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Bioengineering

Síntesis de monocito-targeting Peptide Amphiphile micelas para la proyección de imagen de la aterosclerosis

Published: November 17, 2017 doi: 10.3791/56625
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, University of Southern California

Summary

Este documento presenta un método que implica la síntesis y caracterización de micelas de amphiphile péptido monocito-targeting y los correspondientes ensayos para prueba de biocompatibilidad y capacidad de la micela a monocitos.

Abstract

La ateroesclerosis es una importante contribución a las enfermedades cardiovasculares, la principal causa de muerte en todo el mundo, que afirma 17,3 millones de vidas anualmente. La aterosclerosis es también la principal causa de muerte súbita e infarto de miocardio, instigado por las placas inestables que se rompen y ocluyan los vasos sanguíneos sin previo aviso. Corriente de las modalidades de la proyección de imagen no puede diferenciar entre placas estables e inestables que la ruptura. Micelas de Anfífilos péptido (PAMs) pueden superar esta desventaja puede ser modificado con una variedad de dirigidos a grupos que se unen específicamente al tejido enfermo. Monocitos han demostrado ser marcadores tempranos de la aterosclerosis, mientras que la gran acumulación de monocitos se asocia con placas propensas a la ruptura. Por lo tanto, nanopartículas que pueden dirigirse a monocitos pueden utilizarse para discriminar diferentes etapas de la aterosclerosis. Para ello, aquí, se describe un protocolo para la preparación de monocito-PAMs (monocito chemoattractant protein-1 (MCP-1) PAMs). PAMs de MCP-1 uno mismo-se ensamblan a través de síntesis condiciones suaves en forma de nanopartículas de 15 nm de diámetro con cerca de carga superficie neutra. In vitro, PAM fueron encontrada para ser biocompatible y tenían una alta afinidad para monocitos. Los métodos descritos en este documento muestran promesa para una amplia gama de aplicaciones en la aterosclerosis, así como otras enfermedades inflamatorias.

Introduction

Las enfermedades cardiovasculares están pendientes de las principales causas de muerte a nivel mundial con aproximadamente 17,3 millones de muertes en todo el mundo1. Las enfermedades cardiovasculares son aportadas por la ateroesclerosis, una condición en la que las placas se acumulan en las arterias, la sangre de tal modo inhibiendo y el flujo de oxígeno a las células del cuerpo2,3. La progresión de la ateroesclerosis consiste en el engrosamiento y endurecimiento de las arterias por una acumulación de placa, lleva a placa4,de ruptura e infarto de miocardio5, respuesta inflamatoria y metabolismo lipídico irregular. Las células endoteliales expresan moléculas de citocinas y de la adherencia, como MCP-1 que enlaza con el C-C chemokine receptor (CCR2) encuentran en la superficie de monocitos6,7,8. Colesterol oxidado convierte monocitos en macrófagos durante la etapa temprana de formación de la placa, que amplifica la respuesta inflamatoria en la región y lleva a la lesión tisular y la formación de placas inestables o vulnerables9, 10.

Tradicionalmente, la ateroesclerosis se evalúa mediante la evaluación de estenosis luminal por la proyección de imagen anatómica con ecografía o angiografía11,12. Sin embargo, estos métodos pueden determinar sólo estrechamiento severo de la pared arterial y no la etapa temprana de la aterosclerosis, como causas de crecimiento de la placa inicial remodelado arterial mantener el tamaño de la arteria y de la sangre flujo tasa12,13, 14. Por lo tanto, los angiogramas ricas prevalencia de ateroesclerosis. Además, técnicas de imagen no invasivas como la sola emisión del fotón computan la tomografía, tomografía por emisión de positrones y la resonancia magnética se han utilizado recientemente para caracterizar la morfología de la placa como pueden proporcionar información inicial y caracterización de las placas. Sin embargo, estas modalidades son limitadas a menudo por la falta de sensibilidad, resolución espacial, o requieren el uso de radiaciones ionizantes, que imagen progresión de placa en diferentes etapas mucho más desafiante15,16, 17. Un sistema de entrega imagen que identificara concretamente las placas en diferentes etapas de la aterosclerosis es a desarrollar.

Las nanopartículas han demostrado ser una plataforma emergente para en vivo placa orientación y diagnóstico18,19,20,21. En particular, PAMs son ventajosas debido a su diversidad química y capacidad para acomodar una variedad de grupos, composiciones, tamaños, formas y funcionalización de superficies22. Péptido Anfífilos (PAs) consiste en un péptido "headgroup hidrofílico," unido a una cola hidrofóbica, que suelen ser lípidos; Esta estructura anfifílicas confiere capacidades de uno mismo-montaje y permite una visualización multivalente de péptidos en la superficie de la partícula22,23,24. El péptido contiene puede afectar la forma de la partícula a través de plegables y el hidrógeno de la vinculación entre péptidos25. Péptidos que se dobla a través de la interacción β-hoja han demostrado formar micelas alargadas, mientras que α-helicoidal confirmación puede formar dos micelas esféricas y alargada22,23,24, 2526,de,27. Enlazadores de polietilenglicol (PEG) que proteja la carga superficial del péptido pueden colocarse entre el péptido hidrofílico y cola hidrofóbica de PAMs, mejorar la disponibilidad de la nanopartícula en circulación sistémica28, 29 , 30 , 31. PAM también es ventajosa porque son biocompatibles y se ha demostrado que tienen una amplia gama de aplicaciones32,33. La solubilidad en agua de micelas ofrece una ventaja sobre otros sistemas basados en nanopartículas como ciertas nanopartículas poliméricas que no son solubles en agua y tienen que ser suspendido en solubilizantes para inyecciones34. Además, la habilidad de crear PAMs que desmontarán en respuesta a un estímulo específico hace PAM un candidato atractivo para la entrega controlada de drogas intracelular35.

Por Unión al receptor CCR2 y acumulando en el arco aórtico, PAMs fueron desarrolladas previamente para monocitos targeting para monitorear las diferentes etapas de las lesiones ateroscleróticas en la aorta9. En ratones ApoE- / - acumulación de monocitos aumenta proporcionalmente a la progresión de placa36. Además, se encontró que los pacientes con placas propensas a la ruptura, última etapa contienen altas cantidades de monocitos37. Por lo tanto, la modificación de los PAMs para incorporar MCP-1 es útil porque permite mayor especificidad segmentación y diferenciación entre las lesiones ateroscleróticas de etapa temprana y tardía. Estos estudios de prueba de concepto también verificaron que la PAMs son lo suficientemente seguras como ser utilizado pre-clinically y se borran renally38. Puesto que los monocitos y la inflamación son característicos de otras enfermedades, PAMs de MCP-1 tienen el potencial de ser utilizado para los usos terapéuticos y de diagnósticos en otras enfermedades más allá de ateroesclerosis8,39,40 , 41.

Adjunto, divulgamos la fabricación altamente escalable y uno mismo-montado PAMs de MCP-1 que demostró tamaño óptimo de partícula, carga superficial y focalización selectiva a monocitos para aplicaciones de imágenes mejoradas en la aterosclerosis.

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Protocol

Nota: Lea la MSDS de reactivos y siga todas las medidas de seguridad química según lo requerido por la institución local.

1. preparación de PAMs de MCP-1

  1. Preparación de péptido de MCP-1
    1. Pesar 0.25 mmol de Fmoc-L-Lys (Boc)-Wang en un recipiente de reacción (RV). Enjuague la parte de la caravana con 5 mL dimethylforamide (DMF) en una campana de humos químicos.
    2. La RV a un sintetizador de péptidos automatizada de banco de carga. Frascos de ácido aminos pre-empacados, N '- CYNFTINRKISVQRLASYRRITSS - C', de la C a N-terminal de carga. Incluye un frasco vacío en el extremo para el paso de la final de la desprotección.
      Nota: Un péptido codificado por secuencia, N '- CNNSIIRSKQVLRSTRYFRSATYK - C', puede también ser sintetizado utilizando el mismo protocolo.
    3. Una vez terminada la síntesis, transferencia los péptidos en la resina de la RV para el vial de centelleo con 2-3 mL de metanol hasta que todas las resinas son transferidos. Después de la resina se ha hundido hasta el fondo, retire el sobrenadante de metanol y se evapore el resto hasta que se seque. Aspiradora seco por un adicional 2 h o durante la noche a temperatura ambiente.
    4. Hacer solución de escote de 12 mL que contiene:ethanedithiol:water:triisopropylsilane de (TFA) ácido trifluoracético 94:2.5:2.5:1 vol % en una campana de humos químicos. Agitar la solución escote para asegurarse que está mezclado uniformemente.
      PRECAUCIÓN: Porque Triisopropilsilano y Etanoditiol son sensibles al aire, argón purgar frascos de stock de Triisopropilsilano y Etanoditiol para 1 minuto antes de volver a ponerlos.
    5. Coloque el recipiente de síntesis (SV) en una coctelera de brazo de sujeción en la parte inferior de la mitad de la SV. Transferencia de resina de péptido a la SV con 2 mL de solución de escote hasta que todas las resinas del péptido se transfieren.
    6. Lavar los lados del SV con 3 mL de solución de escote. Cierre la tapa de la SV y sacuda a 300 oscilaciones/min durante 4 h.
    7. Pesar un tubo de centrífuga de 50 mL vacía. Registrar la masa.
    8. Después de 4 h, vaciar la solución del peptide hendido de la SV en el tubo de centrífuga de 50 mL. Enjuague el SV varias veces con la solución restante del escote.
    9. Se evaporan peptide hendido solución con nitrógeno hasta que haya menos de 4 mL en el tubo de centrífuga.
    10. Añadir 36 mL de éter helada a la solución de péptido-hendida.
    11. Vórtice la solución hasta que es totalmente blanco o amarillo. Centrifugar a 3.000 x g durante 5 min a 4 ° C y decantar el sobrenadante.
    12. Añadir 40 mL de éter de helada en el tubo. Vórtice y someter a ultrasonidos otra vez. Repita el proceso de centrifugación. Decantar el sobrenadante.
    13. Secar el pellet PA crudo con purga con gas nitrógeno hasta que el éter se evapora visiblemente.
    14. Añadir 20 mL de agua de doble agua, vortex y someter a ultrasonidos hasta que el péptido se disuelve completamente en solución.
    15. Congelación de la solución y liofilizar hasta que se seque.
    16. Una vez que el péptido es secado, pesar la masa del tubo de centrífuga que contiene el péptido crudo. Disolver el péptido crudo en 5 mg/mL de agua.
    17. Disolver 25 mg de crudo péptido de MCP-1 en 5 mL de agua destilada doble para hacer una concentración total de 5 mg/mL. Purificar el péptido de MCP-1 crudo por cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) con 0,1% TFA en el agua (solvente A) y 0.1% TFA en acetonitrilo (solvente B) como fases móviles en una columna de fase reversa C8. Inyectar lo 5 mL del péptido en el HPLC.
      Nota: La fase móvil inicial consistió en 100% de disolvente A en un caudal de 9,0 mL/min reducir solvente A lentamente a 30% en el minuto 27 y sostenga en este composición para 3 minutos regreso el degradado 100% solvente A 3 min y sostenga en este composición para 1 minuto dar una duración total de 34 minutos mantener la temperatura de la columna a 55 ° C. Utilice el modo de fuente de iones positivos para el análisis. El ácido fórmico puede usarse en lugar de TFA, si TFA es demasiado ácida para la columna HPLC. Se recomienda que la velocidad de rampa de composición solvente orgánica no debe superar 2%/min para una mejor separación.
    18. Analizar cada fracción usando espectrometría de masas (MALDI) de desorción/ionización láser asistida por matriz para el producto esperado m/z en 2.890.
      Nota: Disolver el ácido α-ciano-4-hidroxicinámico en 1 mg/mL, en acetonitrilo/agua (50: 50 vol %) como la solución de la matriz. Punto 0,75 μl de solución de la matriz en la placa MALDI, seguida de 0,75 μl de cada fracción. Llevar a cabo el análisis utilizando el modo ion reflexivo positivo en un total rango de 500-5.000 Da.
    19. Combinar fracciones de producto, descargue acetonitrilo, congelar y liofilizar péptidos purificados hasta que se seque.
  2. Preparación de MCP-1 PA
    1. Preparar un 1.1 exceso molar de 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] DSPE-PEG (2000)-maleimida al péptido en viales de centelleo separados. Disolver ambos compuestos en agua doble destilada para hacer ~ 15 mg/mL. Someter a ultrasonidos durante 15 min o hasta que ambas soluciones son totalmente claras.
      Nota: DSPE-PEG (2000)-Cy5 es sintetizada usando el mismo protocolo con DSPE-PEG (2000)-amina y Cy5 funcionalizados éster N-hydroxysuccinimide (NHS), excepto el paso 1.2.3, donde el pH de la solución se ajusta a 8.5.
    2. Agregue una solución de (2000)-maleimida DSPE PEG a la solución del péptido. Vórtice y someter a ultrasonidos.
    3. Añadir 1 M NaOH gota a gota (1 μl) en un momento hasta que el pH de la solución es 7.
    4. Solución de purga de nitrógeno para 5 minutos agitar la solución durante la noche.
    5. Congelación de la solución y liofilizar hasta que se seque.
    6. Una vez que el producto crudo es secado, disolver el sólido en 5 mg/mL de agua.
    7. Purificar con HPLC como se describió anteriormente.
      Nota: Péptido no conjugada y DSPE-PEG(2000) deben eluir entre 15-30% concentración orgánica (vol %), mientras que DSPE-PEG (2000)-MCP-1 conjugado debe eluir entre 40-50% de concentración orgánica.
    8. Analizar cada fracción usando espectrometría de masa MALDI la correspondiente m/z. DSPE-PEG (2000)-MCP-1 debe tener un pico amplio m/z en 5.760.
      Nota: el ácido 2, 5-dihydroxybenzoic se utiliza mejor como matriz para DSPE-PEG (2000)-MCP-1 con MALDI.
  3. Asamblea de PAMs de MCP-1
    1. Disolver 1,75 mg PAs de MCP-1 con 3 mL de metanol en un frasco de 1 dram. Someter a ultrasonidos hasta el PA de MCP-1 se haya disuelto completamente.
      Nota: Cy5 Anfífilos pueden incorporarse en una proporción molar de 10:90 MCP-1 PA para aplicaciones.
    2. Evapore el metanol bajo nitrógeno en un movimiento circular mientras se aclara el metanol restante del lado de la cubeta hasta que se forma una película uniforme en la parte inferior del frasco. Secado de vacío la película durante la noche.
    3. Hidratar la película con 3 mL de agua o fosfato buffer salino (PBS) para hacer una solución de 100 μm de PAMs de MCP-1. Suavemente vortex y someter a ultrasonidos la solución hasta el claro. Incubar a 80 ° C por 30 minutos.
      Nota: La temperatura elevada se ha demostrado para acelerar el proceso uno mismo-Asamblea y permite que el componente del péptido formar la estructura secundaria más estable, reduciendo la micelar crítica (CMC) de concentración42,43.
    4. Enfríe la dispersión resultante a la temperatura ambiente.

2. Caracterización de PAMs de MCP-1

  1. Dispersión ligera dinámica (DLS) y potencial zeta
    1. Coloque 100 μm de MCP-1 PAM o PAM revuelta en una cubeta siguiendo las instrucciones del instrumento potencial DLS o zeta.
      Nota: Cubetas potencial DLS y zeta pueden ser diferentes basado en las instrucciones del instrumento.
    2. Equilibrar el instrumento a la temperatura ambiente. Medir el tamaño y la carga superficial del PAM.
  2. Microscopía electrónica de transmisión (TEM)
    1. Añadir 7 μl de 50 μm PAM de MCP-1 o PAM revuelta hacia una rejilla TEM suspendido dentro de una pinza de cierre automático por 5 min mecha la gota con un trapo de tarea delicada.
    2. Añadir 7 μl de agua para lavar la rejilla. Mecha a la gota.
    3. Añadir 7 μl de 1 wt % fosfotúngstico de ácido durante 2 min mecha la gota. Repetir el punto 2.2.2.
    4. Secar la rejilla TEM antes del análisis TEM.
  3. Espectroscopía de dicroísmo circular (CD)
    1. Encienda el nitrógeno durante 5-10 minutos antes de utilizar el instrumento.
    2. Coloque 300 μL del blanco (agua o PBS) en cubeta.
    3. Medir espectros en 190-265 nm, camino de 0,2 mm de longitud con un tiempo de integración de 1 s y un ancho de 1 banda nm en temperatura ambiente. Recoger 3 repeticiones.
    4. Medida 100 μm de péptido de MCP-1, MCP-1 PAM, revueltos de péptido y revueltos PAM bajo la misma condición descrita en el paso 2.3.3. Restar el espacio en blanco.
    5. Ajuste los datos mediante una interpolación lineal de los espectros de base polylysine.
    6. Apagar el instrumento. Espere 10 minutos antes de apagar el nitrógeno.

3. análisis in Vitro de PAMs de MCP-1

  1. In vitro de biocompatibilidad
    1. Cultura y ampliar WEHI 274.1 murinos monocitos en modificado Eagle suplementado de Dulbecco con 10% suero bovino fetal (FBS), 1% de penicilina-estreptomicina y 0,05 mM 2-Mercaptoetanol en 37 ° C debajo del 5% de CO2 al paso 5.
      Nota: WEHI 274.1 son células de suspensión. Al cultivo, los medios de comunicación deben ser reemplazados cada 2-3 días.
    2. Monocitos de pipeta en los medios de comunicación en un tubo de centrífuga estéril 50 mL. Centrifugar a 300 x g durante 5 min a 4 ° C.
    3. Aspirar viejos media y resuspender en medio fresco 10 mL en el tubo de centrífuga. Mezcla lentamente hasta que las células se distribuyen uniformemente en los medios de comunicación. Contar las células con tinción de azul de tripano y un hemocitómetro.
    4. Diluir las células que hay 4.000 monocitos por 90 μl de medio por pozo. Agregar 90 μl de células en los pocillos de una placa de 96 pocillos. Incubar durante 24 h.
      Nota: Evite el uso de los pozos en el borde exterior de la placa para evitar diferencias en la evaporación y cambios térmicos en la placa. Se llenan los pocillos exteriores 100 μl PBS.
    5. Disuelva 0.15 μmol de péptido MCP-1, MCP-1 PAM, péptido codificado o revueltos-PAM en 150 μL PBS en tubos de microcentrífuga separado, esterilizado. Realice la dilución serial para hacer 65 μl de 1, 10 y 100 μm de cada muestra.
    6. Añadir 10 μl PBS de cada concentración en pocillos que contengan 274.1 WEHI (volumen total: 100 μl por pozo, 6 líneas, 96 pocillos total). Incuban durante 72 h.
    7. Añadir 10 μl (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) (MTS) en cada pocillo. Incubar durante 1 h.
    8. Analizar la absorbancia utilizando un lector de placas a 490 nm o en base a las instrucciones del fabricante.
  2. In vitro el enlace de la micela
    1. Monocitos de semilla 500.000 en cada pocillo de una placa de 6 pozos en 2 mL de medio conteniendo 100 μm marcado con Cy5 PAM de MCP-1 (fracción molar 10:90 DSPE-PEG (2000)-Cy5 y MCP-1 PA). Incubar durante 1 h.
    2. Recoger WEHI 274.1 por centrifugación a 300 x g durante 5 min a 4 ° C. Aspire los medios de comunicación.
    3. Suspender y lavar las células en 2 mL de PBS. Centrifugar a 300 x g durante 5 min a 4 ° C. Aspire el PBS. Repita el proceso de lavado con 2 mL de PBS. Aspire el PBS.
    4. Añadir 2 mL de frío paraformaldehído al 4% para fijar las células. Incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos.
    5. Pipetear las células fijas en un cubreobjetos de vidrio estéril dentro de pocillos de una placa de 6 pozos. Centrifugar a 400 x g durante 5 minutos.
    6. Retire el paraformaldehído. Lave y enjuague una vez con 2 mL de PBS. Suspender con 1 mL PB
      Nota: Al enjuagar, evitar interrumpir las células sobre cubreobjetos.
    7. Coloque 10 μl de glicerol 90% en PBS en una diapositiva. Use una aguja y pinzas para recoger el cubreobjetos. Secar el borde del cubreobjetos. Coloque con cuidado el cubreobjetos sobre un portaobjetos boca abajo.
    8. Cierre suavemente el borde del cubreobjetos con el pulimento de clavo claro. Coloque en el refrigerador hasta que esté listo para la proyección de imagen.
    9. Utilizar un láser confocal de barrido microscopio (CLSM) instalado con láseres para Cy5 λexcitación = 650 nm.

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Representative Results

Preparación del PAM de MCP-1
El motivo del CCR2-enlace (residuos 13-35) de la proteína MCP-1 [YNFTNRKISVQRLASYRRITSSK] o péptido codificado [YNSLVFRIRNSTQRKYRASIST] fue modificado mediante la adición de un residuo de cisteína en el N-terminal. El péptido de MCP-1 fue sintetizado por un método de fase sólida Fmoc-mediada mediante un sintetizador de péptidos automatizada. El péptido crudo fue purificado por HPLC fase inversa en una columna C8 a 50 ° C con 0.1% TFA en mezclas acetonitrilo/agua y caracterizado por espectrometría de masa MALDI (figura 1). El péptido que contiene cisteína fue conjugado en DSPE-PEG2000-maleimida que rendir DSPE-PEG conjugados de péptidos (2000) a través de un vínculo thioether. Después de 24 h a temperatura ambiente, el producto crudo se purificó por HPLC (figura 2). DSPE-PEG (2000)-Cy5 fue sintetizado mediante una reacción de éster de NHS. Monocito-targeting PAMs montado conjuntamente con DSPE-PEG (2000)-MCP-1 DSPE-PEG (2000)-Cy5 se fabrica disolviendo en metanol que se evaporó luego de N2y la película resultante fue secada bajo vacío durante la noche y uno montada en el agua o PBS a través de interacciones hidrofóbicas de los grupos de"cola" para formar PAMs de MCP-1.

Caracterización de PAM de MCP-1
DLS datos e imágenes TEM de monocito-PAMs demostraron nanopartículas bien dispersos, esféricos de 15,3 ± 2.0 nm de diámetro (figura 3 y tabla 1). MCP-1 PAM y PAM revuelta demostró un zeta positivo leve potencial de 12,1 ± 3.1 mV y mV de 13,7 ± 1.9, respectivamente (tabla 1). CD demostró que la incorporación del péptido de MCP-1 dentro de la micela mejorada la estructura secundaria (tabla 2, MCP-1 PAMs: 46,2 ± 0,9% β-hoja, bobina al azar de 53,1 ± 1,4% y MCP1 gratis: 34,2 ± 3.5% β-hoja, bobina al azar de 65,8 ± 3.5%).

In Vitro Análisis de PAM de MCP-1
In vitro biocompatibilidad y monocitos atascamiento de PAMs de MCP-1 se observaron por microscopía confocal. Monocitos de ratón fueron incubados con el aumento de las concentraciones de MCP-1, MCP-1 PAM, péptido codificado y PAM revuelta durante 72 h, y las células fueron encontradas para ser viable y biocompatibles hasta 100 μm (figura 4). Además, la microscopia confocal demostró unión específica de los monocitos a PAMs de MCP-1 en comparación con revueltos PAMs (figura 5).

Figure 1
Figura 1 : Cromatograma HPLC a 220 nm (longitud de onda de enlaces peptídicos) y 254 nm (longitud de onda de la tirosina) de péptido de MCP-1 (A) y el péptido codificado (B) (caja pico min 7,4). Espectro de masas MALDI-TOF de péptido de MCP-1 (C) y el péptido revuelto (D) en un rango de 500-5.000 Da mostrando el pico [M + h]+ a m/z 2.888 (2.890 esperado). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Cromatograma HPLC a 220 nm (longitud de onda de enlaces peptídicos) y 254 nm (longitud de onda de la tirosina) de DSPE-PEG (2000)-MCP-1 (A) y DSPE-PEG (2000)-revueltos (B). (Pico en caja a min 16,9). (C) MALDI-TOF total espectro de DSPE-PEG (2000)-MCP-1 en el rango de 1.000-10.000 Da mostrando los picos [M + h]+ en m/z 2.888 (2.890 esperado) para MCP-1 y m/z 5.758 (5.760 esperado) para DSPE-PEG (2000)-MCP-1. (D) MALDI-TOF total espectro de DSPE-PEG (2000)-revueltos en un rango de 1.000-10.000 Da mostrando los picos [M + h]+ de m/z 2.887 (2.890 esperado) para péptido revuelto y m/z 5.761 (5.760 esperado) para DSPE-PEG-revueltos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : Imágenes TEM de PAM de MCP-1 (A) y PAM (B). Barra de escala = 100 nm. Distribución de tamaño medio en número de PAM de MCP-1 (C) y PAM via DLS (D). Datos son medias ± D.E. (n = 3). (E) análisis de CD de MCP-1 y péptidos codificados y PAMs (n = 3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 : Viabilidad in vitro de 274.1 WEHI murinos monocitos después de la exposición de 72 h y MCP-1 péptido, PAM de MCP-1, péptido revuelto, revuelto identificación Datos son medias ± D.E. (n = 6). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Imágenes CLSM de PAM de MCP-1 (A) y revuelta PAM (B) incorporada con 10 mol % PA Cy5 (rojo) se incubaron con 274.1 WEHI para 1 h. barra de escala = 20 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

PAMs Número-Ave diámetro (nm) PDI Potencial zeta (mV)
MCP-1 15,3 ± 2.0 0.119 ± 0.006 12,1 ± 3.1
Revuelto 16,9 ± 1.4 0.232 ± 0.019 13.7 ± 1,9
Mide en tampón PBS. Los datos se expresan como media ± SD

Tabla 1: Tamaño, polidispersidad y potencial zeta de PAMs.

a-hélice (%) b-hoja (%) Bobina al azar (%)
Péptido de MCP-1 ± 0.0 0.0 36,2 ± 2.2 63,8 ± 1.8
PAM DE MCP-1 ± 0,7 0,6 46.2 ± 0.9 53,1 ± 1.4
Revuelto péptido ± 0.0 0.0 43,7 ± 2.1 56,3 ± 3.5
Revuelta PAM ± 0.0 0.0 60,7 ± 0,2 39.3 ± 0,2

Tabla 2: Composición de la estructura secundaria de péptidos y PAMs.

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Discussion

PAMs de MCP-1 es una plataforma de proyección de imagen molecular prometedora, que consiste en un péptido targeting hidrofílica y cola hidrofóbica que impulsa la naturaleza uno mismo-montada de la nanopartícula. Esta micela metas de monocitos puede prepararse por síntesis simple y pasos de la purificación de la MCP-1 péptido DSPE-PEG (2000)-MCP-1. PAMs tienen muchas características beneficiosas para en vivo imagen molecular como su autoensamblaje bajo condiciones suaves, Biodegradabilidad intrínseca y diversidad estructural y química que permite la incorporación de otras partes de la imagen o dirige a péptidos entregar selectivamente a un sitio específico de interés. Su tamaño de partícula, la forma y la composición pueden ajustarse cambiando el péptido, cola hidrofóbica o concentración micelar, permitiendo óptimas propiedades químicas y físicas para una variedad de aplicaciones22,33.

Mencionar algunas limitaciones del presente Protocolo. En primer lugar, ya que Pam es conducida por interacciones hidrofóbicas, es necesario construir dirigida a péptidos que son hidrofílicos, lo que permite que la parte dirigida a presentarse en la superficie de la micela. Si la secuencia del péptido hidrofóbica, una adición de uno o dos hidrofílicos aminoácidos en el terminal de C puede ser acomodada, pero la adición de aminoácidos puede afectar la estructura secundaria de péptido dentro de la micela, cambiando las propiedades de la péptido dentro de su estado natal en la proteína44,45. En segundo lugar, a bajas concentraciones, PAMs tienen mala estabilidad en ambientes acuosos ya que son altamente dependientes de la CMC, la concentración mínima necesaria para que el PAs a formar una estructura micelar46. Por debajo de la CMC, la micela desmonta a los monómeros de PA individuales y limita la micela para actuar como un portador y descargar un fármaco en un sitio específico47. Para paliar este inconveniente, el CMC puede reducirse mediante el aumento de la longitud de la cadena de la cola hidrofóbica48,49. Por último, el almacenamiento a largo plazo de PAMs en solución no se recomienda como estructura secundaria PA puede cambiar con el tiempo, afectando la estructura micelar y estabilidad, así como eficiencia en ligando vinculante26.

En suma, este protocolo muestra una estrategia basada en la micela de la nanomedicina péptido robusto, uno mismo-montado aterosclerosis la proyección de imagen. MCP-1 PAMs son biocompatible, biodegradable y no tóxico como componentes de la micela se inspiraron en elementos endógenos al cuerpo. Más importante aún, MCP-1 PAM tienen Unión preferencial a monocitos, que aumenta proporcionalmente a la progresión de la placa, facilitando un enfoque no invasivo para diferenciar las etapas de las placas ateroscleróticas. Debido a la modularidad de esta plataforma, PAMs pueden incorporar terapias adicionales dirigidas a péptidos, imagen partes inorgánicas y ácidos nucleicos. Por lo tanto, teniendo en cuenta tales capacidades dinámicas de estas micelas multifuncionales, creemos que estas partículas tienen gran potencial para la traducción clínica de aterosclerosis y otras enfermedades.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores desean reconocer el apoyo financiero de la Universidad de California del sur, el corazón nacional, pulmón y sangre Institute (NHLBI), R00HL124279, Eli y Edythe amplio Premio a la innovación y el L.K. Whittier Fundación no-cáncer Premio investigación traslacional al EJC. Los autores agradecen el centro de microscopía electrónica y microanálisis, centro de excelencia en NanoBiophysics, centro de excelencia para la caracterización Molecular y traslacional Imaging Center en la Universidad de California meridional para asistencia en configuraciones instrumentales.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-ethanedithiol VWR E0032 for peptide synthesis
10 mL disposable serological pipets VWR 89130-898 for cell culture
15 mL centrifuge tubes, polypropylene VWR 89401-566 for various applications
2,5-dihydroxybenzoic acid, 99% Fisher Scientific AC165200050 for MALDI
25 mL disposable serological pipets VWR 89130-900 for cell culture
2-Mercaptoethanol, 50 mM ThermoFisher Scientific 31350010 for cell culture
5 mL disposable serological pipets VWR 89130-896 for cell culture
50 mL centrifuge tubes VWR 89039-658 for various applications
75 cm2 culture flask Fisher Scientific 13-680-65 for cell culture
75 mL reaction vessel Protein Technologies 3000005 for peptide synthesis
96-wells cell culture plate VWR 40101-346 for MTS assay
Acetonitrile, HPLC grade Fisher Scientific A998SK-4 for HPLC purification
Borosilicate glass, 1 dram VWR 66011-041 for PAM synthesis
Borosillicate glass pipet, Long tips VWR 14673-043 for various applications
Coverslip, 0.16-0.19 mm, 22 x 22 mm Fisher Scientific 12-542B for confocal microscopy
Cy5 amine Abcam ab146463 for peptide conjugation
Diethyl ether, ACS grade Fisher Scientific E138-1 for peptide precipitation
Disposable syringes, 20 mL Fisher Scientific 14-817-54 for HPLC purification
Double neubauer ruled hemocytometer VWR 63510-13 for cell counting
DSPE-PEG(2000) amine Avanti 880128P for peptide conjugation
DSPE-PEG(2000) maleimide Avanti 880126P for peptide conjugation
DSPE-PEG(2000)-NHS ester  Nanocs PG2-DSNS-10K for conjugation to Cy5
Dulbecco's modified eagle medium-high glucose Sigma Aldrich D5796-500ML for cell culture
Fetal bovine serum, qualified, heat inactivated ThermoFisher Scientific 10438026 for cell culture
Fmoc-L-Ala-OH /HBTU Protein Technologies PS3-H5-A for peptide synthesis
Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH /HBTU Protein Technologies PS3-H5-RBF for peptide synthesis
Fmoc-L-Asn(Trt)-OH /HBTU Protein Technologies PS3-H5-NT for peptide synthesis
Fmoc-L-Cys(Trt)-OH /HBTU Protein Technologies PS3-H5-CT for peptide synthesis
Fmoc-L-Gln(Trt)-OH /HBTU Protein Technologies PS3-H5-QT for peptide synthesis
Fmoc-L-Ile-OH /HBTU Protein Technologies PS3-H5-I for peptide synthesis
Fmoc-L-Leu-OH /HBTU Protein Technologies PS3-H5-L for peptide synthesis
Fmoc-L-Lys(Boc)-OH /HBTU Protein Technologies PS3-H5-KBC for peptide synthesis
Fmoc-L-Phe-OH /HBTU Protein Technologies PS3-H5-F for peptide synthesis
Fmoc-L-Ser(tBu)-OH /HBTU Protein Technologies PS3-H5-SB for peptide synthesis
Fmoc-L-Thr(tBu)-OH /HBTU Protein Technologies PS3-H5-TB for peptide synthesis
Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH /HBTU Protein Technologies PS3-H5-YB for peptide synthesis
Fmoc-L-Val-OH /HBTU Protein Technologies PS3-H5-V for peptide synthesis
Fmoc-Lys(Boc)-wang resin, 100-200 mesh Novabiochem 856013 for peptide synthesis
Formic acid, optima LC/MS grade Fisher Scientific A117-50 for HPLC purification
Glycerol VWR M152-1L for confocal microscopy
Hand tally counter Fisher Scientific S90189 for cell counting
Magnetic stir bars, egg-shaped VWR 58949-006 for peptide conjugation
Methanol, ACS certified Fisher Scientific A412-4 for PAM synthesis
MTS cell proliferation colorimetric assay kit VWR 10191-104 for MTS assay
N,N-Dimethylformamide, sequencing grade Fisher Scientific BP1160-4 for peptide synthesis
N-Methylmorpholine Protein Technologies S-1L-NMM for peptide synthesis
Paraformaldehyde Fisher Scientific AC416780250 for fixing cells
PBS, pH 7.4 ThermoFisher Scientific 10010049 for various applications
Penicillin/streptomycin, 10,000 U/mL ThermoFisher Scientific 15140122 for cell culture
Peptide synthesis vessel, 25 mL  Fisher Scientific CG186011 for peptide synthesis
Phosphotungstic acid  Fisher Scientific A248-25 for TEM
Piperidine Spectrum P1146-2.5LTGL for peptide synthesis
Plain glass microscope slide 75 x 25 mm Fisher Scientific 12-550-A3 for confocal microscopy
Reagent reservoirs, sterile  VWR 95128093 for cell culture
Self-closing tweezer TedPella 515 for TEM
TEM support film TedPella 01814F for TEM
Trifluoroacetic acid  Fisher Scientific BP618-500 for peptide cleavage and HPLC purification
Triisopropylsilane VWR TCT1533-5ml for peptide cleavage
Trypan blue solution, 0.4% ThermoFisher Scientific 15250061 for cell counting
Tweezer, general purpose-serrated VWR 231-SA-SE for confocal microscopy
WEHI-274.1 ATCC ATCC CRL-1679 murine monocyte
automated benchtop peptide synthesizer Protein Technologies PS3 Benchtop Peptide Synthesizer
α- cyano- 4- hydroxycinnamic acid, 99% Sigma Aldrich 476870-2G for MALDI

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References

  1. Mozaffarian, D., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), e38-e60 (2016).
  2. Falk, E. Pathogenesis of atherosclerosis. J. Am. Coll. Cardiol. 47 (8, Suppl. C), C7-C12 (2006).
  3. Rahmani, M., Cruz, R. P., Granville, D. J., McManus, B. M. Allograft Vasculopathy Versus Atherosclerosis. Circ. Res. 99 (8), 801-815 (2006).
  4. Luis, A. J. Atherosclerosis. Nature. 407 (6801), 233-241 (2000).
  5. Libby, P., Ridker, P. M., Hansson, G. K. Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis. Nature (London, U. K). 473 (7347), 317-325 (2011).
  6. Boring, L., Gosling, J., Cleary, M., Charo, I. F. Decreased lesion formation in CCR2-/- mice reveals a role for chemokines in the initiation of atherosclerosis. Nature (London). 394 (6696), 894-897 (1998).
  7. Szmitko, P. E., et al. New Markers of Inflammation and Endothelial Cell Activation. Circulation. 108 (16), 1917-1923 (2003).
  8. Deshmane, S. L., Kremlev, S., Amini, S., Sawaya, B. E. Monocyte Chemoattractant Protein-1 (MCP-1): An Overview. J. Interferon Cytokine Res. 29 (6), 313-326 (2009).
  9. Chung, E. J., et al. Monocyte-Targeting Supramolecular Micellar Assemblies: A Molecular Diagnostic Tool for Atherosclerosis. Adv. Healthcare Mater. 4 (3), 367-376 (2015).
  10. Chung, E. J. Targeting and therapeutic peptides in nanomedicine for atherosclerosis. Exp Biol Med (Maywood). 241 (9), 891-898 (2016).
  11. Sanz, J., Fayad, Z. A. Imaging of atherosclerotic cardiovascular disease. Nature (London, U. K.). 451 (7181), 953-957 (2008).
  12. Tarkin, J. M., et al. Imaging Atherosclerosis. Circ. Res. 118 (4), 750-769 (2016).
  13. Hennerici, M., Baezner, H., Daffertshofer, M. Ultrasound and arterial wall disease. Cerebrovasc Dis. 17 Suppl 1, 19-33 (2004).
  14. Nissen, S. E. Application of intravascular ultrasound to characterize coronary artery disease and assess the progression or regression of atherosclerosis. Am J Cardiol. 89 (4A), 24B-31B (2002).
  15. Khalil, M. M., Tremoleda, J. L., Bayomy, T. B., Gsell, W. Molecular SPECT Imaging: An Overview. Int J Mol Imaging. 2011, 796025 (2011).
  16. Lerakis, S., et al. Imaging of the vulnerable plaque: noninvasive and invasive techniques. Am J Med Sci. 336 (4), 342-348 (2008).
  17. Sun, Z. H., Rashmizal, H., Xu, L. Molecular imaging of plaques in coronary arteries with PET and SPECT. J Geriatr Cardiol. 11 (3), 259-273 (2014).
  18. Godin, B., et al. Emerging applications of nanomedicine for the diagnosis and treatment of cardiovascular diseases. Trends Pharmacol. Sci. 31 (5), 199-205 (2010).
  19. Branco de Barros, A. L., Tsourkas, A., Saboury, B., Cardoso, V. N., Alavi, A. Emerging role of radiolabeled nanoparticles as an effective diagnostic technique. EJNMMI Res. 2 (1), 31-39 (2012).
  20. Jayagopal, A., Linton, M. F., Fazio, S., Haselton, F. R. Insights into atherosclerosis using nanotechnology. Curr. Atheroscler. Rep. 12 (3), 209-215 (2010).
  21. Khodabandehlou, K., Masehi-Lano, J. J., Poon, C., Wang, J., Chung, E. J. Targeting cell adhesion molecules with nanoparticles using in vivo and flow-based in vitro models of atherosclerosis. Exp Biol Med (Maywood). 242 (8), 799-812 (2017).
  22. Trent, A., Marullo, R., Lin, B., Black, M., Tirrell, M. Structural properties of soluble peptide amphiphile micelles. Soft Matter. 7 (20), 9572-9582 (2011).
  23. Hartgerink, J. D., Beniash, E., Stupp, S. I. Peptide-amphiphile nanofibers: A versatile scaffold for the preparation of self-assembling materials. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (8), 5133-5138 (2002).
  24. Missirlis, D., et al. Effect of the Peptide Secondary Structure on the Peptide Amphiphile Supramolecular Structure and Interactions. Langmuir. 27 (10), 6163-6170 (2011).
  25. Zhong, L., Johnson, W. C. Environment affects amino acid preference for secondary structure. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89 (10), 4462-4465 (1992).
  26. Shimada, T., Lee, S., Bates, F. S., Hotta, A., Tirrell, M. Wormlike Micelle Formation in Peptide-Lipid Conjugates Driven by Secondary Structure Transformation of the Headgroups. J. Phys. Chem. B. 113 (42), 13711-13714 (2009).
  27. Missirlis, D., et al. Linker Chemistry Determines Secondary Structure of p5314-29 in Peptide Amphiphile Micelles. Bioconjugate Chem. 21 (3), 465-475 (2010).
  28. Elbert, D. L., Hubbell, J. A. Surface treatments of polymers for biocompatibility. Annu. Rev. Mater. Sci. 26, 365-394 (1996).
  29. Xue, Y., O'Mara, M. L., Surawski, P. P. T., Trau, M., Mark, A. E. Effect of Poly(ethylene glycol) (PEG) Spacers on the Conformational Properties of Small Peptides: A Molecular Dynamics Study. Langmuir. 27 (1), 296-303 (2011).
  30. Canalle, L. A., Loewik, D. W. P. M., van Hest, J. C. M. Polypeptide-polymer bioconjugates. Chem. Soc. Rev. 39 (1), 329-353 (2010).
  31. Hamley, I. W. PEG-Peptide Conjugates. Biomacromolecules. 15 (5), 1543-1559 (2014).
  32. Acar, H., et al. Self-assembling peptide-based building blocks in medical applications. Adv. Drug Delivery Rev. , (2016).
  33. Busseron, E., Ruff, Y., Moulin, E., Giuseppone, N. Supramolecular self-assemblies as functional nanomaterials. Nanoscale. 5 (16), 7098-7140 (2013).
  34. Barrett, J. C., et al. Modular Peptide Amphiphile Micelles Improving an Antibody-Mediated Immune Response to Group A Streptococcus. ACS Biomater. Sci. Eng. 3 (2), 144-152 (2017).
  35. Toughrai, S., et al. Reduction-Sensitive Amphiphilic Triblock Copolymers Self-Assemble Into Stimuli-Responsive Micelles for Drug Delivery. Macromol. Biosci. 15 (4), 481-489 (2015).
  36. Swirski, F. K., et al. Monocyte accumulation in mouse atherogenesis is progressive and proportional to extent of disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103 (27), 10340-10345 (2006).
  37. Kashiwagi, M., et al. Association of monocyte subsets with vulnerability characteristics of coronary plaques as assessed by 64-slice multidetector computed tomography in patients with stable angina pectoris. Atherosclerosis (Amsterdam, Neth). 212 (1), 171-176 (2010).
  38. Chung, E. J., Tirrell, M. Recent Advances in Targeted, Self-Assembling Nanoparticles to Address Vascular Damage Due to Atherosclerosis. Adv. Healthcare Mater. 4 (16), 2408-2422 (2015).
  39. Cassetta, L., Pollard, J. W. Cancer immunosurveillance: role of patrolling monocytes. Cell Res. 26 (1), 3-4 (2016).
  40. Williams, C. B., Yeh, E. S., Soloff, A. C. Tumor-associated macrophages: unwitting accomplices in breast cancer malignancy. NPJ Breast Cancer. 2, (2016).
  41. Richards, D. M., Hettinger, J., Feuerer, M. Monocytes and Macrophages in Cancer: Development and Functions. Cancer Microenviron. 6 (2), 179-191 (2013).
  42. Schick, M. J. Effect of temperature on the critical micelle concentration of nonionic detergents. Thermodynamics of micelle formation. J. Phys. Chem. 67 (9), 1796-1799 (1963).
  43. Marullo, R., Kastantin, M., Drews, L. B., Tirrell, M. Peptide contour length determines equilibrium secondary structure in protein-analogous micelles. Biopolymers. 99 (9), 573-581 (2013).
  44. Hilbich, C., Kisters-Woike, B., Reed, J., Masters, C. L., Beyreuther, K. Substitutions of hydrophobic amino acids reduce the amyloidogenicity of Alzheimer's disease βA4 peptides. J. Mol. Biol. 228 (2), 460-473 (1992).
  45. Trevino, S. R., Scholtz, J. M., Pace, C. N. Amino Acid Contribution to Protein Solubility: Asp, Glu, and Ser Contribute more Favorably than the other Hydrophilic Amino Acids in RNase Sa. J. Mol. Biol. 366 (2), 449-460 (2007).
  46. Kim, S. W., Shi, Y. Z., Kim, J. Y., Park, K. N., Cheng, J. X. Overcoming the barriers in micellar drug delivery: Loading efficiency, in vivo stability, and micelle-cell interaction. Expert Opin Drug Delivery. 7 (1), 49-62 (2010).
  47. Rangel-Yagui, C. O., Pessoa, A. Jr, Tavares, L. C. Micellar solubilization of drugs. J. Pharm. Pharm. Sci. 8 (2), 147-163 (2005).
  48. Batrakova, E., et al. Fundamental relationships between the composition of pluronic block copolymers and their hypersensitization effect in MDR cancer cells. Pharm. Res. 16 (9), 1373-1379 (1999).
  49. Chen, L. J., Lin, S. Y., Huang, C. C. Effect of Hydrophobic Chain Length of Surfactants on Enthalpy-Entropy Compensation of Micellization. J. Phys. Chem. B. 102 (22), 4350-4356 (1998).

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Bioingeniería número 129 monocito péptido micelas ateroesclerosis nanopartículas proyección de imagen autoensamblaje diagnóstico
Síntesis de monocito-targeting Peptide Amphiphile micelas para la proyección de imagen de la aterosclerosis
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Poon, C., Sarkar, M., Chung, E. J.… More

Poon, C., Sarkar, M., Chung, E. J. Synthesis of Monocyte-targeting Peptide Amphiphile Micelles for Imaging of Atherosclerosis. J. Vis. Exp. (129), e56625, doi:10.3791/56625 (2017).

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