Summary
Этот документ представлен метод синтеза и характеристика ориентации Моноцит пептидные Амфифильность мицелл и соответствующий assays для проверки на биосовместимость и мицеллы возможность связывать моноцитов.
Abstract
Атеросклероз является крупный вклад сердечно-сосудистых заболеваний, ведущей причиной смерти во всем мире, который утверждает 17,3 миллиона человеческих жизней ежегодно. Атеросклероз является также основной причиной внезапной смерти и инфаркт миокарда, подстрекаемые нестабильной бляшки, которые разорвать и конторах кровеносного сосуда без предупреждения. Текущие изображения формы не может различать стабильного и нестабильного бляшки, которые разрыву. Пептидные amphiphiles мицелл (ПАМС) может преодолеть этот недостаток, как они могут быть изменены с различными ориентации постановление, которые связывают специально для пораженной ткани. Моноциты было показано, быть ранних маркеров атеросклероза, в то время как большие накопления моноцитов ассоциируется с металлическими пластинками, склонных к разрыву. Следовательно наночастицы, которые можно ориентировать моноцитов может использоваться для дискриминации различных стадиях атеросклероза. С этой целью здесь, мы описать протокол для подготовки Моноцит ориентация ПАМС (Моноцит хемотаксического белка-1 (МКП-1) ПАМС). MCP-1 ПАМС собираются самостоятельно через синтез условиях мягкая форма наночастиц 15 Нм в диаметре с рядом нейтральных поверхности заряда. В пробирке, пам были найдены быть биосовместимых и имеют высокое сродство для моноцитов. Методы, описанные здесь обещают для широкого круга приложений, атеросклероз, а также других воспалительных заболеваний.
Introduction
Сердечно-сосудистые заболевания остаются ведущих причин смерти во всем мире с приблизительно117,3 миллиона случаев смерти во всем мире. Сердечно-сосудистые заболевания являются представленные атеросклероза, условие, в котором металлические пластинкы накапливаться в артерий, тем самым блокируя крови и поток кислорода в клетки тела2,3. Прогрессирование атеросклероза предполагает утолщение и твердеть артерий воспалительной реакции, нерегулярные липидного обмена и наращивания зубного налета, ведущих к доска разрыв и инфаркт миокарда4,5. Эндотелиальные клетки Экспресс цитокинов и сцепления молекул, которые включают MCP-1, который привязывает к C-C хемокиновых рецепторов (CCR2), нашли на поверхности моноциты6,,78. Окисленного холестерина преобразует моноцитов в макрофаги на ранней стадии формирования зубного налета, который усиливает воспалительный процесс в регионе и приводит к повреждения тканей и формированию нестабильных или уязвимых бляшек9, 10.
Традиционно атеросклероз оценивается путем оценки Люминал стенозом анатомических изображений с помощью ангиографии или УЗИ11,12. Однако, эти методы может только определить сужение тяжелой артериальной стенки и не на ранней стадии атеросклероза, как первоначальный налета роста вызывает артериальной ремоделирования поддерживать размер артерии и крови поток скорость12,13, 14. Таким образом ангиограмм underrepresent распространенности атеросклероза. Кроме того, неинвазивные методы визуализации таких выбросов одиночных фотонов компьютерная томография, позитронно-эмиссионная томография и магнитно-резонансной томографии, недавно были использованы характеризовать налета морфологии, как они могут обеспечить начальной детали и характеристика бляшек. Однако эти условия часто ограничивается отсутствием чувствительности, пространственное разрешение, или требуют использования ионизирующего излучения, делая изображений прогрессии налета на разных стадиях гораздо более сложной,15,16 17. Тепловизионная система доставки, которая бы конкретно определить бляшек на разных стадиях атеросклероза предстоит разработать.
Наночастицы показали быть возникающих платформы в vivo доска ориентации и диагностика18,19,20,21. В частности из-за их химического разнообразие и возможность размещения различных постановление, композиции, размеров, форм и поверхности функционализации22выгодны пам. Пептидные amphiphiles (ССА) состоят из гидрофильные, пептидный «headgroup» придают гидрофобным хвост, который обычно являются липиды; Эта структура амфифильных наделяет самостоятельной сборки возможности и позволяет многовалентных отображения пептидов на поверхности частиц22,23,24. Headgroups пептид может влиять на формы частиц путем складывания и водородных связей между пептидами25. Было показано, что пептиды, которые раз через β-лист взаимодействия форме удлиненных мицеллы, в то время как α-винтовой подтверждения могут образовываться как сферических и удлиненные мицеллы22,23,24, 25,,2627. Полиэтиленгликоль (PEG) компоновщики, щит поверхности заряд пептида могут быть размещены между гидрофильные пептида и гидрофобные хвост пам, повышение доступности наночастиц в кровообращения28, 29 , 30 , 31. СМУУ также выгодно, потому что они биосовместимых и было показано, имеют широкий спектр приложений32,33. Значения растворимости в воде мицелл предлагает преимущество перед другими системами, на основе наночастиц, например некоторых полимерных наночастиц, не растворим в воде и должны быть приостановлены в solubilizers для инъекций34. Кроме того возможность создания ПАМС которые разбирать в ответ на конкретные стимулы делает ПАМС привлекательным кандидатом для доставки контролируемых наркотиков внутриклеточных35.
Связывание с рецепторами CCR2 и накапливается в аорты, СМУУ ранее были разработаны для Моноцит ориентации для мониторинга различных этапах атеросклеротических поражений аорты9. В ароЕ мышей- / - накопление Моноцит возрастает пропорционально налета прогрессии36. Кроме того было установлено, что пациенты с подверженных разрыв, поздней стадии таблички содержат большее количество моноцитов37. Таким образом изменение ПАМС включить MCP-1 полезно, потому что она позволяет для большей нацеленности специфичность и дифференциации между ранней и поздней стадии атеросклеротических поражений. Эти доказательства в концепция исследования также подтвердили ПАМС достаточно безопасно, чтобы использоваться в pre-clinically и очищаются парентеральному38. Поскольку моноцитов и воспаление характерны для других заболеваний, СМУУ MCP-1 имеют потенциал, чтобы быть использованы для лечебных и диагностических приложений в других заболеваний за пределы атеросклероза8,,3940 , 41.
Здесь мы приводим изготовление высокомасштабируемую и собственн-собранные ПАМС MCP-1, которая продемонстрировала оптимальный размер частицы, поверхности заряд и избирательного отношения к моноциты для расширения графических приложений в атеросклероза.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Прочитайте MSDS для реагентов и следовать все меры химической безопасности, как это предусмотрено местным учреждением.
1. Подготовка ПАМС MCP-1
-
Подготовка MCP-1 пептида
- Весят, 0,25 ммоль Fmoc-L-Лис (БП)-Ван в реакционный сосуд (RV). Промывайте стороне RV с 5 мл dimethylforamide (DMF) в химической зонта.
- Загрузите RV на автоматизированной benchtop пептид синтезатор. Загрузка предварительно упакованных аминокислоты флаконов, N «- CYNFTINRKISVQRLASYRRITSS - C», от C к N-terminus. Включить пустой флакон в конце этапа окончательного deprotection.
Примечание: Яичница пептид с последовательностью, N «- CNNSIIRSKQVLRSTRYFRSATYK - C», могут также быть синтезированы используя тот же протокол. - По завершении синтеза передачи пептидов на смолы из RV сцинтилляционные флакона с 2-3 мл метанола до тех пор, пока все смол передаются. После того, как смола потоплены на дно, удалить супернатант метанола и испаряться, оставшееся до полного высыхания. Пылесос сухой для дополнительных 2 h, или на ночь при комнатной температуре.
- Сделайте расщепления 12 мл раствора содержит trifluoracetic кислоты (ТФК):ethanedithiol:water:triisopropylsilane 94:2.5:2.5:1 vol % в химической зонта. Вихрем расщепления решение чтобы убедиться, что он равномерно смешивается.
Предупреждение: Потому что triisopropylsilane и ethanedithiol воздуха чувствительных, аргон продувки запасов флаконов triisopropylsilane и ethanedithiol за 1 мин до положить их обратно. - Поместите синтеза судна (SV) на руку шейкер, закрепление в нижней половине SV. Пептид смолы можно передать SV с 2 мл раствора расщепления до тех пор, пока все пептид-смол передаются.
- Мыть стороны SV с 3 мл раствора расщепления. Закройте крышку SV и погрозит 300 колебания/мин на 4 ч.
- Весят из пустой 50 мл пластиковых пробирок. Запись массы.
- После 4 ч слейте рассеченного пептид решение от SV в центрифуге Тюбик 50 мл. Промойте SV несколько раз с оставшийся раствор расщепления.
- Испарится рассеченного пептид решение с азотом, до тех пор, пока существует менее чем 4 мл в пластиковых пробирок.
- Добавьте 36 мл ледяной эфира пептид расщепляется решение.
- Вихревой решение пока полностью белый или желтый. Центрифуга на 3000 x g 5 минут при температуре 4 ° C и сцеживаться супернатант.
- Добавьте 40 мл ледяной эфира в трубку. Вортекс и sonicate снова. Повторите процесс центрифугирования. Декант супернатант.
- Сухие сырой гранул ПА с азота газом продувки до эфира заметно испаряется.
- Добавить 20 мл двойной дистиллированной воды, вихрь и sonicate до тех пор, пока пептида полностью растворяют в растворе.
- Решение проблемы зависания и lyophilize до полного высыхания.
- После того, как сушеные пептида, весят из массы пластиковых пробирок, содержащие сырой пептид. Растворите сырой пептида в 5 мг/мл воды.
- Растворите 25 мг сырой MCP-1 пептида в 5 мл двойной дистиллированной воды, чтобы сделать общую концентрацию 5 мг/мл. Очистки сырой пептид MCP-1 на высокопроизводительных жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с помощью 0,1% TFA в воде (растворитель A) и 0.1% TFA в ацетонитриле (растворитель B) как подвижных фазах на столбце реверс фаза C8. Inject 5 мл пептида в HPLC.
Примечание: Первоначальный мобильный этап состоял из 100% растворителя 9.0 мл/мин со скоростью потока уменьшить растворителя A медленно до 30% в 27 мин и проводить в этой композиции на 3 мин возвращение градиента в 100% растворителем более 3 мин и удерживайте в этой композиции за 1 мин дать Общее время выполнения 34 мин держать температуру столбца при 55 ° C. Используйте режим источника положительных ионов для анализа. Муравьиная кислота может использоваться вместо TFA, если TFA слишком кислой для ВЭЖХ столбца. Рекомендуется, что органический растворитель состав рамп скорость не должна превышать 2%/min для лучшего разделения. - Анализ каждой фракции с помощью матрицы с помощью лазерной десорбции/ионизации (MALDI) масс-спектрометрии для ожидаемого продукта m/z в 2890.
Примечание: Растворить α-циано-4-Гидроксикоричная кислота в 1 мг/мл в ацетонитриле/воды (50: 50% vol) как Матрица решения. Пятно 0,75 мкл раствора матрица на MALDI пластину, следуют 0,75 мкл каждой фракции. Провести анализ, используя режим положительный ион Светоотражающий в массовых спектр Da 500-5000. - Совместить продукт фракций, сдуть ацетонитриле, замораживания и lyophilize очищенный пептидов до полного высыхания.
-
Подготовка MCP-1 ПА
- Подготовьте 1.1 Молярная избыток 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] DSPE-ПЭГ (2000)-maleimide для пептида в отдельных сцинтилляционные флаконов. Растворяют оба соединения в двойной дистиллированной воды, чтобы сделать ~ 15 мг/мл. Sonicate за 15 минут или до тех пор, пока оба решения полностью ясны.
Примечание: DSPE-ПЭГ (2000)-Cy5 синтезируется, используя тот же протокол с DSPE-ПЭГ (2000)-Амин и Cy5, Эстер функционализированных N-оксисукцинимидного (ГСЗ), за исключением шага 1.2.3, где рН раствора корректируется до 8,5. - DSPE-ПЭГ (2000)-maleimide решение добавьте решение пептида. Вортекс и sonicate.
- Добавить 1 M NaOH прикапывают (1 мкл), в то время, до тех пор, пока pH раствора является 7.
- Решение очистки азота для 5 минут перемешать раствор на ночь.
- Решение проблемы зависания и lyophilize до полного высыхания.
- После того, как сырой продукт сушат, растворяют твердые в 5 мг/мл воды.
- Очищают с ВЭЖХ, как описано выше.
Примечание: Неконъюгированной пептида и DSPE-PEG(2000) следует элюировать между 15-30% органических концентрации (vol %), при этом DSPE-PEG конъюгата (2000)-MCP-1 следует элюировать между органических концентрации 40-50%. - Анализ каждой фракции с помощью масс-спектрометрия MALDI для соответствующего м/з DSPE-ПЭГ (2000)-MCP-1 должен иметь широкое m/z пик в 5760.
Примечание: 2,5-dihydroxybenzoic кислота лучше всего использовать как матрица для DSPE-ПЭГ (2000)-MCP-1 с MALDI.
- Подготовьте 1.1 Молярная избыток 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] DSPE-ПЭГ (2000)-maleimide для пептида в отдельных сцинтилляционные флаконов. Растворяют оба соединения в двойной дистиллированной воды, чтобы сделать ~ 15 мг/мл. Sonicate за 15 минут или до тех пор, пока оба решения полностью ясны.
-
Ассамблея ПАМС MCP-1
- Распустить 1,75 мг PAs MCP-1 с 3 мл метанола в пробирку 1-драм. Sonicate до тех пор, пока полностью не растворится MCP-1 ПА.
Примечание: Cy5 amphiphiles могут быть включены в молярное соотношение составлявшее MCP-1 ПА для графических приложений. - Испарения метанола под азота в круговом движении во время промывки оставшихся метанола у стороне флакона до тех пор, пока в нижней части флакона формируется равномерную пленку. Вакуум сухой фильм ночь.
- Гидрат фильм с 3 мл воды или фосфатного буфера физраствора (PBS), с тем чтобы сделать 100 мкм решения МКП-1 пам. Аккуратно водоворот и sonicate решение до ясно. Инкубируйте на 80 ° C за 30 мин.
Примечание: При повышенной температуре было показано для ускорения самостоятельной сборки процесса и позволяет компоненту пептид сформировать наиболее стабильных вторичной структуры, при одновременном снижении мицеллы критической концентрации (CMC)42,43. - Прохладно результате рассеивания до комнатной температуры.
- Распустить 1,75 мг PAs MCP-1 с 3 мл метанола в пробирку 1-драм. Sonicate до тех пор, пока полностью не растворится MCP-1 ПА.
2. характеристика ПАМС MCP-1
-
Динамическое рассеяние света (DLS) и Зета потенциальных
- Место 100 мкм PAM MCP-1 или омлет PAM в кювет согласно инструкциям DLS или Зета потенциального инструмента.
Примечание: DLS и Зета потенциальных кюветы может отличаться на основании документа инструкции. - Сбалансировать инструмента до комнатной температуры. Измерьте размер и поверхности заряд PAM.
- Место 100 мкм PAM MCP-1 или омлет PAM в кювет согласно инструкциям DLS или Зета потенциального инструмента.
-
Просвечивающей электронной микроскопии (ТЕА)
- 7 мкл 50 мкм PAM MCP-1 или омлет PAM на сетку ТЕА приостановлено в пределах самозакрывающиеся пинцет для 5 минут фитиль от капли салфеткой деликатную задачу.
- 7 мкл воды для стирки в сетке. Фитиль от капли.
- Мкл 7 1 wt % фосфорвольфрамовой кислоты на 2 мин фитиль от капли. Повторите шаг 2.2.2.
- Сухие ТЕА сетки до анализа ТЕА.
-
Спектроскопия круговой дихроизма (CD)
- Включите азота для 5-10 мин до использования инструмента.
- Место 300 мкл заготовки (вода или PBS) в кювете.
- Измерение спектров на 190-265 Нм, 0,2 мм длина пути с 1 время интеграции s и пропускной способностью 1 Нм в комнатной температуре. Соберите 3 реплицирует.
- Мера 100 мкм MCP-1 пептида, МКП-1 PAM, кинулись пептида и кинулись PAM при том же условии, описано в шаге 2.3.3. Вычитание из пустой.
- Размеру данных, с использованием линейной интерполяции спектров polylysine основе.
- Выключите прибор. Подождите 10 минут перед выключением азота.
3. анализ в Vitro ПАМС MCP-1
-
В vitro биосовместимость
- Культура и расширить WEHI 274,1 мышиных моноцитов в Дульбекко изменение орел среде с 10% плода бычьим сывороточным (ФБС), 1% пенициллин стрептомицином и 0,05 мм 2-меркаптоэтанол в 37 ° C под 5% CO2 проезд 5.
Примечание: WEHI 274,1, подвеска клетки. При культивировании, средства массовой информации должны быть пополнен каждые 2-3 дня. - Накапайте моноцитов в СМИ в стерильных 50 мл пластиковых пробирок. Центрифуга на 300 x g 5 мин при 4 ° C.
- Аспирационная старые средства массовой информации и Ресуспензируйте в 10 мл свежего СМИ в пластиковых пробирок. Смесь медленно до тех пор, пока клетки равномерно распределены в средствах массовой информации. Подсчет количества ячеек, с помощью окрашивания Трипановый синий и Горяева.
- Разбавьте клетки, что есть 4000 моноцитов в 90 мкл СМИ за хорошо. Мкл 90 клеток в скважинах 96-луночных плиты. Проинкубируйте 24 ч.
Примечание: Избегайте использования скважин на внешние края пластины избежать различий в испарение и температурные изменения в пластине. Заполните наружных скважин с 100 мкл PBS. - Растворите 0,15 мкмоль MCP-1 пептида, МКП-1 PAM, кинулись пептид, или яичница PAM в 150 мкл PBS в отдельных, стерилизованные microcentrifuge трубы. Выполните последовательный разрежения сделать 65 мкл 1, 10 и 100 мкм каждого образца.
- Добавить 10 мкл PBS каждой концентрации в скважинах, содержащие WEHI 274,1 (общий объем: 100 мкл в Ну, 6 линий, 96 всего скважин). Проинкубируйте 72 ч.
- 10 мкл (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) (МТС) в каждой скважине. Инкубируйте 1 час.
- Анализировать поглощения, используя читателя пластины на 490 Нм или на основании инструкции производителя.
- Культура и расширить WEHI 274,1 мышиных моноцитов в Дульбекко изменение орел среде с 10% плода бычьим сывороточным (ФБС), 1% пенициллин стрептомицином и 0,05 мм 2-меркаптоэтанол в 37 ° C под 5% CO2 проезд 5.
-
В vitro мицеллы привязки
- Семя 500,000 моноцитов в каждой скважине 6-ну плиты в 2 мл средства массовой информации, содержащие 100 мкм Cy5-меченых MCP-1 PAM (составлявшее молярное соотношение DSPE-ПЭГ (2000)-Cy5 и МКП-1 ПА). Инкубируйте 1 час.
- Сбор WEHI 274,1 центрифугированием при 300 g x 5 мин при 4 ° C. Аспирационная средств массовой информации.
- Ресуспензируйте и вымыть клетки в 2 мл PBS. Центрифуга на 300 x g 5 мин при 4 ° C. Аспирационная PBS. Повторите процесс стирки с 2 мл PBS. Аспирационная PBS.
- Добавьте 2 мл холодного параформальдегида 4% исправить клетки. Инкубации при комнатной температуре в течение 10 мин.
- Пипетки фиксированного клетки на стерильных стеклянных coverslip в пределах скважин 6-ну плиты. Центрифуга на 400 x g за 5 мин.
- Удаление параформальдегида. Вымойте и сполосните 2 мл PBS один раз. Ресуспензируйте с 1 мл раствора PB
Примечание: Когда полоскания, Избегайте нарушения клетки на coverslip. - Положите 10 мкл 90% глицерина в PBS на слайд. Используйте иглы и пинцет, чтобы забрать coverslip. Сухие края coverslip. Осторожно разместите coverslip на слайд лицевой стороной вниз.
- Слегка уплотнить coverslip с четкой лак. Поместите в холодильник, пока готовы для обработки изображений.
- Используйте конфокальный лазерный сканирующий микроскоп (CLSM) установил с лазерами для Cy5 на λвозбуждения = 650 Нм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Подготовка PAM MCP-1
CCR2-привязки мотив (остатки 13-35) МКП-1 белок [YNFTNRKISVQRLASYRRITSSK] или омлет пептид [YNSLVFRIRNSTQRKYRASIST] был изменен путем добавления цистеина остатков на N-terminus. MCP-1 пептида был синтезирован Fmoc опосредованной твердофазный метода с помощью автоматизированных пептид синтезатор. Сырой пептид был очищенная методом ВЭЖХ реверс фазы на С8 столбца при 50 ° C, с использованием 0,1% TFA в ацетонитриле/водные смеси и характеризуется масс-спектрометрия MALDI (рис. 1). Цистеин содержащее пептид был конъюгированных на DSPE-PEG2000-maleimide для получения конъюгатов (2000)-пептид DSPE-PEG через связь тиоэфиры. После 24 ч при комнатной температуре сырой продукт был очищенная методом ВЭЖХ (рис. 2). DSPE-ПЭГ (2000)-Cy5 был синтезирован с использованием реакции Эстер NHS. Моноцит ориентация ПАМС совместно собран с DSPE-ПЭГ (2000)-MCP-1 DSPE-ПЭГ (2000)-Cy5 были сфабрикованы, растворяя в метаноле, который был затем испаряется, N2, и полученный фильм был сушат под вакуумом на ночь и самостоятельно собранный в воде или PBS через гидрофобных взаимодействий «хвост групп» форму ПАМС MCP-1.
Характеристика PAM MCP-1
DLS данных и изображений ТЕА Моноцит таргетинга ПАМС показал хорошо дисперсных, сферических наночастиц 15.3 Нм ± 2,0 в диаметре (Рисунок 3 и таблицу 1). MCP-1 ПАМС и кинулись ПАМС показал незначительное положительное Зета потенциал 12.1 МВ ± 3,1 и 13,7 ± 1,9 м, соответственно (Таблица 1). CD показало активизировать включение MCP-1 пептида в пределах мицеллы вторичной структуры (Таблица 2, пам MCP-1: 46.2 ± 0,9% β-лист, 53,1 ± 1,4% случайные катушки и бесплатные MCP1: 34.2 ± 3,5% β-лист, 65.8 ± 3,5% случайные катушки).
В пробирке Анализ PAM MCP-1
В vitro биосовместимость и Моноцит связывание ПАМС MCP-1 были отмечены confocal микроскопии. Моноциты мыши инкубировали с увеличением концентрации MCP-1, МКП-1 PAM, кинулись пептида и кинулись PAM для 72 h, и клетки были найдены быть жизнеспособным и биосовместимых до 100 мкм (рис. 4). Кроме того конфокальная микроскопия показал конкретные привязки моноцитов ПАМС MCP-1 по сравнению с платных ПАМС (рис. 5).
Рисунок 1 : ВЭЖХ Хроматограмма на 220 Нм (длина волны-пептидных связей) и 254 Нм (тирозин волны) МКП-1 пептида (A) и кинулись пептида (B) (Boxed пик в 7.4 мин). MALDI-TOF массовых спектр MCP-1 пептида (C) и кинулись пептида (D) в диапазоне 500-5000 да показаны пик для [M + H]+ на m/z 2888 (ожидаемый 2890). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: ВЭЖХ Хроматограмма на 220 Нм (длина волны-пептидных связей) и 254 Нм (тирозин волны) DSPE-ПЭГ (2000)-MCP-1 (A) и DSPE-ПЭГ (2000)-платные (B). (В штучной упаковке пик в 16,9 мин). (C) MALDI-TOF массовые спектр DSPE-ПЭГ (2000)-MCP-1 в диапазоне 1000-10000 да показаны пики для [M + H]+ на m/z 2888 (ожидаемый 2890) для MCP-1 и m/z 5,758 (ожидаемый 5760) для DSPE-PEG (2000)-MCP-1. (D) MALDI-TOF массовые спектр DSPE-ПЭГ (2000)-яичница в диапазоне 1000-10000 да показаны пики для [M + H]+ 2,887 (ожидаемый 2890) для платных пептид m/z и m/z 5,761 (ожидаемый 5760) для DSPE-PEG-платные. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : ТЕА изображения PAM MCP-1 (A) и кинулись PAM (B). Шкалы бар = 100 Нм. Номер среднего размера распределение МКП-1 PAM (C) и кинулись PAM через DLS (D). Данные являются среднее ± с.д. (n = 3). (E) анализ CD MCP-1 и кинулись пептидов и ПАМС (n = 3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : В vitro жизнеспособности мышиных моноцитов WEHI 274,1 после 72 ч воздействия MCP-1 пептида, MCP-1 PAM, кинулись пептид и кинулись PAM. Данные являются среднее ± с.д. (n = 6). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: CLSM изображения PAM MCP-1 (A) и кинулись PAM (B) объединена с 10 моль % Cy5 ПА (красный) инкубированы с WEHI 274,1 для линейки шкалы 1 ч. = 20 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Пам | Номер-Аве диаметр (Нм) | PDI | Зета потенциал (mV) |
| MCP-1 | 15.3 ± 2,0 | 0,119 ± 0,006 | 12.1 ± 3,1 |
| Яичница | 16.9 ± 1.4 | 0.232 ± 0,019 | 13,7 ± 1,9 |
| Измеряется в PBS буфера. Данные выражаются как означает ± SD. | |||
Таблица 1: Размер, полиизопрена и Зета потенциал пам.
| -Спираль (%) | b лист (%) | Случайные катушка (%) | |
| MCP-1 пептида | 0.0 ± 0.0 | 36.2 ± 2,2 | 63.8 ± 1,8 |
| ПЭМ MCP-1 | 0,7 ± 0,6 | 46.2 ± 0,9 | 53,1 ± 1.4 |
| Кинулись пептида | 0.0 ± 0.0 | 43.7 ± 2,1 | 56.3 ± 3,5 |
| Кинулись PAM | 0.0 ± 0.0 | 60.7 ± 0,2 | 39,3 ± 0,2 |
Таблица 2: Вторичной структуры состав пептиды и пам.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ПАМС MCP-1 являются перспективным молекулярной визуализации платформа, состоящая из гидрофильного таргетинга пептида и гидрофобных хвост, что диски собственн-собранные характер наночастиц. Эта ориентация Моноцит мицеллы можно приготовить путем простой синтеза и очистки шагов MCP-1 пептида и DSPE-ПЭГ (2000)-MCP-1. ПАМС имеют много полезных характеристики в vivo молекулярной визуализации такие как их самостоятельной сборки под мягких условиях, внутреннюю способность к биологическому разложению и структурной и химической разнообразия, позволяя для включения других изображений постановление или ориентация пептиды выборочно доставить на определенном сайте интерес. Их размер частиц, форма и композиции могут быть настроены путем изменения пептид, гидрофобные хвост или концентрации мицеллообразования, позволяя оптимальным химические и физические свойства для различных приложений22,33.
Следует отметить несколько ограничений настоящего Протокола. Во-первых поскольку ПАМС движет гидрофобных взаимодействий, необходимо построить таргетинга пептидов, которые гидрофильные, тем самым позволяя таргетинга остаток должен быть представлен на поверхности мицеллы. Если последовательность пептид гидрофобная, добавление одного или двух гидрофильные аминокислот на конечной остановке C могут быть размещены, но добавлением аминокислот могут повлиять на вторичной структуры пептида в пределах мицеллы, таким образом изменяя свойства пептиды в пределах своего родного государства в протеин44,45. Во-вторых при низких концентрациях, СМУУ имеют плохое стабильность в водной среде как они сильно зависит от CMC, минимальные концентрации, необходимые для PAs сформировать мицеллярный структура46. Ниже CMC мицеллы дизассемблирует для отдельных ПА мономеров и ограничивает мицеллы выступать в качестве носителя и выгружать наркотиков на определенном сайте47. Чтобы облегчить этот недостаток, CMC может быть уменьшена путем увеличения длины цепи гидрофобные хвост48,49. Наконец длительного хранения пам в растворе не рекомендуется как вторичная структура ПА может измениться со временем, влияя тем самым на мицеллярный структуры и стабильности, а также эффективности лиганда привязки26.
В целом этот протокол демонстрирует стратегию на основе мицеллы наномедицины надежные, собственн-собранные пептид для визуализации атеросклероза. MCP-1 ПАМС биосовместимых, биологически и нетоксичные как компоненты мицеллы вдохновлены от элементов эндогенного к телу. Более важно СМУУ MCP-1 имеют преференциального привязку к моноцитов, которые пропорционально увеличить прогресс зубного налета, содействия неинвазивная подход к дифференциации этапов атеросклеротических бляшек. Благодаря модульности этой платформы пам может включать терапии, дополнительные ориентации пептиды, постановление и нуклеиновых кислот. Следовательно учитывая такие динамические возможности этих многофункциональных мицелл, мы считаем, что эти частицы провести большие перспективы для клинических перевод в атеросклероза и других заболеваний.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы отметить финансовую поддержку от университета Южной Калифорнии, Национальный сердца, легких и крови института (NHLBI), R00HL124279, Эли Edythe Широкое Innovation Award и л.к. Уиттиер фонд Non-рак Переводческая премия предоставлено ЕЕК. Авторы благодарят центр за электронная микроскопия и микроанализ, центр повышения квалификации в NanoBiophysics, центр повышения квалификации для молекулярная характеристика и переводческая изображений центра в университете Южной Калифорнии для помощи в Инструментальная установок.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-ethanedithiol | VWR | E0032 | for peptide synthesis |
| 10 mL disposable serological pipets | VWR | 89130-898 | for cell culture |
| 15 mL centrifuge tubes, polypropylene | VWR | 89401-566 | for various applications |
| 2,5-dihydroxybenzoic acid, 99% | Fisher Scientific | AC165200050 | for MALDI |
| 25 mL disposable serological pipets | VWR | 89130-900 | for cell culture |
| 2-Mercaptoethanol, 50 mM | ThermoFisher Scientific | 31350010 | for cell culture |
| 5 mL disposable serological pipets | VWR | 89130-896 | for cell culture |
| 50 mL centrifuge tubes | VWR | 89039-658 | for various applications |
| 75 cm2 culture flask | Fisher Scientific | 13-680-65 | for cell culture |
| 75 mL reaction vessel | Protein Technologies | 3000005 | for peptide synthesis |
| 96-wells cell culture plate | VWR | 40101-346 | for MTS assay |
| Acetonitrile, HPLC grade | Fisher Scientific | A998SK-4 | for HPLC purification |
| Borosilicate glass, 1 dram | VWR | 66011-041 | for PAM synthesis |
| Borosillicate glass pipet, Long tips | VWR | 14673-043 | for various applications |
| Coverslip, 0.16-0.19 mm, 22 x 22 mm | Fisher Scientific | 12-542B | for confocal microscopy |
| Cy5 amine | Abcam | ab146463 | for peptide conjugation |
| Diethyl ether, ACS grade | Fisher Scientific | E138-1 | for peptide precipitation |
| Disposable syringes, 20 mL | Fisher Scientific | 14-817-54 | for HPLC purification |
| Double neubauer ruled hemocytometer | VWR | 63510-13 | for cell counting |
| DSPE-PEG(2000) amine | Avanti | 880128P | for peptide conjugation |
| DSPE-PEG(2000) maleimide | Avanti | 880126P | for peptide conjugation |
| DSPE-PEG(2000)-NHS ester | Nanocs | PG2-DSNS-10K | for conjugation to Cy5 |
| Dulbecco's modified eagle medium-high glucose | Sigma Aldrich | D5796-500ML | for cell culture |
| Fetal bovine serum, qualified, heat inactivated | ThermoFisher Scientific | 10438026 | for cell culture |
| Fmoc-L-Ala-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-A | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-RBF | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Asn(Trt)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-NT | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Cys(Trt)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-CT | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Gln(Trt)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-QT | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Ile-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-I | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Leu-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-L | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Lys(Boc)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-KBC | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Phe-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-F | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Ser(tBu)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-SB | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Thr(tBu)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-TB | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-YB | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Val-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-V | for peptide synthesis |
| Fmoc-Lys(Boc)-wang resin, 100-200 mesh | Novabiochem | 856013 | for peptide synthesis |
| Formic acid, optima LC/MS grade | Fisher Scientific | A117-50 | for HPLC purification |
| Glycerol | VWR | M152-1L | for confocal microscopy |
| Hand tally counter | Fisher Scientific | S90189 | for cell counting |
| Magnetic stir bars, egg-shaped | VWR | 58949-006 | for peptide conjugation |
| Methanol, ACS certified | Fisher Scientific | A412-4 | for PAM synthesis |
| MTS cell proliferation colorimetric assay kit | VWR | 10191-104 | for MTS assay |
| N,N-Dimethylformamide, sequencing grade | Fisher Scientific | BP1160-4 | for peptide synthesis |
| N-Methylmorpholine | Protein Technologies | S-1L-NMM | for peptide synthesis |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | AC416780250 | for fixing cells |
| PBS, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 10010049 | for various applications |
| Penicillin/streptomycin, 10,000 U/mL | ThermoFisher Scientific | 15140122 | for cell culture |
| Peptide synthesis vessel, 25 mL | Fisher Scientific | CG186011 | for peptide synthesis |
| Phosphotungstic acid | Fisher Scientific | A248-25 | for TEM |
| Piperidine | Spectrum | P1146-2.5LTGL | for peptide synthesis |
| Plain glass microscope slide 75 x 25 mm | Fisher Scientific | 12-550-A3 | for confocal microscopy |
| Reagent reservoirs, sterile | VWR | 95128093 | for cell culture |
| Self-closing tweezer | TedPella | 515 | for TEM |
| TEM support film | TedPella | 01814F | for TEM |
| Trifluoroacetic acid | Fisher Scientific | BP618-500 | for peptide cleavage and HPLC purification |
| Triisopropylsilane | VWR | TCT1533-5ml | for peptide cleavage |
| Trypan blue solution, 0.4% | ThermoFisher Scientific | 15250061 | for cell counting |
| Tweezer, general purpose-serrated | VWR | 231-SA-SE | for confocal microscopy |
| WEHI-274.1 | ATCC | ATCC CRL-1679 | murine monocyte |
| automated benchtop peptide synthesizer | Protein Technologies | PS3 Benchtop Peptide Synthesizer | |
| α- cyano- 4- hydroxycinnamic acid, 99% | Sigma Aldrich | 476870-2G | for MALDI |
References
- Mozaffarian, D., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), e38-e60 (2016).
- Falk, E. Pathogenesis of atherosclerosis. J. Am. Coll. Cardiol. 47 (8, Suppl. C), C7-C12 (2006).
- Rahmani, M., Cruz, R. P., Granville, D. J., McManus, B. M. Allograft Vasculopathy Versus Atherosclerosis. Circ. Res. 99 (8), 801-815 (2006).
- Luis, A. J. Atherosclerosis. Nature. 407 (6801), 233-241 (2000).
- Libby, P., Ridker, P. M., Hansson, G. K. Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis. Nature (London, U. K). 473 (7347), 317-325 (2011).
- Boring, L., Gosling, J., Cleary, M., Charo, I. F. Decreased lesion formation in CCR2-/- mice reveals a role for chemokines in the initiation of atherosclerosis. Nature (London). 394 (6696), 894-897 (1998).
- Szmitko, P. E., et al. New Markers of Inflammation and Endothelial Cell Activation. Circulation. 108 (16), 1917-1923 (2003).
- Deshmane, S. L., Kremlev, S., Amini, S., Sawaya, B. E. Monocyte Chemoattractant Protein-1 (MCP-1): An Overview. J. Interferon Cytokine Res. 29 (6), 313-326 (2009).
- Chung, E. J., et al. Monocyte-Targeting Supramolecular Micellar Assemblies: A Molecular Diagnostic Tool for Atherosclerosis. Adv. Healthcare Mater. 4 (3), 367-376 (2015).
- Chung, E. J. Targeting and therapeutic peptides in nanomedicine for atherosclerosis. Exp Biol Med (Maywood). 241 (9), 891-898 (2016).
- Sanz, J., Fayad, Z. A. Imaging of atherosclerotic cardiovascular disease. Nature (London, U. K.). 451 (7181), 953-957 (2008).
- Tarkin, J. M., et al. Imaging Atherosclerosis. Circ. Res. 118 (4), 750-769 (2016).
- Hennerici, M., Baezner, H., Daffertshofer, M. Ultrasound and arterial wall disease. Cerebrovasc Dis. 17 Suppl 1, 19-33 (2004).
- Nissen, S. E. Application of intravascular ultrasound to characterize coronary artery disease and assess the progression or regression of atherosclerosis. Am J Cardiol. 89 (4A), 24B-31B (2002).
- Khalil, M. M., Tremoleda, J. L., Bayomy, T. B., Gsell, W. Molecular SPECT Imaging: An Overview. Int J Mol Imaging. 2011, 796025 (2011).
- Lerakis, S., et al. Imaging of the vulnerable plaque: noninvasive and invasive techniques. Am J Med Sci. 336 (4), 342-348 (2008).
- Sun, Z. H., Rashmizal, H., Xu, L. Molecular imaging of plaques in coronary arteries with PET and SPECT. J Geriatr Cardiol. 11 (3), 259-273 (2014).
- Godin, B., et al. Emerging applications of nanomedicine for the diagnosis and treatment of cardiovascular diseases. Trends Pharmacol. Sci. 31 (5), 199-205 (2010).
- Branco de Barros, A. L., Tsourkas, A., Saboury, B., Cardoso, V. N., Alavi, A. Emerging role of radiolabeled nanoparticles as an effective diagnostic technique. EJNMMI Res. 2 (1), 31-39 (2012).
- Jayagopal, A., Linton, M. F., Fazio, S., Haselton, F. R. Insights into atherosclerosis using nanotechnology. Curr. Atheroscler. Rep. 12 (3), 209-215 (2010).
- Khodabandehlou, K., Masehi-Lano, J. J., Poon, C., Wang, J., Chung, E. J. Targeting cell adhesion molecules with nanoparticles using in vivo and flow-based in vitro models of atherosclerosis. Exp Biol Med (Maywood). 242 (8), 799-812 (2017).
- Trent, A., Marullo, R., Lin, B., Black, M., Tirrell, M. Structural properties of soluble peptide amphiphile micelles. Soft Matter. 7 (20), 9572-9582 (2011).
- Hartgerink, J. D., Beniash, E., Stupp, S. I. Peptide-amphiphile nanofibers: A versatile scaffold for the preparation of self-assembling materials. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (8), 5133-5138 (2002).
- Missirlis, D., et al. Effect of the Peptide Secondary Structure on the Peptide Amphiphile Supramolecular Structure and Interactions. Langmuir. 27 (10), 6163-6170 (2011).
- Zhong, L., Johnson, W. C. Environment affects amino acid preference for secondary structure. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89 (10), 4462-4465 (1992).
- Shimada, T., Lee, S., Bates, F. S., Hotta, A., Tirrell, M. Wormlike Micelle Formation in Peptide-Lipid Conjugates Driven by Secondary Structure Transformation of the Headgroups. J. Phys. Chem. B. 113 (42), 13711-13714 (2009).
- Missirlis, D., et al. Linker Chemistry Determines Secondary Structure of p5314-29 in Peptide Amphiphile Micelles. Bioconjugate Chem. 21 (3), 465-475 (2010).
- Elbert, D. L., Hubbell, J. A. Surface treatments of polymers for biocompatibility. Annu. Rev. Mater. Sci. 26, 365-394 (1996).
- Xue, Y., O'Mara, M. L., Surawski, P. P. T., Trau, M., Mark, A. E. Effect of Poly(ethylene glycol) (PEG) Spacers on the Conformational Properties of Small Peptides: A Molecular Dynamics Study. Langmuir. 27 (1), 296-303 (2011).
- Canalle, L. A., Loewik, D. W. P. M., van Hest, J. C. M. Polypeptide-polymer bioconjugates. Chem. Soc. Rev. 39 (1), 329-353 (2010).
- Hamley, I. W. PEG-Peptide Conjugates. Biomacromolecules. 15 (5), 1543-1559 (2014).
- Acar, H., et al. Self-assembling peptide-based building blocks in medical applications. Adv. Drug Delivery Rev. , (2016).
- Busseron, E., Ruff, Y., Moulin, E., Giuseppone, N. Supramolecular self-assemblies as functional nanomaterials. Nanoscale. 5 (16), 7098-7140 (2013).
- Barrett, J. C., et al. Modular Peptide Amphiphile Micelles Improving an Antibody-Mediated Immune Response to Group A Streptococcus. ACS Biomater. Sci. Eng. 3 (2), 144-152 (2017).
- Toughrai, S., et al. Reduction-Sensitive Amphiphilic Triblock Copolymers Self-Assemble Into Stimuli-Responsive Micelles for Drug Delivery. Macromol. Biosci. 15 (4), 481-489 (2015).
- Swirski, F. K., et al. Monocyte accumulation in mouse atherogenesis is progressive and proportional to extent of disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103 (27), 10340-10345 (2006).
- Kashiwagi, M., et al. Association of monocyte subsets with vulnerability characteristics of coronary plaques as assessed by 64-slice multidetector computed tomography in patients with stable angina pectoris. Atherosclerosis (Amsterdam, Neth). 212 (1), 171-176 (2010).
- Chung, E. J., Tirrell, M. Recent Advances in Targeted, Self-Assembling Nanoparticles to Address Vascular Damage Due to Atherosclerosis. Adv. Healthcare Mater. 4 (16), 2408-2422 (2015).
- Cassetta, L., Pollard, J. W. Cancer immunosurveillance: role of patrolling monocytes. Cell Res. 26 (1), 3-4 (2016).
- Williams, C. B., Yeh, E. S., Soloff, A. C. Tumor-associated macrophages: unwitting accomplices in breast cancer malignancy. NPJ Breast Cancer. 2, (2016).
- Richards, D. M., Hettinger, J., Feuerer, M. Monocytes and Macrophages in Cancer: Development and Functions. Cancer Microenviron. 6 (2), 179-191 (2013).
- Schick, M. J. Effect of temperature on the critical micelle concentration of nonionic detergents. Thermodynamics of micelle formation. J. Phys. Chem. 67 (9), 1796-1799 (1963).
- Marullo, R., Kastantin, M., Drews, L. B., Tirrell, M. Peptide contour length determines equilibrium secondary structure in protein-analogous micelles. Biopolymers. 99 (9), 573-581 (2013).
- Hilbich, C., Kisters-Woike, B., Reed, J., Masters, C. L., Beyreuther, K. Substitutions of hydrophobic amino acids reduce the amyloidogenicity of Alzheimer's disease βA4 peptides. J. Mol. Biol. 228 (2), 460-473 (1992).
- Trevino, S. R., Scholtz, J. M., Pace, C. N. Amino Acid Contribution to Protein Solubility: Asp, Glu, and Ser Contribute more Favorably than the other Hydrophilic Amino Acids in RNase Sa. J. Mol. Biol. 366 (2), 449-460 (2007).
- Kim, S. W., Shi, Y. Z., Kim, J. Y., Park, K. N., Cheng, J. X. Overcoming the barriers in micellar drug delivery: Loading efficiency, in vivo stability, and micelle-cell interaction. Expert Opin Drug Delivery. 7 (1), 49-62 (2010).
- Rangel-Yagui, C. O., Pessoa, A. Jr, Tavares, L. C. Micellar solubilization of drugs. J. Pharm. Pharm. Sci. 8 (2), 147-163 (2005).
- Batrakova, E., et al. Fundamental relationships between the composition of pluronic block copolymers and their hypersensitization effect in MDR cancer cells. Pharm. Res. 16 (9), 1373-1379 (1999).
- Chen, L. J., Lin, S. Y., Huang, C. C. Effect of Hydrophobic Chain Length of Surfactants on Enthalpy-Entropy Compensation of Micellization. J. Phys. Chem. B. 102 (22), 4350-4356 (1998).
