מאמר זה מציג שיטה המערבים את סינתזה ואפיון של פילוח מונוציט פפטיד אמפיפיליות הקזאין, מבחני המתאימה כדי לבדוק את התאימות והיכולת של מיצלה כדי לאגד ומונוציטים.
טרשת עורקים הוא תורם מרכזי למחלות לב וכלי דם, הגורם המוביל למוות ברחבי העולם, אשר טוען 17.3 מיליון אנשים בשנה. טרשת עורקים הוא גם הגורם המוביל של מוות פתאומי, אוטם שריר הלב, שעודד פלאק לא יציב נקרעים ועוברים occlude את כלי הדם ללא אזהרה. זרם שיטות הדמיה לא יכול להבדיל בין פלאק לא יציב ויציבה להיקרע. פפטיד חומרים פעילי שטח הקזאין (PAMs) יכול להתגבר על חיסרון זה כפי ניתן לשנותן עם מגוון של פילוח moieties לאגד במיוחד כדי רקמות חולות. ומונוציטים הוכחו להיות סמנים מוקדם של טרשת עורקים, בעוד הצטברות גדולה של monocytes משויך הפלאק נוטה להיקרע. לפיכך, חלקיקים שיכולות היעד ומונוציטים ניתן להפלות בשלבים שונים של טרשת עורקים. לשם כך, כאן, נתאר פרוטוקול על פי פילוח מונוציט PAMs (מונוציט chemoattractant חלבון-1 (MCP-1) PAMs). PAMs MCP-1 הם התאספו עצמית דרך סינתזה בתנאים מתון כדי טופס חלקיקים של 15 ננומטר קוטר עם יד תשלום משטח נייטרלי. במבחנה, PAMs נמצאו מסתיימים והיתה זיקה מחייבת גבוהה עבור ומונוציטים. בשיטות המתוארות בזאת מבטיחים למגוון רחב של יישומים טרשת עורקים, כמו גם מחלות דלקתיות אחרות.
מחלות לב וכלי דם להישאר להיות הגורמים המובילים. למוות באופן גלובלי עם 17.3 מיליון מקרי מוות ברחבי העולם1. מחלות לב וכלי דם נתרמים על ידי טרשת עורקים, מצב שבו הפלאק לבנות את העורקים, ובכך מעכבים דם, זרימת חמצן אל התאים של הגוף2,3. ההתקדמות של טרשת עורקים כרוך את עיבוי ואת התקשות של העורקים על ידי תגובה דלקתית, חילוף החומרים של השומנים לא סדיר, הצטברות פלאק, המוביל אל רובד אוטם שריר הלב ולמסמנים4,5. תאי אנדותל מבטאים מולקולות ציטוקינים והצמדות, הכוללים MCP-1 זה נקשר לקולטן C-C כימוקין (CCR2) על פני השטח של monocytes6,7,8. כולסטרול מחומצן ממירה ומונוציטים מקרופאגים בשלב מוקדם של היווצרות הפלאק, אשר מגביר את התגובה דלקתית באזור, מוביל פגיעה ברקמות ואת היווצרות הפלאק לא יציבה או פגיע9, 10.
באופן מסורתי, טרשת עורקים מחושבת על-ידי הערכת היצרות luminal על ידי הדמיה אנטומית באמצעות11,של מסתמים או אולטרסאונד-12. עם זאת, שיטות אלה יכול לקבוע אך ורק היצרות חמורה של הקיר עורקים, לא שבשלב מוקדם של טרשת עורקים, כמו צמיחה שלט הראשונית גורמת שיפוץ העורקים כדי לשמור על גודל עורק ודם תזרים קצב12,13, 14. לכן, angiograms underrepresent שכיחות טרשת עורקים. בנוסף, טכניקות הדמיה לא פולשנית כגון פליטת פוטון בודד שחושב טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים טומוגרפיה, דימות תהודה מגנטית שימשו לאחרונה לאפיין פלאק מורפולוגיה כפי שהם יכולים לספק פרטים הראשונית, אפיון של הפלאק. עם זאת, האופנים האלה מוגבלים לעיתים קרובות על ידי חוסר רגישות, רזולוציה מרחבית, או דורשים השימוש של קרינה מייננת, ביצוע הדמיה פלאק התקדמות בשלבים שונים הרבה יותר מאתגר15,16, 17. מערכת משלוח הדמיה אשר במיוחד מזהה שלטי בשלבים שונים של טרשת עורקים נשאר להיות מפותח.
חלקיקים הוכיחו להיות פלטפורמה המתעוררים ויוו פלאק מיקוד ואבחון18,19,20,21. בפרט, PAMs הם יתרון בשל המגוון הכימי שלהם ואת היכולת להכיל מגוון moieties, יצירות, גדלים, צורות של פני השטח functionalization22. פפטיד חומרים פעילי שטח (PAs) מורכב הידרופיליות, פפטיד “headgroup” מצורף וזנב הידרופובי, אשר בדרך כלל שומנים; מבנה amphiphilic זה מקנה יכולות וההספק עצמי ומאפשר תצוגה multivalent של פפטידים על פני השטח של חלקיקים22,23,24. Headgroups פפטיד יכול להשפיע על צורת החלקיקים באמצעות קיפול ומימן מליטה בין פפטידים25. פפטידים מקפלים כתהליכי β-גיליון הוכחו יוצרות הקזאין מוארך, ואילו אישור α-הסליל יכולים ליצור שני כדורי ומוארך הקזאין22,23,24, 2526,,27. ניתן להניח linkers פוליאתילן גליקול (PEG) למגן את המטען משטח של פפטיד בין פפטיד הידרופילית את וזנב הידרופובי של PAMs, שיפור הזמינות של ננו-חלקיק מחזור מערכתי28, 29 , 30 , 31. PAMs הם גם יתרון כי הם אינם מסתיימים הוכחו, יש מגוון רחב של יישומי32,33. המסיסות במים הקזאין מציע יתרון על פני מערכות אחרות כגון חלקיקים פולימרים מסוימים אינם מסיסים במים, יש להיות מושעים ב- solubilizers עבור זריקות34מבוססי ננו-חלקיק. בנוסף, היכולת ליצור PAMs זה לפרק בתגובה לגירויים ספציפיים הופכת PAMs מבוקר הסמים תאיים משלוח35ההרסני.
על ידי קשירה לקולטן CCR2 המצטבר קשת אבי העורקים, PAMs פותחו בעבר עבור מונוציט מיקוד לעקוב אחר השלבים השונים התרדמה ב אבי העורקים9. בעכברים ספקיות– / – , הצטברות מונוציט מגדילה באופן פרופורציונלי פלאק התקדמות36. יתר על כן, נמצא כי חולים עם שלטי נוטה להיקרע, בשלב מאוחר מכילים כמויות גבוהות של monocytes37. לכן, השינוי של PAMs לשלב MCP-1 הוא שימושי כי זה מאפשר להגדיר מיקוד ובידול בין התרדמה, מאוחר-בשלב מוקדם. מחקרים אלה הוכחה הרעיון לאמת גם כי PAMs בטוחים מספיק לשמש pre-clinically, נמחקים renally38. מאז ומונוציטים ודלקת האופייני למחלות אחרות, PAMs MCP-1 יש פוטנציאל לשמש ליישומים טיפוליים ואבחון מחלות אחרות מעבר טרשת עורקים-8,–39,–40 , 41.
במסמך זה, אנו מדווחים על הזיוף של PAMs MCP-1 מאוד מדרגיים, שהורכבו עצמית, אשר הדגים של החלקיק לגודל האופטימלי משטח הטעינה, המיקוד סלקטיבי ומונוציטים עבור יישומי הדמיה משופר של טרשת עורקים.
PAMs MCP-1 הם פלטפורמה הדמיה מולקולרית מבטיח, המורכב פפטיד מיקוד הידרופילית וזנב הידרופובי שמניע את מהות עצמית שהורכב ננו-חלקיק. מיצלה פילוח מונוציט הזה ניתן להכין על ידי סינתזה פשוטה ואת שלבי טיהור של פפטיד MCP-1 ו- DSPE-יתד (2000)-MCP-1. PAMs יש מאפיינים רבים מועילים ויוו מולקולרית הדמיה כגון שלהם ה?…
The authors have nothing to disclose.
המחברים, הייתי רוצה להכיר את התמיכה הפיננסית של אוניברסיטת דרום קליפורניה, הלב הלאומית, ריאות, ודם המכון (NHLBI), R00HL124279, אלי ו אידית פרס החדשנות רחבה, L.K. Whittier קרן Non-סרטן פרס המחקר translational שהוענקו EJC. המחברים תודה למרכז מיקרוסקופ אלקטרונים, Microanalysis, מרכז של מצוינות NanoBiophysics, מרכז התמחות על אפיון מולקולרי ומרכז Translational הדמיה-אוניברסיטת דרום קליפורניה לעזרה בארגון כיוונוני אינסטרומנטלית.
1,2-ethanedithiol | VWR | E0032 | for peptide synthesis |
10 mL disposable serological pipets | VWR | 89130-898 | for cell culture |
15 mL centrifuge tubes, polypropylene | VWR | 89401-566 | for various applications |
2,5-dihydroxybenzoic acid, 99% | Fisher Scientific | AC165200050 | for MALDI |
25 mL disposable serological pipets | VWR | 89130-900 | for cell culture |
2-Mercaptoethanol, 50 mM | ThermoFisher Scientific | 31350010 | for cell culture |
5 mL disposable serological pipets | VWR | 89130-896 | for cell culture |
50 mL centrifuge tubes | VWR | 89039-658 | for various applications |
75 cm2 culture flask | Fisher Scientific | 13-680-65 | for cell culture |
75 mL reaction vessel | Protein Technologies | 3000005 | for peptide synthesis |
96-wells cell culture plate | VWR | 40101-346 | for MTS assay |
Acetonitrile, HPLC grade | Fisher Scientific | A998SK-4 | for HPLC purification |
Borosilicate glass, 1 dram | VWR | 66011-041 | for PAM synthesis |
Borosillicate glass pipet, Long tips | VWR | 14673-043 | for various applications |
Coverslip, 0.16-0.19 mm, 22 x 22 mm | Fisher Scientific | 12-542B | for confocal microscopy |
Cy5 amine | Abcam | ab146463 | for peptide conjugation |
Diethyl ether, ACS grade | Fisher Scientific | E138-1 | for peptide precipitation |
Disposable syringes, 20 mL | Fisher Scientific | 14-817-54 | for HPLC purification |
Double neubauer ruled hemocytometer | VWR | 63510-13 | for cell counting |
DSPE-PEG(2000) amine | Avanti | 880128P | for peptide conjugation |
DSPE-PEG(2000) maleimide | Avanti | 880126P | for peptide conjugation |
DSPE-PEG(2000)-NHS ester | Nanocs | PG2-DSNS-10K | for conjugation to Cy5 |
Dulbecco's modified eagle medium-high glucose | Sigma Aldrich | D5796-500ML | for cell culture |
Fetal bovine serum, qualified, heat inactivated | ThermoFisher Scientific | 10438026 | for cell culture |
Fmoc-L-Ala-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-A | for peptide synthesis |
Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-RBF | for peptide synthesis |
Fmoc-L-Asn(Trt)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-NT | for peptide synthesis |
Fmoc-L-Cys(Trt)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-CT | for peptide synthesis |
Fmoc-L-Gln(Trt)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-QT | for peptide synthesis |
Fmoc-L-Ile-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-I | for peptide synthesis |
Fmoc-L-Leu-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-L | for peptide synthesis |
Fmoc-L-Lys(Boc)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-KBC | for peptide synthesis |
Fmoc-L-Phe-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-F | for peptide synthesis |
Fmoc-L-Ser(tBu)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-SB | for peptide synthesis |
Fmoc-L-Thr(tBu)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-TB | for peptide synthesis |
Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-YB | for peptide synthesis |
Fmoc-L-Val-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-V | for peptide synthesis |
Fmoc-Lys(Boc)-wang resin, 100-200 mesh | Novabiochem | 856013 | for peptide synthesis |
Formic acid, optima LC/MS grade | Fisher Scientific | A117-50 | for HPLC purification |
Glycerol | VWR | M152-1L | for confocal microscopy |
Hand tally counter | Fisher Scientific | S90189 | for cell counting |
Magnetic stir bars, egg-shaped | VWR | 58949-006 | for peptide conjugation |
Methanol, ACS certified | Fisher Scientific | A412-4 | for PAM synthesis |
MTS cell proliferation colorimetric assay kit | VWR | 10191-104 | for MTS assay |
N,N-Dimethylformamide, sequencing grade | Fisher Scientific | BP1160-4 | for peptide synthesis |
N-Methylmorpholine | Protein Technologies | S-1L-NMM | for peptide synthesis |
Paraformaldehyde | Fisher Scientific | AC416780250 | for fixing cells |
PBS, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 10010049 | for various applications |
Penicillin/streptomycin, 10,000 U/mL | ThermoFisher Scientific | 15140122 | for cell culture |
Peptide synthesis vessel, 25 mL | Fisher Scientific | CG186011 | for peptide synthesis |
Phosphotungstic acid | Fisher Scientific | A248-25 | for TEM |
Piperidine | Spectrum | P1146-2.5LTGL | for peptide synthesis |
Plain glass microscope slide 75 x 25 mm | Fisher Scientific | 12-550-A3 | for confocal microscopy |
Reagent reservoirs, sterile | VWR | 95128093 | for cell culture |
Self-closing tweezer | TedPella | 515 | for TEM |
TEM support film | TedPella | 01814F | for TEM |
Trifluoroacetic acid | Fisher Scientific | BP618-500 | for peptide cleavage and HPLC purification |
Triisopropylsilane | VWR | TCT1533-5ml | for peptide cleavage |
Trypan blue solution, 0.4% | ThermoFisher Scientific | 15250061 | for cell counting |
Tweezer, general purpose-serrated | VWR | 231-SA-SE | for confocal microscopy |
WEHI-274.1 | ATCC | ATCC CRL-1679 | murine monocyte |
automated benchtop peptide synthesizer | Protein Technologies | PS3 Benchtop Peptide Synthesizer | |
α- cyano- 4- hydroxycinnamic acid, 99% | Sigma Aldrich | 476870-2G | for MALDI |