Summary
Este trabalho apresenta um método que envolve a síntese e caracterização de micelas de amphiphile peptídeo monócito-direcionamento e o correspondente ensaios para testar a capacidade do micelle para vincular a monócitos e biocompatibilidade.
Abstract
A aterosclerose é dos principais contribuintes para doenças cardiovasculares, a principal causa de morte no mundo, que reivindica a 17,3 milhões de vidas anualmente. A aterosclerose é também a principal causa de morte súbita e infarto do miocárdio, instigada por placas instáveis que se romper e obstruir o vaso sanguíneo sem aviso. Corrente de imagens modalidades não pode diferenciar entre placas estáveis e instáveis que se romper. Micelas de amphiphiles peptídeo (PAMs) podem superar esta desvantagem, como eles podem ser modificados com uma variedade de direcionamento metades que ligam especificamente ao tecido doente. Os monócitos foram mostrados para ser marcadores início da aterosclerose, enquanto grande acúmulo de monócitos é associado com placas propensas a ruptura. Daí, nanopartículas que podem direcionar os monócitos podem ser usadas para discriminar os diferentes estágios da aterosclerose. Para esse fim, descrevemos aqui, um protocolo para a preparação de monócitos-direcionamento PAMs (monócitos quimiotático proteína-1 (MCP-1) PAMs). MCP-1 PAMs self são montadas através de síntese em condições suaves a forma nanopartículas de 15 nm de diâmetro, com perto de carga de superfície neutra. In vitro, PAMs foram encontradas para ser biocompatível e tinha uma afinidade de ligação de alta para os monócitos. Os métodos descritos neste documento são promissores para uma ampla gama de aplicações em aterosclerose, bem como outras doenças inflamatórias.
Introduction
As doenças cardiovasculares continuam a ser as principais causas de morte globalmente com aproximadamente 17,3 milhões de mortes em todo o mundo1. Doenças cardiovasculares são contribuídas por aterosclerose, uma condição em que acumulam placas nas artérias, inibindo assim, sangue e fluxo de oxigênio para as células do corpo2,3. A progressão da aterosclerose envolve o espessamento e endurecimento das artérias por uma resposta inflamatória, metabolismo lipídico irregular e acúmulo de placa bacteriana, levando a placa ruptura e infarto do miocárdio,4,5. Células endoteliais expressam moléculas de aderência e citocinas, que incluem MCP-1 que se liga ao receptor chemokine CC (CCR2) encontrado na superfície de monócitos6,7,8. Colesterol oxidado converte os monócitos em macrófagos durante a fase inicial da formação de placa bacteriana, que amplifica a resposta inflamatória na região e leva à lesão tecidual e a formação de placas instáveis ou vulneráveis9, 10.
Tradicionalmente, a aterosclerose é avaliada através da avaliação de estenose luminal por imagens anatômicas usando ultra-som ou angiografia11,12. No entanto, esses métodos somente podem determinar estreitamento grave da parede arterial e não na fase inicial da aterosclerose, como crescimento de placa inicial provoca remodelamento arterial manter o tamanho da artéria e sangue fluxo taxa12,13, 14. Portanto, angiografia sub-representar prevalência de aterosclerose. Além disso, técnicas de imagem não-invasivas, tais como emissão de fóton único computadorizada tomografia computadorizada, ressonância magnética e tomografia por emissão de pósitrons recentemente tem sido usados para caracterizar a morfologia da placa, como eles podem fornecer detalhes iniciais e caracterização de placas. No entanto, estas modalidades são muitas vezes limitadas pela falta de sensibilidade, resolução espacial, ou exigem o uso de radiação ionizante, fazendo a progressão de placa de imagem em diferentes fases muito mais desafiador15,16, 17. Um sistema de entrega de imagens que iria identificar especificamente placas em diferentes estágios da aterosclerose permanece para ser desenvolvido.
As nanopartículas têm demonstrado ser uma plataforma emergente para na vivo placa diagnóstico e direcionamento18,19,20,21. Em particular, PAMs são vantajosas devido a sua diversidade química e capacidade para acomodar uma variedade de partes, composições, tamanhos, formas e superfície functionalization22. Amphiphiles peptídeo (PAs) consistem de um peptídeo hidrofílico, "headgroup" anexado a uma cauda hidrofóbica, que normalmente são lípidos; Essa estrutura anfifílica confere capacidades auto-montagem e permite uma visualização multivalentes dos peptídeos na superfície da partícula22,23,24. O headgroups de peptídeo pode afetar a forma das partículas através de dobramento e hidrogénio entre peptídeos25. Peptídeos que dobra através da interação de β-folha têm sido mostrados para formar micelas alongadas, enquanto confirmação α-hélice pode formar ambos micelas esféricas e alongadas22,23,24, 2526,de,27. Polietileno glicol (PEG) linkers que protegem a carga superficial do peptide podem ser colocados entre o peptídeo hidrofílico e cauda hidrofóbica do PAMs, aumentando a disponibilidade da nanopartículas na circulação sistêmica28, 29 , 30 , 31. PAMs também são vantajosas porque são biocompatíveis e tem sido demonstrados que têm uma ampla gama de aplicações de32,33. A solubilidade em água de micelas oferece uma vantagem sobre outros sistemas baseados em nanopartículas como certas nanopartículas poliméricas que não são solúveis em água e tem que ser suspenso em solubilizers para injeções34. Além disso, a capacidade de criar PAMs que desmontagem em resposta a um estímulo específico torna PAMs um candidato atraente para drogas intracelular controlada entrega35.
Vinculando-se ao receptor CCR2 e acumular-se no arco aórtico, PAMs anteriormente foram desenvolvidas para monócitos direcionamento para monitorar diferentes fases de lesões ateroscleróticas na aorta9. Em ApoE- / - ratos, acúmulo de monócitos aumenta proporcionalmente a placa progressão36. Além disso, verificou-se que pacientes com estágio final, sujeitos a ruptura de placas contêm quantidades mais elevadas de monócitos37. Portanto, a modificação do PAMs incorporar MCP-1 é útil porque permite maior especificidade de segmentação e diferenciação entre lesões ateroscleróticas e tarde-estágio inicial. Estes estudos de prova de conceito também verificado que PAMs são seguras o suficiente ser usado em pré-clinicamente e são limpas em38. Desde que os monócitos e inflamação são característicos de outras doenças, MCP-1 PAMs têm o potencial para ser usado para aplicações de diagnósticos e terapêuticas em outras doenças além da aterosclerose8,39,40 , 41.
Neste documento, nós relatamos a fabricação de altamente escalável e self montado MCP-1 PAMs que demonstrou o tamanho ideal da partícula, carga de superfície e seleção de alvos para monócitos para aplicativos de imagem aprimorados em aterosclerose.
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Protocol
Nota: Leia o MSDS para reagentes e siga todas as medidas de segurança química, conforme exigido pela instituição local.
1. preparação de MCP-1 PAMs
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Preparação de peptídeo de MCP-1
- Pesar 0,25 mmol de Fmoc-L-Lys (Boc)-Wang em uma embarcação da reação (RV). Enxágue o lado do VD com 5 mL dimethylforamide (DMF) em uma coifa de química.
- Carrega o RV em um sintetizador de peptídeo de bancada automatizada. Frascos de aminoácido de carga pré-embalados, N '- CYNFTINRKISVQRLASYRRITSS - C', do C a N-terminal. Incluem um frasco vazio no final para a etapa final de desproteção.
Nota: Um peptide mexido com sequência, N '- CNNSIIRSKQVLRSTRYFRSATYK - C', pode também ser sintetizada utilizando o mesmo protocolo. - Finalizada a síntese, transferi os peptídeos na resina do RV para o frasco de cintilação com 2-3 mL de metanol até todas as resinas são transferidas. Depois que a resina afundou-se no fundo, remover o sobrenadante de metanol e evaporar o restante até secar. Vácuo seco para um adicional 2 h ou durante a noite em temperatura ambiente.
- Fazer 12 mL de solução de clivagem contendo trifluoracetic ácido (TFA):ethanedithiol:water:triisopropylsilane 94:2.5:2.5:1 vol % em uma coifa de química. Agite a solução de clivagem para certificar-se que uniformemente misturado.
Cuidado: Porque triisopropylsilane e Etanoditiol são sensíveis ao ar, argônio limpar estoque frascos de triisopropylsilane e Etanoditiol por 1 min antes de colocá-los de volta. - Coloque o recipiente de síntese (SV) em um agitador de braço pela metade do SV de aperto na parte inferior. Transferência do peptide-resina para o SV com 2 mL de solução de clivagem até que todos os peptídeo-resinas são transferidos.
- Lave os lados do SV com 3 mL de solução de clivagem. Feche a tampa do SV e agitar em 300 oscilações/min durante 4 h.
- Pese um tubo de centrifugação de 50 mL vazio. Recorde a massa.
- Após 4 h, drene a solução de peptídeo clivada de SV no tubo de centrífuga de 50 mL. Enxágue o SV várias vezes com o restante da solução clivagem.
- Evapore a solução de peptídeo clivados com nitrogênio até há menos de 4 mL restantes no tubo de centrífuga.
- Adicione 36 mL de éter gelada para a solução de peptídeo-fendida.
- Vórtice a solução até que ele é completamente branca ou amarela. Centrifugar a 3.000 x g por 5 min a 4 ° C e decante o sobrenadante.
- Adicione éter gelada de 40 mL para o tubo. Vórtice e proceda à sonicação novamente. Repita o processo de centrifugação. Decante o sobrenadante.
- Seca o sedimento de PA bruto com purgação com gás nitrogênio até o éter é evaporado visivelmente.
- Adicionar 20 mL bidestilada água, vórtice e proceda à sonicação até o peptídeo é completamente dissolvido em solução.
- Congelar a solução e lyophilize até secar.
- Uma vez seco o peptídeo, pese a massa do tubo de centrífuga contendo o peptídeo bruto. Dissolva o peptídeo bruto em 5 mg/mL de água.
- Dissolva 25 mg de bruto do peptide de MCP-1 em 5 mL de água bidestilada para fazer uma concentração total de 5 mg/mL. Purificar o peptídeo de MCP-1 bruto por cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) utilizando 0,1% TFA em água (solvente A) e 0,1% TFA em acetonitrila (solvente B) como fases móveis em uma coluna de fase reversa C8. Os 5 mL do peptide injete a HPLC.
Nota: A fase móvel inicial consistia em 100% solvente A um débito de 9,0 mL/min. diminuir solvente A lentamente para 30% em 27 min e manter esta composição de 3 min. o gradiente de solvente 100% de retorno um 3 min e espera para esta composição para 1 min dar um tempo de execução total de 34 min. manter a temperatura da coluna a 55 ° C. Use o modo de fonte de íon positivo para a análise. Ácido fórmico pode ser usado no lugar do TFA, se TFA é muito ácido para a coluna HPLC. Recomenda-se que a velocidade de subida de composição solvente orgânico não deve exceder 2%/min para melhor separação. - Analise cada fração usando espectrometria de massa do laser assistida por matriz (MALDI) de dessorção/ionização o produto esperado m/z no 2.890.
Nota: Dissolver ácido α-cyano-4-hidroxicinâmicos a 1 mg/mL em acetonitrila/água (50: 50% de vol) como a solução de matriz. Aviste 0,75 µ l da solução de matriz na chapa de MALDI, seguida de 0,75 µ l de cada fração. Realizar a análise utilizando um modo reflexivo de íon positivo em uma faixa de massa de 500-5.000 Da. - Combine fracções de produto, explodir acetonitrilo, congelar e lyophilize peptídeos purificados até secar.
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Preparação de MCP-1 PA
- Prepare um excesso molar 1.1 de 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- amino(polyethylene glycol)-2000] DSPE-PEG (2000)-maleimide de peptídeo em frascos separados de cintilação. Dissolver os dois compostos em água bidestilada tornar ~ 15 mg/mL. Proceda à sonicação por 15 min ou até que ambas as soluções são completamente claras.
Nota: DSPE-PEG (2000)-Cy5 é sintetizado usando o mesmo protocolo com DSPE-PEG-amina (2000) e N-Hidroxisuccinimida (NHS) acrescida de éster Cy5, exceto passo 1.2.3, onde o pH da solução é ajustado para 8,5. - Adicione DSPE-PEG (2000)-maleimide solução para a solução de peptídeo. Vórtice e proceda à sonicação.
- Adicionar 1 M NaOH gota a gota (1 µ l) de cada vez até que o pH da solução é 7.
- Solução de expurgo de nitrogênio por 5 min. agitar a solução durante a noite.
- Congelar a solução e lyophilize até secar.
- Uma vez seco o produto bruto, dissolva o sólido em 5 mg/mL de água.
- Purifica com HPLC como descrito acima.
Nota: Na Unconjugated peptídeo e DSPE-PEG(2000) eluir entre 15-30% de concentração orgânica (% vol), enquanto DSPE-PEG (2000)-MCP-1 conjugado deve eluir entre 40-50% de concentração de orgânicos. - Analise cada fração usando espectrometria de massa MALDI para o correspondente m/z DSPE-PEG (2000)-MCP-1 deve ter um pico m/z amplo no 5.760.
Nota: o ácido benzoico-2,5 é melhor usado como matriz para DSPE-PEG (2000)-MCP-1 com MALDI.
- Prepare um excesso molar 1.1 de 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- amino(polyethylene glycol)-2000] DSPE-PEG (2000)-maleimide de peptídeo em frascos separados de cintilação. Dissolver os dois compostos em água bidestilada tornar ~ 15 mg/mL. Proceda à sonicação por 15 min ou até que ambas as soluções são completamente claras.
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Montagem de MCP-1 PAMs
- Dissolver 1,75 mg PAs de MCP-1, com 3 mL de metanol em um frasco de dram com 1. Proceda à sonicação até o MCP-1 PA é completamente dissolvido.
Nota: Amphiphiles Cy5 podem ser incorporados em uma relação molar de 10:90 MCP-1 PA para aplicativos de imagem. - Evapore o metanol sob nitrogênio em movimentos circulares enquanto enxaguar o restante metanol fora do frasco até um filme uniforme é formado na parte inferior do frasco. Vácuo-seco o filme durante a noite.
- Hidrate o filme com 3 mL de tampão de água ou fosfato salino (PBS) para fazer uma solução de 100 µM de MCP-1 PAMs. Suavemente o vórtice e proceda à sonicação a solução até que desobstruído. Incube a 80 ° C por 30 min.
Nota: A temperatura elevada tem sido mostrada para acelerar o processo auto-montagem e permite que o componente de peptídeo formar a estrutura secundária mais estável, reduzindo a concentração (CMC) de crítica micelle42,43. - Legal a dispersão resultante a temperatura ambiente.
- Dissolver 1,75 mg PAs de MCP-1, com 3 mL de metanol em um frasco de dram com 1. Proceda à sonicação até o MCP-1 PA é completamente dissolvido.
2. caracterização de MCP-1 PAMs
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Difusão dinâmica da luz (DLS) e potencial zeta
- Lugar de 100 µM de MCP-1 PAM ou mexida PAM em uma cubeta de acordo com as instruções do instrumento potencial DLS ou zeta.
Nota: DLS e zeta potenciais cubetas podem ser diferentes com base nas instruções do instrumento. - Equilibrar o instrumento à temperatura ambiente. Medir o tamanho e carga superficial do PAM.
- Lugar de 100 µM de MCP-1 PAM ou mexida PAM em uma cubeta de acordo com as instruções do instrumento potencial DLS ou zeta.
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Microscopia eletrônica de transmissão (TEM)
- Adicionar 7 µ l de 50 µM MCP-1 PAM ou mexida PAM para um grid TEM suspensos dentro de uma pinça de auto-fechamento 5 min. pavio fora a gota com uma limpeza delicada tarefa.
- Adicione 7 µ l de água para lavar a grade. Pavio-embora o droplet.
- Adicione 7 µ l de ácido fosfotúngstico 1 wt % por 2 min. pavio fora da gota. Repita a etapa 2.2.2.
- Seque a grade TEM antes da análise de temperatura.
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Espectroscopia de Dicroísmo circular (CD)
- Ligue o nitrogênio por 5-10 min antes da utilização do instrumento.
- Coloque 300 µ l de espaço em branco (água ou PBS) na cubeta.
- Medir espectros no 190-265 nm, 0.2 mm-comprimento do percurso com um tempo de integração s 1 e uma largura de 1, banda nm na temperatura ambiente. Colete 3 repetições.
- Peptídeo de MCP-1 medida de 100 µM, MCP-1 PAM, mexidos do peptide e mexidos PAM sob a mesma condição descrita na etapa 2.3.3. Subtrai o espaço em branco.
- Ajuste os dados usando uma interpolação linear dos espectros de base polylysine.
- Desligue o instrumento. Espere 10 min antes de desligar o nitrogênio.
3. análise in Vitro de MCP-1 PAMs
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Biocompatibilidade in vitro
- Cultura e expandir WEHI 274.1 murino monócitos em modificado Eagle suplementado de Dulbecco com 10% de soro fetal bovino (FBS), 1% penicilina-estreptomicina e 0,05 mM 2-Mercaptoetanol em 37 ° C abaixo de 5% de CO2 para passagem 5.
Nota: WEHI 274.1 são células de suspensão. Quando o cultivo, a mídia deve ser alimentada a cada 2-3 dias. - Monócitos de pipeta nos meios de comunicação em um tubo de centrífuga de 50ml estéril. Centrifugação a 300 x g por 5 min a 4 ° C.
- Aspirar a velha mídia e ressuspender em mídia fresco 10 mL no tubo de centrífuga. Misture lentamente até que as células são distribuídas uniformemente na mídia. Conte as células com coloração azul trypan e um hemocytometer.
- Dilua as células que existem 4.000 monócitos por 90 µ l de mídia por bem. Adicione 90 µ l de células em poços de uma placa de 96 poços. Incube durante 24 h.
Nota: Evite usar os poços na borda exterior da placa para evitar diferenças de evaporação e mudanças térmicas na placa. Encha os poços exteriores com 100 µ l PBS. - Dissolva 0,15 µmol de peptídeo MCP-1, PAM de MCP-1, peptídeo mexido ou ovos mexidos-PAM em 150 µ l PBS, em separado, esterilizado microcentrifuga tubos. Realize uma diluição serial para fazer 65 µ l de 1, 10 e 100 µ m de cada amostra.
- Adicionar 10 µ l PBS de cada concentração em poços contendo WEHI 274.1 (total volume: 100 µ l por bem, 6 linhas, 96 poços totais). Incube durante 72 h.
- Adicionar 10 µ l (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) (MTS) em cada poço. Incube durante 1 h.
- Analisar a absorvância usando um leitor de placas em 490 nm ou com base nas instruções do fabricante.
- Cultura e expandir WEHI 274.1 murino monócitos em modificado Eagle suplementado de Dulbecco com 10% de soro fetal bovino (FBS), 1% penicilina-estreptomicina e 0,05 mM 2-Mercaptoetanol em 37 ° C abaixo de 5% de CO2 para passagem 5.
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Vinculação de micela em vitro
- Monócitos de semente 500.000 em cada poço de uma placa de 6 em 2 mL de mídia contendo 100 µM Cy5-rotulado PAM de MCP-1 (10:90 razão molar de DSPE-PEG (2000)-Cy5 e MCP-1 PA). Incube durante 1 h.
- Coletar WEHI 274.1 por centrifugação a 300 x g por 5 min a 4 ° C. Aspire os meios de comunicação.
- Resuspenda e lavar as células em 2 mL de PBS. Centrifugação a 300 x g por 5 min a 4 ° C. Aspire a PBS. Repita o processo de lavagem com 2 mL de PBS. Aspire a PBS.
- Adicione 2 mL de frio paraformaldeído 4% para consertar as células. Incube a temperatura ambiente por 10 min.
- Pipetar as células fixas sobre uma lamela de vidro estéril dentro poços de uma placa de 6. Centrifugar a 400 x g durante 5 min.
- Remova o paraformaldeído. Lave e enxágue com 2 mL de PBS uma vez. Resuspenda com 1 mL de PB
Nota: Quando enxaguar, evite perturbar as células no sentido da lamela. - Colocar 10 µ l de 90% de glicerol em PBS para um slide. Use uma agulha e uma pinça para pegar a lamela. Seque a extremidade da lamela. Coloque delicadamente a lamela numa lâmina voltada para baixo.
- Selo gentilmente a extremidade da lamela com esmaltes claros. Coloque na geladeira até que esteja pronto para a imagem latente.
- Usar um laser confocal microscópio (CLSM) instalado com lasers para Cy5 em λexcitação = 650 nm.
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Representative Results
Preparação de MCP-1 PAM
O CCR2-motivo (resíduos 13-35) da proteína de MCP-1 [YNFTNRKISVQRLASYRRITSSK] ou mexido peptídeo [YNSLVFRIRNSTQRKYRASIST] foi modificado com a adição de um resíduo de cisteína na N-terminal. O peptídeo de MCP-1 foi sintetizado por um método de fase sólida Fmoc-negociada usando um sintetizador de peptídeo automatizado. O peptídeo bruto foi purificado por HPLC de fase reversa em uma coluna de C8 a 50 ° C, utilizando 0,1% TFA em misturas acetonitrila/água e caracteriza-se por espectrometria de massa MALDI (Figura 1). O peptídeo contendo cisteína foi conjugado para DSPE-PEG2000-maleimide para produzir DSPE-PEG conjugados de peptídeo (2000)-através de uma ligação tioéter. Depois de 24 horas à temperatura ambiente, o produto bruto foi purificado por HPLC (Figura 2). DSPE-PEG (2000)-Cy5 foi sintetizado usando uma reação de éster de NHS. Monócitos-direcionamento PAMs co montado com DSPE-PEG (2000)-MCP-1 DSPE-PEG (2000)-Cy5 foram fabricados pela dissolução em metanol que então foi evaporado por N2e o filme resultante foi secado sob vácuo durante a noite e auto montado em água ou PBS através de interações hidrofóbicas dos "grupos de cauda" ao formulário MCP-1 PAMs.
Caracterização de MCP-1 PAM
Dados DLS e TEM imagens de monócitos-direcionamento PAMs mostraram bem dispersas, esférica de nanopartículas de 15,3 ± 2,0 nm de diâmetro (Figura 3 e tabela 1). Tanto MCP-1 PAMs e mexidas PAMs mostraram uma ligeira zeta positivo potencial de 12,1 ± 3,1 mV e 13,7 ± 1,9 mV, respectivamente (tabela 1). CD mostrou que a incorporação do peptide MCP-1 dentro do micelle reforçada a estrutura secundária (tabela 2, MCP-1 PAMs: 46,2 ± 0,9% β-folha, 53,1 ± 1,4% bobina aleatória e MCP1 livre: 34,2 ± 3,5% β-folha, 65.8 ± 3,5% bobina aleatória).
In Vitro Análise de MCP-1 PAM
Em vitro biocompatibilidade e monócitos vinculação de MCP-1 PAMs foram observadas por microscopia confocal. Os monócitos mouse foram incubados com concentrações crescentes de MCP-1, MCP-1 PAM, peptídeo mexido e ovos mexida PAM para 72 h, e as células foram encontradas para ser viável e biocompatível até 100 µM (Figura 4). Além disso, a microscopia confocal mostrou ligação específica de monócitos para PAMs MCP-1 quando comparado com ovos mexidas PAMs (Figura 5).
Figura 1 : Cromatograma HPLC em 220 nm (comprimento de onda de ligações peptídicas) e 254 nm (comprimento de onda de tirosina) de peptídeo de MCP-1 (A) e peptídeo mexido (B) (in a box pico de 7,4 min). Espectro de massa MALDI-TOF de peptídeo de MCP-1 (C) e peptídeo mexido (D) a uma distância de 500-5.000 Da mostrando o pico para [M + H]+ , em m/z 2.888 (2.890 esperado). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Cromatograma HPLC em 220 nm (comprimento de onda de ligações peptídicas) e 254 nm (comprimento de onda de tirosina) da DSPE-PEG (2000)-MCP-1 (A) e DSPE-PEG (2000)-mexidos (B). (In a box pico a 16,9 min). (C) MALDI-TOF massa espectro de DSPE-PEG (2000)-MCP-1 em um intervalo de 1.000-10.000 Da mostrando os picos para [M + H]+ , em m/z 2.888 (2.890 esperado) para MCP-1 e m/z 5.758 (5.760 esperado) para DSPE-PEG (2000)-MCP-1. (D) MALDI-TOF massa espectro de DSPE-PEG (2000)-mexidos em um intervalo de 1.000-10.000 Da mostrando os picos para [M + H]+ a m/z 2.887 (2.890 esperado) para ovos mexido peptide e m/z 5.761 (5.760 esperado) para DSPE-PEG-mexidos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Imagens de temperatura da PAM MCP-1 (A) e mexidos PAM (B). Barra de escala = 100 nm. Distribuição de tamanho de número médio de PAM MCP-1 (C) e mexidos PAM através de DLS (D). Dados são média ± D.P. (n = 3). (E) análise de CD de MCP-1 e peptídeos mexidos e PAMs (n = 3). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Viabilidade in vitro de WEHI 274.1 murino monócitos após 72 h de exposição de MCP-1 peptídeo, MCP-1, peptídeo embaralhado e PAM Pam mexidos Dados são média ± D.P. (n = 6). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Imagens CLSM de PAM MCP-1 (A) e PAM mexida (B) incorporada com 10 mol % Cy5 PA (vermelho) incubado com 274.1 WEHI para h. 1 barra de escala = 20 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| PAMs | Número-Ave diâmetro (nm) | PDI | Potencial Zeta (mV) |
| MCP-1 | 15,3 ± 2.0 | 0.119 ± 0,006 | 12.1 ± 3,1 |
| Ovos mexidos | 16,9 ± 1,4 | 0.232 ± 0,019 | 13,7 ± 1,9 |
| Medido em tampão PBS. Os dados são expressos como média ± SD | |||
Tabela 1: Tamanho, polidispersividade e potencial zeta de PAMs.
| a-hélice (%) | b-folha (%) | Bobina aleatória (%) | |
| Peptídeo de MCP-1 | ± 0.0 0.0 | 36,2 ± 2,2 | 63.8 ± 1,8 |
| MCP-1 PAM | 0,7 ± 0,6 | 46.2 ± 0,9 | 53,1 ± 1,4 |
| Ovos mexido peptídeo | ± 0.0 0.0 | 43.7 ± 2,1 | 56.3 ± 3.5 |
| Ovos mexida PAM | ± 0.0 0.0 | 60,7 ± 0.2 | 39.3 ± 0.2 |
Tabela 2: Composição de estrutura secundária de peptídeos e PAMs.
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Discussion
MCP-1 PAMs são uma promissora plataforma de imagem molecular, consistindo de um peptídeo alvo hidrofílico e cauda hidrofóbica que impulsiona a natureza Self montada das nanopartículas. Este micelle monócito-direcionamento pode ser preparado por síntese simples e etapas de purificação de peptídeo de MCP-1 e DSPE-PEG (2000)-MCP-1. PAMs têm muitas características benéficas na vivo imagem molecular tais como seus auto-montagem sob condições suaves, biodegradabilidade intrínseca e diversidade estrutural e química, permitindo a incorporação de outras partes da imagem latente ou direcionamento de peptídeos seletivamente entregar para um site específico de interesse. Sua composição, forma e tamanho de partícula podem ser ajustados alterando o peptídeo, cauda hidrofóbica ou concentração micelle, permitindo propriedades físicas e químicas ideais para uma variedade de aplicações de22,33.
Algumas limitações do presente protocolo devem ser mencionadas. Primeiro, desde PAMs são conduzidas por interações hidrofóbicas, é necessário construir o direcionamentos peptídeos que são hidrofílicos, permitindo assim que o moiety direcionamento a ser apresentada na superfície do micelle. Se a sequência do peptídeo é hidrofóbica, uma adição de um ou dois hidrofílicos aminoácidos no terminal C pode ser acomodada, mas a adição de aminoácidos pode afetar a estrutura secundária do peptide dentro do micelle, alterando as propriedades da peptídeo em seu estado nativo na proteína44,45. Em segundo lugar, em baixas concentrações, PAMs tem estabilidade pobre em ambientes aquosos como eles são altamente dependentes do CMC, a concentração mínima necessária para PAs formar uma estrutura micélica46. Abaixo o CMC, o micelle desmonta para monômeros individuais do PA e limita a micela para atua como um transportador e descarrega uma droga em um site específico de47. Para aliviar este inconveniente, a CMC pode ser diminuída, aumentando o comprimento de cadeia da cauda hidrofóbica48,49. Finalmente, o armazenamento a longo prazo dos PAMs em solução não é recomendado como estrutura secundária PA pode mudar com o tempo, afectando assim a estrutura micélica e estabilidade, bem como a eficiência em ligante vinculação26.
Em suma, este protocolo demonstra uma estratégia de nanomedicina micelle-baseado de peptídeo robusto, Self montado para aterosclerose de imagem. MCP-1 PAMs são biocompatível, biodegradável e não tóxico, como componentes do micelle são inspirados em elementos endógenos ao corpo. Mais importante, MCP-1 PAMs tem ligação preferencial de monócitos, que aumentam proporcionalmente à progressão da placa, facilitando uma abordagem não-invasiva para diferenciar os estágios de ateroma. Devido a modularidade desta plataforma, PAMs podem incorporar terapêutica, adicional de direcionamento de peptídeos, partes da imagem latente e ácidos nucleicos. Portanto, tendo em conta tais capacidades dinâmicas destas micelas multifuncionais, acreditamos que estas partículas realizar a grande promessa para a tradução clínica na aterosclerose e outras doenças.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Os autores gostaria de agradecer o apoio financeiro da University of Southern California, o coração nacional, pulmão e Instituto de sangue (NHLBI), R00HL124279, Eli e Edythe amplo Innovation Award e o L.K. Whittier Fundação Non-câncer Prêmio de pesquisa translacional concedida a EJC. Os autores agradecer o centro de microscopia eletrônica e microanálise, centro de excelência em NanoBiophysics, centro de excelência para a caracterização Molecular e Translational Imaging Center na Universidade de Southern California para assistência em configurações de instrumentais.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-ethanedithiol | VWR | E0032 | for peptide synthesis |
| 10 mL disposable serological pipets | VWR | 89130-898 | for cell culture |
| 15 mL centrifuge tubes, polypropylene | VWR | 89401-566 | for various applications |
| 2,5-dihydroxybenzoic acid, 99% | Fisher Scientific | AC165200050 | for MALDI |
| 25 mL disposable serological pipets | VWR | 89130-900 | for cell culture |
| 2-Mercaptoethanol, 50 mM | ThermoFisher Scientific | 31350010 | for cell culture |
| 5 mL disposable serological pipets | VWR | 89130-896 | for cell culture |
| 50 mL centrifuge tubes | VWR | 89039-658 | for various applications |
| 75 cm2 culture flask | Fisher Scientific | 13-680-65 | for cell culture |
| 75 mL reaction vessel | Protein Technologies | 3000005 | for peptide synthesis |
| 96-wells cell culture plate | VWR | 40101-346 | for MTS assay |
| Acetonitrile, HPLC grade | Fisher Scientific | A998SK-4 | for HPLC purification |
| Borosilicate glass, 1 dram | VWR | 66011-041 | for PAM synthesis |
| Borosillicate glass pipet, Long tips | VWR | 14673-043 | for various applications |
| Coverslip, 0.16-0.19 mm, 22 x 22 mm | Fisher Scientific | 12-542B | for confocal microscopy |
| Cy5 amine | Abcam | ab146463 | for peptide conjugation |
| Diethyl ether, ACS grade | Fisher Scientific | E138-1 | for peptide precipitation |
| Disposable syringes, 20 mL | Fisher Scientific | 14-817-54 | for HPLC purification |
| Double neubauer ruled hemocytometer | VWR | 63510-13 | for cell counting |
| DSPE-PEG(2000) amine | Avanti | 880128P | for peptide conjugation |
| DSPE-PEG(2000) maleimide | Avanti | 880126P | for peptide conjugation |
| DSPE-PEG(2000)-NHS ester | Nanocs | PG2-DSNS-10K | for conjugation to Cy5 |
| Dulbecco's modified eagle medium-high glucose | Sigma Aldrich | D5796-500ML | for cell culture |
| Fetal bovine serum, qualified, heat inactivated | ThermoFisher Scientific | 10438026 | for cell culture |
| Fmoc-L-Ala-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-A | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-RBF | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Asn(Trt)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-NT | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Cys(Trt)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-CT | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Gln(Trt)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-QT | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Ile-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-I | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Leu-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-L | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Lys(Boc)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-KBC | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Phe-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-F | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Ser(tBu)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-SB | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Thr(tBu)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-TB | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-YB | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Val-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-V | for peptide synthesis |
| Fmoc-Lys(Boc)-wang resin, 100-200 mesh | Novabiochem | 856013 | for peptide synthesis |
| Formic acid, optima LC/MS grade | Fisher Scientific | A117-50 | for HPLC purification |
| Glycerol | VWR | M152-1L | for confocal microscopy |
| Hand tally counter | Fisher Scientific | S90189 | for cell counting |
| Magnetic stir bars, egg-shaped | VWR | 58949-006 | for peptide conjugation |
| Methanol, ACS certified | Fisher Scientific | A412-4 | for PAM synthesis |
| MTS cell proliferation colorimetric assay kit | VWR | 10191-104 | for MTS assay |
| N,N-Dimethylformamide, sequencing grade | Fisher Scientific | BP1160-4 | for peptide synthesis |
| N-Methylmorpholine | Protein Technologies | S-1L-NMM | for peptide synthesis |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | AC416780250 | for fixing cells |
| PBS, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 10010049 | for various applications |
| Penicillin/streptomycin, 10,000 U/mL | ThermoFisher Scientific | 15140122 | for cell culture |
| Peptide synthesis vessel, 25 mL | Fisher Scientific | CG186011 | for peptide synthesis |
| Phosphotungstic acid | Fisher Scientific | A248-25 | for TEM |
| Piperidine | Spectrum | P1146-2.5LTGL | for peptide synthesis |
| Plain glass microscope slide 75 x 25 mm | Fisher Scientific | 12-550-A3 | for confocal microscopy |
| Reagent reservoirs, sterile | VWR | 95128093 | for cell culture |
| Self-closing tweezer | TedPella | 515 | for TEM |
| TEM support film | TedPella | 01814F | for TEM |
| Trifluoroacetic acid | Fisher Scientific | BP618-500 | for peptide cleavage and HPLC purification |
| Triisopropylsilane | VWR | TCT1533-5ml | for peptide cleavage |
| Trypan blue solution, 0.4% | ThermoFisher Scientific | 15250061 | for cell counting |
| Tweezer, general purpose-serrated | VWR | 231-SA-SE | for confocal microscopy |
| WEHI-274.1 | ATCC | ATCC CRL-1679 | murine monocyte |
| automated benchtop peptide synthesizer | Protein Technologies | PS3 Benchtop Peptide Synthesizer | |
| α- cyano- 4- hydroxycinnamic acid, 99% | Sigma Aldrich | 476870-2G | for MALDI |
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