Summary
Cet article présente une méthode impliquant la synthèse et la caractérisation de monocyte-ciblage des micelles peptide amphiphile et le correspondant d’essais pour tester la biocompatibilité et la capacité de la micelle de liaison aux monocytes.
Abstract
L’athérosclérose est un facteur majeur de maladies cardio-vasculaires, la principale cause de décès dans le monde, que réclame 17,3 millions de vies chaque année. L’athérosclérose est également la principale cause de mort subite et infarctus du myocarde, fomentées par des plaques instables qui se rompent et bloquer le vaisseau sanguin sans avertissement. Courant de modalités d’imagerie ne peut pas différencier entre les plaques stables et instables qui se rompent. Micelles de peptides amphiphiles (PAMs) peuvent surmonter cet inconvénient car ils peuvent être modifiés avec une variété de ciblage des moitiés qui se lient spécifiquement à des tissus malades. Monocytes montrent à des marqueurs précoces de l’athérosclérose, tandis que la forte accumulation de monocytes est associée à plaques sujettes à la rupture. Par conséquent, des nanoparticules qui peuvent cibler des monocytes peuvent servir à discriminer les différentes étapes de l’athérosclérose. À cette fin, nous décrivons ici un protocole pour la préparation de monocyte-ciblage PAMs (monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) PAMs). MCP-1 PAMs sont self-assembled par l’intermédiaire de synthèse dans des conditions douces aux nanoparticules forme de 15 nm de diamètre, avec près de charge surface neutre. In vitro, PAMs se sont avérées biocompatibles et avait une affinité élevée pour les monocytes. Les méthodes décrites dans les présentes sont prometteuses pour un large éventail d’applications dans l’athérosclérose ainsi que d’autres maladies inflammatoires.
Introduction
Les maladies cardiovasculaires restent les principales causes de décès dans le monde avec environ 17,3 millions de décès dans le monde1. Les maladies cardiovasculaires sont fournis par l’athérosclérose, une affection dans laquelle les plaques s’accumuler dans les artères, le sang ainsi inhiber et le débit d’oxygène aux cellules du corps2,3. La progression de l’athérosclérose implique l’épaississement et le durcissement des artères par une réaction inflammatoire, métabolisme lipidique irréguliers et la formation de plaques, conduisant à la plaque risque de rupture ou d’infarctus du myocarde,4,5. Les cellules endothéliales expriment des molécules de cytokines et d’adhérence, incluent des MCP-1 qui se lie au récepteur des chimiokines C-C (CCR2) à la surface des monocytes6,7,8. Cholestérol oxydé convertit monocytes macrophages durant les premiers stades de formation de la plaque, qui amplifie la réponse inflammatoire dans la région et conduit à la lésion des tissus et la formation de plaques instables ou vulnérables9, 10.
Traditionnellement, l’athérosclérose est évaluée en évaluant la sténose luminale par imagerie anatomique à l’aide d’ultrasons ou angiographie11,12. Cependant, ces méthodes ne peuvent déterminer un rétrécissement sévère de la paroi artérielle et pas le stade précoce de l’athérosclérose, car la croissance initiale plaque entraîne un remodelage artériel maintenir la taille de l’artère et le sang écoulement tarifaire12,13, 14. Par conséquent, les angiogrammes sous-représenter la prévalence de l’athérosclérose. En outre, les techniques d’imagerie non invasives comme une émission de photon unique calculé tomographie, tomographie par émission de positons et l’imagerie par résonance magnétique ont récemment été utilisées pour caractériser la morphologie de la plaque car ils peuvent fournir des détails initiaux et caractérisation des plaques. Toutefois, ces modalités sont souvent limitées par le manque de sensibilité, résolution spatiale, ou exigent l’utilisation de rayonnements ionisants, rendant la progression plaque d’imagerie à des stades différents, beaucoup plus difficile de15,16, 17. Un système d’imagerie permettant d’identifier plus précisément les plaques à différents stades de l’athérosclérose reste à développer.
NANOPARTICULES ont montré pour être une plate-forme émergente pour in vivo plaque ciblage et diagnostics18,19,20,21. En particulier, PAMs sont avantageuse en raison de leur diversité chimique et de la capacité d’accueillir une variété de moitiés, compositions, tailles, formes et fonctionnalisation de surface22. Peptides amphiphiles (Fe) se composent d’un peptide « tête hydrophile, » attaché à une queue hydrophobe, qui sont généralement des lipides ; Cette structure amphiphile confère des capacités de l’auto-assemblage et permet un affichage multivalent des peptides sur la surface des particules22,23,24. Le peptide polaires peuvent influer sur la forme des particules par le biais de pliage et de liaisons hydrogènes entre les peptides25. Les peptides qui se replient grâce à l’interaction de feuillet β auraient dû être divulgués afin de former des micelles allongés, tandis que α-hélicoïdale confirmation peut former deux micelles sphériques et allongée22,23,24, 25,26,27. Linkers de polyéthylène glycol (PEG) qui protègent la charge superficielle du peptide peuvent être placés entre le peptidiques hydrophiles et la queue hydrophobe de PAMs, améliorer l’accessibilité de la NANOPARTICULE dans la circulation systémique28, 29 , 30 , 31. PAMs sont aussi avantageuses car elles sont biocompatibles et auraient dû être divulgués d’avoir un large éventail d’applications32,,33. Solubilité dans l’eau des micelles offre un avantage sur les autres systèmes à base de nanoparticules comme certaines nanoparticules polymériques qui ne sont pas solubles dans l’eau et ont dû être suspendu en solubilisants pour injections34. En outre, la possibilité de créer des PAMs qui démonter en réponse à un stimulus spécifique fait PAMs un candidat attrayant pour drogue intracellulaire contrôlée livraison35.
En se liant au récepteur CCR2 et qui s’accumulent dans la crosse aortique, PAMs ont été développées précédemment monocyte visant à surveiller les différents stades de lésions athéroscléreuses dans l' aorte9. Chez les souris- / - de l’ApoE, accumulation de monocytes augmente proportionnellement à la plaque progression36. En outre, il a été constaté que les patients avec des plaques sujettes à rupture, stades contiennent des quantités plus élevées de monocytes37. Par conséquent, la modification des PAMs d’incorporer des MCP-1 est utile car il permet une plus grande précision de ciblage et de différencier les lésions athéroscléreuses et fin-début. Ces études de validation a également vérifié que PAMs sont suffisamment sûres pour être utilisé en préclinique et sont effacées insuffisants38. Monocytes et l’inflammation étant caractéristique à d’autres maladies, MCP-1 PAMs ont le potentiel d’être utilisé pour des applications thérapeutiques et diagnostiques dans d’autres maladies au-delà de l’athérosclérose8,39,40 , 41.
Ici, nous rapportons la fabrication de hautement évolutif et auto-assemblés PAMs de MCP-1 qui fait preuve de la particule taille optimale, charge superficielle et ciblage sélectif aux monocytes pour des applications d’imagerie dans l’athérosclérose.
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Protocol
Remarque : Lire la fiche signalétique pour réactifs et suivre toutes les mesures de sécurité chimique tel que requis par l’institution locale.
1. préparation du MCP-1 PAMs
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Préparation du peptide de MCP-1
- Peser 0,25 mmol de Fmoc-L-Lys (Boc)-Wang dans un réacteur (RV). Rincez le côté de la RV avec 5 mL de dimethylforamide (DMF) sous une hotte chimique.
- Charger le RV sur un synthétiseur de peptide de benchtop automatisé. Flacons d’acides aminés charge préemballé, N « - CYNFTINRKISVQRLASYRRITSS - C », de la C à l’extrémité N-terminale. Comprend un flacon vide à la fin de l’étape finale de déprotection.
Remarque : Un peptide brouillé avec séquence, N « - CNNSIIRSKQVLRSTRYFRSATYK - C », peut aussi être synthétisé en utilisant le même protocole. - Synthèse terminée, transférer les peptides sur résine de la RV dans le flacon à scintillation avec 2-3 mL de méthanol jusqu'à ce que toutes les résines sont transférées. Après que la résine a coulé vers le bas, retirez le surnageant de méthanol et évaporer le restant à sec. Aspirateur sec pendant 2 h supplémentaires, ou toute la nuit à température ambiante.
- Faire 12 mL de solution clivage composé acide (TFA) :ethanedithiol:water:triisopropylsilane à 94:2.5:2.5:1 % en volume dans une hotte chimique. Agiter la solution de clivage pour s’assurer que c’est mélangé uniformément.
ATTENTION : Triisopropylsilane et éthanedithiol étant sensible à air, argon purge des flacons stocks de triisopropylsilane et éthanedithiol pendant 1 min avant de les remettre. - Placer le récipient de synthèse (SV) sur un agitateur de bras de serrage au bas de la moitié de la SV. Transférer le peptide-résine à la SV avec 2 mL de solution de clivage jusqu'à ce que tous les adsorbants sont transférés.
- Laver les côtés de la SV avec 3 mL de solution de clivage. Fermez le bouchon de la SV et l’agiter à 300 oscillations/min pendant 4 h.
- Peser avec un tube de centrifugation de vide de 50 mL. Enregistrement de la messe.
- Après 4 h, vider la solution de peptide clivés de la SV dans le tube de centrifuger de 50 mL. Rincer la SV plusieurs fois avec la solution restante de clivage.
- Évaporer le peptide clivées solution avec de l’azote jusqu'à ce qu’il y a moins de 4 mL restant dans le tube à centrifuger.
- Ajouter 36 mL d’éther glacé à la solution de peptide clivée.
- Vortex la solution jusqu'à ce qu’il est complètement blanc ou jaune. Centrifuger à 3 000 x g pendant 5 min à 4 ° C et éliminer le surnageant.
- Ajouter 40 mL éther glacée dans le tube. Vortex et laisser agir à nouveau. Répétez le processus de centrifugation. Décanter le liquide surnageant.
- Sécher le culot PA brut avec azote gaz purge jusqu'à ce que l’éther est visiblement évaporé.
- Ajouter 20 mL bidistillée, vortex, l’eau et laisser agir jusqu'à ce que le peptide est complètement dissous dans la solution.
- Congeler la solution et lyophiliser jusqu’au sec.
- Une fois que le peptide est séché, peser la masse du tube à centrifuger contenant le peptide brut. Dissoudre le peptide brut à 5 mg/mL d’eau.
- Dissoudre 25 mg de peptide de MCP-1 brut dans 5 mL d’eau bidistillée à une concentration totale de 5 mg/mL. Purifier le peptide de MCP-1 brut par chromatographie liquide à haute performance (CLHP) à l’aide de 0,1 % TFA dans de l’eau (solvant A) et 0,1 % TFA dans l’acétonitrile (solvant B) comme des phases mobiles sur une colonne en phase inversée C8. Injecter les 5 mL du peptide dans la CLHP.
Remarque : La phase mobile initiale était composé de 100 % de solvant A un débit de 9,0 mL/min. diminuer le solvant A lentement à 30 % en 27 min et le tenir à cette composition pendant 3 min. retour du gradient à 100 % de solvant un plus 3 min et maintenez à cette composition pendant 1 min donner une exécution totale de 34 min. maintenir la température de la colonne à 55 ° C. Utiliser le mode de source d’ions positifs pour l’analyse. L’acide formique peut être utilisé à la place de TFA, si TFA est trop acide pour la colonne HPLC. Il est recommandé que la vitesse de rampe de composition du solvant organique ne doit pas dépasser 2%/min pour une meilleure séparation. - Analyser chaque fraction à l’aide de la spectrométrie de masse (MALDI) de désorption-ionisation laser assistée par matrice pour le produit attendu de m/z à 2 890.
NOTE : Dissoudre l’acide α-cyano-4-hydroxycinnamique à 1 mg/mL dans l’acétonitrile/eau (50 : 50 % en volume) comme la solution de la matrice. Repérez les 0,75 µL de solution de matrice sur la plaque MALDI, suivie de 0,75 µL de chaque fraction. Effectuer l’analyse à l’aide d’un mode positif ion réfléchissant à une gamme de masses de 500-5 000 Da. - Combiner des fractions de produit, souffler dans l’acétonitrile, geler et lyophiliser peptides purifiés à sec.
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Préparation de MCP-1 PA
- Préparer un excès molaire 1.1 de 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] DSPE-PEG (2000)-maléimide au peptide dans des flacons séparés à scintillation. Dissoudre les deux composés dans l’eau bidistillée à ~ 15 mg/mL. Laisser agir pendant 15 minutes ou jusqu'à ce que les deux solutions sont tout à fait claires.
Remarque : Le DSPE-PEG (2000)-Cy5 est synthétisé en utilisant le même protocole avec DSPE-PEG (2000)-amine et Cy5 fonctionnalisés ester N-hydroxysuccinimide (NHS), à l’exception de l’étape 1.2.3, où le pH de la solution est ajusté à 8,5. - Ajouter DSPE-PEG (2000)-maléimide solution à la solution de peptide. Vortex et laisser agir.
- Ajouter 1 M NaOH goutte à goutte (1 µL) à la fois jusqu'à ce que le pH de la solution est de 7.
- Solution de purge d’azote pendant 5 min. remuer la solution du jour au lendemain.
- Congeler la solution et lyophiliser jusqu’au sec.
- Une fois que le produit brut est séché, dissoudre le solide à 5 mg/mL d’eau.
- Purifier par HPLC, tel que décrit ci-dessus.
NOTE : Peptide non conjuguée et DSPE-PEG(2000) devraient éluer entre 15-30 % concentration organique (% en volume), tandis que DSPE-PEG (2000)-MCP-1 conjugué doit éluer entre 40-50 % concentration organique. - Analyser chaque fraction à l’aide de la spectrométrie de masse MALDI pour les correspondants m/z DSPE-PEG (2000)-MCP-1 devrait avoir un pic large m/z à 5 760.
NOTE : acide 2, 5-dihydroxybenzoïque est mieux utilisé comme matrice pour DSPE-PEG (2000)-MCP-1 avec la MALDI.
- Préparer un excès molaire 1.1 de 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] DSPE-PEG (2000)-maléimide au peptide dans des flacons séparés à scintillation. Dissoudre les deux composés dans l’eau bidistillée à ~ 15 mg/mL. Laisser agir pendant 15 minutes ou jusqu'à ce que les deux solutions sont tout à fait claires.
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Assemblée de MCP-1 PAMs
- Dissoudre 1,75 mg PAs de MCP-1 avec 3 mL de méthanol dans un flacon 1-dram. Laisser agir jusqu'à dissolution complète de la MCP-1 PA.
NOTE : Cy5 amphiphiles peut être incorporé à un rapport molaire de 10 : 90 PA de MCP-1 pour les applications d’imagerie. - Evaporer le méthanol en présence d’azote dans un mouvement circulaire tout en rinçant le méthanol restant sur le côté de la cuvette jusqu'à ce qu’un film uniform est formé au fond du flacon. Séchage sous vide le film du jour au lendemain.
- Hydrater le film avec 3 mL de tampon phosphate ou de l’eau saline (PBS), afin de préparer une solution de 100 µM de MCP-1 PAMs. Vortex doucement et laisser agir la solution jusqu’au clair. Incuber à 80 ° C pendant 30 min.
Remarque : La température élevée a été montrée pour accélérer le processus d’auto-assemblage et permet au composant de peptide former la structure secondaire plus stable, tout en réduisant la micellaire critique concentration (CMC)42,43. - Cool la dispersion obtenue à la température ambiante.
- Dissoudre 1,75 mg PAs de MCP-1 avec 3 mL de méthanol dans un flacon 1-dram. Laisser agir jusqu'à dissolution complète de la MCP-1 PA.
2. caractérisation des MCP-1 PAMs
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Diffusion dynamique de la lumière (DLS) et potentiel zêta
- Place de 100 µM de MCP-1 PAM ou brouillée PAM dans une cuvette conformément aux instructions de l’instrument potentiel DLS ou zeta.
Remarque : Des cuvettes de potentiel DLS et zeta peuvent être différents selon les instructions de l’instrument. - Equilibrer l’instrument à la température ambiante. Mesurer la taille et la charge superficielle de la PAM.
- Place de 100 µM de MCP-1 PAM ou brouillée PAM dans une cuvette conformément aux instructions de l’instrument potentiel DLS ou zeta.
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Microscopie électronique à transmission (TEM)
- Ajouter 7 µL de 50 µM MCP-1 PAM ou brouillée PAM vers une grille de TEM suspendu dans une pince fermeture automatique pour 5 min. mèche à la goutte avec une lingette de tâche délicate.
- Ajouter 7 µL d’eau pour laver la grille. Mèche à la goutte.
- Ajouter 7 µL de 1 wt % l’acide phosphotungstique pour 2 min. mèche à la goutte. Répétez l’étape 2.2.2.
- Sécher la grille TEM avant l’analyse TEM.
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Spectroscopie de dichroïsme circulaire (CD)
- Allumez l’azote pendant 5-10 min avant l’utilisation de l’instrument.
- Déposer 300 µL de vide (eau ou PBS) dans la cuvette.
- Mesurer les spectres à 190-265 nm, 0. 2 mm-longueur du chemin avec un temps d’intégration 1 s et une bande passante de 1 nm à température ambiante. Collecter 3 répétitions.
- Mesure 100 µM peptide de MCP-1, MCP-1 PAM, brouillés peptidique et brouillés PAM sous la même condition décrite à l’étape 2.3.3. Soustraire de l’essai à blanc.
- Ajuster les données à l’aide d’une interpolation linéaire des spectres de base polylysine.
- Éteignez l’appareil. Attendre 10 min avant d’éteindre l’azote.
3. l’analyse in Vitro de MCP-1 PAMs
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In vitro de biocompatibilité
- Culture et développez WEHI 274,1 murines monocytes dans Eagle modifié milieu de Dulbecco additionné de 10 % sérum fœtal (SVF), 1 % la pénicilline-streptomycine et 0,05 mM 2-mercaptoéthanol à 37 ° C moins de 5 % de CO2 passage 5.
NOTE : WEHI 274,1 sont des cellules en suspension. Lorsque la mise en culture, les médias devraient être réapprovisionnés tous les 2-3 jours. - Monocytes pipette dans les médias dans un tube à centrifuger stérile de 50 mL. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min à 4 ° C.
- Aspirer les anciens médias et resuspendre dans 10 mL de milieu frais dans le tube à centrifuger. Mélanger lentement jusqu'à ce que les cellules sont réparties uniformément dans les médias. Compter les cellules à l’aide d’une coloration bleu trypan et un hémocytomètre.
- Diluer les cellules telles qu’il y a 4 000 monocytes par 90 µL des médias / puits. Ajouter 90 µL de cellules dans le puits d’une plaque de 96 puits. Incuber pendant 24 h.
Remarque : Évitez d’utiliser les puits sur le bord extérieur de la plaque pour éviter des différences entre évaporation et des variations thermiques de la plaque. Remplir les puits extérieurs avec 100 µL PBS. - Dissoudre 0,15 µmol de peptide MCP-1, MCP-1 PAM, peptide brouillé ou brouillés-PAM dans 150 µL de PBS dans des tubes de microcentrifuge distinct, stérilisé. Effectuer des dilutions pour faire 65 µL de 1, 10 et 100 µM de chaque échantillon.
- Ajouter 10 µL PBS de chacune des concentrations dans les puits contenant WEHI 274,1 (volume total : 100 µL par bien, 6 lignes, total de 96 puits). Incuber pendant 72 h.
- Ajouter 10 µL (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) (MTS) dans chaque puits. Incuber pendant 1 heure.
- Analyser l’absorbance à l’aide d’un lecteur à 490 nm ou selon les instructions du fabricant.
- Culture et développez WEHI 274,1 murines monocytes dans Eagle modifié milieu de Dulbecco additionné de 10 % sérum fœtal (SVF), 1 % la pénicilline-streptomycine et 0,05 mM 2-mercaptoéthanol à 37 ° C moins de 5 % de CO2 passage 5.
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Liaison de micelle in vitro
- Monocytes graine 500 000 dans chaque puits d’une plaque de 6 puits dans 2 mL de support contenant 100 µM étiquetés Cy5 MCP-1 PAM (10 : 90 rapport molaire du DSPE-PEG (2000)-Cy5 et PA de MCP-1). Incuber pendant 1 heure.
- Recueillir WEHI 274,1 par centrifugation à 300 x g pendant 5 min à 4 ° C. Aspirer les médias.
- Resuspendre et laver les cellules dans 2 mL de PBS. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min à 4 ° C. Aspirer le PBS. Répétez le processus de lavage avec 2 mL de PBS. Aspirer le PBS.
- Ajouter 2 mL de paraformaldéhyde froide de 4 % pour fixer les cellules. Incuber à température ambiante pendant 10 min.
- Pipette les cellules fixes sur une lamelle de verre stériles dans les puits d’une plaque de 6 puits. Centrifuger à 400 g pendant 5 min.
- Retirez le paraformaldéhyde. Lavez et rincez une fois avec 2 mL de PBS. Remettre en suspension avec 1 mL PB
Remarque : Lorsque le rinçage, ne pas perturber les cellules sur la lamelle couvre-objet. - Mettez 10 µL de 90 % de glycérol dans du PBS sur une diapositive. Utiliser une aiguille et une pince pour ramasser de la lamelle. Sécher le bord de la lamelle. Placez délicatement la lamelle sur une lame face vers le bas.
- Doucement, sceller le bord de la lamelle avec vernis à ongles transparent. Placer au réfrigérateur jusqu’au moment de l’imagerie.
- Utiliser un confocal laser scanning microscope (CLSM) installé avec des lasers pour Cy5 à λexcitation = 650 nm.
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Representative Results
Préparation du PAM de MCP-1
Le motif de liaison CCR2 (résidus 13-35) de la protéine MCP-1 [YNFTNRKISVQRLASYRRITSSK] ou un peptide brouillé [YNSLVFRIRNSTQRKYRASIST] a été modifié par l’ajout d’un résidu de cystéine sur l’extrémité N-terminale. Le peptide de MCP-1 a été synthétisé par une méthode de phase solide Fmoc-négociée à l’aide d’un synthétiseur de peptide automatisé. Le peptide brut a été purifié par HPLC en phase inversée sur une colonne de C8 à 50 ° C à l’aide de 0,1 % TFA dans des mélanges acétonitrile/eau et caractérisés par spectrométrie de masse MALDI (Figure 1). Le peptide contenant de cystéine est conjugué sur DSPE-PEG2000-maléimide conjugués (2000)-peptide DSPE-PEG par une liaison thioether de céder. Après 24 h à température ambiante, le produit brut a été purifié par CLHP (Figure 2). DSPE-PEG (2000)-Cy5 a été synthétisé à l’aide d’une réaction d’ester de NHS. Monocyte-ciblage PAMs assemblées conjointement avec DSPE-PEG (2000)-MCP-1 DSPE-PEG (2000)-Cy5 ont été fabriqués par dissolution dans le méthanol qui est ensuite évaporée par N2et le film qui en résulte est séché sous vide pendant la nuit et self-assembled dans l’eau ou PBS à travers les interactions hydrophobes des groupes « queue » pour former PAMs de MCP-1.
Caractérisation du PAM de MCP-1
DLS données et images TEM de monocyte-ciblage PAMs a montré des nanoparticules sphériques, bien dispersés de 15,3 ± 2,0 nm de diamètre (Figure 3 et tableau 1). Tant PAMs de MCP-1 et brouillées PAMs ont montré une légère zeta positif potentiels de 12,1 ± 3,1 mV et 13,7 ± 1,9 mV, respectivement (tableau 1). CD a montré que l’incorporation du peptide MCP-1 au sein de la micelle amélioré la structure secondaire (tableau 2, MCP-1 PAMs : 46,2 ± 0,9 % β-feuille, 53,1 ± 1,4 % pelote aléatoire et MCP1 gratuit : 34,2 ± 3,5 % β-feuille, pelote aléatoire de 65,8 ± 3,5 %).
In Vitro Analyse du PAM de MCP-1
Liaison de MCP-1 PAMs biocompatibilité et monocytes in vitro ont été observés en microscopie confocale. Monocytes de souris ont été incubées avec des concentrations croissantes de MCP-1, MCP-1 PAM, peptide brouillé et PAM brouillée pendant 72 h, et les cellules ont été jugées viables et biocompatible jusqu'à 100 µM (Figure 4). En outre, microscopie confocale a montré une liaison spécifique des monocytes à PAMs de MCP-1 par rapport à brouillés PAMs (Figure 5).
Figure 1 : Chromatogramme HPLC à 220 nm (longueur d’onde des liaisons peptidiques) et 254 nm (longueur d’onde de la tyrosine) de peptide de MCP-1 (A) et le peptide brouillé (B) (Boxed pic à 7,4 min). Spectre de masse MALDI-TOF de peptide de MCP-1 (C) et le peptide brouillé (D) à une distance de 500-5 000 Da, montrant le pic pour [M + H]+ à m/z 2 888 (attendus 2 890). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Chromatogramme HPLC à 220 nm (longueur d’onde des liaisons peptidiques) et 254 nm (longueur d’onde de la tyrosine) du DSPE-PEG (2000)-MCP-1 (A) et (2000) DSPE-PEG-brouillés (B). (PIC boxed à 16,9 min). Spectre de DSPE-PEG (2000)-MCP-1 à une distance de 1 000-10 000 Da, montrant les pics pour [M + H]+ à m/z 2 888 (attendus 2 890) pour MCP-1 et m/z 5 758 (attendue 5 760) pour DSPE-PEG (2000)-MCP-1 de masse MALDI-TOF de (C). Spectre de DSPE-PEG (2000) de masse MALDI-TOF de (D)-brouillés à une distance de 1 000-10 000 Da montrant des pics pour [M + H]+ à m/z 2 887 (attendus 2 890) peptide brouillés et m/z 5 761 (attendue 5 760) pour DSPE-PEG-brouillés. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Images TEM de MCP-1 PAM (A) et brouillés PAM (B). Echelle = 100 nm. Distribution de taille moyenne en nombre de MCP-1 PAM (C) et brouillés PAM par l’intermédiaire de listes de distribution (D). Les données sont des moyennes ± S.D. (n = 3). (E) CD analyse de MCP-1 et peptides brouillés et PAMs (n = 3). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : In vitro la viabilité des monocytes murines WEHI 274,1 après 72 h d’exposition à MCP-1 peptide, MCP-1 PAM, peptide brouillé et brouillés PAM. Les données sont des moyennes ± S.D. (n = 6). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Images CLSM du PAM de MCP-1 (A) et PAM brouillée (B) intégrée avec 10 mol % PA Cy5 (rouge) incubés avec WEHI 274,1 pour 1 h. Echelle = 20 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| PAMs | Diamètre de nombre-Ave (nm) | PDI | Potentiel zêta (mV) |
| MCP-1 | 15.3 ± 2,0 | 0.119 ± 0,006 | 12,1 ± 3.1 |
| Brouillés | 16,9 ± 1.4 | 0.232 ± 0,019 | 13,7 ± 1,9 |
| Mesuré dans le tampon PBS. Données sont exprimées en moyenne ± SD | |||
Tableau 1 : Taille, polydispersité et potentiel zêta des PAMs.
| une hélice (%) | Feuillet-b (%) | Pelote (%) | |
| Peptide de MCP-1 | ± 0,0 0,0 | 36,2 ± 2.2 | 63,8 ± 1,8 |
| MCP-1 PAM | ± 0,7 0,6 | 46.2 ± 0,9 | 53,1 ± 1.4 |
| Peptide brouillé | ± 0,0 0,0 | 43,7 ± 2,1 | 56,3 ± 3,5 |
| PAM brouillée | ± 0,0 0,0 | 60.7 ± 0,2 | 39,3 ± 0,2 |
Tableau 2 : Composition de la structure secondaire des peptides et des PAMs.
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Discussion
MCP-1 PAMs sont une plate-forme d’imagerie moléculaire prometteuse, consistant en un peptide ciblage hydrophile et queue hydrophobe qui anime la nature auto-assemblées de la NANOPARTICULE. Ce ciblage monocyte micelle peut être préparé par synthèse simple et étapes de la purification du peptide de MCP-1 et DSPE-PEG (2000)-MCP-1. PAMs ont de nombreuses caractéristiques bénéfiques en vivo imagerie moléculaire telles que leur auto-assemblage sous des conditions douces, biodégradabilité intrinsèque et la diversité structurale et chimique permettant l’incorporation d’autres moitiés d’imagerie ou ciblage des peptides de livrer sélectivement sur un site spécifique d’intérêt. Leur granulométrie, la forme et la composition peuvent être ajustées en changeant le peptide, queue hydrophobe ou concentration micellaire, permettant des propriétés chimiques et physiques optimales pour une variété d’applications22,,33.
Convient de mentionner quelques limitations du présent protocole. Tout d’abord, puisque PAMs sont conduites par des interactions hydrophobes, il est nécessaire de construire le ciblage des peptides qui sont hydrophiles, permettant ainsi la portion de ciblage qui sera présenté à la surface de la micelle. Si la séquence peptidique est hydrophobe, l’ajout d’un ou deux acides aminés hydrophiles à l’extrémité C terminale peut être logé, mais l’ajout d’acides aminés pourrait affecter la structure secondaire de peptide dans la micelle, modifiant ainsi les propriétés de la peptide dans son état natif dans la protéine44,45. En second lieu, à de faibles concentrations, PAMs ont faible stabilité dans un environnement aqueux car ils sont fortement tributaires de la CMC, la concentration minimale nécessaire pour le PAs former une structure micellaire46. Au-dessous de la CMC, la micelle désassemble aux différents monomères de PA et limite la micelle pour agir comme transporteur et décharger un médicament à un site spécifique47. Pour pallier cet inconvénient, le CMC peut être diminué en augmentant la longueur de la chaîne de la queue hydrophobe48,49. Enfin, le stockage à long terme des PAMs en solution est déconseillé car la structure secondaire PA peut changer avec le temps, cela n’affecte la structure micellaire et stabilité, ainsi que l’efficacité en liaison26ligands.
En somme, ce protocole illustre une stratégie de nanomédecine axée sur les micelles robuste, auto-assemblés peptide d’imagerie de l’athérosclérose. MCP-1 PAMs sont biocompatibles, biodégradable et non toxique comme composants de la micelle sont inspirent des éléments endogènes de l’organisme. Plus important encore, MCP-1 PAMs ont une liaison préférentielle aux monocytes, qui augmentent proportionnellement à la progression de la plaque, facilitant une approche non invasive pour différencier les stades des plaques d’athérosclérose. Grâce à la modularité de cette plate-forme, PAMs peuvent incorporer therapeutics, supplémentaires ciblant des peptides, imagerie moitiés et acides nucléiques. Par conséquent, compte tenu des capacités dynamiques de ces micelles multifonctionnels, nous croyons que ces particules sont très prometteurs pour la traduction clinique dans l’athérosclérose et d’autres maladies.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à souligner l’appui financier de l’University of Southern California, le National Heart, Lung et Blood Institute (NHLBI), R00HL124279, Eli et Edythe large Innovation Award et la Fondation de Whittier L.K. Non-Cancer Bourse de recherche translationnelle accordée à EJC. Les auteurs remercient le Centre pour la microscopie électronique et microanalyse, Centre d’Excellence en NanoBiophysics, Centre d’Excellence pour la caractérisation moléculaire et translationnelle Imaging Center à l’University of Southern California, de l’assistance configurations instrumentales.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-ethanedithiol | VWR | E0032 | for peptide synthesis |
| 10 mL disposable serological pipets | VWR | 89130-898 | for cell culture |
| 15 mL centrifuge tubes, polypropylene | VWR | 89401-566 | for various applications |
| 2,5-dihydroxybenzoic acid, 99% | Fisher Scientific | AC165200050 | for MALDI |
| 25 mL disposable serological pipets | VWR | 89130-900 | for cell culture |
| 2-Mercaptoethanol, 50 mM | ThermoFisher Scientific | 31350010 | for cell culture |
| 5 mL disposable serological pipets | VWR | 89130-896 | for cell culture |
| 50 mL centrifuge tubes | VWR | 89039-658 | for various applications |
| 75 cm2 culture flask | Fisher Scientific | 13-680-65 | for cell culture |
| 75 mL reaction vessel | Protein Technologies | 3000005 | for peptide synthesis |
| 96-wells cell culture plate | VWR | 40101-346 | for MTS assay |
| Acetonitrile, HPLC grade | Fisher Scientific | A998SK-4 | for HPLC purification |
| Borosilicate glass, 1 dram | VWR | 66011-041 | for PAM synthesis |
| Borosillicate glass pipet, Long tips | VWR | 14673-043 | for various applications |
| Coverslip, 0.16-0.19 mm, 22 x 22 mm | Fisher Scientific | 12-542B | for confocal microscopy |
| Cy5 amine | Abcam | ab146463 | for peptide conjugation |
| Diethyl ether, ACS grade | Fisher Scientific | E138-1 | for peptide precipitation |
| Disposable syringes, 20 mL | Fisher Scientific | 14-817-54 | for HPLC purification |
| Double neubauer ruled hemocytometer | VWR | 63510-13 | for cell counting |
| DSPE-PEG(2000) amine | Avanti | 880128P | for peptide conjugation |
| DSPE-PEG(2000) maleimide | Avanti | 880126P | for peptide conjugation |
| DSPE-PEG(2000)-NHS ester | Nanocs | PG2-DSNS-10K | for conjugation to Cy5 |
| Dulbecco's modified eagle medium-high glucose | Sigma Aldrich | D5796-500ML | for cell culture |
| Fetal bovine serum, qualified, heat inactivated | ThermoFisher Scientific | 10438026 | for cell culture |
| Fmoc-L-Ala-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-A | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-RBF | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Asn(Trt)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-NT | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Cys(Trt)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-CT | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Gln(Trt)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-QT | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Ile-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-I | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Leu-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-L | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Lys(Boc)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-KBC | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Phe-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-F | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Ser(tBu)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-SB | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Thr(tBu)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-TB | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-YB | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Val-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-V | for peptide synthesis |
| Fmoc-Lys(Boc)-wang resin, 100-200 mesh | Novabiochem | 856013 | for peptide synthesis |
| Formic acid, optima LC/MS grade | Fisher Scientific | A117-50 | for HPLC purification |
| Glycerol | VWR | M152-1L | for confocal microscopy |
| Hand tally counter | Fisher Scientific | S90189 | for cell counting |
| Magnetic stir bars, egg-shaped | VWR | 58949-006 | for peptide conjugation |
| Methanol, ACS certified | Fisher Scientific | A412-4 | for PAM synthesis |
| MTS cell proliferation colorimetric assay kit | VWR | 10191-104 | for MTS assay |
| N,N-Dimethylformamide, sequencing grade | Fisher Scientific | BP1160-4 | for peptide synthesis |
| N-Methylmorpholine | Protein Technologies | S-1L-NMM | for peptide synthesis |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | AC416780250 | for fixing cells |
| PBS, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 10010049 | for various applications |
| Penicillin/streptomycin, 10,000 U/mL | ThermoFisher Scientific | 15140122 | for cell culture |
| Peptide synthesis vessel, 25 mL | Fisher Scientific | CG186011 | for peptide synthesis |
| Phosphotungstic acid | Fisher Scientific | A248-25 | for TEM |
| Piperidine | Spectrum | P1146-2.5LTGL | for peptide synthesis |
| Plain glass microscope slide 75 x 25 mm | Fisher Scientific | 12-550-A3 | for confocal microscopy |
| Reagent reservoirs, sterile | VWR | 95128093 | for cell culture |
| Self-closing tweezer | TedPella | 515 | for TEM |
| TEM support film | TedPella | 01814F | for TEM |
| Trifluoroacetic acid | Fisher Scientific | BP618-500 | for peptide cleavage and HPLC purification |
| Triisopropylsilane | VWR | TCT1533-5ml | for peptide cleavage |
| Trypan blue solution, 0.4% | ThermoFisher Scientific | 15250061 | for cell counting |
| Tweezer, general purpose-serrated | VWR | 231-SA-SE | for confocal microscopy |
| WEHI-274.1 | ATCC | ATCC CRL-1679 | murine monocyte |
| automated benchtop peptide synthesizer | Protein Technologies | PS3 Benchtop Peptide Synthesizer | |
| α- cyano- 4- hydroxycinnamic acid, 99% | Sigma Aldrich | 476870-2G | for MALDI |
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