Summary
Detta dokument presenterar en metod som omfattar syntes och karakterisering av monocyt-targeting peptid amphiphile miceller och motsvarande analyser för att testa för biokompatibilitet och micelle förmåga att binda till monocyter.
Abstract
Åderförkalkning är en stor bidragsgivare till hjärt-kärlsjukdom, den ledande dödsorsaken i världen, vilken fordran 17,3 miljoner liv årligen. Åderförkalkning är också den vanligaste orsaken till plötslig död och hjärtinfarkt, initieras av instabila plack som brista och Täpp blodkärl utan varning. Aktuella imaging villkoren inte kan skilja mellan stabila och instabila plack som brista. Peptid amphiphiles miceller (PAMs) kan övervinna denna nackdel som de kan ändras med olika inriktning beståndsdelarna som binder specifikt till sjuk vävnad. Monocyter har visat sig vara tidiga markörer för ateroskleros, medan stor ackumulation av monocyter är associerad med plack som är benägna att brista. Nanopartiklar som kan rikta monocyter kan därför användas för att diskriminera olika stadier av åderförkalkning. Därför här, beskriver vi ett protokoll för beredning av monocyt-targeting PAMs (monocyt korrektiv protein-1 (MCP-1) PAMs). MCP-1 PAMs monteras själv genom syntes under milda förhållanden för formuläret nanopartiklar 15 nm i diameter med nära neutralt ytladdning. In vitro, PAMs befanns vara biokompatibelt och hade en hög affinitet för monocyter. De metoder som beskrivs häri visar löfte för ett brett spektrum av applikationer i åderförkalkning samt andra inflammatoriska sjukdomar.
Introduction
Hjärt-och kärlsjukdomar förblir vara de ledande dödsorsakerna globalt med cirka 17,3 miljoner dödsfall i världen1. Hjärt-och kärlsjukdomar tillhandahålls av åderförkalkning, ett tillstånd där plack bygga upp i artärerna, därmed hämmande blod och syre flöde till cellerna i kroppen2,3. Utvecklingen av åderförkalkning innebär förtjockning och åderförkalkning genom en inflammatorisk reaktion, oregelbundna lipidmetabolismen och plack byggs upp, vilket leder till plack bristning och hjärtinfarkt4,5. Endotelceller uttrycker cytokiner och vidhäftning molekylar, som inkluderar MCP-1 som binder till C-C chemokine receptorn (CCR2) finns på ytan av monocyter6,7,8. Oxiderat kolesterol konverterar monocyter till makrofager under den tidiga fasen av plack, vilket förstärker den inflammatoriska reaktionen i regionen och leder till vävnadsskada och bildandet av instabila eller sårbara plack9, 10.
Traditionellt, utvärderas åderförkalkning genom att bedöma luminala stenos av anatomiska imaging använder angiografi eller ultraljud11,12. Dessa metoder kan dock endast avgöra allvarlig förträngning av kärlväggen och inte i tidigt skede av åderförkalkning, eftersom inledande plack tillväxt orsakar arteriell remodeling att upprätthålla artär storlek och blod flödet klassar12,13, 14. Därför underrepresent angiograms åderförkalkning prevalens. Dessutom beräknas noninvasiv avbildningstekniker såsom single photon emission tomography, positron emissions tomografi och magnetisk resonanstomografi har nyligen använts för att karakterisera plack morfologi som de kan ge ursprungliga detaljer och karakterisering av plack. Men dessa modaliteter begränsas ofta av bristen på lyhördhet, rumslig upplösning, eller kräva användning av joniserande strålning, att göra imaging plack progression i olika skeden mycket mer utmanande15,16, 17. En tänkbar leveranssystem som specifikt identifierar plack i olika skeden av åderförkalkning är fortfarande utvecklas.
Nanopartiklar har visat sig vara en framväxande plattform för i vivo plack inriktning och diagnostik18,19,20,21. PAMs är särskilt fördelaktig på grund av deras kemiska mångfald och förmåga att tillgodose en mängd olika beståndsdelarna, kompositioner, storlekar, former och ytan funktionalisering22. Peptid amphiphiles (PAs) består av en hydrofil, peptid ”headgroup” bifogas en hydrofoba svans, som vanligtvis är lipider; Denna amfifila struktur ger själv montering funktioner och möjliggör en multivalenta visning av peptider på ytan av den partikel22,23,24. Den peptid headgroups kan påverka partikel formen genom vikning och vätebindningen mellan peptider25. Peptider som vik genom β-ark interaktion har visat att bilda långsträckt miceller, medan α-spiralformade bekräftelse kan bilda båda sfäriska och långsträckt miceller22,23,24, 25,26,27. Polyetylenglykol (PEG) linkers som skydda surface laddningen av peptiden kan placeras mellan den hydrofila peptiden och hydrofoba svansen på PAMs, förbättra tillgången till nanopartikelportföljen i systemcirkulationen28, 29 , 30 , 31. PAMs är också fördelaktigt eftersom de är biokompatibelt och har visat sig ha ett brett spektrum av applikationer32,33. Bevattnasolubilityen av miceller erbjuder en fördel över andra nanopartikel-baserat system såsom vissa polymera nanopartiklar som inte är lösligt i vatten och måste avbrytas i solubilizers för injektionsvätskor34. Dessutom gör möjligheten att skapa PAMs som isär som svar på en specifik stimuli PAMs en attraktiv kandidat för kontrollerade intracellulära drogen leverans35.
Genom att binda till receptorn CCR2 och ansamlas i aortabågen, utvecklades tidigare PAMs för monocyt inriktning för att övervaka olika stadier av aterosklerotiska lesioner i aorta9. I ApoE- / - möss, monocyt ackumulation ökar proportionellt till plack progression36. Dessutom konstaterades det att patienter med bristning-benägen, sent stadium plack innehåller högre mängder av monocyter37. Ändring av PAMs att införliva MCP-1 är därför användbar eftersom den ger större inriktning specificitet och differentiering mellan tidig - och sent stadium aterosklerotiska lesioner. Dessa proof-of-concept studier också bekräftat att PAMs är tillräckligt säkra för att användas pre-clinically och rensas renalt38. Monocyter och inflammation är kännetecknande för andra sjukdomar, har MCP-1 PAMs potential att användas för terapeutiska och diagnostiska program i andra sjukdomar utöver åderförkalkning8,39,40 , 41.
Häri, rapporterar vi tillverkning av skalbara och själv monterade MCP-1 PAMs som visat partikeln optimal storlek, ytladdning och selektiv inriktning att monocyter för förbättrad bildprogram i åderförkalkning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Obs: Läs SDB för reagenser och följ alla kemiska säkerhetsåtgärder som krävs enligt lokala institution.
1. beredning av MCP-1 PAMs
-
Beredning av MCP-1 peptid
- Väg upp 0,25 mmol Fmoc-L-Lys (Boc)-Wang i ett reaktionskärl (RV). Skölj sidan av RV med 5 mL dimethylforamide (DMF) i kemiska dragskåp.
- Ladda RV på en automatiserad bänkmonterade peptid synthesizer. Belastning som färdigförpackade aminosyra injektionsflaskor, N '- CYNFTINRKISVQRLASYRRITSS - C', från C till N-terminalen. Inkludera en tom flaska i slutet för slutliga deprotection steg.
Obs: En äggröra peptid med sekvens, N '- CNNSIIRSKQVLRSTRYFRSATYK - C', kan också syntetiseras använder samma protokoll. - När syntes är klar, överför peptiderna på harts från RV till scintillation injektionsflaskan med 2-3 mL metanol förrän alla hartser överförs. När kådan har sjunkit till botten, ta bort supernatanten metanol och avdunsta de återstående tills de är torra. Vakuum torra för en ytterligare 2 h eller över natten i rumstemperatur.
- Gör 12 mL klyvning lösning som innehåller trifluoracetic syra (TFA):ethanedithiol:water:triisopropylsilane 94:2.5:2.5:1 vol % i kemiska dragskåp. Snurra den klyvning lösningen att se till att det är jämnt blandat.
Varning: Eftersom triisopropylsilane och ethanedithiol är luft-känslig, argon rensa lager injektionsflaskor med triisopropylsilane och ethanedithiol för 1 min före sätta dem tillbaka. - Placera syntes fartyget (SV) på en arm shaker av fastspänning nära botten hälften av SV. Överföra peptid-harts till SV med 2 mL klyvning lösning förrän alla peptid-hartser överförs.
- Tvätta sidorna av SV med 3 mL klyvning lösning. Stäng locket på SV och skaka på 300 svängningar/min för 4 h.
- Väg upp en tom 50 mL centrifugrör. Spela in massan.
- Efter 4 h, dränera klyvs peptid lösningen från SV i 50 mL centrifugrör. Skölj SV flera gånger med återstående klyvning lösningen.
- Indunsta klyvs peptid lösning med kväve tills det är mindre än 4 mL kvar i centrifugröret.
- Lägga till 36 mL iskallt eter peptid-avspjälkar lösningen.
- Vortex lösningen tills den är helt vit eller gul. Centrifugera vid 3 000 x g i 5 minuter vid 4 ° C, och Dekantera supernatanten.
- Tillsätt 40 mL iskallt eter till röret. Vortex och Sonikera igen. Upprepa processen centrifugering. Dekantera supernatanten.
- Torka den rå PA pelleten med kväve gas purging tills etern är synbart avdunstat.
- Tillsätt 20 mL dubbeldestillerat vatten, vortex, och Sonikera tills peptiden är helt upplöst i lösning.
- Frysa lösningen och lyophilize tills den är torr.
- När peptiden är torkat, väga ut massa centrifugröret innehållande rå peptiden. Lös upp rå peptiden i 5 mg/mL vatten.
- Lös upp 25 mg av rå MCP-1 peptid i 5 mL dubbeldestillerat vatten till en koncentration på 5 mg/ml. Rena råa MCP-1 peptiden genom högpresterande vätskekromatografi (HPLC) med 0.1% transfettsyror i vatten (lösningsmedel A) och 0,1% transfettsyror i acetonitril (lösningsmedel B) som mobila faser på en C8 kolonn med omvänd fas. Injicera 5 mL av peptiden i HPLC.
Obs: Den första mobila fasen bestod av 100% lösningsmedel A med en flödeshastighet av 9,0 mL/min. minska lösningsmedel A långsamt till 30% i 27 minuters och håll i denna komposition under 3 min. avkastning övertoningen till 100% lösningsmedel en över 3 min och håll på denna komposition för 1 min att ge en total körning av 34 min. hålla kolumn temperaturen vid 55 ° C. Använda positiv Jon källäge för analys. Myrsyra kan användas i stället för TFA, om TFA är för surt för i HPLC-kolonnen. Det rekommenderas att organiska lösningsmedel sammansättningen ramp hastigheten inte bör överstiga 2%/min för bättre separation. - Analysera varje fraktion med matrix-assisted laser desorption/jonisering (MALDI) masspektrometri för den förvänta produkt m/z på 2 890.
Obs: Lös α-cyano-4-hydroxycinnamic acid vid 1 mg/mL acetonitril/vatten (50: 50 vol.%) som modellösning. Spot 0,75 µL matrix lösning på MALDI plattan, följt av 0,75 µL av varje fraktion. Genomföra analysen med en positiv reflekterande Jon läge på en massa räckvidd på 500-5000 Da. - Kombinera produkt fraktioner, blåsa av acetonitril, frysa, och lyophilize renat peptider tills de är torra.
-
Beredning av MCP-1 PA
- Förbereda en 1.1 molar överskott av 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] DSPE-PEG (2000)-maleimide för peptid i separata scintillation injektionsflaskor. Lös upp båda föreningarna i dubbeldestillerat vatten till ~ 15 mg/mL. Sonikera i 15 min eller tills båda lösningarna är helt klart.
Obs: DSPE-PEG (2000)-Cy5 syntetiseras använder samma protokoll med DSPE-PEG (2000)-Amin och N-hydroxysuccinimide (NHS) ester-functionalized Cy5, utom steg 1.2.3, där lösningen pH justeras till 8,5. - Lägga till DSPE-PEG (2000)-maleimide lösning till peptid lösningen. Vortex och Sonikera.
- Tillsätt 1 M NaOH droppvis (1 µL) tills pH-värdet i lösningen är 7.
- Kväve laxermedel lösning för 5 min. rör om lösningen över natten.
- Frysa lösningen och lyophilize tills den är torr.
- När den råa produkten torkas, lös fast i 5 mg/mL vatten.
- Rena med HPLC som beskrivs ovan.
Obs: Okonjugerat peptid och DSPE-PEG(2000) bör eluera mellan 15-30% ekologisk koncentration (volymprocent), medan DSPE-PEG (2000)-MCP-1 konjugat bör eluera mellan 40-50% ekologisk koncentration. - Analysera varje fraktion med MALDI masspektrometri för den motsvarande m/z. DSPE-PEG (2000)-MCP-1 bör ha en bred m/z-topp 5 760.
Obs: 2,5-dihydroxybenzoic syra används bäst som matrisen för DSPE-PEG (2000)-MCP-1 med MALDI.
- Förbereda en 1.1 molar överskott av 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] DSPE-PEG (2000)-maleimide för peptid i separata scintillation injektionsflaskor. Lös upp båda föreningarna i dubbeldestillerat vatten till ~ 15 mg/mL. Sonikera i 15 min eller tills båda lösningarna är helt klart.
-
Montering av MCP-1 PAMs
- Lös 1,75 mg MCP-1 PAs med 3 mL metanol i en injektionsflaska av 1-dram. Sonikera tills MCP-1 PA är helt upplöst.
Obs: Cy5 amphiphiles kan införlivas i 10:90 MCP-1 PA för bildprogram molar förhållandet. - Avdunsta metanol under kväve i en cirkelrörelse samtidigt sköljer den återstående metanolen av sidan av injektionsflaskan tills en enhetlig film bildas på botten av injektionsflaskan. Vakuum-torr filmen över natten.
- Återfukta filmen med 3 mL vatten eller fosfat buffert saltlösning (PBS) för att göra en 100 µM lösning av MCP-1 PAMs. Försiktigt vortex och Sonikera lösningen tills klart. Inkubera vid 80 ° C i 30 min.
Obs: Den förhöjda temperaturen har visat sig påskynda den självmontering process och tillåter komponenten peptid att bilda det mest stabila sekundärt strukturerar, samtidigt sänka den kritiska micelle koncentration (CMC)42,43. - Cool den resulterande spridningen till rumstemperatur.
- Lös 1,75 mg MCP-1 PAs med 3 mL metanol i en injektionsflaska av 1-dram. Sonikera tills MCP-1 PA är helt upplöst.
2. karakterisering av MCP-1 PAMs
-
Dynamiska ljusspridning (DLS) och zeta potential
- Plats 100 µM MCP-1 PAM eller kodade PAM i en kyvetten enligt anvisningarna från DLS eller zeta potential instrumentet.
Obs: DLS och zeta potential kyvetter kan vara olika utifrån instrumentets anvisningar. - Temperera instrumentet till rumstemperatur. Mät storleken och ytladdning av PAM.
- Plats 100 µM MCP-1 PAM eller kodade PAM i en kyvetten enligt anvisningarna från DLS eller zeta potential instrumentet.
-
Transmissionselektronmikroskopi (TEM)
- Tillsätt 7 µL 50 µm MCP-1 PAM eller kodade PAM på ett TEM rutnät avskaffas inom en självstängande pincett för 5 min. Wick bort droplet-programmet med en delikat uppgift torka.
- Tillsätt 7 µL av vatten för att tvätta rutnätet. Wick bort droplet-programmet.
- Tillsätt 7 µL av 1 wt % phosphotungstic syra för 2 min. Wick bort droplet-programmet. Upprepa steg 2.2.2.
- Torka rutnätet TEM före TEM analys.
-
Cirkulärdichroism (CD) spektroskopi
- Slå på kvävgasen för 5-10 min före användning av instrumentet.
- Placera 300 µL av Tom (vatten eller PBS) i kyvetten.
- Mäta spectra på 190-265 nm, 0,2 mm väg-längd med en 1 s integration tid, och en 1 nm bandbredd i rumstemperatur. Samla 3 replikat.
- Mått 100 µM MCP-1 peptid, MCP-1 PAM, äggröra peptid och äggröra PAM på samma villkor som beskrivs i steg 2.3.3. Subtrahera från tomrummet.
- Passa data med hjälp av en linjär interpolation av polylysine grund spektra.
- Stäng av instrumentet. Vänta 10 min innan du stänger av kvävet.
3. in Vitro -analys av MCP-1 PAMs
-
In vitro biokompatibilitet
- Kultur och expandera WEHI 274,1 murina monocyter i Dulbeccos modifierade Eagle Medium kompletteras med 10% fetalt bovint serum (FBS), 1% penicillin-streptomycin och 0,05 mM 2-merkaptoetanol i 37 ° C under 5% CO2 till passage 5.
Obs: WEHI 274,1 är fjädring celler. När odling, bör media fyllas på varje 2-3 dagar. - Pipettera monocyter i media i ett sterilt 50 mL centrifugrör. Centrifugera vid 300 x g under 5 minuter vid 4 ° C.
- Sug ut gamla media och blandas i 10 mL färsk media i centrifugröret. Blanda långsamt tills cellerna är jämnt fördelade i media. Räkna cellerna med hjälp av trypan blå färgning och en hemocytometer.
- Späd cellerna så att det finns 4 000 monocyter per 90 µL av media per brunn. Tillsätt 90 µL av celler i brunnar i en plattan med 96 brunnar. Inkubera under 24 h.
Obs: Undvik att använda brunnarna på yttre kanten av plattan för att undvika skillnader i avdunstning och termiska förändringar i plattan. Fyll yttre brunnarna med 100 µL PBS. - Lös upp 0,15 µmol av MCP-1 peptid, MCP-1 PAM, kodade peptid eller äggröra-PAM i 150 µL PBS i separat, steriliserad mikrocentrifugrör. Utföra seriell utspädning för att göra 65 µL av 1, 10 och 100 µM av varje prov.
- Lägg till 10 µL PBS för varje koncentration i brunnar som innehåller WEHI 274,1 (total volym: 100 µL per Tja, 6 rader, 96 totalt brunnarna). Inkubera i 72 h.
- Tillsätt 10 µL (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) (MTS) i varje brunn. Inkubera i 1 h.
- Analysera absorbansen med hjälp av en tallrik-läsare på 490 nm eller utifrån tillverkarens anvisningar.
- Kultur och expandera WEHI 274,1 murina monocyter i Dulbeccos modifierade Eagle Medium kompletteras med 10% fetalt bovint serum (FBS), 1% penicillin-streptomycin och 0,05 mM 2-merkaptoetanol i 37 ° C under 5% CO2 till passage 5.
-
In vitro micelle bindande
- Utsäde 500.000 monocyter i varje brunn 6-well platta i 2 mL av media som innehåller 100 µM Cy5-märkt MCP-1 PAM (10:90 molar förhållandet av DSPE-PEG (2000)-Cy5 och MCP-1 PA). Inkubera i 1 h.
- Samla WEHI 274,1 genom centrifugering vid 300 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Aspirera media.
- Omsuspendera och tvätta cellerna i 2 mL PBS. Centrifugera vid 300 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Aspirera PBS. Upprepa tvättprocessen med 2 mL PBS. Aspirera PBS.
- Tillsätt 2 mL kallt 4% PARAFORMALDEHYD fixar cellerna. Odla i rumstemperatur i 10 min.
- Pipettera fast cellerna på en steril täckglas inom brunnar i en 6-väl-plattan. Centrifugera vid 400 x g i 5 min.
- Ta bort PARAFORMALDEHYD. Tvätta och skölj med 2 mL PBS en gång. Blandas med 1 mL PB
Obs: När sköljning, inte störa cellerna på täckglaset. - Lägg 10 µL av 90% glycerol i PBS på ett objektglas. Använd en nål och pincett för att plocka upp täckglaset. Torr i utkanten av täckglaset. Placera försiktigt täckglaset på ett objektglas med framsidan nedåt.
- Varsamt försegla kanten på täckglaset med genomskinligt nagellack. Placera i kylskåpet tills den för avbildning.
- Använda en confocal laser skanning Mikroskop (CLSM) installerat med lasrar för Cy5 på λexcitation = 650 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Beredning av MCP-1 PAM
CCR2-bindande motivet (rester 13-35) av MCP-1 protein [YNFTNRKISVQRLASYRRITSSK] eller kodade peptid [YNSLVFRIRNSTQRKYRASIST] ändrades genom att lägga till en cysteinrest på N-terminalen. MCP-1 peptiden var syntetiseras av en Fmoc-medierad fasta fasen metod med en automatiserad peptid synthesizer. Den råa peptiden renades genom HPLC med omvänd fas på en C8 kolumn vid 50 ° C med 0,1% transfettsyror i acetonitril/vatten blandningar och kännetecknas av MALDI masspektrometri (figur 1). Cystein-innehållande peptiden var konjugerat till DSPE-PEG2000-maleimide ge DSPE-PEG (2000)-peptid konjugat via en thioether koppling. Efter 24 h i rumstemperatur renades rå produkten genom HPLC (figur 2). DSPE-PEG (2000)-Cy5 syntetiserades använder en NHS ester reaktion. Monocyt-targeting PAMs tillsammans med DSPE-PEG monterad (2000)-MCP-1 och DSPE-PEG (2000)-Cy5 var fabricerade genom upplösning i metanol som sedan var avdunstat av N2, och den resulterande filmen var torkat under vakuum över natten och själv monterade i vatten eller PBS genom de hydrofoba interaktioner ”svans grupper” att bilda MCP-1 PAMs.
Karakterisering av MCP-1 PAM
DLS data och TEM bilder av monocyt-targeting PAMs visade väl spridd, sfäriska nanopartiklar av 15,3 ± 2,0 nm i diameter (diagram 3 och tabell 1). Både MCP-1 PAMs och kodade PAMs visade en svag positiv zeta potential av 12,1 ± 3.1 mV och 13,7 ± 1,9 mV, respektive (tabell 1). CD visade att införlivandet av MCP-1 peptiden inom micelle förbättrade det sekundära strukturerar (tabell 2, MCP-1 PAMs: 46,2 ± 0,9% β-ark, 53,1 ± 1,4% slumpmässig spole och gratis MCP1: 34,2 ± 3,5% β-blad, 65,8 ± 3,5% slumpmässig spole).
In Vitro Analys av MCP-1 PAM
In vitro biokompatibilitet och monocyt bindningen av MCP-1 PAMs observerades av konfokalmikroskopi. Mus monocyter inkuberades med ökande koncentrationer av MCP-1, MCP-1 PAM, kodade peptid och kodade PAM för 72 h och cellerna befanns vara livskraftig och biokompatibla upp till 100 µM (figur 4). Dessutom visade konfokalmikroskopi specifik bindning av monocyter till MCP-1 PAMs jämfört med kodade PAMs (figur 5).
Figur 1 : HPLC kromatogrammet 220 nm (våglängd av peptidbindningar) och 254 nm (tyrosin våglängd) av MCP-1 peptid (A) och kodade peptid (B), (Boxed topp vid 7,4 min). MALDI-TOF masspektrum MCP-1 peptid (C) och kodade peptid (D) på en räckvidd på 500-5000 Da visar toppen för [M + H]+ vid m/z 2,888 (förväntade 2 890). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: HPLC kromatogrammet 220 nm (våglängd av peptidbindningar) och 254 nm (tyrosin våglängd) DSPE-PEG (2000)-MCP-1 (A) och DSPE-PEG (2000)-kodade (B). (Boxed topp vid 16,9 min). (C) MALDI-TOF massa spektrum av DSPE-PEG (2000)-MCP-1 på en räckvidd på 1 000-10 000 Da visar topparna för [M + H]+ på m/z 2,888 (förväntade 2 890) för MCP-1 och m/z 5,758 (beräknade 5 760) för DSPE-PEG (2000)-MCP-1. (D) MALDI-TOF massa spektrum av DSPE-PEG (2000)-äggröra på en räckvidd på 1 000-10 000 Da visar topparna för [M + H]+ på m/z 2 887 (förväntade 2 890) för kodade peptid och m/z 5 761 (beräknade 5 760) för DSPE-PEG-kodade. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : TEM bilder av MCP-1 PAM (A) och kodade PAM (B). Skalstapeln = 100 nm. Nummer-genomsnittliga storlek distribution av MCP-1 PAM (C) och kodade PAM via DLS (D). Data är medelvärde ± S.D. (n = 3). (E) CD analys av MCP-1 och kodade peptider och PAMs (n = 3). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : In vitro livskraft WEHI 274,1 murina monocyter efter 72 h exponering för MCP-1 peptid, MCP-1 PAM, kodade peptid, och kodade PAM. Data är medelvärde ± S.D. (n = 6). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: CLSM bilder av MCP-1 PAM (A) och kodade PAM (B) införlivas med 10 mol % Cy5 PA (röd) inkuberas med WEHI 274,1 för 1 h. skalstapeln = 20 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
| PAMs | Nummer-Ave diameter (nm) | PDI | Zeta Potential (mV) |
| MCP-1 | 15,3 ± 2,0 | 0.119 ± 0,006 | 12.1 ± 3.1 |
| Äggröra | 16,9 ± 1,4 | 0.232 ± 0,019 | 13.7 ± 1,9 |
| Mätt i PBS-bufferten. Uppgifter uttrycks som menar ± SD. | |||
Tabell 1: Storlek, polydispertion och zeta potential PAMs.
| a-Helix (%) | b-ark (%) | Slumpmässig spole (%) | |
| MCP-1 peptid | 0,0 ± 0,0 | 36,2 ± 2,2 | 63,8 ± 1,8 |
| MCP-1 PAM | 0,7 ± 0,6 | 46,2 ± 0,9 | 53,1 ± 1,4 |
| Kodade peptid | 0,0 ± 0,0 | 43,7 ± 2,1 | 56,3 ± 3,5 |
| Kodade PAM | 0,0 ± 0,0 | 60,7 ± 0,2 | 39,3 ± 0,2 |
Tabell 2: Sekundärt strukturera sammansättningen av peptider och PAMs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MCP-1 PAMs är en lovande molekylär imaging plattform, bestående av en hydrofil inriktning peptid och hydrofoba svans som driver själv monterade beskaffenhet nanopartikelportföljen. Detta monocyt-inriktning micelle kan framställas genom enkel syntes och reningssteg för MCP-1 peptid och DSPE-PEG (2000)-MCP-1. PAMs har många positiva egenskaper för i vivo molekylär imaging som deras självmontering under milda förhållanden, inneboende biologisk nedbrytbarhet och strukturella och kemiska mångfald möjliggör införlivandet av andra imaging beståndsdelarna eller inriktning peptider för att selektivt leverera till en specifik plats av intresse. Deras partikelstorlek, form och sammansättning kan stämmas av ändra peptid, hydrofoba svans eller micelle koncentration, att tillåta optimala kemiska och fysikaliska egenskaper för en mängd applikationer22,33.
Några begränsningar i detta protokoll bör nämnas. Först, eftersom PAMs drivs av hydrofoba interaktioner, är det nödvändigt att konstruera riktade peptider som är hydrofil, vilket innebär att den inriktning biexponentiellt presenteras på ytan av micelle. Om sekvensen peptid är hydrofoba, ett tillägg av en eller två hydrofil aminosyror på C terminus kan rymmas, men tillägg av aminosyror kan påverka peptid sekundära struktur inom micelle, därmed ändrar egenskaper för den peptid inom dess infödda statligt i den protein44,45. Andra vid låga koncentrationer har PAMs dålig stabilitet i vattenlösning miljöer eftersom de är starkt beroende av CMC, den lägsta koncentration som behövs för PAs att bilda en micellar struktur46. Nedanför CMC, micelle Disassemblerar till enskilda PA monomerer och begränsar micelle för att fungera som en bärare och lasta en drog på en specifik plats47. För att lindra denna nackdel, kan CMC minskas genom att öka hydrofoba svans48,49kedja längd. Slutligen, den långsiktiga lagringen av PAMs i lösning rekommenderas inte eftersom PA sekundärt strukturera kan förändras med tiden, vilket påverkar den micellar struktur och stabilitet, samt effektiviteten i liganden bindande26.
Sammanfattningsvis visar detta protokoll en robust, själv monterade peptid micelle-baserade nanomedicin strategi för imaging åderförkalkning. MCP-1 PAMs är biokompatibla, biologiskt nedbrytbara och giftfritt som komponenter i micelle är inspirerade från element endogena till kroppen. Viktigare, har MCP-1 PAMs förmånliga bindning till monocyter, vilket ökar proportionellt till plack progression, främjande av en icke-invasiv strategi att differentiera stadier av aterosklerotiska plack. Tack vare Modulariteten av denna plattform, kan PAMs införliva therapeutics, ytterligare riktade peptider, bild-beståndsdelarna och nukleinsyror. Därför tror ges sådana dynamiska funktionerna i dessa multifunktionella miceller, vi att dessa partiklar hålla stort löfte för kliniska översättning i åderförkalkning och andra sjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill erkänna det finansiella stödet från University of Southern California, nationella hjärtat, Lung, och blod Institute (NHLBI), R00HL124279, Eli och Edythe bred Innovation Award och Larsson Whittier stiftelsen icke-Cancer Translational Research Award ges till EJC. Författarna tackar centrum för elektron mikroskopi och mikroanalys, Center of Excellence i NanoBiophysics, Center of Excellence för molekylär karaktärisering och Translational Imaging Center vid University of Southern California för bistånd i instrumental uppställningar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-ethanedithiol | VWR | E0032 | for peptide synthesis |
| 10 mL disposable serological pipets | VWR | 89130-898 | for cell culture |
| 15 mL centrifuge tubes, polypropylene | VWR | 89401-566 | for various applications |
| 2,5-dihydroxybenzoic acid, 99% | Fisher Scientific | AC165200050 | for MALDI |
| 25 mL disposable serological pipets | VWR | 89130-900 | for cell culture |
| 2-Mercaptoethanol, 50 mM | ThermoFisher Scientific | 31350010 | for cell culture |
| 5 mL disposable serological pipets | VWR | 89130-896 | for cell culture |
| 50 mL centrifuge tubes | VWR | 89039-658 | for various applications |
| 75 cm2 culture flask | Fisher Scientific | 13-680-65 | for cell culture |
| 75 mL reaction vessel | Protein Technologies | 3000005 | for peptide synthesis |
| 96-wells cell culture plate | VWR | 40101-346 | for MTS assay |
| Acetonitrile, HPLC grade | Fisher Scientific | A998SK-4 | for HPLC purification |
| Borosilicate glass, 1 dram | VWR | 66011-041 | for PAM synthesis |
| Borosillicate glass pipet, Long tips | VWR | 14673-043 | for various applications |
| Coverslip, 0.16-0.19 mm, 22 x 22 mm | Fisher Scientific | 12-542B | for confocal microscopy |
| Cy5 amine | Abcam | ab146463 | for peptide conjugation |
| Diethyl ether, ACS grade | Fisher Scientific | E138-1 | for peptide precipitation |
| Disposable syringes, 20 mL | Fisher Scientific | 14-817-54 | for HPLC purification |
| Double neubauer ruled hemocytometer | VWR | 63510-13 | for cell counting |
| DSPE-PEG(2000) amine | Avanti | 880128P | for peptide conjugation |
| DSPE-PEG(2000) maleimide | Avanti | 880126P | for peptide conjugation |
| DSPE-PEG(2000)-NHS ester | Nanocs | PG2-DSNS-10K | for conjugation to Cy5 |
| Dulbecco's modified eagle medium-high glucose | Sigma Aldrich | D5796-500ML | for cell culture |
| Fetal bovine serum, qualified, heat inactivated | ThermoFisher Scientific | 10438026 | for cell culture |
| Fmoc-L-Ala-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-A | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-RBF | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Asn(Trt)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-NT | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Cys(Trt)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-CT | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Gln(Trt)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-QT | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Ile-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-I | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Leu-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-L | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Lys(Boc)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-KBC | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Phe-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-F | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Ser(tBu)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-SB | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Thr(tBu)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-TB | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-YB | for peptide synthesis |
| Fmoc-L-Val-OH /HBTU | Protein Technologies | PS3-H5-V | for peptide synthesis |
| Fmoc-Lys(Boc)-wang resin, 100-200 mesh | Novabiochem | 856013 | for peptide synthesis |
| Formic acid, optima LC/MS grade | Fisher Scientific | A117-50 | for HPLC purification |
| Glycerol | VWR | M152-1L | for confocal microscopy |
| Hand tally counter | Fisher Scientific | S90189 | for cell counting |
| Magnetic stir bars, egg-shaped | VWR | 58949-006 | for peptide conjugation |
| Methanol, ACS certified | Fisher Scientific | A412-4 | for PAM synthesis |
| MTS cell proliferation colorimetric assay kit | VWR | 10191-104 | for MTS assay |
| N,N-Dimethylformamide, sequencing grade | Fisher Scientific | BP1160-4 | for peptide synthesis |
| N-Methylmorpholine | Protein Technologies | S-1L-NMM | for peptide synthesis |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | AC416780250 | for fixing cells |
| PBS, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 10010049 | for various applications |
| Penicillin/streptomycin, 10,000 U/mL | ThermoFisher Scientific | 15140122 | for cell culture |
| Peptide synthesis vessel, 25 mL | Fisher Scientific | CG186011 | for peptide synthesis |
| Phosphotungstic acid | Fisher Scientific | A248-25 | for TEM |
| Piperidine | Spectrum | P1146-2.5LTGL | for peptide synthesis |
| Plain glass microscope slide 75 x 25 mm | Fisher Scientific | 12-550-A3 | for confocal microscopy |
| Reagent reservoirs, sterile | VWR | 95128093 | for cell culture |
| Self-closing tweezer | TedPella | 515 | for TEM |
| TEM support film | TedPella | 01814F | for TEM |
| Trifluoroacetic acid | Fisher Scientific | BP618-500 | for peptide cleavage and HPLC purification |
| Triisopropylsilane | VWR | TCT1533-5ml | for peptide cleavage |
| Trypan blue solution, 0.4% | ThermoFisher Scientific | 15250061 | for cell counting |
| Tweezer, general purpose-serrated | VWR | 231-SA-SE | for confocal microscopy |
| WEHI-274.1 | ATCC | ATCC CRL-1679 | murine monocyte |
| automated benchtop peptide synthesizer | Protein Technologies | PS3 Benchtop Peptide Synthesizer | |
| α- cyano- 4- hydroxycinnamic acid, 99% | Sigma Aldrich | 476870-2G | for MALDI |
References
- Mozaffarian, D., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), e38-e60 (2016).
- Falk, E. Pathogenesis of atherosclerosis. J. Am. Coll. Cardiol. 47 (8, Suppl. C), C7-C12 (2006).
- Rahmani, M., Cruz, R. P., Granville, D. J., McManus, B. M. Allograft Vasculopathy Versus Atherosclerosis. Circ. Res. 99 (8), 801-815 (2006).
- Luis, A. J. Atherosclerosis. Nature. 407 (6801), 233-241 (2000).
- Libby, P., Ridker, P. M., Hansson, G. K. Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis. Nature (London, U. K). 473 (7347), 317-325 (2011).
- Boring, L., Gosling, J., Cleary, M., Charo, I. F. Decreased lesion formation in CCR2-/- mice reveals a role for chemokines in the initiation of atherosclerosis. Nature (London). 394 (6696), 894-897 (1998).
- Szmitko, P. E., et al. New Markers of Inflammation and Endothelial Cell Activation. Circulation. 108 (16), 1917-1923 (2003).
- Deshmane, S. L., Kremlev, S., Amini, S., Sawaya, B. E. Monocyte Chemoattractant Protein-1 (MCP-1): An Overview. J. Interferon Cytokine Res. 29 (6), 313-326 (2009).
- Chung, E. J., et al. Monocyte-Targeting Supramolecular Micellar Assemblies: A Molecular Diagnostic Tool for Atherosclerosis. Adv. Healthcare Mater. 4 (3), 367-376 (2015).
- Chung, E. J. Targeting and therapeutic peptides in nanomedicine for atherosclerosis. Exp Biol Med (Maywood). 241 (9), 891-898 (2016).
- Sanz, J., Fayad, Z. A. Imaging of atherosclerotic cardiovascular disease. Nature (London, U. K.). 451 (7181), 953-957 (2008).
- Tarkin, J. M., et al. Imaging Atherosclerosis. Circ. Res. 118 (4), 750-769 (2016).
- Hennerici, M., Baezner, H., Daffertshofer, M. Ultrasound and arterial wall disease. Cerebrovasc Dis. 17 Suppl 1, 19-33 (2004).
- Nissen, S. E. Application of intravascular ultrasound to characterize coronary artery disease and assess the progression or regression of atherosclerosis. Am J Cardiol. 89 (4A), 24B-31B (2002).
- Khalil, M. M., Tremoleda, J. L., Bayomy, T. B., Gsell, W. Molecular SPECT Imaging: An Overview. Int J Mol Imaging. 2011, 796025 (2011).
- Lerakis, S., et al. Imaging of the vulnerable plaque: noninvasive and invasive techniques. Am J Med Sci. 336 (4), 342-348 (2008).
- Sun, Z. H., Rashmizal, H., Xu, L. Molecular imaging of plaques in coronary arteries with PET and SPECT. J Geriatr Cardiol. 11 (3), 259-273 (2014).
- Godin, B., et al. Emerging applications of nanomedicine for the diagnosis and treatment of cardiovascular diseases. Trends Pharmacol. Sci. 31 (5), 199-205 (2010).
- Branco de Barros, A. L., Tsourkas, A., Saboury, B., Cardoso, V. N., Alavi, A. Emerging role of radiolabeled nanoparticles as an effective diagnostic technique. EJNMMI Res. 2 (1), 31-39 (2012).
- Jayagopal, A., Linton, M. F., Fazio, S., Haselton, F. R. Insights into atherosclerosis using nanotechnology. Curr. Atheroscler. Rep. 12 (3), 209-215 (2010).
- Khodabandehlou, K., Masehi-Lano, J. J., Poon, C., Wang, J., Chung, E. J. Targeting cell adhesion molecules with nanoparticles using in vivo and flow-based in vitro models of atherosclerosis. Exp Biol Med (Maywood). 242 (8), 799-812 (2017).
- Trent, A., Marullo, R., Lin, B., Black, M., Tirrell, M. Structural properties of soluble peptide amphiphile micelles. Soft Matter. 7 (20), 9572-9582 (2011).
- Hartgerink, J. D., Beniash, E., Stupp, S. I. Peptide-amphiphile nanofibers: A versatile scaffold for the preparation of self-assembling materials. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (8), 5133-5138 (2002).
- Missirlis, D., et al. Effect of the Peptide Secondary Structure on the Peptide Amphiphile Supramolecular Structure and Interactions. Langmuir. 27 (10), 6163-6170 (2011).
- Zhong, L., Johnson, W. C. Environment affects amino acid preference for secondary structure. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89 (10), 4462-4465 (1992).
- Shimada, T., Lee, S., Bates, F. S., Hotta, A., Tirrell, M. Wormlike Micelle Formation in Peptide-Lipid Conjugates Driven by Secondary Structure Transformation of the Headgroups. J. Phys. Chem. B. 113 (42), 13711-13714 (2009).
- Missirlis, D., et al. Linker Chemistry Determines Secondary Structure of p5314-29 in Peptide Amphiphile Micelles. Bioconjugate Chem. 21 (3), 465-475 (2010).
- Elbert, D. L., Hubbell, J. A. Surface treatments of polymers for biocompatibility. Annu. Rev. Mater. Sci. 26, 365-394 (1996).
- Xue, Y., O'Mara, M. L., Surawski, P. P. T., Trau, M., Mark, A. E. Effect of Poly(ethylene glycol) (PEG) Spacers on the Conformational Properties of Small Peptides: A Molecular Dynamics Study. Langmuir. 27 (1), 296-303 (2011).
- Canalle, L. A., Loewik, D. W. P. M., van Hest, J. C. M. Polypeptide-polymer bioconjugates. Chem. Soc. Rev. 39 (1), 329-353 (2010).
- Hamley, I. W. PEG-Peptide Conjugates. Biomacromolecules. 15 (5), 1543-1559 (2014).
- Acar, H., et al. Self-assembling peptide-based building blocks in medical applications. Adv. Drug Delivery Rev. , (2016).
- Busseron, E., Ruff, Y., Moulin, E., Giuseppone, N. Supramolecular self-assemblies as functional nanomaterials. Nanoscale. 5 (16), 7098-7140 (2013).
- Barrett, J. C., et al. Modular Peptide Amphiphile Micelles Improving an Antibody-Mediated Immune Response to Group A Streptococcus. ACS Biomater. Sci. Eng. 3 (2), 144-152 (2017).
- Toughrai, S., et al. Reduction-Sensitive Amphiphilic Triblock Copolymers Self-Assemble Into Stimuli-Responsive Micelles for Drug Delivery. Macromol. Biosci. 15 (4), 481-489 (2015).
- Swirski, F. K., et al. Monocyte accumulation in mouse atherogenesis is progressive and proportional to extent of disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103 (27), 10340-10345 (2006).
- Kashiwagi, M., et al. Association of monocyte subsets with vulnerability characteristics of coronary plaques as assessed by 64-slice multidetector computed tomography in patients with stable angina pectoris. Atherosclerosis (Amsterdam, Neth). 212 (1), 171-176 (2010).
- Chung, E. J., Tirrell, M. Recent Advances in Targeted, Self-Assembling Nanoparticles to Address Vascular Damage Due to Atherosclerosis. Adv. Healthcare Mater. 4 (16), 2408-2422 (2015).
- Cassetta, L., Pollard, J. W. Cancer immunosurveillance: role of patrolling monocytes. Cell Res. 26 (1), 3-4 (2016).
- Williams, C. B., Yeh, E. S., Soloff, A. C. Tumor-associated macrophages: unwitting accomplices in breast cancer malignancy. NPJ Breast Cancer. 2, (2016).
- Richards, D. M., Hettinger, J., Feuerer, M. Monocytes and Macrophages in Cancer: Development and Functions. Cancer Microenviron. 6 (2), 179-191 (2013).
- Schick, M. J. Effect of temperature on the critical micelle concentration of nonionic detergents. Thermodynamics of micelle formation. J. Phys. Chem. 67 (9), 1796-1799 (1963).
- Marullo, R., Kastantin, M., Drews, L. B., Tirrell, M. Peptide contour length determines equilibrium secondary structure in protein-analogous micelles. Biopolymers. 99 (9), 573-581 (2013).
- Hilbich, C., Kisters-Woike, B., Reed, J., Masters, C. L., Beyreuther, K. Substitutions of hydrophobic amino acids reduce the amyloidogenicity of Alzheimer's disease βA4 peptides. J. Mol. Biol. 228 (2), 460-473 (1992).
- Trevino, S. R., Scholtz, J. M., Pace, C. N. Amino Acid Contribution to Protein Solubility: Asp, Glu, and Ser Contribute more Favorably than the other Hydrophilic Amino Acids in RNase Sa. J. Mol. Biol. 366 (2), 449-460 (2007).
- Kim, S. W., Shi, Y. Z., Kim, J. Y., Park, K. N., Cheng, J. X. Overcoming the barriers in micellar drug delivery: Loading efficiency, in vivo stability, and micelle-cell interaction. Expert Opin Drug Delivery. 7 (1), 49-62 (2010).
- Rangel-Yagui, C. O., Pessoa, A. Jr, Tavares, L. C. Micellar solubilization of drugs. J. Pharm. Pharm. Sci. 8 (2), 147-163 (2005).
- Batrakova, E., et al. Fundamental relationships between the composition of pluronic block copolymers and their hypersensitization effect in MDR cancer cells. Pharm. Res. 16 (9), 1373-1379 (1999).
- Chen, L. J., Lin, S. Y., Huang, C. C. Effect of Hydrophobic Chain Length of Surfactants on Enthalpy-Entropy Compensation of Micellization. J. Phys. Chem. B. 102 (22), 4350-4356 (1998).
