Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

توليف لاستهداف الوحيدات في المذيلات أمفيفيلي الببتيد للتصوير من تصلب الشرايين

Published: November 17, 2017 doi: 10.3791/56625
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, University of Southern California

Summary

وتعرض هذه الورقة طريقة تنطوي على التوليف وتوصيف لاستهداف الوحيدات المذيلات أمفيفيلي الببتيد والمقابلة لها فحوصات لاختبار توافق مع الحياة وقدرة مذيل لربط وحيدات.

Abstract

تصلب الشرايين هو مساهم رئيسي في أمراض القلب والشرايين، السبب الرئيسي للوفاة في العالم، الذي يدعى حياة 17.3 مليون سنوياً. تصلب الشرايين هو أيضا السبب الرئيسي للموت المفاجئ واحتشاء عضلة القلب، بتحريض من لويحات غير المستقرة التي تمزق وأوككلودي الأوعية الدموية دون سابق إنذار. التصوير الطرائق الحالية لا يمكن التفريق بين لويحات المستقرة وغير المستقرة التي تمزق. الببتيد أمفيفيليس المذيلات (PAMs) يمكن التغلب على هذا العيب كما أنها يمكن تعديلها مع مجموعة متنوعة من استهداف مويتيس التي تربط على وجه التحديد للأنسجة المريضة. أظهرت وحيدات لتكون علامات مبكرة لتصلّب الشرايين، بينما يرتبط تراكم كبير من وحيدات مع لويحات المعرضة للتمزق. ومن ثم، يمكن استخدام الجسيمات النانوية التي يمكن أن تستهدف وحيدات لتميز مراحل مختلفة من تصلب الشرايين. تحقيقا لهذه الغاية، هنا، يمكننا وصف بروتوكول لإعداد الوحيدات-استهداف PAMs (الوحيدات chemoattractant البروتين-1 (العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1) PAMs). PAMs العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 يتم تجميعها ذاتيا من خلال التوليف تحت ظروف معتدلة بشكل جسيمات نانوية من 15 نانومتر في قطر بالقرب من تهمة السطحية محايدة. في المختبر، PAMs تم العثور على أن يكون متوافق حيويا وكان تقارب ملزم عالية وحيدات. إظهار الأساليب الموصوفة هنا وعد لمجموعة واسعة من التطبيقات في تصلب الشرايين، فضلا عن الأمراض الالتهابية الأخرى.

Introduction

أمراض القلب والأوعية الدموية تبقى إلى أن الأسباب الرئيسية للوفاة على الصعيد العالمي مع حوالي1من 17.3 مليون حالة وفاة في جميع أنحاء العالم. أمراض القلب والأوعية الدموية هي أسهم بتصلب الشرايين، شرط فيها لويحات تتراكم في الشرايين، مما يمنع الدم وتدفق الأكسجين إلى خلايا الجسم2،3. ويشمل تطور تصلب الشرايين تصلب الشرايين وسماكة الاستجابة الالتهابية، والايض الدهني غير النظامية، وتراكم البلاك، مما يؤدي إلى اللوحة تمزق واحتشاء عضلة القلب4،5. خلايا بطانية التعبير عن جزيئات السيتوكينات والالتصاق، التي تشمل العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 التي تربط لمستقبلات تشيموكيني ج-C (CCR2) الموجودة على سطح وحيدات6،،من78. تحويل الكولسترول المؤكسد وحيدات إلى الضامة خلال المرحلة المبكرة من تشكيل اللوحة، مما يضاعف الاستجابة الالتهابية في المنطقة ويؤدي إلى إصابة الأنسجة وتشكيل لويحات غير مستقرة أو الضعيفة9، 10.

عادة، يتم تقييم تصلب الشرايين بتقييم لومينال تضيق التشريحية التصوير باستخدام الموجات فوق الصوتية أو تصوير الأوعية11،12. ومع ذلك، هذه الأساليب يمكن فقط تحديد تضييق شديد للجدار الشرياني وليس في مرحلة مبكرة من تصلب الشرايين، كما يؤدي النمو اللوحة الأولى يعيد البناء الشرياني الحفاظ على حجم الشريان والدم تدفق معدل12،13، 14. ولذلك، أونديريبريسينت أنجيوجرامس انتشار تصلب الشرايين. بالإضافة إلى ذلك، حسبت موسع تقنيات التصوير مثل انبعاث فوتون واحد التصوير المقطعي والتصوير المقطعي بالبوزيترون، والتصوير بالرنين المغناطيسي مؤخرا قد استخدمت لتوصيف مورفولوجيا اللوحة كما أنها يمكن أن توفر التفاصيل الأولية و توصيف لويحات. ومع ذلك، هذه الطرائق غالباً محدودة بسبب الافتقار إلى الحساسية، القرار المكانية، أو تتطلب استخدام الإشعاع المؤين، مما يجعل التصوير البلاك التقدم في مختلف مراحل أكثر تحديا1615،، 17. ويظل نظام تصوير للتسليم أن تحدد على وجه التحديد لويحات في مراحل مختلفة من تصلب الشرايين توضع.

جسيمات نانوية أظهرت أن تكون منصة ناشئة في فيفو البلاك الاستهداف والتشخيص18،19،،من2021. على وجه الخصوص، PAMs مفيدة نظراً لتنوع المواد الكيميائية والقدرة على استيعاب مجموعة متنوعة من مويتيس والتراكيب، والأحجام، والأشكال والسطحية الروغان22. أمفيفيليس الببتيد (PAs) تتكون من ماء، الببتيد "هيدجروب" يعلق على ذيل مسعور، التي عادة ما تكون الدهون؛ هذا الهيكل amphiphilic يضفي قدرات ذاتية التركيب ويسمح لعرض متعددي الببتيدات على سطح الجسيمات22،،من2324. هيادجروبس الببتيد يمكن أن تؤثر على شكل الجسيمات عن طريق الطي والربط بين الببتيدات25الهيدروجين. أظهرت الببتيدات أمثال من خلال التفاعل β-ورقة لتشكيل المذيلات ممدود، بينما يمكن أن تشكل تأكيد α-حلزونية كلا المذيلات كروية وطوله22،،من2324، 25،،من2627. يمكن وضع linkers البولي إثيلين غليكول (شماعة) أن الدرع بتهمة الببتيد السطحية بين الببتيد ماء وذيل مسعور PAMs، تعزيز توافر نانوحبيبات في الدوران الجهازي28، 29 , 30 , 31-PAMs أيضا مفيدة لأنها متوافق حيويا وقد ثبت أن لديها مجموعة واسعة من التطبيقات32،33. قابلية الذوبان في الماء من المذيلات يوفر ميزة على سائر الأنظمة المستندة إلى نانوحبيبات مثل بعض الجسيمات النانوية البوليمرية التي هي غير قابلة للذوبان في الماء، ويجب أن تكون قد علقت في سولوبيليزيرس لحقن34. بالإضافة إلى ذلك، يجعل القدرة على خلق PAMs أن تفكيك في الاستجابة لمحفزات محددة PAMs مرشح جذابة ل توصيل العقاقير الخاضعة للمراقبة داخل الخلايا35.

ملزمة لمستقبلات CCR2 وتتراكم في قوس الاورطي، وضعت PAMs سابقا الوحيدات تستهدف رصد المراحل المختلفة للآفات تصلب الشرايين في الشريان الاورطي9. في الفئران-/- الذين يزيد تراكم الوحيدات تناسبياً إلى اللوحة تقدم36. وعلاوة على ذلك، وجد أن المرضى الذين يعانون من لويحات المعرضة لتمزق، والمرحلة المتأخرة تحتوي على كميات أعلى من وحيدات37. ولذلك، بتعديل PAMs لإدماج العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 مفيد لأنه يسمح لقدر أكبر من الدقة الاستهداف والتفريق بين الآفات المبكرة والمتأخرة من مرحلة تصلب الشرايين. كما أن هذه الدراسات دليلاً على مفهوم التحقق من أن PAMs أمنا بما يكفي لاستخدامها بريكلينيكالي ويتم مسح رينالى38. وحيدات والتهاب مميزة للأمراض الأخرى، PAMs العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 يكون يمكن أن تستخدم للتطبيقات التشخيصية والعلاجية في أمراض أخرى وراء تصلب الشرايين8،،من3940 , 41.

هنا، نحن تقرير تلفيق PAMs العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 قابلة الغاية وتجميعها ذاتيا التي أظهرت الحجم الأمثل للجسيمات وتهمة السطحية، والاستهداف الانتقائي وحيدات لتطبيقات الصور المحسنة في تصلب الشرايين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: قراءة العظمية الكاشفات واتبع جميع تدابير السلامة الكيميائية كما هو مطلوب من المؤسسات المحلية.

1-الإعداد للعملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 PAMs

  1. الإعداد للعملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 الببتيد
    1. تزن من 0.25 mmol من معتدلاً-L-ليز (بنك)-وانغ في سفينة رد فعل (RV). شطف في الجانب من RV مع 5 مل ديميثيلفوراميدي (DMF) في غطاء الأبخرة كيميائية.
    2. تحميل RV على المزج الآلي benchtop ببتيد. التحميل المسبق وتعبئتها من الأحماض الأمينية القنينات، ن '--سينفتينركيسفقرلاسيريتس--ج'، من C إلى N-المحطة. وتشمل قنينة فارغة في نهاية الخطوة النهائية deprotection.
      ملاحظة: ببتيد سارعت بالتسلسل، ن '--كنسييرسكقفلرستريفرساتيك--ج'، يمكن أيضا توليفها باستخدام البروتوكول نفسه.
    3. بمجرد الانتهاء من تجميع نقل الببتيدات راتنج من RV إلى القنينة التﻷلؤ مع الميثانول مل 2-3 حتى يتم نقل كافة الراتنجات. بعد الراتنج غرقت إلى الأسفل، إزالة الميثانول طافية وتتبخر المتبقية حتى الجاف. الفراغ الجافة ح 2 إضافية، أو بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
    4. جعل الحل انشقاق 12 مل تحتوي على حمض:ethanedithiol:water:triisopropylsilane (تفا) تريفلوراسيتيك في 94:2.5:2.5:1 المجلد % في غطاء الأبخرة كيميائية. دوامة الانقسام والحل للتأكد من أنها مختلطة بالتساوي.
      تنبيه: لأن ترييسوبروبيلسيلاني واثانيديثيول حساسة للهواء، الأرجون تطهير الأسهم قارورة ترييسوبروبيلسيلاني واثانيديثيول لمدة 1 دقيقة قبل وضعها مرة أخرى.
    5. وضع السفينة التوليف (SV) على شاكر ذراع واسطة لقط بالقرب من الأسفل نصف SV. نقل الراتنج الببتيد إلى SV مع 2 مل من محلول الانقسام حتى يتم نقل كافة الببتيد-الراتنجات.
    6. أغسل جانبي SV مع 3 مل حل الانقسام. قم بإغلاق غطاء SV وهزه في الدقيقة ذبذبات 300 ح 4.
    7. تزن بأنبوب الطرد مركزي فارغة 50 مل. السجل الشامل.
    8. بعد ح 4، استنزاف الحل الببتيد ملصوق من SV في أنبوب 50 مل أجهزة الطرد المركزي. شطف SV عدة مرات مع حل الانقسام المتبقية.
    9. تتبخر الحل الببتيد ملصوق مع النيتروجين حتى يكون هناك أقل من 4 مل المتبقية في الأنبوب الطرد المركزي.
    10. إضافة مل 36 المثلج خماسي البروم ثنائي الفينيل في حل المشقوق الببتيد.
    11. دوامة الحل حتى أنه تماما اللون الأبيض أو الأصفر. الطرد المركزي في 3,000 س ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، وصب المادة طافية.
    12. إضافة 40 مل الاثير المثلج للأنبوب. دوامة و sonicate مرة أخرى. كرر عملية الطرد المركزي. صب المادة طافية.
    13. جاف بيليه السلطة الفلسطينية النفط الخام مع تطهير غاز النيتروجين حتى تبخرت الاثير هو واضح.
    14. إضافة 20 مل المقطر مزدوجة والمياه، ودوامه، و sonicate حتى يذوب الببتيد تماما في الحل.
    15. تجميد الحل وليوفيليزي حتى الجاف.
    16. بمجرد الببتيد هو المجففة، تزن خارج كتلة أنبوب الطرد المركزي التي تتضمن الببتيد الخام. حل الببتيد الخام في المياه 5 ملغ/مل.
    17. حل 25 ملغ من النفط الخام الببتيد العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 في 5 مل من الماء المقطر مزدوجة لجعل مجموع تركيز 5 ملغ/مل. تنقية الببتيد العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 النفط الخام من كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء ([هبلك]) باستخدام 0.1% تفا في الماء (المذيب A) و 0.1% تفا في الاسيتو الانيتريل (المذيب ب) كمراحل المتنقلة على عمود عكس مرحلة C8. حقن 5 مل الببتيد [هبلك].
      ملاحظة: المرحلة الأولى متنقلة تتألف من المذيبات 100% ألف بمعدل تدفق 9.0 مل/دقيقة إنقاص المذيبات ببطء إلى 30 في المائة في 27 دقيقة وعقد في هذا التكوين للحد الأدنى 3 عودة المتدرجة للمذيبات 100% 3 دقيقة وعقد في هذا التشكيل لمدة 1 دقيقة لإعطاء أكثر إجمالي وقت تشغيل من 34 دقيقة تبقى عمود درجة حرارة 55 درجة مئوية. استخدام وضع مصدر أيون إيجابية للتحليل. يمكن استخدام حمض الفورميك بدلاً من تفا، إذا تفا حمضية جداً للعمود [هبلك]. من المستحسن لا تتجاوز سرعة المنحدر تشكيل المذيبات العضوية 2%/min لفصل أفضل.
    18. تحليل كل جزء باستخدام الليزر ساعد مصفوفة الامتزاز/التأين (استخدام) الكتلي للمنتج المتوقع m/z في 2,890.
      ملاحظة: حل حمض α-سينو-4-هيدروكسيسيناميك في 1 ملغ/مل في المياه الاسيتو الانيتريل (المجلد 50: 50 ٪) كحل المصفوفة. بقعة 0.75 ميليلتر من محلول مصفوفة على استخدام لوحة، تليها ميليلتر 0.75 لكل جزء. القيام التحليل باستخدام طريقة أيون انعكاسا إيجابيا في نطاق شامل من 500-5,000 دا.
    19. الجمع بين أجزاء المنتج، ضربة قبالة الاسيتو الانيتريل، تجميد، وليوفيليزي المنقي الببتيدات حتى الجافة.
  2. إعداد السلطة الفلسطينية العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1
    1. إعداد من فائض مولى 1.1 من 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-ن-[amino(polyethylene glycol)-2000 [دسب-شماعة (2000)-ماليميدي إلى الببتيد في قنينات التﻷلؤ منفصلة. يحل كل من المركبات في الماء المقطر مزدوجة لجعل ~ 15 ملغ/مل. Sonicate لمدة 15 دقيقة، أو حتى كل الحلول واضحة تماما.
      ملاحظة: دسب-شماعة (2000)-Cy5 يتم تصنيعه باستخدام البروتوكول نفسه مع دسب-شماعة (2000)--أمين و Cy5 إستر فونكتيوناليزيد ن-هيدروكسيسوكسينيميدي (NHS)، باستثناء الخطوة 1.2.3، حيث يتم ضبط الأس الهيدروجيني للحل إلى 8.5.
    2. إضافة دسب-شماعة (2000)-ماليميدي الحل إلى الحل الببتيد. دوامة و sonicate.
    3. إضافة 1 "م هيدروكسيد الصوديوم" dropwise (1 ميليلتر) في وقت واحد حتى الرقم الهيدروجيني للحل هو 7.
    4. الحل إزالة النيتروجين للحد الأدنى 5 إثارة الحل بين عشية وضحاها.
    5. تجميد الحل وليوفيليزي حتى الجاف.
    6. مرة واحدة هو المنتج الخام المجففة، حل الصلبة في الماء 5 ملغ/مل.
    7. تنقية مع [هبلك] كما هو موضح أعلاه.
      ملاحظة: الببتيد أونكونجوجاتيد و DSPE-PEG(2000) أن الوت بين 15 30 في المائة تركيز العضوية (المجلد %)، بينما دسب-شماعة المتقارن (2000)-العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 ينبغي أن الوت بين 40-50% تركيز العضوية.
    8. تحليل كل جزء باستخدام استخدام الطيف الكتلي للمقابلة م/ز. دسب-شماعة (2000)-العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 ينبغي أن يكون ذروة واسعة m/z في 5,760.
      ملاحظة: حمض 2، 5-ديهيدروكسيبينزويك أفضل المصفوفة لشماعة دسب (2000)-العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 باستخدام.
  3. الجمعية العامة للعملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 PAMs
    1. حل 1.75 mg PAs العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 مع 3 مل الميثانول في قنينة 1-أرميني. Sonicate حتى يذوب العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 "السلطة الفلسطينية" تماما.
      ملاحظة: يمكن إدراج أمفيفيليس Cy5 بنسبة مولى 10:90 "السلطة الفلسطينية" العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 للتطبيقات التصوير.
    2. يتبخر الميثانول تحت النيتروجين في حركة دائرية أثناء الشطف الميثانول المتبقية قبالة الجانب القنينة حتى يتم تشكيل فيلم موحدة في أسفل القنينة. الفراغ الجافة الفيلم بين عشية وضحاها.
    3. هيدرات الفيلم مع 3 مل من المخزن المؤقت للمياه أو الفوسفات المالحة (PBS) جعل حل 100 ميكرون من العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 PAMs. بلطف من دوامة و sonicate الحل حتى واضحة. احتضان عند 80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: درجة حرارة مرتفعة قد ثبت للتعجيل بعملية التجميع الذاتي ويسمح المكون الببتيد لتشكيل هيكل الثانوية الأكثر استقرارا، بينما خفض تركيز (CMC) مذيل الحرجة42،43.
    4. بارد التشتت الناتج إلى درجة حرارة الغرفة.

2-وصف العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 PAMs

  1. تشتت الضوء الحيوي (DLS) وزيتا المحتملة
    1. المكان 100 ميكرومتر بالعملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 "أم" أو أم سارعت في ومبومو وفقا لتعليمات الصك المحتمل DLS أو زيتا.
      ملاحظة: دائرة الأراضي والمساحة وزيتا الترعة المحتملة يمكن أن تختلف استناداً إلى الإرشادات في الصك.
    2. حجته الصك إلى درجة حرارة الغرفة. قياس حجم وتهمة السطحية بام.
  2. مجهر إلكتروني (TEM)
    1. إضافة ميليلتر 7 من 50 ميكرومتر علقت بالعملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 أم أو أم سارعت إلى شبكة ال داخل الملاقط إغلاق الذاتي للحد الأدنى 5 الفتيل بعيداً الحبرية مع مسح مهمة حساسة.
    2. إضافة 7 ميليلتر من الماء لغسل الشبكة. فتيلة بعيداً الحبرية.
    3. إضافة ميليلتر 7 1 wt % حمض فوسفوتونجستيك للحد الأدنى 2 الفتيل بعيداً الحبرية. كرر الخطوة 2.2.2.
    4. الجاف للشبكة تيم قبل تحليل ال.
  3. مطيافية تلوانيه دائرية (CD)
    1. قم بتشغيل النيتروجين لمدة 5-10 دقائق قبل استخدامها للصك.
    2. ضع 300 ميليلتر من فارغة (الماء أو برنامج تلفزيوني) في ومبومو.
    3. قياس الأطياف في شمال البحر الأبيض المتوسط 190-265، 0.2 مم طول المسار مع وقت تكامل s 1، وشمال البحر الأبيض المتوسط 1 عرض النطاق ترددي في درجة حرارة الغرفة. جمع 3 وإنشاء نسخ متماثلة.
    4. قياس 100 ميكرومتر العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 الببتيد، "أم" العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1، سارعت الببتيد، وسارعت بام تحت نفس الظروف الموصوفة في الخطوة 2.3.3. استقطاع من الفراغ.
    5. تناسب البيانات باستخدام استيفاء خطي بوليليسيني أساس الأطياف.
    6. إيقاف تشغيل الأداة. انتظر 10 دقائق قبل إيقاف تشغيل النيتروجين.

3-تحليل في المختبر للعملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 PAMs

  1. توافق مع الحياة في المختبر
    1. الثقافة وتوسيع وحيدات موريني WEHI 274.1 في "تعديل النسر المتوسطة" دولبيكو وتستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS)، 1% البنسلين-ستربتوميسين، و 0.05 ملم 2-mercaptoethanol في 37 درجة مئوية تحت 5% CO2 إلى الممر 5.
      ملاحظة: WEHI 274.1 هي تعليق الخلايا. الإعلام عند استزراع، ينبغي أن تعاد كل 2-3 أيام.
    2. بيبيت وحيدات في وسائل الإعلام في أنبوب الطرد مركزي عقيمة 50 مل. أجهزة الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
    3. نضح وسائط الإعلام القديمة وريسوسبيند في 10 مل وسائط جديدة في أنبوب الطرد المركزي. المزيج ببطء حتى الخلايا وتوزع بالتساوي في وسائل الإعلام. عد الخلايا باستخدام التلوين تريبان الأزرق وهيموسيتوميتير.
    4. تمييع الخلايا مثل أن هناك وحيدات 4,000 كل ميليلتر 90 من وسائل الإعلام كل بئر. إضافة ميليلتر 90 من الخلايا في آبار صفيحة 96-جيدا. احتضانها ح 24.
      ملاحظة: تجنب استخدام الآبار على الحافة الخارجية اللوحة لتجنب الخلافات في التبخر والتغيرات الحرارية في اللوحة. سد الآبار الخارجي مع 100 ميليلتر PBS.
    5. حل µmol 0.15 الببتيد العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 أو بالعملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 "أم"، سارعت الببتيد أو أم سارعت في 150 ميليلتر PBS في أنابيب ميكروسينتريفوجي منفصلة، والتعقيم. أداء تمييع المسلسل جعل ميليلتر 65 من 1 و 10 و 100 ميكرومتر لكل عينة.
    6. إضافة 10 ميليلتر PBS كل التركيز في الآبار التي تحتوي على WEHI 274.1 (الحجم الإجمالي: 100 ميليلتر الواحد جيدا، 6 خطوط الآبار الإجمالية 96). احتضانها ح 72.
    7. إضافة 10 ميليلتر (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) (MTS) في كل بئر. احتضانها ح 1.
    8. تحليل امتصاص استخدام قارئ لوحة في 490 نيوتن متر أو استناداً إلى إرشادات الشركة المصنعة.
  2. في المختبر ملزمة مذيل
    1. البذور 500,000 وحيدات في كل بئر من لوحة 6-جيدا في 2 مل وسائط التي تحتوي على 100 ميكرومتر "أم" العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 المسمى Cy5 (نسبة 10:90 المولى دسب-شماعة (2000)-Cy5 و "السلطة الفلسطينية" العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1). احتضانها ح 1.
    2. جمع WEHI 274.1 بالطرد المركزي على 300 غرام x لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. نضح وسائط الإعلام.
    3. ريسوسبيند وغسل الخلايا في 2 مل برنامج تلفزيوني. أجهزة الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. نضح في برنامج تلفزيوني. كرر عملية الغسيل مع 2 مل برنامج تلفزيوني. نضح في برنامج تلفزيوني.
    4. إضافة 2 مل من البرد بارافورمالدهيد 4% إصلاح الخلايا. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
    5. بيبيت الخلايا الثابتة على ساترة زجاجية معقمة داخل آبار لوحة 6-جيدا. الطرد المركزي في 400 غرام x لمدة 5 دقائق.
    6. قم بإزالة بارافورمالدهيد. غسل وشطف مع 2 مل برنامج تلفزيوني مرة واحدة. ريسوسبيند مع 1 مل PB
      ملاحظة: عند الشطف، تجنب تعطيل الخلايا على ساترة.
    7. وضع 10 ميليلتر من والغليسيرول 90% في برنامج تلفزيوني على شريحة. استخدام إبرة وملقط لالتقاط ساترة. جاف على حافة ساترة. بلطف ضع ساترة إلى شريحة facedown.
    8. ختم بلطف على حافة ساترة مع طلاء الأظافر واضحة. ضع في الثلاجة حتى جاهزة للتصوير.
    9. استخدام ليزر [كنفوكل] المسح مجهر (كلسم) المثبتة مع أشعة الليزر ل Cy5 في λالإثارة = 650 نانومتر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الإعداد للعملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 بام
عزر ملزمة CCR2 (بقايا 13-35) للعملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 البروتين [ينفتنركيسفقرلاسيريتسك] أو الببتيد المجمعة [ينسلففريرنستقركيراسيست] تعديل بإضافة بقايا سيستين على N-المحطة. الببتيد العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 تم تصنيعه بطريقة المرحلة الصلبة معتدلاً بوساطة استخدام المزج الآلي ببتيد. تمت تنقيته الببتيد الخام بعكس المرحلة [هبلك] في عمود C8 عند 50 درجة مئوية باستخدام 0.1% تفا في خلائط الاسيتو الانيتريل والمياه، وتتميز باستخدام الطيف الكتلي (الشكل 1). وكان مترافق المحتوية على سيستين الببتيد إلى دسبي-PEG2000-ماليميدي أن تسفر عن شماعة دسبي (2000)-الببتيد يصرف عن طريق ربط ثيويثير. بعد 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة، تمت تنقية النفط الخام المنتج من [هبلك] (الشكل 2). دسب-شماعة (2000)-Cy5 تم تصنيعه باستخدام فعل إستر دائرة الصحة الوطنية. الوحيدات-استهداف PAMs تجميعها يشترك مع شماعة دسبي (2000)-العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 دسبي-شماعة (2000)--Cy5 كانت ملفقة بتذويب في الميثانول وقد تبخرت ثم ن2، والفيلم الناتج كان المجفف تحت الفراغ بين عشية وضحاها وتجميعها ذاتيا في المياه أو برنامج تلفزيوني عن طريق التفاعلات مسعور "مجموعات الذيل" لنموذج العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 PAMs.

وصف للعملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 بام
بيانات دائرة الأراضي والمساحة وصور تيم الوحيدات-استهداف PAMs أظهرت نانوحبيبات جيدا مشتتة، كروية من 15.3 ± 2.0 نانومتر في القطر (الشكل 3 و الجدول 1). PAMs العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 وسارعت PAMs أظهرت زيتا إيجابية طفيفة محتملة من 12.1 mV ± 3.1 و 13.7 ± 1.9 mV، على التوالي (الجدول 1). مؤتمر نزع السلاح قد أظهرت أن إدماج الببتيد العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 داخل مذيل تعزيز هيكل الثانوية (الجدول 2، PAMs العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1: 46.2 ± 0.9% β-ورقة و 53.1 ± 1.4% لفائف عشوائي MCP1 الحرة: 34.2 ± 3.5% β-ورقة، 65.8 ± 3.5% لفائف عشوائي).

في المختبر تحليل العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 بام
ولوحظت في المختبر توافق مع الحياة والوحيدات الملزمة للعملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 PAMs بالفحص المجهري [كنفوكل]. كانت المحتضنة وحيدات الماوس مع التركيزات المتزايدة للعملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 والعملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 بام، سارعت الببتيد وسارعت بام ح 72، وتم العثور على الخلايا لتكون قابلة للحياة ومتوافق حيويا حتى 100 ميكرومتر (الشكل 4). علاوة على ذلك، أظهر الفحص المجهري [كنفوكل] ملزمة محددة من وحيدات للعملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 PAMs عند مقارنتها بالمجمعة PAMs (الشكل 5).

Figure 1
الشكل 1 : [هبلك] chromatogram 220 نيوتن متر (الطول الموجي لسندات ببتيد) و 254 نانومتر (الطول الموجي تيروزين) العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 الببتيد (A) وسارعت الببتيد (ب) (مربع الذروة في دقيقة 7.4). TOF استخدام الطيف الشامل للعملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 الببتيد (ج) وسارعت الببتيد (د) في مجموعة من 500-5,000 دا عرض الذروة [M + H]+ في m/z 2,888 (2,890 المتوقعة). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: [هبلك] chromatogram 220 نيوتن متر (الطول الموجي لسندات ببتيد) و 254 نانومتر (الطول الموجي تيروزين) دسبي-شماعة (2000)-العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 (A) ودسبي-شماعة (2000)-سارعت (ب). (الذروة محاصر في دقيقة 16.9). (ج) استخدام-TOF كتلة الطيف دسبي-شماعة (2000)-العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 في مجموعة من 1,000-10,000 دا عرض القمم [M + H]+ في m/z 2,888 (2,890 المتوقعة) للعملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 و m/z 5,758 (5,760 المتوقعة) لربط دسبي (2000)-العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1. (د) استخدام-TOF كتلة الطيف دسب-شماعة (2000)-سارعت في طائفة من 1,000-10,000 دا عرض القمم [M + H]+ في m/z 2,887 (2,890 المتوقعة) لسارعت الببتيد و m/z 5,761 (5,760 المتوقعة) دسب-شماعة-تدافعت. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : صور تيم للعملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 "بام" (A)، وسارعت بام (ب). شريط المقياس = 100 نانومتر. توزيع عدد من المتوسط الحجم "بام" العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 (ج)، وسارعت بام عبر DLS (د). تكون البيانات يعني ± التنمية المستدامة (n = 3). (ﻫ) تحليل القرص المضغوط للعملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 وسارعت الببتيدات و PAMs (n = 3). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4 : في المختبر إمكانية وحيدات موريني WEHI 274.1 بعد التعرض ح 72 للعملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 الببتيد والعملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 بام، سارعت الببتيد، وسارعت PAM. تكون البيانات يعني ± التنمية المستدامة (n = 6). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
5 الرقم: صور كلسم للعملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 "بام" (A)، وسارعت بام (ب) تدمج مع مول 10% Cy5 السلطة الفلسطينية (أحمر) المحتضنة مع 274.1 WEHI لشريط مقياس حاء – 1 = 20 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

PAMs عدد أفي القطر (nm) حزب النضال الديمقراطي الإندونيسي إمكانات زيتا (mV)
العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 15.3 ± 2.0 0.119 ± 0.006 12.1 ± 3.1
سارعت 16.9 ± 1.4 0.232 ± 0,019 13.7 ± 1.9
تقاس في المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني. يتم التعبير عن البيانات يعني ± التنمية المستدامة.

الجدول 1: الحجم، بوليديسبيرسيتي، وإمكانات زيتا PAMs.

-اللولب (%) ب-ورقة (%) لفائف عشوائية (%)
الببتيد العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 0.0 ± 0.0 36.2 ± 2.2 63.8 ± 1.8
أم العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 0.7 ± 0.6 46.2 ± 0.9 53.1 ± 1.4
الببتيد المجمعة 0.0 ± 0.0 43.7 ± 2.1 56.3 ± 3.5
سارعت بام 0.0 ± 0.0 60.7 ± 0.2 39.3 ± 0.2

الجدول 2: تكوين بنية ثانوية من الببتيدات و PAMs-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

PAMs العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 هي منصة تصوير جزيئي واعدة، تتألف من الببتيد استهداف ماء وذيل مسعور الذي يدفع بطبيعة نانوحبيبات تجميعها ذاتيا. يمكن إعداد هذا مذيل استهداف الوحيدات بتوليف بسيطة وخطوات تنقية العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 الببتيد ودسب-شماعة (2000)-العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1. وقد PAMs العديد من الخصائص المفيدة في فيفو التصوير الجزيئي مثل على التجميع الذاتي تحت ظروف معتدلة وتحلل الأحيائي الجوهرية والتنوع الهيكلي والكيميائية مما يسمح لإدراج أخرى مويتيس التصوير أو استهداف الببتيدات الإدلاء بشكل انتقائي لموقع معين من الفائدة. يمكن ضبطها على حجم الجسيمات، والشكل، وتكوين بتغيير الببتيد، ذيل مسعور، أو تركيز مذيل، السماح للخواص الكيميائية والفيزيائية الأمثل لمجموعة متنوعة من التطبيقات22،33.

تجدر الإشارة إلى عدد قليل من القيود لهذا البروتوكول. أولاً، منذ PAMs تدفعها التفاعلات مسعور، من الضروري لتشييد الببتيدات الاستهداف التي ماء، مما يسمح لمجموعة استهداف ستعرض على سطح مذيل. إذا كان التسلسل الببتيد مسعور، يمكن أن تستوعب إضافة الأحماض الأمينية ماء واحد أو اثنين في المحطة ج، ولكن إضافة الأحماض الأمينية يمكن أن تؤثر على هيكل الببتيد الثانوي داخل مذيل التالي تغيير الخصائص الببتيد في حالته الأصلية في44،البروتين45. ثانيا، في تركيزات منخفضة، PAMs لها الاستقرار الفقراء في البيئات المائية كما أنها تعتمد اعتماداً كبيرا على اللجنة العسكرية المركزية، أن تركيز الحد الأدنى اللازمة لتقييم الأداء لتشكيل هيكل micellar من46. فيما يلي اللجنة العسكرية المركزية، مذيل يفكك للفرد السلطة الفلسطينية مونومرات، ويحد من مذيل بمثابة ناقل وتفريغ مخدرات في موقع معين47. للتخفيف من حدة هذا العيب، يمكن تقليل المركزية بزيادة طول سلسلة من ال48،ذيل مسعور49. وأخيراً، لا ينصح بتخزين طويل الأجل PAMs في حل كهيكل السلطة الفلسطينية الثانوية يمكن أن تتغير مع مرور الوقت، مما يؤثر على هيكل ميسيلار والاستقرار، فضلا عن الكفاءة في يجند ملزمة26.

وخلاصة القول، هذا البروتوكول يوضح استراتيجية تستند إلى مذيل لطب النانوي ببتيد قوية وتجميعها ذاتيا للتصوير تصلب الشرايين. PAMs العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 متوافق حيويا والقابلة للتحلل، وغير سام كمكونات مذيل مستوحاة من العناصر الذاتية للجسم. الأهم من ذلك، قد PAMs العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 ربط تفضيلية وحيدات، التي تزيد تناسبياً إلى تطور اللوحة، تيسير اتباع نهج غير الغازية للتفريق بين المراحل لويحات تصلب الشرايين. بسبب نمطية لهذا النظام الأساسي، يمكن إدراج PAMs المداواة، إضافية تستهدف الببتيدات والتصوير مويتيس، والأحماض النووية. ومن ثم، ونظرا لهذه القدرات الحيوية لهذه المذيلات متعددة الوظائف، نعتقد أن هذه الجسيمات تبشر كبيرة للترجمة السريرية في تصلب الشرايين وغيرها من الأمراض.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

الكتاب يود أن ينوه دعم مالي من جامعة كاليفورنيا الجنوبية وقلب الوطنية والرئة، والدم معهد (NHLBI)، R00HL124279، وايلي واديت جائزة الابتكار واسعة ومؤسسة ويتير عدم-السرطان جائزة البحوث متعدية الجنسيات الممنوحة للمجموعة. يشكر المؤلفون المركز الميكروسكوب الإلكتروني وسليكيه، ومركز التميز في نانوبيوفيسيكس، ومركز التميز "التوصيف الجزيئي" ويشغل مركز تصوير في جامعة كاليفورنيا الجنوبية للمساعدة في الأجهزة مفيدة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-ethanedithiol VWR E0032 for peptide synthesis
10 mL disposable serological pipets VWR 89130-898 for cell culture
15 mL centrifuge tubes, polypropylene VWR 89401-566 for various applications
2,5-dihydroxybenzoic acid, 99% Fisher Scientific AC165200050 for MALDI
25 mL disposable serological pipets VWR 89130-900 for cell culture
2-Mercaptoethanol, 50 mM ThermoFisher Scientific 31350010 for cell culture
5 mL disposable serological pipets VWR 89130-896 for cell culture
50 mL centrifuge tubes VWR 89039-658 for various applications
75 cm2 culture flask Fisher Scientific 13-680-65 for cell culture
75 mL reaction vessel Protein Technologies 3000005 for peptide synthesis
96-wells cell culture plate VWR 40101-346 for MTS assay
Acetonitrile, HPLC grade Fisher Scientific A998SK-4 for HPLC purification
Borosilicate glass, 1 dram VWR 66011-041 for PAM synthesis
Borosillicate glass pipet, Long tips VWR 14673-043 for various applications
Coverslip, 0.16-0.19 mm, 22 x 22 mm Fisher Scientific 12-542B for confocal microscopy
Cy5 amine Abcam ab146463 for peptide conjugation
Diethyl ether, ACS grade Fisher Scientific E138-1 for peptide precipitation
Disposable syringes, 20 mL Fisher Scientific 14-817-54 for HPLC purification
Double neubauer ruled hemocytometer VWR 63510-13 for cell counting
DSPE-PEG(2000) amine Avanti 880128P for peptide conjugation
DSPE-PEG(2000) maleimide Avanti 880126P for peptide conjugation
DSPE-PEG(2000)-NHS ester  Nanocs PG2-DSNS-10K for conjugation to Cy5
Dulbecco's modified eagle medium-high glucose Sigma Aldrich D5796-500ML for cell culture
Fetal bovine serum, qualified, heat inactivated ThermoFisher Scientific 10438026 for cell culture
Fmoc-L-Ala-OH /HBTU Protein Technologies PS3-H5-A for peptide synthesis
Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH /HBTU Protein Technologies PS3-H5-RBF for peptide synthesis
Fmoc-L-Asn(Trt)-OH /HBTU Protein Technologies PS3-H5-NT for peptide synthesis
Fmoc-L-Cys(Trt)-OH /HBTU Protein Technologies PS3-H5-CT for peptide synthesis
Fmoc-L-Gln(Trt)-OH /HBTU Protein Technologies PS3-H5-QT for peptide synthesis
Fmoc-L-Ile-OH /HBTU Protein Technologies PS3-H5-I for peptide synthesis
Fmoc-L-Leu-OH /HBTU Protein Technologies PS3-H5-L for peptide synthesis
Fmoc-L-Lys(Boc)-OH /HBTU Protein Technologies PS3-H5-KBC for peptide synthesis
Fmoc-L-Phe-OH /HBTU Protein Technologies PS3-H5-F for peptide synthesis
Fmoc-L-Ser(tBu)-OH /HBTU Protein Technologies PS3-H5-SB for peptide synthesis
Fmoc-L-Thr(tBu)-OH /HBTU Protein Technologies PS3-H5-TB for peptide synthesis
Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH /HBTU Protein Technologies PS3-H5-YB for peptide synthesis
Fmoc-L-Val-OH /HBTU Protein Technologies PS3-H5-V for peptide synthesis
Fmoc-Lys(Boc)-wang resin, 100-200 mesh Novabiochem 856013 for peptide synthesis
Formic acid, optima LC/MS grade Fisher Scientific A117-50 for HPLC purification
Glycerol VWR M152-1L for confocal microscopy
Hand tally counter Fisher Scientific S90189 for cell counting
Magnetic stir bars, egg-shaped VWR 58949-006 for peptide conjugation
Methanol, ACS certified Fisher Scientific A412-4 for PAM synthesis
MTS cell proliferation colorimetric assay kit VWR 10191-104 for MTS assay
N,N-Dimethylformamide, sequencing grade Fisher Scientific BP1160-4 for peptide synthesis
N-Methylmorpholine Protein Technologies S-1L-NMM for peptide synthesis
Paraformaldehyde Fisher Scientific AC416780250 for fixing cells
PBS, pH 7.4 ThermoFisher Scientific 10010049 for various applications
Penicillin/streptomycin, 10,000 U/mL ThermoFisher Scientific 15140122 for cell culture
Peptide synthesis vessel, 25 mL  Fisher Scientific CG186011 for peptide synthesis
Phosphotungstic acid  Fisher Scientific A248-25 for TEM
Piperidine Spectrum P1146-2.5LTGL for peptide synthesis
Plain glass microscope slide 75 x 25 mm Fisher Scientific 12-550-A3 for confocal microscopy
Reagent reservoirs, sterile  VWR 95128093 for cell culture
Self-closing tweezer TedPella 515 for TEM
TEM support film TedPella 01814F for TEM
Trifluoroacetic acid  Fisher Scientific BP618-500 for peptide cleavage and HPLC purification
Triisopropylsilane VWR TCT1533-5ml for peptide cleavage
Trypan blue solution, 0.4% ThermoFisher Scientific 15250061 for cell counting
Tweezer, general purpose-serrated VWR 231-SA-SE for confocal microscopy
WEHI-274.1 ATCC ATCC CRL-1679 murine monocyte
automated benchtop peptide synthesizer Protein Technologies PS3 Benchtop Peptide Synthesizer
α- cyano- 4- hydroxycinnamic acid, 99% Sigma Aldrich 476870-2G for MALDI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mozaffarian, D., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), e38-e60 (2016).
  2. Falk, E. Pathogenesis of atherosclerosis. J. Am. Coll. Cardiol. 47 (8, Suppl. C), C7-C12 (2006).
  3. Rahmani, M., Cruz, R. P., Granville, D. J., McManus, B. M. Allograft Vasculopathy Versus Atherosclerosis. Circ. Res. 99 (8), 801-815 (2006).
  4. Luis, A. J. Atherosclerosis. Nature. 407 (6801), 233-241 (2000).
  5. Libby, P., Ridker, P. M., Hansson, G. K. Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis. Nature (London, U. K). 473 (7347), 317-325 (2011).
  6. Boring, L., Gosling, J., Cleary, M., Charo, I. F. Decreased lesion formation in CCR2-/- mice reveals a role for chemokines in the initiation of atherosclerosis. Nature (London). 394 (6696), 894-897 (1998).
  7. Szmitko, P. E., et al. New Markers of Inflammation and Endothelial Cell Activation. Circulation. 108 (16), 1917-1923 (2003).
  8. Deshmane, S. L., Kremlev, S., Amini, S., Sawaya, B. E. Monocyte Chemoattractant Protein-1 (MCP-1): An Overview. J. Interferon Cytokine Res. 29 (6), 313-326 (2009).
  9. Chung, E. J., et al. Monocyte-Targeting Supramolecular Micellar Assemblies: A Molecular Diagnostic Tool for Atherosclerosis. Adv. Healthcare Mater. 4 (3), 367-376 (2015).
  10. Chung, E. J. Targeting and therapeutic peptides in nanomedicine for atherosclerosis. Exp Biol Med (Maywood). 241 (9), 891-898 (2016).
  11. Sanz, J., Fayad, Z. A. Imaging of atherosclerotic cardiovascular disease. Nature (London, U. K.). 451 (7181), 953-957 (2008).
  12. Tarkin, J. M., et al. Imaging Atherosclerosis. Circ. Res. 118 (4), 750-769 (2016).
  13. Hennerici, M., Baezner, H., Daffertshofer, M. Ultrasound and arterial wall disease. Cerebrovasc Dis. 17 Suppl 1, 19-33 (2004).
  14. Nissen, S. E. Application of intravascular ultrasound to characterize coronary artery disease and assess the progression or regression of atherosclerosis. Am J Cardiol. 89 (4A), 24B-31B (2002).
  15. Khalil, M. M., Tremoleda, J. L., Bayomy, T. B., Gsell, W. Molecular SPECT Imaging: An Overview. Int J Mol Imaging. 2011, 796025 (2011).
  16. Lerakis, S., et al. Imaging of the vulnerable plaque: noninvasive and invasive techniques. Am J Med Sci. 336 (4), 342-348 (2008).
  17. Sun, Z. H., Rashmizal, H., Xu, L. Molecular imaging of plaques in coronary arteries with PET and SPECT. J Geriatr Cardiol. 11 (3), 259-273 (2014).
  18. Godin, B., et al. Emerging applications of nanomedicine for the diagnosis and treatment of cardiovascular diseases. Trends Pharmacol. Sci. 31 (5), 199-205 (2010).
  19. Branco de Barros, A. L., Tsourkas, A., Saboury, B., Cardoso, V. N., Alavi, A. Emerging role of radiolabeled nanoparticles as an effective diagnostic technique. EJNMMI Res. 2 (1), 31-39 (2012).
  20. Jayagopal, A., Linton, M. F., Fazio, S., Haselton, F. R. Insights into atherosclerosis using nanotechnology. Curr. Atheroscler. Rep. 12 (3), 209-215 (2010).
  21. Khodabandehlou, K., Masehi-Lano, J. J., Poon, C., Wang, J., Chung, E. J. Targeting cell adhesion molecules with nanoparticles using in vivo and flow-based in vitro models of atherosclerosis. Exp Biol Med (Maywood). 242 (8), 799-812 (2017).
  22. Trent, A., Marullo, R., Lin, B., Black, M., Tirrell, M. Structural properties of soluble peptide amphiphile micelles. Soft Matter. 7 (20), 9572-9582 (2011).
  23. Hartgerink, J. D., Beniash, E., Stupp, S. I. Peptide-amphiphile nanofibers: A versatile scaffold for the preparation of self-assembling materials. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (8), 5133-5138 (2002).
  24. Missirlis, D., et al. Effect of the Peptide Secondary Structure on the Peptide Amphiphile Supramolecular Structure and Interactions. Langmuir. 27 (10), 6163-6170 (2011).
  25. Zhong, L., Johnson, W. C. Environment affects amino acid preference for secondary structure. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89 (10), 4462-4465 (1992).
  26. Shimada, T., Lee, S., Bates, F. S., Hotta, A., Tirrell, M. Wormlike Micelle Formation in Peptide-Lipid Conjugates Driven by Secondary Structure Transformation of the Headgroups. J. Phys. Chem. B. 113 (42), 13711-13714 (2009).
  27. Missirlis, D., et al. Linker Chemistry Determines Secondary Structure of p5314-29 in Peptide Amphiphile Micelles. Bioconjugate Chem. 21 (3), 465-475 (2010).
  28. Elbert, D. L., Hubbell, J. A. Surface treatments of polymers for biocompatibility. Annu. Rev. Mater. Sci. 26, 365-394 (1996).
  29. Xue, Y., O'Mara, M. L., Surawski, P. P. T., Trau, M., Mark, A. E. Effect of Poly(ethylene glycol) (PEG) Spacers on the Conformational Properties of Small Peptides: A Molecular Dynamics Study. Langmuir. 27 (1), 296-303 (2011).
  30. Canalle, L. A., Loewik, D. W. P. M., van Hest, J. C. M. Polypeptide-polymer bioconjugates. Chem. Soc. Rev. 39 (1), 329-353 (2010).
  31. Hamley, I. W. PEG-Peptide Conjugates. Biomacromolecules. 15 (5), 1543-1559 (2014).
  32. Acar, H., et al. Self-assembling peptide-based building blocks in medical applications. Adv. Drug Delivery Rev. , (2016).
  33. Busseron, E., Ruff, Y., Moulin, E., Giuseppone, N. Supramolecular self-assemblies as functional nanomaterials. Nanoscale. 5 (16), 7098-7140 (2013).
  34. Barrett, J. C., et al. Modular Peptide Amphiphile Micelles Improving an Antibody-Mediated Immune Response to Group A Streptococcus. ACS Biomater. Sci. Eng. 3 (2), 144-152 (2017).
  35. Toughrai, S., et al. Reduction-Sensitive Amphiphilic Triblock Copolymers Self-Assemble Into Stimuli-Responsive Micelles for Drug Delivery. Macromol. Biosci. 15 (4), 481-489 (2015).
  36. Swirski, F. K., et al. Monocyte accumulation in mouse atherogenesis is progressive and proportional to extent of disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103 (27), 10340-10345 (2006).
  37. Kashiwagi, M., et al. Association of monocyte subsets with vulnerability characteristics of coronary plaques as assessed by 64-slice multidetector computed tomography in patients with stable angina pectoris. Atherosclerosis (Amsterdam, Neth). 212 (1), 171-176 (2010).
  38. Chung, E. J., Tirrell, M. Recent Advances in Targeted, Self-Assembling Nanoparticles to Address Vascular Damage Due to Atherosclerosis. Adv. Healthcare Mater. 4 (16), 2408-2422 (2015).
  39. Cassetta, L., Pollard, J. W. Cancer immunosurveillance: role of patrolling monocytes. Cell Res. 26 (1), 3-4 (2016).
  40. Williams, C. B., Yeh, E. S., Soloff, A. C. Tumor-associated macrophages: unwitting accomplices in breast cancer malignancy. NPJ Breast Cancer. 2, (2016).
  41. Richards, D. M., Hettinger, J., Feuerer, M. Monocytes and Macrophages in Cancer: Development and Functions. Cancer Microenviron. 6 (2), 179-191 (2013).
  42. Schick, M. J. Effect of temperature on the critical micelle concentration of nonionic detergents. Thermodynamics of micelle formation. J. Phys. Chem. 67 (9), 1796-1799 (1963).
  43. Marullo, R., Kastantin, M., Drews, L. B., Tirrell, M. Peptide contour length determines equilibrium secondary structure in protein-analogous micelles. Biopolymers. 99 (9), 573-581 (2013).
  44. Hilbich, C., Kisters-Woike, B., Reed, J., Masters, C. L., Beyreuther, K. Substitutions of hydrophobic amino acids reduce the amyloidogenicity of Alzheimer's disease βA4 peptides. J. Mol. Biol. 228 (2), 460-473 (1992).
  45. Trevino, S. R., Scholtz, J. M., Pace, C. N. Amino Acid Contribution to Protein Solubility: Asp, Glu, and Ser Contribute more Favorably than the other Hydrophilic Amino Acids in RNase Sa. J. Mol. Biol. 366 (2), 449-460 (2007).
  46. Kim, S. W., Shi, Y. Z., Kim, J. Y., Park, K. N., Cheng, J. X. Overcoming the barriers in micellar drug delivery: Loading efficiency, in vivo stability, and micelle-cell interaction. Expert Opin Drug Delivery. 7 (1), 49-62 (2010).
  47. Rangel-Yagui, C. O., Pessoa, A. Jr, Tavares, L. C. Micellar solubilization of drugs. J. Pharm. Pharm. Sci. 8 (2), 147-163 (2005).
  48. Batrakova, E., et al. Fundamental relationships between the composition of pluronic block copolymers and their hypersensitization effect in MDR cancer cells. Pharm. Res. 16 (9), 1373-1379 (1999).
  49. Chen, L. J., Lin, S. Y., Huang, C. C. Effect of Hydrophobic Chain Length of Surfactants on Enthalpy-Entropy Compensation of Micellization. J. Phys. Chem. B. 102 (22), 4350-4356 (1998).

Tags

الهندسة الحيوية، 129 قضية، والوحيدات، الببتيد، المذيلات، وتصلب الشرايين، نانوحبيبات، التصوير، والتجميع الذاتي، التشخيص
توليف لاستهداف الوحيدات في المذيلات أمفيفيلي الببتيد للتصوير من تصلب الشرايين
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Poon, C., Sarkar, M., Chung, E. J.… More

Poon, C., Sarkar, M., Chung, E. J. Synthesis of Monocyte-targeting Peptide Amphiphile Micelles for Imaging of Atherosclerosis. J. Vis. Exp. (129), e56625, doi:10.3791/56625 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter