning (1 L): DMEM pulver (8.3 g/L), 3,7 mg/mL natriumbikarbonat, 1 mg/mL glukose, 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin.- Oppløse 8.3 g DMEM pulver i 900 mL ultrapure vann i en 1000 mL måling sylinder og røre i 30 min til alle partikler er oppløst.
- Legg 50 mL av glukose løsning (100 g/L), 10 mL av 100 x penn/strep løsning og rør for ytterligere 10 min.
- Legg 49,4 mL 7,5% natrium bikarbonat løsning og rør for ytterligere 5 min.
- Justere media pH 7.6 (ved romtemperatur) eller 7.4 (37 ° C) med HCl/NaOH.
- Legg ultrapure vann for å gi et endelig antall 1000 mL.
- Passere løsningen gjennom et 0.22 µm sterilt filter og butikk på 4 ° C før bruk.
- Før eksperimentering, supplere en passende mengde lager løsning med 2% serum, 2 mM L-alanyl-L-glutamin, 2% NS21 og 1 mM luciferin å gjøre en arbeider lager. Dette lager passere filtere 0.22 µm sterilt.
- Måle og justere osmolality til 350 mOsmol med 5 M NaCl, som MOPPER-bufret media.
Merk: Luciferin konsentrasjon bør fastsettes empirisk for hver celle type og sammenheng. For ytterligere informasjon se Feeney et al. 11 serum og NS21 (eller B27 hvis brukt) konsentrasjoner kan endres avhengig av program. Men anbefaler vi at, med mindre empirisk testet for å vise ellers, serum og NS21 (eller alternativ serum-free supplement) brukes, som dette fremmer celle overlevelse og vedlegg. I linjer som ikke kontakter hemme godt, kan det være nødvendig å senke serum konsentrasjonen i innspillingen media å unngå forvirrende virkningene av spredning, som er også fremmes av serum.
4. opptak
- Før du begynner innspillingen, sted passende arbeider media lager (fra trinn 3.1 eller 3.2 avhengig av eksperimentet) i et 37 ° C vannbad å varme.
- Mens media er oppvarming, Fokuser kameraet i bioluminescens inkubator.
- Skru vannet-ugjennomtrengelige, oppvarmet nøytral tetthet filter og sett til side.
- Sette programvare å spille inn en video med en høy oppkjøpet hastighet. Klikk "Kjøp | Kjøp Setup". Angi "Eksponeringstid" 0,2 s og kinetisk syklustiden 0,3 sekunder. Kontroller at EM gevinst er deaktivert.
- Lukk vinduet "Kjøp Setup" og klikk på "ta video"-ikonet.
- Bruker fokus sylinderen, rotere kameralinsen til elementer på sokkelen på høyden skal registreres er tydelig i fokus i videoen.
- Stopp videoen ved å velge "Stopp video".
- Skru den oppvarmede Nøytralfilter tilbake på plass; gjør det vil resultere i skade EM-CCD kameraet og/eller tåkete av målet på grunn av kondens.
- Angi O2og CO2temperatur til ønsket eksperimentelle forhold ved hjelp av kontrollpanelet på forsiden av bioluminescens inkubator.
Merk: Hvis utfører perfused cellekultur gå direkte til seksjon 5 på dette stadiet. - Fjerne celler fra vev kultur inkubatoren og leveringstanken av media. Erstatte media med forvarmes arbeider lager.
- Hvis bioluminescens inkubatoren er ikke å være fuktet under eksperimentet, deretter forsegle retter og plater med en gass-ugjennomtrengelig segl.
Merk: Luftfukting oppnås ved å fylle vann skuffen på bunnen av inkubator.
- Klikk "Kjøp | Kjøp Setup".
- I 'Kamera oppsett'-panelet kan du angi: 'vinningen måte"å"Kinetic"; "Eksponeringstid" til ønsket eksponeringstid, i sekunder (se merknaden nedenfor). 'Ansamlinger' 1. "Kinetic-serien lengde' antall oppkjøpet sykluser ønsket; "Kinetic syklustid" til ønsket tenkelig intervall (sikre at dette er større enn eksponeringstid); 'Skift hastighet' til 4.33 µsecs; "Få" 1. og dem få ' til ønsket nivå (se merknaden nedenfor)
- I 'Autosave'-panelet kan du stille inn filtypen til sif eller TIF. Angi et filnavn og hensiktsmessig lagring beliggenhet.
- I "Spooling"-panelet kan du stille inn filtypen til tiff. Angi et filnavn og hensiktsmessig lagring beliggenhet. Lukk vinduet oppkjøpet oppsett.
Merk: Som bioluminescens inkubator kan brukes til mange forskjellige celler og vev typer, alle har ulike nivåer av bioluminescens, eksponeringstid pålagt å samle et passende bioluminescent signal vil variere mellom eksperimenter. Det er også mulig å variere elektron-multiplisere (EM) gevinst Imaging for å øke omfanget av signalet samlet. For nye applikasjoner ukjent lysstyrken foreslår vi først ta ett bilde med en relativt kort eksponeringstid (rundt 10 min) uten EM gevinst og deretter justere både eksponeringstid og EM få til de ønskede innspillingen har vært nådd. I de fleste tilfeller er en mener signalet 10-20% av maksimal mulig pixel intensiteten for kameraet et godt nivå å satse. Når et passende sett med opptaket parametrene er nådd, starte langsgående oppkjøpet av bilder, som beskrevet ovenfor.
5. perfused vev kultur (valgfritt)
Merk: Som beskrevet i innledningen, bioluminescens inkubator er egnet for avbilding av ikke-standard vev kultur systemer. Dette er eksemplifisert i utviklingen av et system for parfyme cellekultur.
- Frø cellene til én kanal lysbilder med Luer kontakter med en kanal dybde på 0,6 eller 0,8 mm, i DMEM med 10% FBS og penn/strep, som beskrevet i del 1. Lage perfusjon media som beskrevet i trinn 3.2.
- Før innspillingen, forberede slange for nødvendige perfusjon systemet benytter 1 mm indre diameter (ID) ETFE rør og 1 mm ID silikon rør, albue, mannlige og kvinnelige Luer beslag, som vist i figur 2A.
Merk: Fleste av slangen er ETFE rør, med 2 cm deler av silikon rør som brukes til å koble ETFE slangen til Luer beslag, som deretter kobler til kanalen lysbildene. - Sterilisere slangen av rødme med 70% etanol, etterfulgt av sterile PBS.
- Fjerne cellekulturer kanal lysbilder fra inkubator. Sug opp media, og Erstatt med forvarmes perfusjon media.
- Fyll en 20 mL sprøyte med forvarmes perfusjon media.
- Koble slangen til bufferen Skyv (se figur 2) men ikke cellen som inneholder lysbildet, og skyll den rør og skyv med perfusjon media (3-5 mL).
- Koble cellen inneholder lysbildet, og tømme hele systemet med en ytterligere 1 mL av media å fjern eventuelle luftbobler.
- Overføre hele systemet til bioluminescens inkubator.
- Tilpass media-fylt sprøyter til sprøyten pumpe uten å koble fra slangen og tømme en ytterligere 1 mL av media gjennom hele systemet bruke pumpen for å sikre det er ingen luftbobler i systemet.
- Angi diameter på pumpen som i sprøyten brukes.
Merk: For 20 mL sprøyter her, diameteren er 19.13 mm. - Angi inntakets pumpen 50 µL/t og starte den.
- Kontroller at det ikke er noen bobler i lysbilder eller rør før opptak, så dette påvirker luciferase uttrykk når de passerer over celle monolayer. Hvis nødvendig, tømme ytterligere media over cellene å oppnå dette.
- Lukker bioluminescens inkubator døren og fortsetter som i trinn 4.7 begynne innspillingen.
6. behandling under opptak
Merk: Noen ganger er det ønskelig å behandle celler midtveis en innspilling, være det med farmakologiske eller hormonelle agenter. I slike tilfeller er det viktig at cellene behandles med forsiktighet for å hindre mobilnettet oscillation tilbakestiller under behandling. Derfor er det spesielt viktig at cellene er opprettholdt på et konstant temperatur, da dette er en stor entraining stikkordet i mobilnettet døgnrytme5,6.
- Forberede alle komponenter av før stoppe innspillingen.
- Forberede en kjemisk isotermiske pad på 37 ° C.
- Stoppe innspillingen enheten, fjerne retter for å bli behandlet og plassere på isotermiske varme puten.
- Behandle kulturer som nødvendig og tilbake til bioluminescens inkubator på samme sted som før.
- Start innspillingen på nytt.
7. analyser
Merk: Bioluminescens inkubator produserer data i form av en serie enkeltbilder.Vi bruker primært Fiji12 administrere bildene og deretter eksportere mener intensitet pikseldataene for hver region steder (ROI) for videre analyse.
- Åpne bildestakk i Fiji, og justere lysstyrken og kontrasten ved å klikke "bilde | Justere | Lysstyrke/kontrast"og justere skyve barer til bilder er innenfor et passende område for å vise bioluminescent signalet.
- Velg områder av interesse ved hjelp av Avkastningen manager tilgjengelig under "analyser | Verktøy | ROI Manager".
- Eksport mener signalet for det merkede området ved å klikke "Avkastningen manager | Mer | Multimeasure".
- Kopier de resulterende dataene til analyseprogramvare.
- Justere manuelt på grunnlag av data til tidsintervallet imaging (dvs., 15, 30 eller 60 min intervaller, beskrevet som 0,25 0,5 og 1 h) i stedet for hvor bildet levert av Fiji.
Merk: Videre analyse kan nå utføres, for eksempel fastsettelse av perioden. For dette brukes denne formelen til å utføre ikke-lineær regresjonsanalyse:
hvor y er signalet, x tilsvarende tidspunkt, m er gradient av trendlinjen, c er y-skjæringspunktet av trendlinjen, Amplitude er høyden på toppen av bølgeform over trendlinjen, k er decay konstant eller demping (slik at 1 /k er halveringstiden), er skiftet i x av cosinus wave og perioden er tiden en komplett syklus oppstår13. R2 -verdien brukes som en indikator for godhet av fit. Andre metoder for analyse er også mulig. Første 24 h på kjøpet bør utelukkes fra analyse, som cellular bioluminesence oppføre forbigående, ikke-circadian endringer samtidig. Dette er resultatet av en akutt reaksjon på media endring.
Representative Results
Denne artikkelen beskriver en protokoll for bioluminescent avbilding av pattedyrceller med en ALLIGATOR (bioluminescens inkubator). Denne teknikken gir fleksibilitet med fysiske oppsett og ekstracellulære forhold når imaging bioluminescent systemer. Metoder for både enkle statiske vev kultur (figur 1, utfyllende Video 1) og parfyme cellekultur (figur 2, utfyllende Video 2) er beskrevet, men mange andre oppsett kan avbildes med dette systemet. Alle data kvantifisert ved hjelp av metodene beskrevet i § 7.
Figur 1A viser et eksempel video av en bioluminescens innspilling fra 6 x 96-brønns plater som inneholder PER2::LUC fibroblaster4. Ytterste brønnene inneholder celler som disse ikke var nødvendig for dette eksperimentet. Cellene har gjennomgått differensial temperaturen entrainment, der de gjennomgå enten kroppstemperatur syklus av 12 h, på 32 ° C etterfulgt av 12 h 37 ° C i 72 h eller snakke (12 h, på 37 ° C etterfulgt av 12 h, på 32 ° C i 72 h), før du blir holdt i konstant 37 ° C for opptak. 60 min eksponeringer ble tatt hver time. To av disse forholdene er kvantifisert i figur 1B.
Figur 2A viser en skjematisk oppsett av et system for parfyme vev kultur. Dette består av to kanalen lysbilder med rør. Media drives over cellene av en sprøytepumpe. Først av disse lysbildene fungerer som en gass permeabel boble felle (buffer lysbilde) og ikke inneholder noen celler, med andre som inneholder cellene som bioluminescens registreres. En representant videoinnspillingen fra dette systemet er vist i figur 2B. 15 min eksponeringer ble tatt hvert 15 min. Her opprettholdes celler under standard perfusjon forhold eller i nærvær av kasein kinase inhibitor PF670462, som har vist tidligere å forlenge circadian periode og redusere amplituden til klokken gene expression rytmer i kulturperler pattedyrceller14. Effekten på PER2::LUC uttrykk er vist i figur 2C (toppanelet) mot cellene behandlet med samme konsentrasjonen av narkotika under standard statisk celle kultur forhold vises i figur 2C (nedre panelet), med kvantifisering av perioden vist i figur 2D. Det er åpenbart fra denne at behandling med PF670462 påvirker PER2::LUC uttrykk under begge sett med vilkår. Men mens cellene behandlet med PF670462 under perfused forhold Vis perioden forlengelse av ca 3 h (3 ±0.9 h), celler i statisk forhold behandlet med stoffet viser betydelig større perioden forlenge for en periode på > 48 timer. Dette kan være passe av en dempet cosinus, som beskrevet i § 7, (ekstra summen av kvadrater F teste mot en rett linje, p < 0,0001). Interessant, er omfanget av perioden forlenge under perfusjon mye nærmere som observert i vivo14.
Figur 1: Data eksempel. (A) eksempel videostillbilde bioluminescens fra udødeliggjort PER2::LUC i 6 x 96 godt plater i bioluminescens inkubator. Brønner til kvantifiseres har vært merket med gult i supplerende Video 1. (B) kvantifisering av bioluminescens fra A. To sett med 3 plater av celler ble entrained bruker temperatur sykluser (12 h, på 32 ° C; 12 h, på 37° C) som var anti-phasic å produsere overfor faser av PER2 protein uttrykk (n = 6, mener ± SEM). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: perfusjon med CK1δ hemmere. (A) skjematisk av perfusjon. (B) eksempel stillbilde av en bioluminescens opptak fra PER2::LUC celler under perfusjon. Et område for kvantifisering utheves i gult. (C) kvantifisering av bioluminesens av PER2::LUC fibroblaster under perfusjon og statisk forhold med og uten 3 µM CK1 hemmer PF670462 (n = 3, mener ± SEM). Bioluminescens har blitt normalisert til minimums-og maksimumsverdier. (D) analyse av perioden (toveis VARIANSANALYSE, Holm-Sidak flere sammenligninger test).Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Komponent | Siste middels konsentrasjon (μM) | Lager (mg/mL) | For 400 mL NS21 |
| Storfe Albumin | 37 | - | 50 g |
| Catalase | 0,01 | - | 50 mg |
| Glutation | 3.2 | - | 20 mg |
| Insulin | 0,6 | 10 | 8 mL |
| Superoxide dismutase | 0.077 | - | 50 mg |
| Holo-transferrin | 0.062 | - | 100 mg |
| T3 (triiodo-L-thyronine) | 0.0026 | 2 | 20 ΜL |
| L-Carnitine | 12 | - | 40 mg |
| Ethanolamine | 16 | Væske (1 g/ml) | 20 ΜL |
| D (+)-galaktose | 83 | - | 300 mg |
| Putrescine | 183 | - | 322 mg |
| Natrium selenitt | 0.083 | 1 | 280 ΜL |
| Corticosterone | 0.058 | 2 | 0,2 mL |
| Linolsyre | 3.5 | 100 | 0,2 mL |
| Linolenic Acid | 3.5 | 100 | 0,2 mL |
| Lipoic Acid | 0,2 | 4.7 | 0,2 mL |
| Progesteron | 0,02 | 3.2 | 0.04 mL |
| Retinol Acetate | 0,2 | 20 | 0,1 mL |
| Retinol, alle trans | 0,3 | 10 | 0,2 mL |
| D, L-alfa-tokoferol | 2.3 | 100 | 0. 2 mL |
| D, L-alfa-tokoferol acetate | 2.1 | 100 | 0,2 mL |
Tabell 1: NS21 forberedelse.
Supplerende Video 1: eksempel video av bioluminescens fra bra plater. Eksempel stillbilde av bioluminescens fra udødeliggjort PER2::LUC i 6 x 96 bra plater i bioluminescens inkubator. Brønner til kvantifiseres utheves i gult. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende Video 2: eksempel videostillbilde en bioluminescens opptak fra PER2::LUC celler under perfusjon. Et område for kvantifisering utheves i gult. Klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
Protokollen beskrevet her er for pattedyr cellekultur, både under perfused og statisk forhold. Imidlertid kan ALLIGATOR lett tilpasses andre modellsystemer. Faktisk har det allerede vist å gi en utmerket plattform for samtidig overvåking av bevegelse, sove og eksterne gene expression rytmer i Drosophila melanogaster vedlikeholdes under konstant mørke15. Det er også bemerket at avhengig av programmet, kameraet typer enn det som er nevnt her kan være riktig. Vi ser at med riktige filtrene, en modifisert versjon av gjeldende oppsett kan i prinsippet brukes til fluorescens kvantifisering.
De eneste programmene som ALLIGATOREN ikke kanskje riktig er de som spesielt høy romlig oppløsning kreves, for eksempel bildebehandling for spatiotemporal av PER2::LUC uttrykk i organotypic skiver av pattedyr suprachiasmatic kjernen eller andre små vev sektorene.
ALLIGATOR kan mange eksperimenter utføres som hittil ikke er lett oppnåelig med konvensjonell brenning. Sammenlignet med dagens metoder for måling av bioluminescens, gir ALLIGATOR økt fleksibilitet i både type celle kultur parabol eller lysbildet som kan brukes, eksterne medier forhold, følsomhet og processivity.
Dette gjelder spesielt i en tid når det er en bevegelse bort fra standard 2D celle kultur modeller mot 3D organoid og flyt kultur systemer. Som sådan, er det forventet at ALLIGATOR vil gi en praktisk metode som bioluminescens kan måles over mange dager og uker under en rekke forhold.
Disclosures
Det finnes ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Cairn forskning for samarbeidet med å utvikle dette systemet, spesielt Mark Henson, Jeremy Graham og Joao Correia. Vi har også takke Dave Welsh og Akhilesh rødlig for verdifulle diskusjon under designfasen, samt Peter Laskey (tidligere av Hamamatsu) for å arrangere lån av en demo kamera og David Wong for hans kritiske inndata i manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM (1x) + GlutaMAX | Gibco | 31966-021 | |
| Hyclone FetalClone III Serum | GE Healthcare | SH30109.03 | |
| Neurobasal medium | Thermofisher | 21103049 | basal medium |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A4919 | |
| Catalase | Sigma | C40 | |
| Glutathione | Sigma | G6013 | |
| Insulin | Sigma | I1882 | |
| Superoxide Dismutase | Sigma | S5395 | |
| Holo-transferrin | Calbiochem | 616424 | |
| T3 (triiodo-L-thyronine | Sigma | T6397 | |
| L-Carnitine | Sigma | C7518 | |
| Ethanolamine | Sigma | E9508 | |
| D (+)-Galactose | Sigma | G0625 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | |
| Sodium Selenite | Sigma | S9133 | |
| Corticosterone | Sigma | C2505 | |
| Linoleic Acid | Sigma | L1012 | |
| Linolenic Acid | Sigma | L2376 | |
| Lipoic Acid | Sigma | T1395 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Retinol Acetate | Sigma | R7882 | |
| Retinol, all trans | Sigma | 95144 | |
| D,L-alpha-Tocopherol | Sigma | 95240 | |
| D,L-alpha-Tocopherol acetate | Sigma | T3001 | |
| Sodium Bicarbonate Solution | Sigma | S8761-100ML | |
| GlutaMAX (100x) | Gibco | 35050-038 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Galaxy 170R incubator | Eppendorf | CO17301001 | |
| Luciferin | Biosynth | L-8220 | |
| D -(+)-Glucose solution | Sigma | G8644-100ML | |
| DMEM powder | Sigma | D5030 | |
| MOPS | Sigma | PHG0007 | |
| 1 mm I.D. silicone tubing | GE Healthcare | 19-4692-01 | |
| Elbow luer connector | Ibidi | 10802 | |
| Male luer fittings | Ibidi | 10826 | |
| Female luer fittings | Ibidi | 10825 | |
| µ-slide luer I 0.6 | Ibidi | 80196 | |
| BD plastipak 20ml syringe | Becton Dickinson | 300613 | |
| 1mm I.D. ETFE tubing | GE Healthcare | 18-1142-38 | |
| PF670462 | Sigma | SML0795 | |
| B27 Supplement (50x) | ThermoFisher | 17504044 | |
| iXon Ultra EMCCD camera | Andor | iXon 888 | |
| Fiji | ImageJ | N/A | |
| Prism 7.0 | Graphpad Software | N/A | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| Deltaphase Isothermal Pad | Braintree Scientific | 39DP | |
| Heated neutral density filter | Cairn Research | Custom item | |
| Osmomat 030 | Gonotech | Discontinued | |
| 300 mOsmol/kg calibration standard | Gonotech | 30.9.0020 | |
| Measuring vessel | Gonotech | 30.9.0010 | |
| Focusing cylinder | Cairn Research | Custom item | |
| NE-1600 programmable syringe pump | Pump Systems inc. | NE-1600 | |
| Andor Solis Software | Andor | N/A |
References
- Morgan, L. W., Greene, A. V., Bell-Pedersen, D. Circadian and light-induced expression of luciferase in Neurospora crassa. Fungal Genet. and Biol. 38 (3), 327-332 (2003).
- Millar, A. J. A Novel Circadian Phenotype Based on Firefly Luciferase Expression in Transgenic Plants. Plant Cell Online. 4 (9), 1075-1087 (1992).
- Yu, W., Hardin, P. E. Use of Firefly Luciferase Activity Assays to Monitor Circadian Molecular Rhythms In Vivo and In Vitro. Circadian Rhythms: Methods and Protocols. , 465-480 (2007).
- Yoo, S. -H., et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc Natl Acad Sci. 101 (15), 5339-5346 (2004).
- Buhr, D. E., Yoo, S. -H., Takahashi, J. S. Temperature as a universal resetting cue for mammalian circadian oscillators. Science. 330 (6002), 379-385 (2010).
- Brown, S. A., Zumbrunn, G., Fleury-Olela, F., Preitner, N., Schibler, U. Rhythms of mammalian body temperature can sustain peripheral circadian clocks. Current Biology. 12 (18), 1574-1583 (2002).
- Balsalobre, A., et al. Resetting of circadian time in peripheral tissues by glucocorticoid signaling. Science. 289 (5488), 2344-2347 (2000).
- Balsalobre, A., Marcacci, L., Schibler, U. Multiple signaling pathways elicit circadian gene expression in cultured Rat-1 fibroblasts. Curr. Biol. CB. 10 (20), 1291-1294 (2000).
- Hastings, M. H., Reddy, A. B., McMahon, D. G., Maywood, E. S. Analysis of circadian mechanisms in the suprachiasmatic nucleus by transgenesis and biolistic transfection. Methods Enzymol. 393, 579-592 (2005).
- Chen, Y., Stevens, B., Chang, J., Milbrandt, J., Ba Barres,, Hell, J. W. NS21: re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures. J. Neurosci Methods. 171 (2), 239-247 (2008).
- Feeney, K. A., Putker, M., Brancaccio, M., ONeill, J. S. In-depth Characterization of Firefly Luciferase as a Reporter of Circadian Gene Expression in Mammalian Cells. J. Biol. Rhythms. 31 (6), 540-550 (2016).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Hirota, T., Lewis, W. G., Liu, A. C., Lee, J. W., Schultz, P. G., Kay, S. A. A chemical biology approach reveals period shortening of the mammalian circadian clock by specific inhibition of GSK-3beta. Proc Natl Acad Sci. 105 (52), 20746-20751 (2008).
- Meng, Q., Maywood, E. S., Bechtold, D. A., Lu, W., Li, J., Gibbs, J. E. Entrainment of disrupted circadian behavior through inhibition of casein kinase 1 ( CK1 ) enzymes. Proc Natl Acad Sci. 1, 1-6 (2010).
- Khabirova, E., Chen, K. -F., O'Neill, J. S., Crowther, D. C. Flyglow: Single-fly observations of simultaneous molecular and behavioural circadian oscillations in controls and an Alzheimer's model. Sci. Rep. 6, 33759 (2016).
