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Bioengineering

Atherosclerosis के इमेजिंग के लिए Monocyte-लक्ष्यीकरण पेप्टाइड Amphiphile Micelles का संश्लेषण

Published: November 17, 2017 doi: 10.3791/56625
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, University of Southern California

Summary

इस कागज संश्लेषण और monocyte के लक्षण वर्णन-लक्ष्यीकरण पेप्टाइड amphiphile micelles और इसी परख को शामिल करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है के लिए monocytes को बांध करने के लिए micelle की क्षमता और असंगति के लिए परीक्षण करने के लिए ।

Abstract

Atherosclerosis हृदय रोग के लिए एक प्रमुख योगदानकर्ता है, दुनिया भर में मौत का प्रमुख कारण है, जो १७,३००,००० जीवन प्रतिवर्ष दावा करता है । Atherosclerosis भी अचानक मौत और रोधगलन, अस्थिर पट्टिकाओं कि टूटना और चेतावनी के बिना रक्त वाहिका करना द्वारा उकसाया के प्रमुख कारण है । वर्तमान इमेजिंग मोडलें स्थिर और अस्थिर पट्टिकाओं के बीच अंतर नहीं कर सकतीं जो टूटना । पेप्टाइड amphiphiles micelles (पम्म) इस खामी को दूर कर सकते हैं क्योंकि वे विशेष रूप से रोगग्रस्त ऊतक के लिए बांध कि लक्ष्यीकरण moieties की एक किस्म के साथ संशोधित किया जा सकता है. Monocytes atherosclerosis के जल्दी मार्करों होना दिखाया गया है, जबकि Monocytes का बड़ा संचय टूटना करने के लिए प्रवण सजीले टुकड़े के साथ जुड़ा हुआ है । इसलिए, नैनोकणों है कि monocytes लक्ष्य कर सकते है atherosclerosis के विभिंन चरणों में भेदभाव किया जा सकता है । कि अंत करने के लिए, यहाँ, हम monocyte की तैयारी के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन-लक्ष्यीकरण पम्म (monocyte chemoattractant प्रोटीन-1 (एमसीपी-1) पम्म). एमसीपी-1 पम्म के पास तटस्थ सतह प्रभारी के साथ व्यास में 15 एनएम के नैनोकणों फार्म के लिए हल्के परिस्थितियों में संश्लेषण के माध्यम से आत्म इकट्ठे होते हैं । इन विट्रो में, पम्म को संगत होना पाया गया और monocytes के लिए एक उच्च बाइंडिंग संबध था । तरीकों atherosclerosis में आवेदनों की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ ही अंय भड़काऊ रोगों के लिए वादा शो बताया ।

Introduction

हृदय रोगों के लिए मौत का प्रमुख कारण विश्व स्तर पर लगभग १७,३००,००० दुनिया भर में मौतों के साथ रहना1। हृदय रोगों atherosclerosis द्वारा योगदान कर रहे हैं, एक शर्त है जिसमें सजीले टुकड़े धमनियों में निर्माण, जिससे शरीर की कोशिकाओं के लिए रक्त और ऑक्सीजन प्रवाह में बाधा2,3. atherosclerosis की प्रगति एक भड़काऊ प्रतिक्रिया, अनियमित लिपिड चयापचय, और पट्टिका निर्माण, पट्टिका टूटना और रोधगलन4,5के लिए अग्रणी द्वारा और अधिक मोटा होना और धमनियों की सख्ती शामिल है । Endothelial कोशिकाओं साइटोकिंस और आसंजन अणु, जो एमसीपी-1 है कि सी के लिए बांध-सी chemokine रिसेप्टर (CCR2) monocytes6,7,8की सतह पर पाया एक्सप्रेस शामिल हैं । ऑक्सीकरण कोलेस्ट्रॉल पट्टिका गठन, जो इस क्षेत्र में भड़काऊ प्रतिक्रिया को प्रवर्धित और ऊतक की चोट और अस्थिर या कमजोर सजीले टुकड़े के गठन के लिए सुराग के प्रारंभिक चरण के दौरान मैक्रोफेज करने के लिए monocytes धर्मांतरित9, 10.

परंपरागत रूप से, atherosclerosis शारीरिक इमेजिंग द्वारा एंजियोग्राफी या अल्ट्रासाउंड11,12का उपयोग करके चमकदार रोग का आकलन द्वारा मूल्यांकन किया है । हालांकि, इन तरीकों केवल धमनी की दीवार के गंभीर संकुचन और नहीं atherosclerosis के प्रारंभिक चरण निर्धारित कर सकते हैं, प्रारंभिक पट्टिका विकास के रूप में धमनी का आकार और रक्त प्रवाह दर12,13बनाए रखने के लिए remodeling का कारण बनता है, 14. इसलिए, एंजियोग्राम atherosclerosis प्रसार को दर्शाता है । इसके अतिरिक्त, ऐसी एकल फोटॉन उत्सर्जन गणना टोमोग्राफी, पोजीट्रान उत्सर्जन टोमोग्राफी, और चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग के रूप में आक्रामक इमेजिंग तकनीक हाल ही में पट्टिका आकृति विज्ञान की विशेषता के लिए इस्तेमाल किया गया है के रूप में वे प्रारंभिक विवरण प्रदान कर सकते है और सजीले टुकड़े के लक्षण वर्णन । हालांकि, इन मोडलों अक्सर संवेदनशीलता की कमी से सीमित हैं, स्थानिक संकल्प, या विकिरण के उपयोग की आवश्यकता होती है, विभिन्न चरणों में इमेजिंग पट्टिका प्रगति कर बहुत अधिक चुनौतीपूर्ण15,16, 17. एक इमेजिंग वितरण प्रणाली है कि विशेष रूप से atherosclerosis के विभिंन चरणों में पट्टिकाओं की पहचान करने के लिए विकसित किया जाएगा रहता है ।

नैनोकणों के लिए एक उभरते हुए मंच vivo पट्टिका लक्ष्यीकरण और निदान18,19,20,21 में दिखाया गया है । विशेष रूप से, पम्म अपने रासायनिक विविधता और moieties, रचनाएं, आकार, आकार, और सतह functionalization की एक किस्म को समायोजित करने की क्षमता के कारण लाभप्रद है22। पेप्टाइड amphiphiles (क़दम) एक हाइड्रोफिलिक से मिलकर बनता है, पेप्टाइड "headgroup" एक hydrophobic पूंछ से जुड़ा है, जो आम तौर पर लिपिड हैं; यह amphiphilic संरचना स्व-कोडांतरण क्षमताओं को प्रदान करता है और कण22,23,24की सतह पर पेप्टाइड्स के एक multivalent प्रदर्शन के लिए अनुमति देता है । पेप्टाइड headgroups के बीच तह और हाइड्रोजन संबंध के माध्यम से कण आकार को प्रभावित कर सकते हैं25. जो β-पत्रक इंटरैक्शन के माध्यम से गुना पेप्टाइड्स लम्बी micelles प्रपत्र करने के लिए दिखाया गया है, जबकि α-पेचदार पुष्टिकरण दोनों गोलाकार और लम्बी micelles22,23,24प्रपत्र कर सकते हैं, 25,26,27. पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) लिंकर्स कि सतह के प्रभारी को ढाल पेप्टाइड के हाइड्रोफिलिक पेप्टाइड और पम्म की hydrophobic पूंछ के बीच रखा जा सकता है, प्रणालीगत संचलन में nanoparticle की उपलब्धता को बढ़ाने28, 29 , 30 , 31. पम्म भी लाभप्रद है क्योंकि वे संगत कर रहे है और अनुप्रयोगों के एक व्यापक रेंज३२है दिखाया गया है,३३। micelles के पानी घुलनशीलता अंय nanoparticle आधारित प्रणालियों पर एक लाभ प्रदान करता है जैसे कुछ बहुलक नैनोकणों कि पानी में घुलनशील नहीं है और इंजेक्शन के लिए solubilizers में निलंबित कर दिया जाना है३४। इसके अतिरिक्त, पम्म बनाने की क्षमता है कि एक विशिष्ट उत्तेजनाओं के जवाब में जुदा पम्म नियंत्रित intracellular दवा वितरण३५के लिए एक आकर्षक उंमीदवार बनाता है ।

CCR2 रिसेप्टर के लिए बाध्यकारी और महाधमनी आर्क में जमते द्वारा, पम्म पहले atherosclerotic में महाधमनी घावों के विभिन्न चरणों की निगरानी करने के लिए monocyte लक्ष्यीकरण के लिए विकसित किए गए थे9. ApoE-/- चूहों में, monocyte संचय आनुपातिक प्रगति पट्टिका३६करने के लिए बढ़ जाती है । इसके अलावा, यह पाया गया कि टूटना प्रवण, देर चरण पट्टिका के साथ रोगियों monocytes३७की उच्च मात्रा में होते हैं । इसलिए, एमसीपी-1 को शामिल करने के लिए पम्म का संशोधन उपयोगी है क्योंकि यह प्रारंभिक और देर चरण के atherosclerotic घावों के बीच अधिक लक्ष्यीकरण विशिष्टता और विभेदन के लिए अनुमति देता है । इन सबूत की अवधारणा अध्ययन भी सत्यापित किया है कि पम्म काफी सुरक्षित करने के लिए पूर्व नैदानिक इस्तेमाल किया जा सकता है और गुर्दे की३८मंजूरी दे दी है । के बाद से monocytes और सूजन अंय रोगों के लिए विशेषता है, एमसीपी-1 पम्म क्षमता है atherosclerosis से परे अंय रोगों में चिकित्सीय और नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा8,३९,४० , ४१.

इस के साथ साथ, हम उच्च स्केलेबल और आत्म इकट्ठे एमसीपी-1 पम्म के निर्माण की रिपोर्ट है कि कण इष्टतम आकार, भूतल प्रभारी प्रदर्शन किया, और monocytes को atherosclerosis में बढ़ाया इमेजिंग अनुप्रयोगों के लिए चुनिंदा लक्ष्यीकरण ।

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Protocol

नोट: रिएजेंट के लिए MSDS पढ़ें और स्थानीय संस्था द्वारा आवश्यक सभी रासायनिक सुरक्षा उपायों का पालन करें ।

1. एमसीपी-1 पम्म की तैयारी

  1. एमसीपी-1 पेप्टाइड की तैयारी
    1. ०.२५ mmol की Fmoc-एल-Lys (बीओसी)-एक रिएक्शन पोत (RV) में वांग । एक रासायनिक धुएं हुड में 5 मिलीलीटर dimethylforamide (DMF) के साथ आर. वी. के पक्ष कुल्ला ।
    2. एक स्वचालित benchtop पेप्टाइड सिंथेसाइज़र पर RV लोड । लोड पूर्व पैक अमीनो अम्ल शीशियों, N'-CYNFTINRKISVQRLASYRRITSS-c ', सी से N करने के लिए-टर्मिनस । अंतिम संरक्षण कदम के लिए अंत में एक खाली शीशी शामिल करें ।
      नोट: अनुक्रम के साथ एक तले हुए पेप्टाइड, N'-CNNSIIRSKQVLRSTRYFRSATYK-C ', भी एक ही प्रोटोकॉल का उपयोग कर संश्लेषित किया जा सकता.
    3. एक बार संश्लेषण समाप्त हो गया है, सभी रेजिन के स्थानांतरित कर रहे हैं जब तक 2-3 मिलीलीटर मेथनॉल के साथ आर सी के लिए RV से राल पर पेप्टाइड्स हस्तांतरण. के बाद राल नीचे करने के लिए डूब गया है, मेथनॉल supernatant को दूर करने और सूखी जब तक शेष लुप्त हो जाना । वैक्यूम एक अतिरिक्त 2 ज या कमरे के तापमान पर रात भर के लिए सूखी ।
    4. 12 मिलीलीटर दरार बनाने trifluoracetic एसिड (TFA): ethanedithiol: पानी: triisopropylsilane में 94:2.5:2.5:1 vol% एक रासायनिक धुएं हूड में युक्त समाधान । भंवर यह समान रूप से मिश्रित है सुनिश्चित करने के लिए क्लीवेज समाधान ।
      चेतावनी: क्योंकि triisopropylsilane और ethanedithiol हवा के प्रति संवेदनशील हैं, आर्गन उंहें वापस डालने से पहले 1 मिनट के लिए triisopropylsilane और ethanedithiol के शेयर शीशियों शुद्ध ।
    5. एसवी के नीचे आधे के पास दबाना द्वारा एक बांह के बरतन पर संश्लेषण पोत (एसवी) प्लेस । पेप्टाइड-रेजिन के सभी स्थानांतरित कर रहे हैं जब तक दरार समाधान के 2 मिलीलीटर के साथ एसवी के लिए पेप्टाइड-राल स्थानांतरण ।
    6. 3 मिलीलीटर दरार समाधान के साथ एसवी के पक्षों को धो लें । एसवी की टोपी बंद करें और 4 एच के लिए ३०० दोलनों/
    7. बाहर एक खाली ५० एमएल केंद्रापसारक ट्यूब वजन । जन रर ।
    8. 4 ज के बाद, ५० मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब में एसवी से सट पेप्टाइड समाधान नाली । एसवी कई बार कुल्ला शेष दरार समाधान के साथ ।
    9. नाइट्रोजन के साथ सट पेप्टाइड समाधान लुप्त हो जाना जब तक वहां से कम 4 केंद्रापसारक ट्यूब में शेष मिलीलीटर है ।
    10. पेप्टाइड-सट समाधान करने के लिए बर्फ के ३६ मिलीलीटर-ठंडा ईथर जोड़ें ।
    11. भंवर समाधान जब तक यह पूरी तरह से सफेद या पीले रंग का है । 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ३,००० x g पर केंद्रापसारक, और supernatant खिचड़ी भाषा ।
    12. ट्यूब के लिए ४० मिलीलीटर बर्फ-शीत ईथर जोड़ें । भंवर और sonicate फिर से । इस केंद्रापसारक प्रक्रिया को दोहराने । supernatant को नहीं ।
    13. सूखी नाइट्रोजन गैस के साथ कच्चे पीए गोली मिटा जब तक ईथर दिख सुखाया है ।
    14. जोड़ें 20 मिलीलीटर डबल आसुत जल, भंवर, और sonicate जब तक पेप्टाइड पूरी तरह से समाधान में भंग कर दिया है ।
    15. समाधान फ्रीज और शुष्क जब तक lyophilize ।
    16. एक बार पेप्टाइड सूख गया है, कच्चे पेप्टाइड युक्त केंद्रापसारक ट्यूब के द्रव्यमान का वजन । 5 मिलीग्राम/एमएल पानी में कच्चे पेप्टाइड को भंग ।
    17. 25 मिलीग्राम क्रूड एमसीपी-1 पेप्टाइड में 5 मिलीलीटर डबल आसुत पानी की कुल एकाग्रता बनाने के लिए भंग 5 मिलीग्राम/एमएल । क्रूड एमसीपी-1 पेप्टाइड द्वारा उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) का उपयोग कर पानी में ०.१% TFA (विलायक एक) और TFA में ०.१% acetonitrile (विलायक बी) एक C8 रिवर्स चरण कॉलम पर मोबाइल चरणों के रूप में । HPLC में पेप्टाइड के 5 मिलीलीटर सुई ।
      नोट: प्रारंभिक मोबाइल चरण ९.० मिलीलीटर की एक प्रवाह दर पर १००% विलायक एक शामिल/कम विलायक एक धीरे 27 मिनट में 30% के लिए और 3 मिनट के लिए इस संरचना पर पकड़ । १००% विलायक एक से अधिक 3 मिनट के लिए ढाल लौटें और 1 मिनट के लिए इस संरचना पर पकड़ देने के लिए एक कुल रन-३४ मिनट के समय ५५ डिग्री सेल्सियस पर कॉलम तापमान रखो । विश्लेषण के लिए सकारात्मक आयन स्रोत मोड का उपयोग करें । TFA के स्थान पर फार्मल एसिड का इस्तेमाल किया जा सकता है, अगर TFA HPLC कॉलम के लिए बहुत अंलीय है । यह अनुशंसित है कि कार्बनिक विलायक संरचना रैंप गति 2% से अधिक नहीं बेहतर जुदाई के लिए मिनट चाहिए ।
    18. २,८९० में अपेक्षित उत्पाद m/z के लिए मैट्रिक्स असिस्टेड लेजर desorption/ionization (मालदी) मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग करते हुए प्रत्येक अंश का विश्लेषण करें ।
      नोट: भंग α-cyano-4-hydroxycinnamic एसिड पर acetonitrile/पानी में 1 मिलीग्राम/एमएल मैट्रिक्स समाधान के रूप में (50:50 vol%) । स्पॉट ०.७५ µ एल मैट्रिक्स समाधान की मालदी प्लेट पर, इसके बाद प्रत्येक अंश के ०.७५ µ एल. 500 की एक व्यापक रेंज में एक सकारात्मक चिंतनशील आयन मोड का उपयोग कर विश्लेषण बाहर ले-5000 डा.
    19. उत्पाद भागों गठबंधन, acetonitrile, फ्रीज, और सूखी lyophilize जब तक शुद्ध पेप्टाइड्स झटका ।
  2. एमसीपी-1 PA की तैयारी
    1. एक १.१ दाढ़ अतिरिक्त 1, 2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[एमिनो (पॉलीथीन ग्लाइकोल)-२०००] DSPE-खूंटी (2000)-maleimide करने के लिए पेप्टाइड में अलग से जुटाना शीशियों में तैयार करें । डबल आसुत जल में दोनों यौगिकों भंग करने के लिए ~ 15 मिलीग्राम/ Sonicate 15 मिनट के लिए या जब तक दोनों समाधान पूरी तरह से स्पष्ट कर रहे हैं ।
      नोट: DSPE-खूंटी (2000)-Cy5 DSPE के साथ एक ही प्रोटोकॉल का उपयोग कर संश्लेषित है-खूंटी (2000)-अमीन और N-hydroxysuccinimide (एन एच एस) एस्टर-कार्यात्मक Cy5, कदम के अलावा 1.2.3, जहां समाधान के पीएच ८.५ करने के लिए समायोजित है ।
    2. जोड़ें DSPE-खूंटी (2000)-maleimide समाधान पेप्टाइड समाधान करने के लिए । भंवर और sonicate ।
    3. 1 M NaOH dropwise (1 µ l) एक समय में जोड़ें जब तक कि समाधान का पीएच 7 है ।
    4. 5 min. समाधान के लिए नाइट्रोजन पर्ज समाधान रात भर हलचल ।
    5. समाधान फ्रीज और शुष्क जब तक lyophilize ।
    6. कच्चे उत्पाद के सूख जाने के बाद, 5 मिलीग्राम/एमएल पानी में ठोस भंग ।
    7. ऊपर वर्णित के रूप में HPLC के साथ शुद्ध ।
      नोट: Unconjugated पेप्टाइड और DSPE-खूंटी (2000) 15-30% कार्बनिक एकाग्रता (vol%), के बीच elute चाहिए, जबकि DSPE-खूंटी (2000)-एमसीपी-1 संयुग्म 40-50% कार्बनिक एकाग्रता के बीच elute चाहिए ।
    8. मालदी मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग करते हुए प्रत्येक अंश का विश्लेषण इसी m/z. DSPE-खूंटी (2000) के लिए-एमसीपी-1 ५,७६० पर एक व्यापक एम/जेड चोटी होना चाहिए ।
      नोट: 2, 5-dihydroxybenzoic एसिड सबसे अच्छा DSPE के लिए मैट्रिक्स के रूप में प्रयोग किया जाता है-खूंटी (2000)-एमसीपी-1 मालदी के साथ ।
  3. असेंबली ऑफ एमसीपी-1 पम्म
    1. भंग १.७५ मिलीग्राम एमसीपी-1 के साथ एक प्राधान्य 1-घूंट की शीशी में मेथनॉल 3 मिलीलीटर । Sonicate तक एमसीपी-1 PA पूरी तरह से घुल गया है ।
      नोट: Cy5 amphiphiles इमेजिंग अनुप्रयोगों के लिए 10:90 एमसीपी-1 PA के एक दाढ़ अनुपात में शामिल किया जा सकता है ।
    2. एक परिपत्र गति में नाइट्रोजन के तहत मेथनॉल लुप्त हो जाना जबकि शीशी के नीचे एक समान फिल्म का गठन किया है जब तक कि शेष मेथनॉल की ओर से, एक शीशी में कुल्ला । वैक्यूम-सूखी फिल्म रातोंरात ।
    3. पानी या फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) के 3 मिलीलीटर के साथ इस फिल्म को हाइड्रेट एमसीपी-1 पम्म के एक १०० µ एम समाधान बनाने के लिए । धीरे भंवर और sonicate समाधान जब तक स्पष्ट है । 30 मिनट के लिए ८० ° c पर मशीन ।
      नोट: ऊंचा तापमान आत्म विधानसभा प्रक्रिया में तेजी लाने के लिए दिखाया गया है और पेप्टाइड घटक सबसे स्थिर माध्यमिक संरचना बनाने के लिए अनुमति देता है, जबकि क्रिटिकल micelle एकाग्रता (सीएमसी)४२कम,४३.
    4. कमरे के तापमान के परिणामस्वरूप फैलाव शांत ।

2. एमसीपी-1 पम्म का लक्षण वर्णन

  1. गतिशील प्रकाश कैटरिंग (DLS) और जीटा संभावित
    1. प्लेस एमसीपी के १०० µ मीटर-1 पाम या एक cuvette में पाम तले DLS या जीटा संभावित साधन के निर्देशों के अनुसार ।
      नोट: DLS और जीटा संभावित cuvettes साधन के निर्देश के आधार पर अलग किया जा सकता है ।
    2. कमरे के तापमान को साधन Equilibrate । आकार और पाम के भूतल प्रभारी उपाय ।
  2. ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (उनि)
    1. जोड़ें 7 µ ५० µ एम एमसीपी के एल-1 पाम या एक उनि एक स्वयं के भीतर निलंबित ग्रिड पर पाम तले हुए 5 मिनट के लिए नोचना बंद करने के लिए एक नाजुक कार्य के साथ छोटी बूंद दूर बाती ।
    2. ग्रिड को धोने के लिए पानी की 7 µ एल जोड़ें । बाती दूर छोटी बूंद ।
    3. 2 मिनट के लिए 1 wt% phosphotungstic एसिड की 7 µ एल जोड़ें दूर छोटी बूंद बाती । चरण -8 दोहराएँ ।
    4. उनि विश्लेषण से पहले उनि ग्रिड सूखी ।
  3. परिपत्र dichroism (सीडी) स्पेक्ट्रोस्कोपी
    1. साधन का उपयोग करने से पहले 5-10 मिनट के लिए नाइट्रोजन को चालू करें ।
    2. cuvette में जगह खाली (पानी या पंजाबियों) के ३०० µ एल.
    3. मापने स्पेक्ट्रा पर 190-265 एनएम, ०.२ मिमी पथ-लंबाई के साथ एक 1 s एकीकरण समय, और एक 1 एनएम बैंडविड्थ कमरे के तापमान में. इकट्ठा 3 दोहराने ।
    4. उपाय १०० µ m एमसीपी-1 पेप्टाइड, एमसीपी-1 पाम, तले पेप्टाइड, और एक ही चरण 2.3.3 में वर्णित शर्त के तहत पाम तले । खाली से घटाना ।
    5. polylysine आधार स्पेक्ट्रा के रेखीय प्रक्षेप का उपयोग करते हुए डेटा को फ़िट करे ।
    6. यंत्र को बंद कर दें । नाइट्रोजन को मोड़ने से पहले 10 मिनट तक प्रतीक्षा करें ।

3. इन विट्रो Analysis In एमसीपी-1 पम्म

  1. इन विट्रो में असंगति
    1. संस्कृति और विस्तार WEHI २७४.१ murine monocytes में Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 1% पेनिसिलिन-streptomycin, और ०.०५ मिमी 2-mercaptoethanol में ३७ ° c के तहत 5% सह के साथ पूरक 5.2 .
      नोट: WEHI २७४.१ निलंबन कक्ष हैं । जब संवर्धन तो मीडिया को हर 2-3 दिन मंगाया जाना चाहिए ।
    2. प्लास्टिक एक बाँझ ५० एमएल केंद्रापसारक ट्यूब में मीडिया में monocytes । 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ३०० x g पर केंद्रापसारक ।
    3. महाप्राण पुराने मीडिया और 10 एमएल में नए सिरे से निलंबित मीडिया के केंद्रापसारक ट्यूब में । जब तक कोशिकाओं मीडिया में समान रूप से वितरित कर रहे है धीरे मिश्रण । trypan नीले दाग और एक hemocytometer का उपयोग कर कोशिकाओं की गणना ।
    4. कोशिकाओं को पतला इस तरह है कि वहां प्रति ९० µ मीडिया के प्रति अच्छी तरह से ४,००० monocytes हैं । एक ९६-खैर प्लेट के कुओं में कोशिकाओं के ९० µ एल जोड़ें । गर्मी के लिए 24 एच ।
      नोट: प्लेट में वाष्पीकरण और थर्मल परिवर्तन में अंतर से बचने के लिए प्लेट के बाहरी किनारे पर कुओं का उपयोग करने से बचें । १०० µ एल पंजाबियों के साथ बाहरी कुओं भरें ।
    5. भंग ०.१५ एमसीपी के µmol-1 पेप्टाइड, एमसीपी-1 पाम, तले पेप्टाइड, या तले-पाम में १५० µ l पंजाब में अलग, निष्फल microcentrifuge ट्यूबों. धारावाहिक कमजोर पड़ने प्रदर्शन 1, 10, और १०० प्रत्येक नमूने के µ एम के ६५ µ एल बनाने के लिए ।
    6. WEHI युक्त कुओं में प्रत्येक एकाग्रता के 10 µ l पंजाबियों जोड़ें २७४.१ (कुल मात्रा: १०० µ एल प्रति खैर, 6 लाइनों, ९६ कुल कुओं). ७२ एच के लिए मशीन ।
    7. प्रत्येक कुआं में 10 µ l (3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) (MTS) जोड़ें । 1 एच के लिए मशीन ।
    8. ४९० एनएम में एक प्लेट रीडर का उपयोग कर अवशोषण या निर्माता के निर्देशों के आधार पर विश्लेषण ।
  2. इन विट्रो micelle बाइंडिंग
    1. बीज ५००,००० monocytes १०० µ एम Cy5-लेबल एमसीपी-1 पाम (10:90 दाढ़ के अनुपात DSPE-खूंटी (2000)-Cy5 और एमसीपी-1 PA) युक्त मीडिया के 2 मिलीलीटर में एक 6 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुआं में । 1 एच के लिए मशीन ।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ३०० x g पर केंद्रापसारक द्वारा WEHI २७४.१ इकट्ठा । मीडिया को महाप्राण ।
    3. 2 मिलीलीटर पंजाबियों में कोशिकाओं को फिर से सस्पेंड और धो लें । 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ३०० x g पर केंद्रापसारक । पंजाबियों को महाप्राण । 2 मिलीलीटर पंजाबियों के साथ वाशिंग प्रक्रिया दोहराएं । पंजाबियों को महाप्राण ।
    4. कोशिकाओं को ठीक करने के लिए ठंड 4% paraformaldehyde के 2 मिलीलीटर जोड़ें । 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन ।
    5. एक 6-अच्छी तरह से थाली के कुओं के भीतर एक बाँझ कांच coverslip पर तय कोशिकाओं प्लास्टिक । 5 मिनट के लिए ४०० x g पर केंद्रापसारक ।
    6. paraformaldehyde निकालें । 2 मिलीलीटर पंजाबियों के साथ एक बार धो और कुल्ला । 1 एमएल पीबी के साथ रिसस्पेंड
      नोट: जब कुल्ला, coverslip पर कोशिकाओं को बाधित करने से बचें ।
    7. एक स्लाइड पर पंजाब में ९०% ग्लिसरॉल के 10 µ एल रखो । coverslip लेने के लिए एक सुई और नोचना का प्रयोग करें । coverslip के किनारे सुखाएं । धीरे से एक स्लाइड facedown पर coverslip जगह है ।
    8. धीरे स्पष्ट नेल पॉलिश के साथ coverslip के किनारे सील । फ्रिज में रखें जब तक इमेजिंग के लिए तैयार है ।
    9. λउत्तेजना = ६५० एनएम पर Cy5 के लिए पराबैंगनीकिरण के साथ स्थापित एक फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप (CLSM) का प्रयोग करें ।

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Representative Results

एमसीपी-1 पाम की तैयारी
एमसीपी-1 प्रोटीन [YNFTNRKISVQRLASYRRITSSK] या तले पेप्टाइड [YNSLVFRIRNSTQRKYRASIST] के CCR2-बाइंडिंग आकृति (अवशेषों 13-35) N-टर्मिनस पर एक cysteine अवशेषों को जोड़कर संशोधित किया गया था । एमसीपी-1 पेप्टाइड एक स्वचालित पेप्टाइड सिंथेसाइज़र का उपयोग कर एक Fmoc-मध्यस्थता ठोस चरण विधि द्वारा संश्लेषित किया गया था । कच्चे पेप्टाइड रिवर्स चरण HPLC द्वारा शुद्ध किया गया था एक C8 कॉलम पर ५० ° c में ०.१% TFA का उपयोग कर acetonitrile/पानी के मिश्रण और मालदी मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा विशेषता (चित्रा 1) । cysteine-युक्त पेप्टाइड पर संयुग्मित था DSPE-PEG2000-maleimide उपज DSPE-खूंटी (2000)-पेप्टाइड conjugates के माध्यम से एक thioether लिंकेज । कमरे के तापमान पर 24 घंटे के बाद, कच्चे उत्पाद HPLC (चित्रा 2) द्वारा शुद्ध किया गया । DSPE-खूंटी (2000)-Cy5 एक एन एच एस एस्टर प्रतिक्रिया का उपयोग कर संश्लेषित किया गया था । Monocyte-लक्ष्यीकरण पम्म सह-DSPE के साथ इकट्ठे-खूंटी (2000)-एमसीपी-1 और DSPE-खूंटी (2000)-Cy5 में भंग द्वारा गढ़े थे मेथनॉल कि तब N2द्वारा काफूर हो गया था, और परिणामस्वरूप फिल्म वैक्यूम रातोंरात और स्वयं पानी में इकट्ठे के तहत सूख गया था या "पूंछ समूहों" के hydrophobic बातचीत के माध्यम से पंजाबियों एमसीपी-1 पम्म फार्म के लिए ।

एमसीपी-1 पाम के लक्षण वर्णन
DLS डेटा और monocyte लक्ष्यीकरण पम्म के उनि छवियों को अच्छी तरह से फैलाया दिखाया, व्यास में १५.३ ± २.० एनएम के गोलाकार nanoparticle (चित्रा 3 और तालिका 1) । दोनों एमसीपी-1 पम्म और तले पम्म १२.१ ± ३.१ एमवी और १३.७ ± १.९ एमवी, क्रमशः (तालिका 1) के एक मामूली सकारात्मक जीटा क्षमता दिखाया । सीडी से पता चला है कि एमसीपी के शामिल-1 micelle के भीतर पेप्टाइड माध्यमिक संरचना (2 टेबलबढ़ाया, एमसीपी-1 पम्म: ४६.२ ± ०.९% β-पत्रक, ५३.१ ± १.४% यादृच्छिक कुंडल, और मुक्त MCP1:३४.२ ± ३.५% β-शीट, ६५.८ ± ३.५% यादृच्छिक कुंडल) ।

इन विट्रो एमसीपी-1 पाम के विश्लेषण
इन विट्रो में एमसीपी-1 पम्म के monocyte बाइंडिंग और फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा मनाया गया । माउस monocytes एमसीपी की बढ़ती सांद्रता-1, एमसीपी-1 पाम के साथ मशीन थे, पेप्टाइड तले, और ७२ ज के लिए पाम तले, और कोशिकाओं को व्यवहार्य और १०० µ एम (चित्रा 4) को संगत हो पाया गया । इसके अलावा, फोकल माइक्रोस्कोपी एमसीपी-1 पम्म के लिए monocytes के विशिष्ट बंधन दिखाया जब तले पम्म (चित्रा 5) की तुलना में ।

Figure 1
चित्र 1 : २२० एनएम पर HPLC वर्णलेख (पेप्टाइड बांड की तरंग दैर्ध्य) और २५४ एनएम (एमसीपी की tyrosine तरंग दैर्ध्य)-1 पेप्टाइड (एक) और तले हुए पेप्टाइड (बी) (७.४ मिनट पर बॉक्सिंग चोटी). मालदी-तोफ मास स्पेक्ट्रम की एमसीपी-1 पेप्टाइड (सी) और तले पेप्टाइड (डी) की श्रेणी में 500-5000 डीए के लिए चोटी दिखा [m + H]+ पर m/z २,८८८ (अपेक्षित २,८९०) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: HPLC वर्णलेख पर २२० एनएम (पेप्टाइड बांड की तरंग दैर्ध्य) और २५४ एनएम (tyrosine तरंग दैर्ध्य) के DSPE-खूंटी (2000)-एमसीपी-1 (A) और DSPE-खूंटी (2000)-तले (B) । (१६.९ मिनट में बॉक्सिंग चोटी) । (ग) मालदी-तोफ जन स्पेक्ट्रम DSPE-खूंटी (2000)-एमसीपी-1 की श्रेणी में 1000-10000 डीए के लिए चोटियों दिखा [M + H]+ m/z २,८८८ (२,८९०) के लिए एमसीपी-1 और m/z ५,७५८ (उंमीद ५,७६०) DSPE-खूंटी (2000)-एमसीपी-1 के लिए । (घ) मालदी-तोफ जन स्पेक्ट्रम DSPE-खूंटी (2000)-1000 की सीमा पर तले-10000 डीए के लिए चोटियों दिखा [M + H]+ पर m/z २,८८७ (उंमीद २,८९०) के लिए तले हुए पेप्टाइड और m/z ५,७६१ (उंमीद ५,७६०) DSPE-खूंटी के लिए हाथापाई की । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 : एमसीपी के उनि छवियां-1 पाम (एक) और पाम तले (बी) । स्केल बार = १०० एनएम । संख्या-एमसीपी-1 पाम के औसत आकार वितरण (सी) और DLS के माध्यम से पाम तले (डी) । डेटा का अर्थ है ± S.D. (n = 3) । (E) एमसीपी-1 और तले हुए पेप्टाइड्स और पम्म (n = 3) की सीडी विश्लेषण । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : इन विट्रो व्यवहार्यता WEHI २७४.१ murine monocytes के बाद ७२ एच एमसीपी के लिए प्रदर्शन-1 पेप्टाइड, एमसीपी-1 पाम, पेप्टाइड तले, और पाम तले । डेटा का अर्थ है ± S.D. (n = 6) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5: CLSM एमसीपी की छवियां-1 पाम (एक) और पाम तले (ख) 10 के साथ शामिल किया गया% Cy5 फिलीस्तीनी अथॉरिटी (लाल) 1 ज. स्केल बार = 20 µm के लिए WEHI २७४.१ के साथ मशीन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

पम्म संख्या-Ave व्यास (एनएम) pdi जीटा संभावित (एमवी)
एमसीपी-1 १५.३ ± २.० ०.११९ ± ०.००६ १२.१ ± ३.१
तले १६.९ ± १.४ ०.२३२ ± ०.०१९ १३.७ ± १.९
पंजाब में मापा बफर । डेटा अर्थ ± एसडी के रूप में व्यक्त कर रहे हैं ।

तालिका 1: आकार, polydispersity, और पम्म के जीटा क्षमता ।

a-कुण्डल (%) बी-शीट (%) यादृच्छिक कुंडल (%)
एमसीपी-1 पेप्टाइड ०.० ± ०.० ३६.२ ± २.२ ६३.८ ± १.८
एमसीपी-1 पाम ०.७ ± ०.६ ४६.२ ± ०.९ ५३.१ ± १.४
तले पेप्टाइड ०.० ± ०.० ४३.७ ± २.१ ५६.३ ± ३.५
तले पाम ०.० ± ०.० ६०.७ ± ०.२ ३९.३ ± ०.२

तालिका 2: माध्यमिक संरचना पेप्टाइड्स और पम्म की रचना ।

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Discussion

एमसीपी-1 पम्म एक होनहार आणविक इमेजिंग मंच है, जिसमें एक हाइड्रोफिलिक लक्ष्यीकरण पेप्टाइड और hydrophobic पूंछ है कि nanoparticle के आत्म इकट्ठे प्रकृति ड्राइव । इस monocyte-लक्ष्यीकरण micelle को एमसीपी-1 पेप्टाइड और DSPE-खूंटी (2000)-एमसीपी-1 के सरल संश्लेषण और शुद्धि चरणों द्वारा तैयार किया जा सकता है । पम्म ऐसे अपने स्वयं के रूप में vivo में आणविक इमेजिंग के लिए कई लाभकारी विशेषताओं है हल्के शर्तों के तहत विधानसभा, आंतरिक biodegradability, और संरचनात्मक और रासायनिक अंय इमेजिंग moieties के शामिल करने के लिए अनुमति विविधता या रुचि के किसी विशिष्ट साइट को चुन कर डिलीवर करने के लिए पेप्टाइड्स लक्ष्यीकरण. उनके कण आकार, आकार, और संरचना पेप्टाइड, hydrophobic पूंछ, या micelle एकाग्रता बदलने के द्वारा, आवेदन की एक किस्म के लिए इष्टतम रासायनिक और भौतिक गुणों की अनुमति दे सकता है22,३३।

इस प्रोटोकॉल की कुछ सीमाओं का उल्लेख किया जाना चाहिए । सबसे पहले, के बाद से पम्म hydrophobic बातचीत द्वारा संचालित कर रहे हैं, यह लक्ष्यीकरण पेप्टाइड्स कि हाइड्रोफिलिक है निर्माण करने के लिए आवश्यक है, जिससे लक्ष्यीकरण moiety micelle की सतह पर प्रस्तुत किया जा करने की अनुमति । यदि पेप्टाइड अनुक्रम hydrophobic है, एक या दो हाइड्रोफिलिक अमीनो एसिड की सी टर्मिनस पर एक अतिरिक्त समायोजित किया जा सकता है, लेकिन एमिनो एसिड के अलावा micelle के भीतर पेप्टाइड माध्यमिक संरचना को प्रभावित कर सकता है, जिससे के गुणों को बदलने अपने देशी राज्य में प्रोटीन के भीतर पेप्टाइड४४,४५. दूसरा, कम सांद्रता पर, पम्म जलीय वातावरण में गरीब स्थिरता के रूप में वे सीएमसी पर अत्यधिक निर्भर हैं, एक micellar संरचना बनाने के लिए क़दम के लिए ंयूनतम एकाग्रता की जरूरत है४६। सीएमसी के नीचे, micelle व्यक्तिगत पीए मोनोमर को जुदा करता है, और micelle एक वाहक के रूप में कार्य करने के लिए और एक विशिष्ट साइट४७पर एक दवा अनलोड करने के लिए सीमा । इस खामी को दूर करने के लिए, सीएमसी hydrophobic टेल४८,४९की श्रृंखला लंबाई बढ़ाने के द्वारा कम किया जा सकता है । अंत में, पम्म के दीर्घकालिक भंडारण के रूप में फिलीस्तीनी अथॉरिटी माध्यमिक संरचना समय के साथ बदल सकते हैं, जिससे micellar संरचना और स्थिरता, साथ ही ligand बंधन में दक्षता को प्रभावित करने के रूप में अनुशंसित नहीं है26।

संक्षेप में, इस प्रोटोकॉल इमेजिंग atherosclerosis के लिए एक मजबूत, स्व-इकट्ठे पेप्टाइड micelle-आधारित nanomedicine रणनीति प्रदर्शित करता है । एमसीपी-1 पम्म, biodegradable, और micelle के घटकों के रूप में गैर विषैले तत्व शरीर के लिए अंतर्जात तत्वों से प्रेरित हैं । इससे भी महत्वपूर्ण बात, एमसीपी-1 पम्म monocytes के लिए बाध्यकारी है, जो आनुपातिक पट्टिका प्रगति करने के लिए वृद्धि, atherosclerotic सजीले टुकड़े के चरणों में अंतर करने के लिए एक गैर इनवेसिव दृष्टिकोण की सुविधा । इस मंच की मॉड्यूलरता के कारण, पम्म चिकित्सकीय, अतिरिक्त लक्ष्यीकरण पेप्टाइड्स, इमेजिंग moieties, और न्यूक्लिक एसिड शामिल कर सकते हैं । इसलिए, इन बहुआयामी micelles के इस तरह के गतिशील क्षमताओं को देखते हुए, हम मानते है कि इन कणों atherosclerosis और अंय रोगों में नैदानिक अनुवाद के लिए महान वादा पकड़ो ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक दक्षिणी कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, राष्ट्रीय हृदय, फेफड़े, और रक्त संस्थान (NHLBI), R00HL124279, एली और Edythe व्यापक नवाचार पुरस्कार, और लालकृष्ण Whittier फाउंडेशन गैर कैंसर से वित्तीय सहायता स्वीकार करना चाहते है EJC को दी गई शोधों रिसर्च अवार्ड. लेखक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और Microanalysis, NanoBiophysics में उत्कृष्टता के केंद्र, आणविक लक्षण वर्णन के लिए उत्कृष्टता के केंद्र के लिए केंद्र का धंयवाद, और अनुवाद में सहायता के लिए दक्षिणी कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय में इमेजिंग केंद्र वाद्य setups ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-ethanedithiol VWR E0032 for peptide synthesis
10 mL disposable serological pipets VWR 89130-898 for cell culture
15 mL centrifuge tubes, polypropylene VWR 89401-566 for various applications
2,5-dihydroxybenzoic acid, 99% Fisher Scientific AC165200050 for MALDI
25 mL disposable serological pipets VWR 89130-900 for cell culture
2-Mercaptoethanol, 50 mM ThermoFisher Scientific 31350010 for cell culture
5 mL disposable serological pipets VWR 89130-896 for cell culture
50 mL centrifuge tubes VWR 89039-658 for various applications
75 cm2 culture flask Fisher Scientific 13-680-65 for cell culture
75 mL reaction vessel Protein Technologies 3000005 for peptide synthesis
96-wells cell culture plate VWR 40101-346 for MTS assay
Acetonitrile, HPLC grade Fisher Scientific A998SK-4 for HPLC purification
Borosilicate glass, 1 dram VWR 66011-041 for PAM synthesis
Borosillicate glass pipet, Long tips VWR 14673-043 for various applications
Coverslip, 0.16-0.19 mm, 22 x 22 mm Fisher Scientific 12-542B for confocal microscopy
Cy5 amine Abcam ab146463 for peptide conjugation
Diethyl ether, ACS grade Fisher Scientific E138-1 for peptide precipitation
Disposable syringes, 20 mL Fisher Scientific 14-817-54 for HPLC purification
Double neubauer ruled hemocytometer VWR 63510-13 for cell counting
DSPE-PEG(2000) amine Avanti 880128P for peptide conjugation
DSPE-PEG(2000) maleimide Avanti 880126P for peptide conjugation
DSPE-PEG(2000)-NHS ester  Nanocs PG2-DSNS-10K for conjugation to Cy5
Dulbecco's modified eagle medium-high glucose Sigma Aldrich D5796-500ML for cell culture
Fetal bovine serum, qualified, heat inactivated ThermoFisher Scientific 10438026 for cell culture
Fmoc-L-Ala-OH /HBTU Protein Technologies PS3-H5-A for peptide synthesis
Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH /HBTU Protein Technologies PS3-H5-RBF for peptide synthesis
Fmoc-L-Asn(Trt)-OH /HBTU Protein Technologies PS3-H5-NT for peptide synthesis
Fmoc-L-Cys(Trt)-OH /HBTU Protein Technologies PS3-H5-CT for peptide synthesis
Fmoc-L-Gln(Trt)-OH /HBTU Protein Technologies PS3-H5-QT for peptide synthesis
Fmoc-L-Ile-OH /HBTU Protein Technologies PS3-H5-I for peptide synthesis
Fmoc-L-Leu-OH /HBTU Protein Technologies PS3-H5-L for peptide synthesis
Fmoc-L-Lys(Boc)-OH /HBTU Protein Technologies PS3-H5-KBC for peptide synthesis
Fmoc-L-Phe-OH /HBTU Protein Technologies PS3-H5-F for peptide synthesis
Fmoc-L-Ser(tBu)-OH /HBTU Protein Technologies PS3-H5-SB for peptide synthesis
Fmoc-L-Thr(tBu)-OH /HBTU Protein Technologies PS3-H5-TB for peptide synthesis
Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH /HBTU Protein Technologies PS3-H5-YB for peptide synthesis
Fmoc-L-Val-OH /HBTU Protein Technologies PS3-H5-V for peptide synthesis
Fmoc-Lys(Boc)-wang resin, 100-200 mesh Novabiochem 856013 for peptide synthesis
Formic acid, optima LC/MS grade Fisher Scientific A117-50 for HPLC purification
Glycerol VWR M152-1L for confocal microscopy
Hand tally counter Fisher Scientific S90189 for cell counting
Magnetic stir bars, egg-shaped VWR 58949-006 for peptide conjugation
Methanol, ACS certified Fisher Scientific A412-4 for PAM synthesis
MTS cell proliferation colorimetric assay kit VWR 10191-104 for MTS assay
N,N-Dimethylformamide, sequencing grade Fisher Scientific BP1160-4 for peptide synthesis
N-Methylmorpholine Protein Technologies S-1L-NMM for peptide synthesis
Paraformaldehyde Fisher Scientific AC416780250 for fixing cells
PBS, pH 7.4 ThermoFisher Scientific 10010049 for various applications
Penicillin/streptomycin, 10,000 U/mL ThermoFisher Scientific 15140122 for cell culture
Peptide synthesis vessel, 25 mL  Fisher Scientific CG186011 for peptide synthesis
Phosphotungstic acid  Fisher Scientific A248-25 for TEM
Piperidine Spectrum P1146-2.5LTGL for peptide synthesis
Plain glass microscope slide 75 x 25 mm Fisher Scientific 12-550-A3 for confocal microscopy
Reagent reservoirs, sterile  VWR 95128093 for cell culture
Self-closing tweezer TedPella 515 for TEM
TEM support film TedPella 01814F for TEM
Trifluoroacetic acid  Fisher Scientific BP618-500 for peptide cleavage and HPLC purification
Triisopropylsilane VWR TCT1533-5ml for peptide cleavage
Trypan blue solution, 0.4% ThermoFisher Scientific 15250061 for cell counting
Tweezer, general purpose-serrated VWR 231-SA-SE for confocal microscopy
WEHI-274.1 ATCC ATCC CRL-1679 murine monocyte
automated benchtop peptide synthesizer Protein Technologies PS3 Benchtop Peptide Synthesizer
α- cyano- 4- hydroxycinnamic acid, 99% Sigma Aldrich 476870-2G for MALDI

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इंजीनियरिंग अंक १२९ Monocyte पेप्टाइड micelles atherosclerosis nanoparticle इमेजिंग स्व-विधानसभा नैदानिक
Atherosclerosis के इमेजिंग के लिए Monocyte-लक्ष्यीकरण पेप्टाइड Amphiphile Micelles का संश्लेषण
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Poon, C., Sarkar, M., Chung, E. J.… More

Poon, C., Sarkar, M., Chung, E. J. Synthesis of Monocyte-targeting Peptide Amphiphile Micelles for Imaging of Atherosclerosis. J. Vis. Exp. (129), e56625, doi:10.3791/56625 (2017).

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