Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

סינתזה של פילוח מונוציט פפטיד אמפיפיליות הקזאין עבור הדמיה של טרשת עורקים

Published: November 17, 2017 doi: 10.3791/56625
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, University of Southern California

Summary

מאמר זה מציג שיטה המערבים את סינתזה ואפיון של פילוח מונוציט פפטיד אמפיפיליות הקזאין, מבחני המתאימה כדי לבדוק את התאימות והיכולת של מיצלה כדי לאגד ומונוציטים.

Abstract

טרשת עורקים הוא תורם מרכזי למחלות לב וכלי דם, הגורם המוביל למוות ברחבי העולם, אשר טוען 17.3 מיליון אנשים בשנה. טרשת עורקים הוא גם הגורם המוביל של מוות פתאומי, אוטם שריר הלב, שעודד פלאק לא יציב נקרעים ועוברים occlude את כלי הדם ללא אזהרה. זרם שיטות הדמיה לא יכול להבדיל בין פלאק לא יציב ויציבה להיקרע. פפטיד חומרים פעילי שטח הקזאין (PAMs) יכול להתגבר על חיסרון זה כפי ניתן לשנותן עם מגוון של פילוח moieties לאגד במיוחד כדי רקמות חולות. ומונוציטים הוכחו להיות סמנים מוקדם של טרשת עורקים, בעוד הצטברות גדולה של monocytes משויך הפלאק נוטה להיקרע. לפיכך, חלקיקים שיכולות היעד ומונוציטים ניתן להפלות בשלבים שונים של טרשת עורקים. לשם כך, כאן, נתאר פרוטוקול על פי פילוח מונוציט PAMs (מונוציט chemoattractant חלבון-1 (MCP-1) PAMs). PAMs MCP-1 הם התאספו עצמית דרך סינתזה בתנאים מתון כדי טופס חלקיקים של 15 ננומטר קוטר עם יד תשלום משטח נייטרלי. במבחנה, PAMs נמצאו מסתיימים והיתה זיקה מחייבת גבוהה עבור ומונוציטים. בשיטות המתוארות בזאת מבטיחים למגוון רחב של יישומים טרשת עורקים, כמו גם מחלות דלקתיות אחרות.

Introduction

מחלות לב וכלי דם להישאר להיות הגורמים המובילים. למוות באופן גלובלי עם 17.3 מיליון מקרי מוות ברחבי העולם1. מחלות לב וכלי דם נתרמים על ידי טרשת עורקים, מצב שבו הפלאק לבנות את העורקים, ובכך מעכבים דם, זרימת חמצן אל התאים של הגוף2,3. ההתקדמות של טרשת עורקים כרוך את עיבוי ואת התקשות של העורקים על ידי תגובה דלקתית, חילוף החומרים של השומנים לא סדיר, הצטברות פלאק, המוביל אל רובד אוטם שריר הלב ולמסמנים4,5. תאי אנדותל מבטאים מולקולות ציטוקינים והצמדות, הכוללים MCP-1 זה נקשר לקולטן C-C כימוקין (CCR2) על פני השטח של monocytes6,7,8. כולסטרול מחומצן ממירה ומונוציטים מקרופאגים בשלב מוקדם של היווצרות הפלאק, אשר מגביר את התגובה דלקתית באזור, מוביל פגיעה ברקמות ואת היווצרות הפלאק לא יציבה או פגיע9, 10.

באופן מסורתי, טרשת עורקים מחושבת על-ידי הערכת היצרות luminal על ידי הדמיה אנטומית באמצעות11,של מסתמים או אולטרסאונד-12. עם זאת, שיטות אלה יכול לקבוע אך ורק היצרות חמורה של הקיר עורקים, לא שבשלב מוקדם של טרשת עורקים, כמו צמיחה שלט הראשונית גורמת שיפוץ העורקים כדי לשמור על גודל עורק ודם תזרים קצב12,13, 14. לכן, angiograms underrepresent שכיחות טרשת עורקים. בנוסף, טכניקות הדמיה לא פולשנית כגון פליטת פוטון בודד שחושב טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים טומוגרפיה, דימות תהודה מגנטית שימשו לאחרונה לאפיין פלאק מורפולוגיה כפי שהם יכולים לספק פרטים הראשונית, אפיון של הפלאק. עם זאת, האופנים האלה מוגבלים לעיתים קרובות על ידי חוסר רגישות, רזולוציה מרחבית, או דורשים השימוש של קרינה מייננת, ביצוע הדמיה פלאק התקדמות בשלבים שונים הרבה יותר מאתגר15,16, 17. מערכת משלוח הדמיה אשר במיוחד מזהה שלטי בשלבים שונים של טרשת עורקים נשאר להיות מפותח.

חלקיקים הוכיחו להיות פלטפורמה המתעוררים ויוו פלאק מיקוד ואבחון18,19,20,21. בפרט, PAMs הם יתרון בשל המגוון הכימי שלהם ואת היכולת להכיל מגוון moieties, יצירות, גדלים, צורות של פני השטח functionalization22. פפטיד חומרים פעילי שטח (PAs) מורכב הידרופיליות, פפטיד "headgroup" מצורף וזנב הידרופובי, אשר בדרך כלל שומנים; מבנה amphiphilic זה מקנה יכולות וההספק עצמי ומאפשר תצוגה multivalent של פפטידים על פני השטח של חלקיקים22,23,24. Headgroups פפטיד יכול להשפיע על צורת החלקיקים באמצעות קיפול ומימן מליטה בין פפטידים25. פפטידים מקפלים כתהליכי β-גיליון הוכחו יוצרות הקזאין מוארך, ואילו אישור α-הסליל יכולים ליצור שני כדורי ומוארך הקזאין22,23,24, 2526,,27. ניתן להניח linkers פוליאתילן גליקול (PEG) למגן את המטען משטח של פפטיד בין פפטיד הידרופילית את וזנב הידרופובי של PAMs, שיפור הזמינות של ננו-חלקיק מחזור מערכתי28, 29 , 30 , 31. PAMs הם גם יתרון כי הם אינם מסתיימים הוכחו, יש מגוון רחב של יישומי32,33. המסיסות במים הקזאין מציע יתרון על פני מערכות אחרות כגון חלקיקים פולימרים מסוימים אינם מסיסים במים, יש להיות מושעים ב- solubilizers עבור זריקות34מבוססי ננו-חלקיק. בנוסף, היכולת ליצור PAMs זה לפרק בתגובה לגירויים ספציפיים הופכת PAMs מבוקר הסמים תאיים משלוח35ההרסני.

על ידי קשירה לקולטן CCR2 המצטבר קשת אבי העורקים, PAMs פותחו בעבר עבור מונוציט מיקוד לעקוב אחר השלבים השונים התרדמה ב אבי העורקים9. בעכברים ספקיות- / - , הצטברות מונוציט מגדילה באופן פרופורציונלי פלאק התקדמות36. יתר על כן, נמצא כי חולים עם שלטי נוטה להיקרע, בשלב מאוחר מכילים כמויות גבוהות של monocytes37. לכן, השינוי של PAMs לשלב MCP-1 הוא שימושי כי זה מאפשר להגדיר מיקוד ובידול בין התרדמה, מאוחר-בשלב מוקדם. מחקרים אלה הוכחה הרעיון לאמת גם כי PAMs בטוחים מספיק לשמש pre-clinically, נמחקים renally38. מאז ומונוציטים ודלקת האופייני למחלות אחרות, PAMs MCP-1 יש פוטנציאל לשמש ליישומים טיפוליים ואבחון מחלות אחרות מעבר טרשת עורקים-8,-39,-40 , 41.

במסמך זה, אנו מדווחים על הזיוף של PAMs MCP-1 מאוד מדרגיים, שהורכבו עצמית, אשר הדגים של החלקיק לגודל האופטימלי משטח הטעינה, המיקוד סלקטיבי ומונוציטים עבור יישומי הדמיה משופר של טרשת עורקים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: קרא את MSDS עבור ריאגנטים ופעל כל אמצעי בטיחות כימית כנדרש על-ידי מוסד מקומי.

1. הכנת PAMs MCP-1

  1. הכנת פפטיד MCP-1
    1. שוקלים לצאת mmol 0.25 של Fmoc-L-ליס (מפחיד)-Wang בכלי התגובה (RV). יש לשטוף את הצד של הקרוואן עם dimethylforamide מ ל (DMF) בשכונה fume כימי.
    2. לטעון את הקרוואן על סינתיסייזר פפטיד benchtop אוטומטית. לטעון ארוזים מראש הבקבוקונים חומצת אמינו, N "- CYNFTINRKISVQRLASYRRITSS - C", מ- C כדי אמיני. לכלול את מבחנה ריקה בסוף השלב הסופי deprotection.
      הערה: פפטיד מקושקשות עם רצף, N "- CNNSIIRSKQVLRSTRYFRSATYK - C", יכול גם להיות מסונתז שימוש באותו הפרוטוקול.
    3. לאחר סיום סינתזה, להעביר את פפטידים על שרף הקרוואן המבחנה נצנוץ עם 2-3 מ ל מתנול עד כל שרפים מועברים. לאחר השרף שקעה לתחתית, להסיר את מתנול supernatant ולא להתאדות הנותרים עד יבש. אבק יבש h 2 נוספות או למשך הלילה בטמפרטורת החדר.
    4. להפוך את פתרון המחשוף 12 mL המכיל חומצה trifluoracetic (TFA):ethanedithiol:water:triisopropylsilane ב 94:2.5:2.5:1% vol בשכונה fume כימי. מערבולת הפתרון המחשוף כדי לוודא כי הוא מעורב באופן שווה.
      התראה: כי triisopropylsilane ethanedithiol אוויר רגיש בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד, ארגון לטהר צלוחיות מניות של triisopropylsilane ו- ethanedithiol עבור 1 דקות לפני שמוציאים אותם בחזרה.
    5. הניחו את כלי הקיבול של סינתזה (SV) על גבי שאכר זרוע על ידי מחבר חובק למעקה ליד החלק התחתון של ה-SV. העברה פפטיד-שרף ה-SV 2 מ של פצילות פתרון עד כל פפטיד-שרפים מועברים.
    6. לשטוף את הצדדים של ה-SV עם 3 מ ל המחשוף פתרון. לסגור את הפקק של ה-SV ומנערים ב 300 תנודות/דקה במשך 4 שעות.
    7. שוקלים את צינור צנטריפוגה ריק 50 מ. להקליט את המסה.
    8. לאחר 4 שעות, לנקז את הפתרון cleaved פפטיד של ה-SV לתוך הצינור צנטריפוגה 50 מ. לשטוף את ה-SV מספר פעמים עם הפתרון המחשוף הנותרים.
    9. להתנדף פפטיד cleaved פתרון עם חנקן עד שיש פחות מ 4 מ ל שנותרו בצינור צנטריפוגה.
    10. להוסיף 36 מ"ל של האתר כקרח הפתרון ביקע פפטיד.
    11. הפתרון עד מערבולת הוא לגמרי לבן או צהוב. צנטריפוגה ב 3000 g x עבור 5 דקות ב 4 ° C, decant את תגובת שיקוע.
    12. הוסף אתר קר כקרח 40 מ"ל ברכבת התחתית. מערבולת, sonicate שוב. חזור על תהליך צנטריפוגה. Decant את תגובת שיקוע.
    13. יבש בגדר הרשות הפלסטינית גולמי עם חנקן גז מנקה עד האתר הוא בעליל התאדו.
    14. הוסף 20 מ"ל מזוקק פעמיים מים, מערבולת, ו- sonicate עד פפטיד היא התפרקה לחלוטין בפתרון.
    15. להקפיא את הפתרון, lyophilize עד יבש.
    16. ברגע פפטיד הוא מיובש, לשקול את המסה של הצינור צנטריפוגה המכיל את פפטיד גולמי. להמיס את פפטיד גס 5 מ"ג/מ"ל מים.
    17. להמיס 25 מ ג של פפטיד גולמי MCP-1 ב- 5 מ ל מים מזוקק פעמיים כדי ליצור ריכוז מוחלט של 5 מ"ג/מ"ל. לטהר את גולמי MCP-1 פפטיד על ידי ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC) באמצעות 0.1% TFA במים (הממס A) ו- 0.1% TFA ב- acetonitrile (הממס B) בתור שלבים ניידים על עמודה הפוכה-פאזי C8. להזריק את 5 מיליליטר פפטיד לתוך HPLC.
      הערה: שלב ניידים הראשונית כללה 100% ממס A בקצב הזרימה של 9.0 מ ל לדקה להקטין הממס A לאט כדי 30% 27 דקות והחזק הזה בהרכב במשך 3 דקות חזרה מעבר הצבע כדי 100% ממס מעל 3 דקות והחזק הזה בהרכב עבור 1 דקות לתת ריצה-הזמן הכולל 34 למינימום של שמור על הטמפרטורה עמודה 55 מעלות צלזיוס. השתמש מצב מקור יון חיובי עבור הניתוח. חומצה פורמית יכול לשמש במקום TFA, אם TFA הוא חומצי מדי עבור העמודה HPLC. מומלץ כי המהירות הרמפה ההרכב הממס האורגני לא יעלה על 2%/min להפרדה טובה יותר.
    18. לנתח כל שבר באמצעות ספקטרומטר מסה לייזר בסיוע מטריקס desorption/יינון (MALDI) עבור המוצר הצפוי ז/ז-2,890.
      הערה: להמיס חומצה α-cyano-4-hydroxycinnamic-1 מ ג/מ ל acetonitrile/מים (50: 50% vol) כפתרון מטריקס. במקום µL 0.75 של מטריקס פתרון לצלחת MALDI, ואחריו 0.75 µL של כל שבר. לבצע את הניתוח באמצעות מצב חיובי יון רפלקטיביים במגוון המונית של 500-5000 Da.
    19. לשלב המוצר שברים, לפוצץ את acetonitrile, להקפיא, ולאחר lyophilize פפטידים מטוהרים עד יבש.
  2. הכנה של הרשות הפלסטינית MCP-1
    1. הכן של עודף טוחנת 1.1 של 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] DSPE-יתד (2000)-maleimide כדי פפטיד של נצנוץ נפרד בקבוקונים. להמיס שתי תרכובות במים מזוקק פעמיים כדי להפוך ~ 15 מ"ג/מ"ל. Sonicate למשך 15 דקות, או עד שני פתרונות ברורים לחלוטין.
      הערה: DSPE-יתד (2000)-Cy5 הוא מסונתז באמצעות פרוטוקול זהה עם DSPE-יתד (2000)-אמין, N-hydroxysuccinimide (NHS) אסתר-functionalized Cy5, למעט שלב 1.2.3, איפה ה-pH של התמיסה מותאם 8.5.
    2. להוסיף פתרון (2000)-maleimide DSPE-יתד הפתרון פפטיד. המערבולת ו sonicate.
    3. להוסיף 1 מ' NaOH dropwise (1 µL) עד ה-pH של התמיסה הוא 7.
    4. חנקן לטיהור לפתרון 5 דק מערבבים את הפתרון בין לילה.
    5. להקפיא את הפתרון, lyophilize עד יבש.
    6. ברגע שהמוצר גולמי הוא מיובש, להמיס המוצק של 5 מ"ג/מ"ל מים.
    7. לטהר עם HPLC כמתואר לעיל.
      הערה: פפטיד Unconjugated ו- DSPE-PEG(2000) צריך elute בין 15-30% ריכוז אורגנית (vol %), בעוד DSPE-יתד המספר המשלים (2000)-MCP-1 צריך elute בין 40-50% ריכוז אורגנית.
    8. לנתח כל שבר באמצעות ספקטרומטר מסה MALDI עבור המתאימים m/z. DSPE-יתד (2000)-MCP-1 צריך לשיא מ רחב/z-5,760.
      הערה: 2, 5-dihydroxybenzoic חומצה מתאימה ביותר לשימוש כמו המטריקס DSPE-יתד (2000)-MCP-1 עם MALDI.
  3. הרכבה של MCP-1 PAMs
    1. להמיס 1.75 מ ג PAs MCP-1 עם מתנול 3 מ בבקבוקון 1-דראם. Sonicate עד שהרשות MCP-1 היא התפרקה לחלוטין.
      הערה: ניתן לשלב חומרים פעילי שטח Cy5 ביחס של שן טוחנת של 10:90 הרשות הפלסטינית MCP-1 עבור יישומי הדמיה.
    2. להתנדף מתנול תחת חנקן בתנועה סיבובית בזמן השטיפה מתנול הנותרים את הצד של המיכל עד סרט אחיד נוצר בתחתית המבחנה. ואקום-יבש הסרט בן לילה.
    3. מימה את הסרט עם 3 מ"ל של מאגר מים או פוספט תמיסת מלח (PBS) כדי להפוך פתרון 100 מיקרומטר של PAMs MCP-1. בעדינות המערבולת ו sonicate הפתרון עד שקוף. דגירה ב 80 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
      הערה: הטמפרטורה מוגברות הוכח כדי להאיץ את תהליך הרכבה עצמית ומאפשרת את הרכיב פפטיד ליצור משני המבנה היציב ביותר, תוך כדי הנמכת42,את הריכוז (CMC) מיצלה קריטי43.
    4. מגניב את פיזור וכתוצאה מכך לטמפרטורת החדר.

2. אפיון PAMs MCP-1

  1. פיזור אור דינאמי (DLS) ואת פוטנציאל זטה
    1. המקום 100 מיקרומטר של פאם MCP-1 או פאם מקושקשות ב cuvette על פי ההוראות של המכשיר פוטנציאליים DLS או זטא.
      הערה: DLS, זטה וואקום פוטנציאלי יכול להיות שונה בהתבסס על ההוראות של המכשיר.
    2. Equilibrate הכלי לטמפרטורת החדר. למדוד את גודל ואת משטח הטעינה של פאם.
  2. במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM)
    1. להוסיף 7 µL של 50 מיקרומטר פאם MCP-1 או פאם מקושקשות על גבי רשת TEM מושעים בתוך פינצטה עצמית הסגירה עבור 5 דק הפתיל משם ה-droplet עם מגבון המשימה העדינה.
    2. להוסיף 7 µL של מים כדי לשטוף את הרשת. לפתיל משם ה-droplet.
    3. להוסיף 7 µL של wt 1% חומצה phosphotungstic עבור 2 דק הפתיל משם ה-droplet. חזור על שלב 2.2.2.
    4. יבש את הרשת TEM לפני ניתוח TEM.
  3. ספקטרוסקופיה קיווטות (CD)
    1. הפעל את החנקן למשך 5-10 דקות לפני השימוש בכלי.
    2. מקום µL 300 של ריק (מים או PBS) cuvette.
    3. למדוד ספקטרה-190-265 nm, 0.2 מ מ אורך נתיב עם זמן אינטגרציה s 1, ורוחב הפס nm 1 הטמפרטורה בחדר. לאסוף 3 משכפל.
    4. מדד 100 מיקרומטר MCP-1 פפטיד, פאם MCP-1, ביצים מקושקשות פפטיד, ונעמד פאם תחת באותו המצב שמתואר בשלב 2.3.3. להחסיר מן הריק.
    5. להתאים את הנתונים באמצעות אינטרפולציה ליניארית של polylysine בסיס ספקטרה.
    6. כבה את המכשיר. לחכות 10 דקות לפני ביטול את החנקן.

3. ניתוח במבחנה של MCP-1 PAMs

  1. במבחנה הביו
    1. תרבות ולהרחיב את ה-וואי 274.1 ומונוציטים מאתר של Dulbecco ששינה נשר בינוני בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS), 1% פניצילין-סטרפטומיצין, מ מ 0.05 מרקפטואתנול, ב- 37 מעלות מתחת 5% CO2 כדי מעבר 5.
      הערה: ה-וואי 274.1 הם תאים ההשעיה. כאשר culturing, התקשורת צריכה להיות מתחדש כל 2-3 ימים.
    2. Pipet ומונוציטים בתקשורת לתוך שפופרת צנטרפוגה סטרילי 50 מ. צנטריפוגה ב 300 x g דקות 5-4 מעלות צלזיוס.
    3. האחות המדיה הישנה, resuspend בתקשורת טריים 10 מ"ל לתוך הצינור צנטריפוגה. מערבבים לאט עד תאים מופצים בצורה שווה בתקשורת. לספור את התאים באמצעות צביעת trypan blue ו- hemocytometer.
    4. לדלל תאים כאלה ישנם 4,000 ומונוציטים לכל µL 90 של מדיה לכל טוב. להוסיף 90 µL של תאים בבארות של צלחת 96-ובכן. תקופת דגירה של 24 שעות.
      הערה: הימנע משימוש הבארות על הקצה החיצוני של הצלחת כדי למנוע הבדלי אידוי ושינויים תרמי בצלחת. למלא הבארות החיצוני 100 µL PBS.
    5. להמיס µmol 0.15 של MCP-1 פפטיד, פאם MCP-1, פפטיד מקושקשות או מקושקשת. פאם ב- PBS µL 150 צינורות microcentrifuge נפרדים, מעוקר. לבצע דילול טורי כדי להפוך µL 65 של 1, 10 ו- 100 מיקרומטר של כל דגימה.
    6. להוסיף 10 PBS µL ריכוז כל בבארות המכיל את ה-וואי 274.1 (סה כ עוצמה: µL 100 לכל, 6 קווי, בארות סה כ 96). תקופת דגירה של 72 h.
    7. להוסיף 10 µL (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) (MTS) כל היטב. תקופת דגירה של 1 h.
    8. לנתח את ספיגת שימוש בקורא צלחת 490 nm או בהתאם להוראות היצרן.
  2. במבחנה מיצלה איגוד
    1. ומונוציטים זרע 500,000 ב כל טוב של צלחת 6-ובכן ב- 2 מ של המדיה המכילה 100 מיקרומטר התווית על-ידי Cy5 פאם MCP-1 (יחס טוחנת 10:90 של DSPE-יתד (2000)-Cy5 והרשות MCP-1). תקופת דגירה של 1 h.
    2. לאסוף ה-וואי 274.1 על ידי צנטריפוגה ב g x 300 דקות 5-4 מעלות צלזיוס. האחות התקשורת.
    3. Resuspend ולשטוף את התאים ב- 2 מ"ל PBS. צנטריפוגה ב 300 x g דקות 5-4 מעלות צלזיוס. מחוק לגמרי מגניב. חזור על התהליך הכביסה עם 2 מ"ל PBS. מחוק לגמרי מגניב.
    4. להוסיף 2 מ של paraformaldehyde 4% קר לתקן את התאים. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.
    5. Pipet התאים קבוע על גבי coverslip זכוכית סטריליים בתוך בארות של צלחת 6-. טוב. צנטריפוגה-400 g x עבור 5 דקות.
    6. להסיר את paraformaldehyde. לרחוץ ולשטוף עם 2 מ"ל PBS פעם אחת. Resuspend עם 1 מל PB
      הערה: כאשר שטיפה, להימנע לשבש את פעולת התאים על coverslip.
    7. לשים 10 µL של 90% גליצרול PBS לשקופית. השתמש במחט עם פינצטה כדי לאסוף את coverslip. יבש על קצה coverslip. הנח בעדינות את coverslip לשקופית עם הפנים למטה.
    8. בעדינות חותם על קצה coverslip עם לק ברורה. מניחים במקרר עד מוכן עבור הדמיה.
    9. להשתמש לייזר קונפוקלי סורק מיקרוסקופ (CLSM) המותקן עם לייזרים עבור Cy5-λעירור = 650 ננומטר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הכנה של פאם MCP-1
מוטיב CCR2 מחייב (שאריות 13-35) של MCP-1 חלבון [YNFTNRKISVQRLASYRRITSSK] או מקושקשות פפטיד [YNSLVFRIRNSTQRKYRASIST] שונתה על-ידי הוספת משקע ציסטאין על קצה אמיני. פפטיד MCP-1 היה מסונתז על ידי שיטה מוצק-פאזי בתיווך Fmoc באמצעות סינתיסייזר של פפטיד אוטומטית. פפטיד גולמי היתה מטוהרת על-ידי הפוכה-פאזי HPLC על עמודה C8 ב 50 מעלות צלזיוס באמצעות 0.1% TFA ב תערובות acetonitrile/מים, מאופיין MALDI ספקטרומטר מסה (איור 1). פפטיד המכיל ציסטאין היה מצומדת אל DSPE-PEG2000-maleimide להניב DSPE-יתד conjugates (2000)-פפטיד באמצעות חיבור אמיתי thioether. לאחר 24 שעות בטמפרטורת החדר, המוצר הגולמי היה טהור על ידי HPLC (איור 2). DSPE-יתד (2000)-Cy5 היה מסונתז באמצעות לתגובה אסתר NHS. פילוח מונוציט PAMs שיתוף מורכבים עם DSPE-יתד (2000)-MCP-1 DSPE-יתד (2000)-Cy5 היו מפוברק על ידי המסת ב מתנול זה היה ואז התאדו מאת N2ואת הסרט שנוצר היה מיובשים תחת ואקום במשך הלילה, התאספו עצמי במים או PBS דרך אינטראקציות הידרופוביות מקבוצות"זנב" טופס PAMs MCP-1.

אפיון של פאם MCP-1
DLS נתונים ותמונות TEM של פילוח מונוציט PAMs הראה nanoparticle מפוזר היטב, כדורית של 15.3 ± 2.0 nm קוטר (איור 3 וטבלה 1). PAMs MCP-1 והן PAMs מקושקשות הראה זטה חיובי קלה פוטנציאלית של 12.1 mV ± 3.1 ו- 13.7 ± 1.9 mV, בהתאמה (טבלה 1). תקליטור הראה כי שילוב של פפטיד MCP-1 בתוך מיצלה משופרת של מבנה שניוני (טבלה 2, PAMs MCP-1: 46.2 ± 0.9% β-גיליון 1.4% ± 53.1 סליל אקראי, MCP1 חינם: ± 3.5% β-גיליון, סליל אקראי של 3.5% 65.8 ± 34.2).

במבחנה ניתוח של פאם MCP-1
במבחנה הביו, מונוציט קשירה של MCP-1 PAMs נצפו על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. העכבר ומונוציטים היו מודגרות עם הגדלת ריכוזים של MCP-1, פאם MCP-1, פפטיד מקושקשות, ביצים מקושקשות. פאם במשך 72 h, התאים נמצאו להיות בר קיימא, מסתיימים עד 100 מיקרומטר (איור 4). יתר על כן, מיקרוסקופיה קונפוקלית הראה קשירה ספציפי של monocytes PAMs MCP-1 בהשוואה מקושקשות PAMs (איור 5).

Figure 1
איור 1 : Chromatogram HPLC-220 nm (אורך גל של חלבון) ל- 254 ננומטר (אורך גל של טירוזין) של פפטיד MCP-1 (א) ופפטיד מקושקשות (B) (שיא Boxed ב 7.4 דקה). MALDI-תוף הספקטרום המונית של פפטיד MCP-1 (ג) ופפטיד מקושקשות (D) בטווח של 500-5000 Da מציג אל הפסגה [M + H]+ -m/z 2,888 (2,890 הצפוי). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: Chromatogram HPLC-220 nm (אורך גל של חלבון) ל- 254 ננומטר (אורך גל של טירוזין) של DSPE-יתד (2000)-MCP-1 (א) ו- DSPE-יתד (2000)-מקושקשת (B). (מסגרת שיא ב- 16.9 דקה). (ג) MALDI-TOF המונית, הספקטרום של DSPE-יתד (2000)-MCP-1 בטווח של 1,000-10,000 Da מציג את הפסגות עבור [M + H]+ -m/z 2,888 (2,890 הצפוי) עבור MCP-1 ו- m/z 5,758 (5,760 הצפוי) עבור DSPE-יתד (2000)-MCP-1. (ד) MALDI-TOF המונית, הספקטרום של DSPE-יתד (2000)-מקושקשת בטווח של 1,000-10,000 Da מציג את הפסגות עבור [M + H]+ -m/z 2,887 (2,890 הצפוי) עבור פפטיד מקושקשות ו- m/z 5,761 (5,760 הצפוי) עבור DSPE-פג-מקושקשת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : TEM תמונות של פאם MCP-1 (א) מהחסכונות פאם (B). סרגל קנה מידה = 100 ננומטר. התפלגות גודל המספר הממוצע של פאם MCP-1 (ג) מהחסכונות פאם ויה DLS (D). הנתונים הם זאת אומרת ± ש (n = 3). (E) ניתוח תקליטור של MCP-1 ופפטידים מקושקשות ו PAMs (n = 3). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4 : במבחנה הכדאיות של ה-וואי 274.1 ומונוציטים מאתר לאחר חשיפה 72 h MCP-1 פפטיד, פאם MCP-1, פפטיד מקושקשות, ו PAM. מעורבלות הנתונים הם זאת אומרת ± ש (n = 6). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: תמונות CLSM של פאם MCP-1 (א) ו פאם מקושקשות (B) משולב עם מול 10% Cy5 הרשות הפלסטינית (אדום) מודגרות עם ה-וואי 274.1 עבור סרגל קנה מידה ה' 1 = 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

PAMs קוטר מספר-Ave (אן אם) PDI פוטנציאל זטה (mV)
MCP-1 15.3 ± 2.0 0.119 ± 0.006 12.1 ± 3.1
ביצים מקושקשות 16.9 ± 1.4 0.232 ± 0.019 13.7 ± 1.9
נמדד ב- PBS מאגר. הנתונים מבוטאים אומר ± SD.

טבלה 1: גודל, polydispersity, ופוטנציאל זטה של PAMs.

-סליל (%) b-גיליונות (%) סליל אקראי (%)
פפטיד MCP-1 0.0 ± 0.0 36.2 ± 2.2 63.8 ± 1.8
פאם MCP-1 0.7 ± 0.6 46.2 ± 0.9 53.1 ± 1.4
פפטיד מקושקשות 0.0 ± 0.0 43.7 ± 2.1 56.3 ± 3.5
פאם מקושקשות 0.0 ± 0.0 60.7 ± 0.2 39.3 ± 0.2

בטבלה 2: מבנה שניוני קומפוזיציה של פפטידים, PAMs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

PAMs MCP-1 הם פלטפורמה הדמיה מולקולרית מבטיח, המורכב פפטיד מיקוד הידרופילית וזנב הידרופובי שמניע את מהות עצמית שהורכב ננו-חלקיק. מיצלה פילוח מונוציט הזה ניתן להכין על ידי סינתזה פשוטה ואת שלבי טיהור של פפטיד MCP-1 ו- DSPE-יתד (2000)-MCP-1. PAMs יש מאפיינים רבים מועילים ויוו מולקולרית הדמיה כגון שלהם הרכבה עצמית תחת תנאים מתון biodegradability מהותי, מבניים וכימיים גיוון המאפשר שיתוף אחרים moieties הדמיה או פילוח פפטידים למסור באופן סלקטיבי אתר מסוים של עניין. יהיה מכוון שלהם גודל החלקיקים, צורה, הרכב על ידי שינוי פפטיד, הזנב הידרופוביות, או ריכוז מיצלה, ומאפשר מאפיינים כימיים ופיזיים אופטימלית עבור מגוון של יישומים22,33.

יש לציין כמה מגבלות של פרוטוקול זה. קודם כל, מאז PAMs מונעים ע י אינטראקציות הידרופוביות, זה הכרחי לבנות מיקוד פפטידים שנמצאים הידרופיליות, ובכך לאפשר את moiety מיקוד שיוצגו על-פני מיצלה. אם הרצף פפטיד הוא הידרופוביות, תוספת של אחד או שניים חומצות אמינו התחנה הסופית C ניתן לאכלס, אך התוספת של חומצות אמינו יכול להשפיע על המבנה משני פפטיד בתוך מיצלה, ובכך לשנות את המאפיינים של פפטיד בתוך למצבו המקורי ב-44,חלבון45. שנית, בריכוזים נמוכים, PAMs יש יציבות בסביבה מימית כפי שהם תלויים במידה רבה CMC, הריכוז המינימלי הדרוש עבור PAs ליצור את מבנה micellar46. להלן CMC, מיצלה פירוק כדי מונומרים הרשות הפלסטינית בודדים, מגביל את מיצלה כדי לפעול כנשא ולפרוק תרופה-אתר מסוים47. כדי להקל על חיסרון זה, ניתן להקטין את CMC על ידי הגדלת אורך שרשרת48,הזנב הידרופובי49. לבסוף, אחסון לטווח ארוך של PAMs בפתרון לא מומלץ כי מבנה שניוני הרשות תוכל לשנות עם הזמן, ובכך להשפיע על מבנה micellar, יציבות, וכן היעילות ליגנד מחייב26.

לסיכום, פרוטוקול זה מדגים אסטרטגיה מבוסס מיצלה ננו-רפואה פפטיד חזקות, שהורכבו עצמית הדמיה טרשת עורקים. PAMs MCP-1 הם מסתיימים, מתכלה, רעילים כמו מרכיבי מיצלה שמקבלים השראה מגורמים אנדוגניים לגוף. יותר חשוב PAMs MCP-1 יש מחייב מועדף ומונוציטים, אשר מגבירים באופן פרופורציונלי כדי התקדמות פלאק, הקלת הגישה לא פולשנית של הבחנה שלבים של הפלאק טרשת עורקים. עקב המודולריות של הפלטפורמה, PAMs באפשרותך לשלב הרפוי, נוספים מיקוד פפטידים, הדמיה moieties וחומצות גרעין. לפיכך, נתון כזה יכולות דינמיות של אלה הקזאין רב תכליתיים, אנו מאמינים כי החלקיקים להחזיק הבטחה גדולה לתרגום קלינית ב טרשת עורקים ומחלות אחרות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

המחברים, הייתי רוצה להכיר את התמיכה הפיננסית של אוניברסיטת דרום קליפורניה, הלב הלאומית, ריאות, ודם המכון (NHLBI), R00HL124279, אלי ו אידית פרס החדשנות רחבה, L.K. Whittier קרן Non-סרטן פרס המחקר translational שהוענקו EJC. המחברים תודה למרכז מיקרוסקופ אלקטרונים, Microanalysis, מרכז של מצוינות NanoBiophysics, מרכז התמחות על אפיון מולקולרי ומרכז Translational הדמיה-אוניברסיטת דרום קליפורניה לעזרה בארגון כיוונוני אינסטרומנטלית.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-ethanedithiol VWR E0032 for peptide synthesis
10 mL disposable serological pipets VWR 89130-898 for cell culture
15 mL centrifuge tubes, polypropylene VWR 89401-566 for various applications
2,5-dihydroxybenzoic acid, 99% Fisher Scientific AC165200050 for MALDI
25 mL disposable serological pipets VWR 89130-900 for cell culture
2-Mercaptoethanol, 50 mM ThermoFisher Scientific 31350010 for cell culture
5 mL disposable serological pipets VWR 89130-896 for cell culture
50 mL centrifuge tubes VWR 89039-658 for various applications
75 cm2 culture flask Fisher Scientific 13-680-65 for cell culture
75 mL reaction vessel Protein Technologies 3000005 for peptide synthesis
96-wells cell culture plate VWR 40101-346 for MTS assay
Acetonitrile, HPLC grade Fisher Scientific A998SK-4 for HPLC purification
Borosilicate glass, 1 dram VWR 66011-041 for PAM synthesis
Borosillicate glass pipet, Long tips VWR 14673-043 for various applications
Coverslip, 0.16-0.19 mm, 22 x 22 mm Fisher Scientific 12-542B for confocal microscopy
Cy5 amine Abcam ab146463 for peptide conjugation
Diethyl ether, ACS grade Fisher Scientific E138-1 for peptide precipitation
Disposable syringes, 20 mL Fisher Scientific 14-817-54 for HPLC purification
Double neubauer ruled hemocytometer VWR 63510-13 for cell counting
DSPE-PEG(2000) amine Avanti 880128P for peptide conjugation
DSPE-PEG(2000) maleimide Avanti 880126P for peptide conjugation
DSPE-PEG(2000)-NHS ester  Nanocs PG2-DSNS-10K for conjugation to Cy5
Dulbecco's modified eagle medium-high glucose Sigma Aldrich D5796-500ML for cell culture
Fetal bovine serum, qualified, heat inactivated ThermoFisher Scientific 10438026 for cell culture
Fmoc-L-Ala-OH /HBTU Protein Technologies PS3-H5-A for peptide synthesis
Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH /HBTU Protein Technologies PS3-H5-RBF for peptide synthesis
Fmoc-L-Asn(Trt)-OH /HBTU Protein Technologies PS3-H5-NT for peptide synthesis
Fmoc-L-Cys(Trt)-OH /HBTU Protein Technologies PS3-H5-CT for peptide synthesis
Fmoc-L-Gln(Trt)-OH /HBTU Protein Technologies PS3-H5-QT for peptide synthesis
Fmoc-L-Ile-OH /HBTU Protein Technologies PS3-H5-I for peptide synthesis
Fmoc-L-Leu-OH /HBTU Protein Technologies PS3-H5-L for peptide synthesis
Fmoc-L-Lys(Boc)-OH /HBTU Protein Technologies PS3-H5-KBC for peptide synthesis
Fmoc-L-Phe-OH /HBTU Protein Technologies PS3-H5-F for peptide synthesis
Fmoc-L-Ser(tBu)-OH /HBTU Protein Technologies PS3-H5-SB for peptide synthesis
Fmoc-L-Thr(tBu)-OH /HBTU Protein Technologies PS3-H5-TB for peptide synthesis
Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH /HBTU Protein Technologies PS3-H5-YB for peptide synthesis
Fmoc-L-Val-OH /HBTU Protein Technologies PS3-H5-V for peptide synthesis
Fmoc-Lys(Boc)-wang resin, 100-200 mesh Novabiochem 856013 for peptide synthesis
Formic acid, optima LC/MS grade Fisher Scientific A117-50 for HPLC purification
Glycerol VWR M152-1L for confocal microscopy
Hand tally counter Fisher Scientific S90189 for cell counting
Magnetic stir bars, egg-shaped VWR 58949-006 for peptide conjugation
Methanol, ACS certified Fisher Scientific A412-4 for PAM synthesis
MTS cell proliferation colorimetric assay kit VWR 10191-104 for MTS assay
N,N-Dimethylformamide, sequencing grade Fisher Scientific BP1160-4 for peptide synthesis
N-Methylmorpholine Protein Technologies S-1L-NMM for peptide synthesis
Paraformaldehyde Fisher Scientific AC416780250 for fixing cells
PBS, pH 7.4 ThermoFisher Scientific 10010049 for various applications
Penicillin/streptomycin, 10,000 U/mL ThermoFisher Scientific 15140122 for cell culture
Peptide synthesis vessel, 25 mL  Fisher Scientific CG186011 for peptide synthesis
Phosphotungstic acid  Fisher Scientific A248-25 for TEM
Piperidine Spectrum P1146-2.5LTGL for peptide synthesis
Plain glass microscope slide 75 x 25 mm Fisher Scientific 12-550-A3 for confocal microscopy
Reagent reservoirs, sterile  VWR 95128093 for cell culture
Self-closing tweezer TedPella 515 for TEM
TEM support film TedPella 01814F for TEM
Trifluoroacetic acid  Fisher Scientific BP618-500 for peptide cleavage and HPLC purification
Triisopropylsilane VWR TCT1533-5ml for peptide cleavage
Trypan blue solution, 0.4% ThermoFisher Scientific 15250061 for cell counting
Tweezer, general purpose-serrated VWR 231-SA-SE for confocal microscopy
WEHI-274.1 ATCC ATCC CRL-1679 murine monocyte
automated benchtop peptide synthesizer Protein Technologies PS3 Benchtop Peptide Synthesizer
α- cyano- 4- hydroxycinnamic acid, 99% Sigma Aldrich 476870-2G for MALDI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mozaffarian, D., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), e38-e60 (2016).
  2. Falk, E. Pathogenesis of atherosclerosis. J. Am. Coll. Cardiol. 47 (8, Suppl. C), C7-C12 (2006).
  3. Rahmani, M., Cruz, R. P., Granville, D. J., McManus, B. M. Allograft Vasculopathy Versus Atherosclerosis. Circ. Res. 99 (8), 801-815 (2006).
  4. Luis, A. J. Atherosclerosis. Nature. 407 (6801), 233-241 (2000).
  5. Libby, P., Ridker, P. M., Hansson, G. K. Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis. Nature (London, U. K). 473 (7347), 317-325 (2011).
  6. Boring, L., Gosling, J., Cleary, M., Charo, I. F. Decreased lesion formation in CCR2-/- mice reveals a role for chemokines in the initiation of atherosclerosis. Nature (London). 394 (6696), 894-897 (1998).
  7. Szmitko, P. E., et al. New Markers of Inflammation and Endothelial Cell Activation. Circulation. 108 (16), 1917-1923 (2003).
  8. Deshmane, S. L., Kremlev, S., Amini, S., Sawaya, B. E. Monocyte Chemoattractant Protein-1 (MCP-1): An Overview. J. Interferon Cytokine Res. 29 (6), 313-326 (2009).
  9. Chung, E. J., et al. Monocyte-Targeting Supramolecular Micellar Assemblies: A Molecular Diagnostic Tool for Atherosclerosis. Adv. Healthcare Mater. 4 (3), 367-376 (2015).
  10. Chung, E. J. Targeting and therapeutic peptides in nanomedicine for atherosclerosis. Exp Biol Med (Maywood). 241 (9), 891-898 (2016).
  11. Sanz, J., Fayad, Z. A. Imaging of atherosclerotic cardiovascular disease. Nature (London, U. K.). 451 (7181), 953-957 (2008).
  12. Tarkin, J. M., et al. Imaging Atherosclerosis. Circ. Res. 118 (4), 750-769 (2016).
  13. Hennerici, M., Baezner, H., Daffertshofer, M. Ultrasound and arterial wall disease. Cerebrovasc Dis. 17 Suppl 1, 19-33 (2004).
  14. Nissen, S. E. Application of intravascular ultrasound to characterize coronary artery disease and assess the progression or regression of atherosclerosis. Am J Cardiol. 89 (4A), 24B-31B (2002).
  15. Khalil, M. M., Tremoleda, J. L., Bayomy, T. B., Gsell, W. Molecular SPECT Imaging: An Overview. Int J Mol Imaging. 2011, 796025 (2011).
  16. Lerakis, S., et al. Imaging of the vulnerable plaque: noninvasive and invasive techniques. Am J Med Sci. 336 (4), 342-348 (2008).
  17. Sun, Z. H., Rashmizal, H., Xu, L. Molecular imaging of plaques in coronary arteries with PET and SPECT. J Geriatr Cardiol. 11 (3), 259-273 (2014).
  18. Godin, B., et al. Emerging applications of nanomedicine for the diagnosis and treatment of cardiovascular diseases. Trends Pharmacol. Sci. 31 (5), 199-205 (2010).
  19. Branco de Barros, A. L., Tsourkas, A., Saboury, B., Cardoso, V. N., Alavi, A. Emerging role of radiolabeled nanoparticles as an effective diagnostic technique. EJNMMI Res. 2 (1), 31-39 (2012).
  20. Jayagopal, A., Linton, M. F., Fazio, S., Haselton, F. R. Insights into atherosclerosis using nanotechnology. Curr. Atheroscler. Rep. 12 (3), 209-215 (2010).
  21. Khodabandehlou, K., Masehi-Lano, J. J., Poon, C., Wang, J., Chung, E. J. Targeting cell adhesion molecules with nanoparticles using in vivo and flow-based in vitro models of atherosclerosis. Exp Biol Med (Maywood). 242 (8), 799-812 (2017).
  22. Trent, A., Marullo, R., Lin, B., Black, M., Tirrell, M. Structural properties of soluble peptide amphiphile micelles. Soft Matter. 7 (20), 9572-9582 (2011).
  23. Hartgerink, J. D., Beniash, E., Stupp, S. I. Peptide-amphiphile nanofibers: A versatile scaffold for the preparation of self-assembling materials. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (8), 5133-5138 (2002).
  24. Missirlis, D., et al. Effect of the Peptide Secondary Structure on the Peptide Amphiphile Supramolecular Structure and Interactions. Langmuir. 27 (10), 6163-6170 (2011).
  25. Zhong, L., Johnson, W. C. Environment affects amino acid preference for secondary structure. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89 (10), 4462-4465 (1992).
  26. Shimada, T., Lee, S., Bates, F. S., Hotta, A., Tirrell, M. Wormlike Micelle Formation in Peptide-Lipid Conjugates Driven by Secondary Structure Transformation of the Headgroups. J. Phys. Chem. B. 113 (42), 13711-13714 (2009).
  27. Missirlis, D., et al. Linker Chemistry Determines Secondary Structure of p5314-29 in Peptide Amphiphile Micelles. Bioconjugate Chem. 21 (3), 465-475 (2010).
  28. Elbert, D. L., Hubbell, J. A. Surface treatments of polymers for biocompatibility. Annu. Rev. Mater. Sci. 26, 365-394 (1996).
  29. Xue, Y., O'Mara, M. L., Surawski, P. P. T., Trau, M., Mark, A. E. Effect of Poly(ethylene glycol) (PEG) Spacers on the Conformational Properties of Small Peptides: A Molecular Dynamics Study. Langmuir. 27 (1), 296-303 (2011).
  30. Canalle, L. A., Loewik, D. W. P. M., van Hest, J. C. M. Polypeptide-polymer bioconjugates. Chem. Soc. Rev. 39 (1), 329-353 (2010).
  31. Hamley, I. W. PEG-Peptide Conjugates. Biomacromolecules. 15 (5), 1543-1559 (2014).
  32. Acar, H., et al. Self-assembling peptide-based building blocks in medical applications. Adv. Drug Delivery Rev. , (2016).
  33. Busseron, E., Ruff, Y., Moulin, E., Giuseppone, N. Supramolecular self-assemblies as functional nanomaterials. Nanoscale. 5 (16), 7098-7140 (2013).
  34. Barrett, J. C., et al. Modular Peptide Amphiphile Micelles Improving an Antibody-Mediated Immune Response to Group A Streptococcus. ACS Biomater. Sci. Eng. 3 (2), 144-152 (2017).
  35. Toughrai, S., et al. Reduction-Sensitive Amphiphilic Triblock Copolymers Self-Assemble Into Stimuli-Responsive Micelles for Drug Delivery. Macromol. Biosci. 15 (4), 481-489 (2015).
  36. Swirski, F. K., et al. Monocyte accumulation in mouse atherogenesis is progressive and proportional to extent of disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103 (27), 10340-10345 (2006).
  37. Kashiwagi, M., et al. Association of monocyte subsets with vulnerability characteristics of coronary plaques as assessed by 64-slice multidetector computed tomography in patients with stable angina pectoris. Atherosclerosis (Amsterdam, Neth). 212 (1), 171-176 (2010).
  38. Chung, E. J., Tirrell, M. Recent Advances in Targeted, Self-Assembling Nanoparticles to Address Vascular Damage Due to Atherosclerosis. Adv. Healthcare Mater. 4 (16), 2408-2422 (2015).
  39. Cassetta, L., Pollard, J. W. Cancer immunosurveillance: role of patrolling monocytes. Cell Res. 26 (1), 3-4 (2016).
  40. Williams, C. B., Yeh, E. S., Soloff, A. C. Tumor-associated macrophages: unwitting accomplices in breast cancer malignancy. NPJ Breast Cancer. 2, (2016).
  41. Richards, D. M., Hettinger, J., Feuerer, M. Monocytes and Macrophages in Cancer: Development and Functions. Cancer Microenviron. 6 (2), 179-191 (2013).
  42. Schick, M. J. Effect of temperature on the critical micelle concentration of nonionic detergents. Thermodynamics of micelle formation. J. Phys. Chem. 67 (9), 1796-1799 (1963).
  43. Marullo, R., Kastantin, M., Drews, L. B., Tirrell, M. Peptide contour length determines equilibrium secondary structure in protein-analogous micelles. Biopolymers. 99 (9), 573-581 (2013).
  44. Hilbich, C., Kisters-Woike, B., Reed, J., Masters, C. L., Beyreuther, K. Substitutions of hydrophobic amino acids reduce the amyloidogenicity of Alzheimer's disease βA4 peptides. J. Mol. Biol. 228 (2), 460-473 (1992).
  45. Trevino, S. R., Scholtz, J. M., Pace, C. N. Amino Acid Contribution to Protein Solubility: Asp, Glu, and Ser Contribute more Favorably than the other Hydrophilic Amino Acids in RNase Sa. J. Mol. Biol. 366 (2), 449-460 (2007).
  46. Kim, S. W., Shi, Y. Z., Kim, J. Y., Park, K. N., Cheng, J. X. Overcoming the barriers in micellar drug delivery: Loading efficiency, in vivo stability, and micelle-cell interaction. Expert Opin Drug Delivery. 7 (1), 49-62 (2010).
  47. Rangel-Yagui, C. O., Pessoa, A. Jr, Tavares, L. C. Micellar solubilization of drugs. J. Pharm. Pharm. Sci. 8 (2), 147-163 (2005).
  48. Batrakova, E., et al. Fundamental relationships between the composition of pluronic block copolymers and their hypersensitization effect in MDR cancer cells. Pharm. Res. 16 (9), 1373-1379 (1999).
  49. Chen, L. J., Lin, S. Y., Huang, C. C. Effect of Hydrophobic Chain Length of Surfactants on Enthalpy-Entropy Compensation of Micellization. J. Phys. Chem. B. 102 (22), 4350-4356 (1998).

Tags

בביו-הנדסה גיליון 129 מונוציט פפטיד הקזאין טרשת עורקים ננו-חלקיק הדמיה הרכבה עצמית אבחון
סינתזה של פילוח מונוציט פפטיד אמפיפיליות הקזאין עבור הדמיה של טרשת עורקים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Poon, C., Sarkar, M., Chung, E. J.… More

Poon, C., Sarkar, M., Chung, E. J. Synthesis of Monocyte-targeting Peptide Amphiphile Micelles for Imaging of Atherosclerosis. J. Vis. Exp. (129), e56625, doi:10.3791/56625 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter