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Biochemistry

分離とシロイヌナズナ由来のミトコンドリアの呼吸測定

Published: January 5, 2018 doi: 10.3791/56627

Summary

ミトコンドリアは、植物細胞のわずかな割合は、彼ら研究の範囲を精製する必要があります。ミトコンドリアは、均質化、続いて高純度ミトコンドリア分画を取得する微分と密度勾配遠心法によってさまざまな植物器官から分離できます。

Abstract

ミトコンドリアは植物、特にニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチド (NADH) やフラビン アデニンなど削減化合物の酸化からアデノシン三リン酸 (ATP) の生産の多くの代謝経路に関与する重要な細胞内小器官型 (FADH2)。シロイヌナズナのゲノムの完全な注釈が確立して最も広くプラント モデルを使用し、したがってさまざまな器官 (葉や根、花) からミトコンドリアを浄化するために必要なツールをフル活用する必要があること今ミトコンドリアの生物学を研究するシロイヌナズナ用があります。ミトコンドリアは、様々 なアプローチ、続いて連続コロイド密度勾配を使用して更に精製粗ミトコンドリア ペレットを生産差動遠心分離手順の一連を使用して組織の均質化によって分離します。遠心分離。コロイド密度材料がその後複数の遠心分離手順によって削除されます。新鮮な葉のティッシュの 100 g から始まって、ミトコンドリアの 2-3 mg 日常的に取得できます。これらのミトコンドリアの呼吸実験阻害剤及び各種の基材を使用しているを確認する能力を持つ 100 250 nmol O2-1 mg ミトコンドリア蛋白-1 (NADH 依存率) の典型的な率を表示します。基板を酸化と代替とチトクローム ターミナル オキシダーゼの容量。このプロトコルでは、シロイヌナズナ葉連続コロイド密度勾配および精製された植物ミトコンドリアの効率的な呼吸測定を使用してからミトコンドリアの分離法について説明します。

Introduction

植物ミトコンドリア研究の歴史は、100 年1以上さかのぼります。無傷ミトコンドリアが 1950 年代初頭に隔離された最初差動遠心分離を使用します。1980 年代におけるコロイドの密度勾配の出現は、浸透圧調節を受けることがなく精製するミトコンドリアを許可しました。グラデーション精製ミトコンドリアは質量分析法の感度のためのほとんどの目的に適しているも比較的軽微な汚染物質検出することができます、不適切なミトコンドリアの場所2を割り当てることができます。プラスチド局在型の両方を削除フリーフロー電気泳動することができますの使用とペルオキシソーム汚染3、無料が、フローの電気泳動は専門性の高い技術と研究の大半には必要ありません。さらに、そのデュアルまたは複数のターゲット蛋白質の思い出したする必要がある蛋白質の場所を決定するときにセルに発生します。葉緑体/プラスチドとミトコンドリアの4、およびミトコンドリア標的蛋白質の数の以上 100 デュアル ターゲットタンパク質を説明し、ペルオキシソームでは5が知られています。さらに、特定の刺激、酸化ストレスなどの下で蛋白質の再配置は、細胞生物学6新興テーマです。このように、蛋白質の位置を学び、生物学の文脈で検討する必要が、さまざまなアプローチ、決定および場所2を確認します。

ミトコンドリア、通常の均質化によって植物組織から分離されて、バランスがミトコンドリアを解放する細胞壁を壊して開けるとミトコンドリアを損傷されていない間必要です。伝統的に、ジャガイモとカリフラワー、均質化は、活動を維持するためにさまざまなコンポーネントのバッファーで抽出液を作る家庭用ミキサー/ジューサー装置を使用します。エンドウ葉からミトコンドリアの分離 (稚苗 (~ 10 日古い) を使用してミトコンドリアの分離のための普及した材料は、葉材が柔らかくて、細胞を溶解するミキサーを利用しています。シロイヌナズナT-DNA 挿入ノック アウトの行の可用性と機能研究を実施するミトコンドリアを浄化することができる必要がある葉、根、花からミトコンドリアの分離法の開発組織。全体的に他の植物の開発方法を最適化するために必要な材料の研削役得で、よく7に働いた。シロイヌナズナのこれはさまざまな方法 (下記参照) で達成することができます、組織の種類 (撮影対ルート) によって異なります。さまざまな器官からミトコンドリアの密度として連続的な勾配の使用を最適化することも、または発達段階を意味する彼らは別様に移行することができます。したがって、最大分離のためグラデーションの密度は、洗練された最高の分離を達成するためにことを確認することができます。

一度精製したタンパク質、tRNA の吸収実験、酵素活性測定法、呼吸鎖測定および西部のしみの分析を含む研究のさまざまなミトコンドリアを使用ことができます。ミトコン ドリアは、蛋白質量の質量分析にも使用できます。複数の反応 (MRM) 分析を監視可能の定量化タンパク質を定義しますが、重要な分析法の開発を必要とする対象となります。これに対し、ジメチルまたは他同位体ラベル8による定量化は、生物学的知見を明らかにする使用することができます全体のプロテオームの間での違いを識別するに発見アプローチを提供します。

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Protocol

このプロトコルはそのまま土壌コロイドの連続密度勾配を使用して上に成長したシロイヌナズナ器官ミトコンドリアの分離に使用されます。4 ° C で行われているすべてのプロシージャの次の材料のコレクション

1. 粉砕媒体、洗浄バッファー、およびグラデーションのソリューションの準備

  1. 研磨媒体 (マイナス アスコルビン酸とシステイン) とテーブル1 2 x 洗浄バッファーの 200 mL 1 日分離前に 300 mL を準備、4 ° C で冷える
    注: アスコルビン酸ナトリウムと L-システイン (遊離塩基) 17.84 mM, 20.36 mM の最終的な集中にそれぞれ追加、分離の朝に研削中にします。ミトコンドリアが使用される西部のしみまたはブルー ネイティブ ポリアクリルアミドゲルのゲルの電気泳動 (BN-PAGE) 分析、BSA のない洗浄バッファー x 2 を構成します。
  2. ミトコンドリアの分離 (図 1表 1) の朝にグラデーションを準備します。
    1. 重いと光のグラデーションのソリューションは、2 つのビーカー。それぞれの 35 mL で 2 つの勾配管十分です。
    2. グラデーションの注ぎ口と PVC 蠕動チューブを脱イオン水の部屋を洗って、すべての管から管を通しても流れを確保します。
    3. 場所 2 遠沈管 (50 mL) PVC チューブ蠕動アウトレットで氷の上のわずかな角度ではチューブの下側にグラデーションのソリューションが実行されるようにチューブの内側にテープで固定。
    4. 内側と外側の部屋 (ダウン黒レバー) の間の接続を閉じます。マグネチックスターラー内側のチャンバー内の小さな攪拌棒にグラデーションの注ぎ口を配置します。
    5. 内側のチャンバー (チューブのコンセントを商工会議所) に 35 mL 重勾配液を注ぐ。(300 mL/h) を高速に設定されて蠕動性ポンプ率で残りは半分まで氷上に置いた 2 つの遠沈管に重勾配液を調剤します。
    6. 外側の商工会議所 (商工会議所管出口なし) に 35 mL の光勾配溶液を注ぐ。チャンバー (黒プッシュ レバーを途中で) の間の接続を開き、穏やかに混合するソリューションを許可します。磁性攪拌器を使用してソリューションをミックスします。
    7. ソリューションをゆっくりと実行を許可する (60 mL/h) 2 つのチャンバーからミックス グラデーション ミックスのすべてまで 0 - 4.4% (w/v) ポリビニルピロリドン (PVP) グラデーション入り管。手順 2.12 で使用する準備ができるまで氷でグラデーションをしてください。
      メモ: グラデーションが準備されると、希釈洗浄媒体 prechilled 脱イオン水と 4 ° C で維持寒さ 1 x x 2

2. 均質化とミトコンドリアの分離

  1. ハサミで土で 4 週間の古いシロイヌナズナ栽培全体ロゼット組織を切り取り、少なくとも 80 植物 1 の準備のため必要となります。
    注: 10 14 日古い水文化、最小 5 ポット/準備、または 4 板の最小培地・培基底塩混合物 (MS) 寒天上に成長した 2 週間の古い苗も使用される場合があります。
  2. 予冷 4 ° C の大きなモルタルと乳棒粉砕媒体 (表 1) の 75 mL と小さな断片にカットされている植物材料の半分を配置し、組織の大きな作品が残っていないまで数分間、広く挽きます。
  3. 中古ウェットろ過材 (22-25 μ m 孔サイズ) と粉砕媒体の 4 層と 500 mL の三角フラスコにプラスチック漏斗を介してろ過材の 4 層を磨砕液をフィルターします。
  4. 研削中の 75 ml の別組織の残りの半分を挽きます。
  5. 濾材の乳剤を組み合わせるし、フィルターを通して可能な磨砕液と同じくらい。
  6. 粉砕媒体、500 mL 三角フラスコにもう一度フィルターの残り 150 mL でもう一度ろ過材に残った残存組織を挽きます。
  7. 2,500 x g で 5 分間固定角ロータ 4 ° C で 8 中古冷蔵 50 mL プラスチック遠心管にフィルターのホモジネートを遠心します。
  8. きれいな遠心チューブに上清を注ぐ (50 mL; 緑のペレットを妨害しない) と 4 ° C で 17,500 x g で固定角ロータで 20 分間遠心します。
  9. 破棄すべてが < 吸引により上清の 3 mL (またはペレットを乱すことがなくオフ優しく注ぐ)。優しく小さな細かいブラシを使用して残留清でペレットを再懸濁します。
  10. 各管に洗浄バッファー x 1 の 10 mL を追加し、4 管を組み合わせて 1 きれいな遠心管 (2 管の結果など)。
  11. 1 x 50 mL 洗浄バッファーでこれらの管を記入し、手順 2.7 2.9 を繰り返します。
  12. プール 1 粗ミトコンドリア餌スポイトを使用して管し、罰金の絵筆で均等に分散 (少量の洗浄バッファーが使用できますが、最終巻は、グラデーションの上に合うように 3 mL 以下にする必要があります)。優しく 2 連続 0 - 4.4% (w/v) PVP グラデーションの上に落とすとミトコンドリアの懸濁液を層します。
  13. チューブ (1 x 洗浄バッファーを使用して) 重量によってバランスをとるし、40 分休憩がオフになっていることを確認のための 4 ° C で 40,000 × g で遠心分離機します。ミトコンドリア、管の下部にあるバンドに移行するまたは (曇り、黄色バンドによって識別される管の下部に重液に存在します。図 2)。
  14. 吸引によりミトコンドリアのバンド上のソリューションの上部 5 cm を慎重に取り外します。
  15. 2 クリーン チューブにミトコンドリアを含む残りのソリューションを配布し、洗浄バッファー x 1 と入力します。プラスチック パラフィン フィルムでチューブの口を覆っていると数回の反転によって、コロイドの密度勾配とミトコンドリアを均等に配る。遅いブレーキ 4 ° C で 31,000 × gで 15 分間遠心します。
    注: 遠心分離の前に確認、ミトコンドリアと残りのコロイドの密度勾配を均等に分散します。さもなければ、コロイド密度勾配が管の底に集中、ミトコンドリアのペレット化を防ぐ。
  16. 吸引、塗りつぶし 1 x 洗浄管 50 mL までのバッファーし、混合して再び反転して上清を削除します。ゆっくりブレーキを 4 ° C で 31,000 × g で 15 分間遠心します。
  17. 上清を吸引し、変更された 200 μ L ヒント (その端の開口部の上の先端を少しカット) とピペットを使用して可能な限り小さなとしてミトコンドリア ペレット ボリューム (〜 500 μ L) を収集します。1.5 mL チューブにミトコンドリアを配置し、即座の使用または-80 ° C でストアの氷の上に維持
    注: 場合ミトコンドリアは、ナトリウム dodecyl 硫酸塩-ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) に使用される、BN-PAGE - またはイムノブロット分析使用 BSA のない洗浄バッファー x 1 (すなわち、ステップ 2.15 と 2.16) 最終的な洗浄のため。
  18. ブラッドフォード法によるミトコンドリアのタンパク質濃度を決定します。
    注: の 4 ° C で使用するまで-80 ° c ストア ペレット BN-PAGE-遠心分離機因数。酸素消費量測定では、唯一の新鮮単離ミトコンドリアを使用できます。

3. 酸素消費量測定

注: による酸素消費量たて分離植物ミトコンドリアはミトコンドリア イヌイット、チトクロームc経路アクティビティ、および代替経路の活性の測定を有効にする、クラーク型の酸素電極で分析できます。

  1. ソフトウェアのインストール
    1. インストール ライセンス酸素酸素消費量測定に使用するコンピューターにソフトウェアを監視します。
  2. 呼吸中、基板、化学貯蔵液およびクラーク型の酸素電極の作製
    1. 酸素消費量の測定に使われる呼吸媒体 (300 mM ショ糖、10 mM の NaCl、5 mM KH2PO4、2 mM MgSO40.1% (w/v) ウシ血清アルブミン (BSA) 10 mM TES (pH 7.2)) を準備します。
    2. 基板、阻害剤、およびミトコンドリア呼吸 (表 2) を測定するエフェクタを準備します。これらを以前作成し、-20 ° C で保存
      注: pH 7.0 に有機酸などの酸性の溶液の pH を中和する NaOH を使用する前に使用しています。
    3. 呼吸中長期分析室 (25 ° C) として同じ温度を暖めます。
    4. クラーク型の酸素電極メーカーのプロトコルで説明されているように組み立てます。
    5. 測定室に 1 mL の空気飽和水 (空気飽和水は精力的に大きな三角フラスコに少量の純水を揺することによって得られる) を配置します。かくはんに切り替えるにはするには、「攪拌速度」ボタンをクリックします。"On"ボタンをクリックし、攪拌速度を 65 rpm に設定。継続する"OK"をクリックします。25 ° C で水を継続的にかき混ぜる
  3. 酸素電極の校正
    1. 測定室 (25 ° C) として同じ温度を校正に使用される水を温めます。
    2. 現在の安定化し、酸素電極を校正するを待ちます。
    3. 酸素電極の校正を開始するには、「調整」ボタンをクリックして、を選択し、「空気飽和水」「液体位相校正」
    4. 新しいウィンドウが (酸素キャリブレーション (液相) - 5 のステップ 1) を開きます。(電極のコントロール ボックスに接続されているチャネル) を調整し、(セット 25 ° C に「商工会議所温度」と「大気圧」101.32 kpa) の変数を入力するチャンネルを選択します。OK をクリックして""続行します。
    5. 次攪拌速度 (65 rpm) (5 の手順 2)、セットアップのステップして続行する"OK"をクリックします。
    6. 5 の手順 3 で高原に到達する信号を待ちます。言葉「高原に達した OK を押して続行します"がボックスに表示されます。継続する"OK"をクリックします。
    7. 5 の手順 4、亜ジチオン酸ナトリウム 5 mg を追加することによってゼロ酸素チャンバーを確立します。継続する"OK"をクリックします。
      注: 酸素濃度の低下がトレースに表示されます、0 に到達する必要があります。
    8. キャリブレーション (5 のステップ 5) の最後のステップで高原に到達する信号を待ちます。言葉「高原に達した OK を押して続行します"がボックスに表示されます。継続する"OK"をクリックします。
    9. キャリブレーションを保存する「校正の保存」をクリックします。新しいウィンドウが開きます。酸素制御ボックスの新しい調整内容を保存することを確認して「OK」をクリックします。
      注: 成功した校正後ラベル「酸素 (nmol/mL)」が y 軸に表示されます。
    10. キャリブレーション後に、適切な洗浄を確実に (少なくとも 5-10 回) チャンバー内に水を洗浄によって測定チャンバーをきれい。測定に呼吸媒体の場所 1 mL は商工会議所、酸素消費トレースが線形になるまで数分間平衡に膜ができます。
    11. 良いスロープ ビューを取得する酸素消費トレースの規模に適応します。"ズーム XY"をクリックし、変数を入力 (0 - に「酸素」を設定 300 と 0 - 45 分に「時間軸」)。
  4. ミトコンドリアの整合性の定量
    1. プランジャー オープン、反応室に 970 μ L 空気飽和呼吸媒体を追加します。
    2. (総蛋白はその後の計算に含まれる必要があります) ミトコンドリア分離後決定として 30 μ L 分離ミトコンドリアや合計のミトコンドリア蛋白質の 150 μ g を追加カットの先端のピペットを使用して反応室へ。
    3. 継続的に 25 ° c (65 rpm) バー マグネチックスターラーを使用して、ソリューションを空気飽和状態にミトコンドリアの懸濁液をかき混ぜます。
    4. プランジャーとチャンバーのシール、酸素消費量を記録する「録音を開始」をクリックし、、(1-2 分) を安定させるために酸素消費トレース。
    5. アスコルビン酸 10 mM、25 μ M シトクロムc "洗剤"する前にレートを取得する 5 分を追加した後、手動で酸素消費率を決定します。
      注: 基板、阻害剤、およびトレースで直接エフェクターの追加のラベル、「イベント マークの追加」ボタンをクリックし、、対応するラベル指定を入力します。継続する"OK"をクリックします。
    6. "洗剤"後率を与えるに 0.05% (v/v) 洗剤を追加した後 3 分の手動での酸素消費率を決定します。「録画を停止」をクリック
    7. 「料金の変更表」ボタンをクリックします。2 カーソルがグラフ画面上の縦線として表示されます。間隔を定義するトレースの必要な位置にカーソル速度のペアをドラッグします。左率のカーソルを使用してトレースに沿って間隔を移動します。間隔の右の速度のカーソルを使用してそれ自体を設定します。監視ソフトウェア自動的に酸素は、トレースに沿って速度間隔のカーソルを移動しながら 2 つのカーソル間ベスト フィットの直線を描画します。
    8. 目的の間隔と位置を定義すると、単価を右クリックでテーブルに、カーソルが 2 の 1 で入力し、「テーブルにレートを追加」を選択メインの単価表に単価を表示することを確認するには、「追加」をクリックします。
    9. "洗剤"の前に速度をパーセンテージとして表される"洗剤"後レートによって除算ミトコンドリアの整合性を計算し、100 からそれを減算します。
  5. ミトコンドリア呼吸の定量
    1. プランジャー オープン、反応室の呼吸の空気飽和中 970 μ L を追加します。500 μ M ATP や 30 μ L 分離ミトコンドリア呼吸反応チャンバ中にカットでピペットを使用して合計のミトコンドリア蛋白質の 150 μ g を追加します。
    2. 25 ° C で (65 rpm) バー マグネチックスターラーを使用して継続的にミトコンドリアの懸濁液をかき混ぜる
    3. プランジャーを閉じ、酸素消費量を記録し、(線形酸素消費トレースのとき) を安定させるために酸素消費速度の 1-2 分待つ」記録を開始」をクリックします。5 mM コハク酸を追加します。約 2 分間の酸素消費率を記録します。
      注: 基板、阻害剤、およびトレースで直接エフェクターの追加のラベル、「イベント マークの追加」ボタンをクリックし、、対応するラベル指定を入力します。継続する"OK"をクリックします。
    4. 1 mM アデノシン二リン酸 (ADP) を追加します。2 分の酸素消費率の記録が再開します。
    5. 1 mM NADH を追加します。4 8 分の酸素消費率を記録します。このレートは、チトクロム酸化酵素を介して呼吸の容量です。
    6. チトクロームc経路を阻害するため 1 mM シアン化カリウム (KCN) (または 2.5 μ M myxothiazol または 5 μ M アンチマイシン A) を追加し、代替酸化酵素による酸素消費量を観察する約 2 分を記録し続けます。
    7. 5 mM ジチオトレイトール (DTT) と代替オキシダーゼを完全にアクティブにする 10 mM ピルビン酸を追加します。5-7 分の記録し続けます: 代替オキシダーゼの容量です。
    8. 500 μ M n-プロピルガ レート (nPG) を追加し、2 分間記録します。これは化学的に禁じることができない残留酸素消費率を査定します。それはミトコンドリアの起源する可能性が高いではないと記録、その他の料金からこの率を減算します。シトクロムcと (KCN と nPG) ことによって、AOX 経路の抑制後まだ発生して酸素消費量は、ペルオキシダーゼ ミトコン ドリア9の汚染物質として存在に由来すると思われます。
    9. 「録画を停止」をクリック
    10. 「料金の変更表」ボタンをクリックして単価を右クリックでテーブルに 2 つカーソルのいずれかで入力と「テーブルにレートの追加」を選択。メインの単価表に単価を表示することを確認するには、「追加」をクリックします。
      注: とき有機溶剤に溶解したエフェクタを追加 (e.g。、アンチマイシン A、nPG、myxothiazol)、商工会議所およびプランジャー エタノールで洗浄する必要があります、適切な洗浄を確保するには、水が。

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Representative Results

このプロトコルを使用して、SDS-PAGE とイムノブロットによって異なるミトコンドリア蛋白質を検出することができました。図 3 aに示すように、水の培養組織から分離したタンパク質はかすかなバンド (2 μ g) を検出するのに十分です。信号強度は、ロード量に比例して増加します。プレート (図 3 b)、高い光ストレスへの応答上に成長した組織から分離したミトコンドリアの異なった遺伝子型の治療は代替オキシダーゼ抗体バイオアセッテイによって分析できます。

ミトコンドリア ・ チトクロムc経路活性代替経路のイヌイットは、新鮮単離ミトコンドリア サンプルを使用して測定できます。説明の隔離プロシージャ (図 4 a) の中にミトコンドリアの整合性はよく保持されます。チトクロームc経路および代替オキシダーゼ経路を介して酸素消費量は影響を受けて、分離ミトコンドリアに異なる基板, 阻害剤とエフェクタを追加する (図 4 b)。

Figure 1
図 1: グラデーションの準備のためのセットアップ。左: PVC 蠕動チューブ コンセントは、チューブの内側にテープで氷上に置いたわずかな角度と遠沈管 (50 mL)中央: 蠕動性ポンプ;重いグラデーション (チャンバー) と光のグラデーション (外箱) ソリューションを含む磁気スターラーの上に右: グラデーションの注ぎ口。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: シロイヌナズナからミトコンドリアの精製を撃つ連続を使用して 0 - 4.4% (w/v) PVP/28% コロイド密度勾配。暗い緑バンドは、チラコイドとグラデーションのソリューションの上部に示されているように他の汚染です。ミトコンドリア分画は、管の底に近い白緑がかったバンドとして登場。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: SDS ページ、特定の抗体を用いてバイオアセッテイ ミトコンドリア蛋白質の分離します。野生のシロイヌナズナの水培養 2 週齢から分離された (A) ミトコンドリア型 (コロンビア-0, Col 0) 植物が SDS-PAGE を受けるし、S4 (NADH: ユビキノン酸化還元酵素サブユニットに対する抗体の検出Ndufs4、At5g67590)。無染色マーカーの分子量はゲルの外側車線に読み込まれた、10 の代表的なバンドのサイズはキロ ダルトン (kDa) で示されます。検出された Ndufs4 タンパク質の分子質量は 18 kDa です。蛋白質量が 2 μ g の総蛋白の値を基準にして表示されます。(B) 3% (w/v) ショ糖と 0.8% 寒天 (w/v) とメディアが 750 Με m-2-1にさらされた Gamborg の b5 2 週齢苗 (HL) を強調表示し、6 h 後に収穫ミトコンドリアが精製されミトコンドリア蛋白質SDS-PAGE で区切られ、代替オキシダーゼ (AOX) に対する抗体を検出します。34 kDa の分子質量と immunodetectable AOX タンパク質の存在が示されます。蛋白質量は、コントロール (2 μ g) の値を基準にして表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4: O2分離別消費量の代表的な痕跡植物ミトコンドリア。上記シロイヌナズナ野生型植物 (コル-0) から分離された (A) ミトコンドリアは酸素消費量測定の前に外側の膜の整合性を分析しました。ミトコン (150 μ g 合計ミトコンドリア蛋白質) の 30 μ L を使用しました。ミトコンドリアの整合性は、前述のように 90% として決定されました。(B) 酸素消費量測定を 30 μ を使用して行ったシロイヌナズナ野生型植物からミトコンドリア (150 μ g 合計ミトコンドリア蛋白質) を分離しました。合計ミトコンドリア呼吸と AOX 経路を求めた。これらのデータからシトクロムc経路や AOX 経路を通じて酸素消費量を決定できます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

粉砕媒体
化学 濃度
ショ糖 0.3 M
ピロリン酸ナトリウム (Na4P2O7 · 10 H2O) 25 mM
EDTA 二ナトリウム塩 2 mM
リン酸-カリウム (KH2PO4) 10 mM
ポリビニルピロリドン (PVP40) 1% (w/v)
ウシ血清アルブミン (BSA) 1% (w/v)
脱イオン水
(HCl を使用して) 7.5 pH を調整します。
注: 300 mL 研削中、1.06 g ナトリウム アスコルビン酸の (最終濃度: 17.84 mM) と 0.74 g システイン (最終濃度: 20.36 mM) を使用する直前に追加されます。添加後 pH を確認し、必要に応じて 1 M NaOH で 7.5 に調整します。
2 X 洗浄バッファー
化学 濃度
ショ糖 0.6 M
TES 20 mM
ウシ血清アルブミン (BSA) 0.2% (w/v)
脱イオン水
(NaOH を使用して) 7.5 pH を調整します。
グラデーション
重いグラデーション ソリューション (4.4% (w/v) PVP) 2 勾配管
2 X 洗浄バッファー 17.5 mL
Colloidial 密度勾配 9.8 mL
PVP 40 (20% (w/v)) 7.7 mL
光のグラデーション溶液 (0% (w/v) PVP) 2 勾配管
2 X 洗浄バッファー 17.5 mL
Colloidial 密度勾配 9.8 mL
脱イオン水 7.7 mL

表 1: バッファーおよびミトコンドリアの分離に使用されるグラデーションの組成物。

省略形 原液濃度 ストレージ 最終濃度 ボリューム 1 ml の反応の追加
基板
シトクロム c チトクローム c 2.5 mM (H2O) の -20 ° C 25 Μ M 10 μ l
NADH NADH (H2O) 0.1 M -20 ° C 1 mM 10 μ l
コハク酸 Succ 500 mM (H2O) の -20 ° C 5 mM 10 μ l
阻害剤
アンチマイシン A AA 1 mM (江藤) -20 ° C 5 Μ M 5 μ l
シアン化物 KCN (H2O) 100 mM 4 ° C 1 mM 10 μ l
Myxothiazol Myxo (エタノール) で 500 μ M -20 ° C 2.5 Μ M 5 μ l
n-没食子酸プロピル nPG (江藤) 100 mM -20 ° C 500 Μ M 5 μ l
エフェクタ
ADP ADP (H2O) 100 mM -20 ° C 1 mM 10 μ l
アスコルビン酸 Asc 500 mM (H2O) の 使用の日に新鮮なを確認します。 10 mM 20 μ l
ATP ATP (H2O) 100 mM -20 ° C 500 Μ M 5 μ l
Dithiotreitol DTT (H2O) 1 M 使用の日に新鮮なを確認します。 10 mM 10 μ l
ピルビン酸 Pyr (H2O) 1 M -20 ° C 10 mM 10 μ l
洗剤 10% (v/v) (H2O) 4 ° C 0.05% (v/v) 5 μ l

表 2: 基板, 阻害剤と酸素消費量測定用エフェクタのリスト。

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Discussion

通常、シロイヌナズナからミトコンドリアの分離は徹底的な研磨と 5 mg を超える利回りが得られますが約 80-100 の 3 - 4 週間の古い植物からミトコンドリアの 3 mg を利回りを残します。収量は生育条件によって異なります、老化9の中にも維持されるように思われますがミトコンドリアの構造は、senesce の葉、劇的に減少します。良好な収率を取得する最も重要な機能の 1 つは、ミトコンドリアを解放する細胞を溶解する研磨方法です。機械的研削装置の数は購入可能な中、シロイヌナズナの乳鉢と乳棒で粉砕を実現収量の面で一貫して良好な結果として細胞内小器官にはほとんど損傷を持つ細胞を溶かすこと機械研削盤は高速ですが、最適化を必要し、する研削に必要な量は、組織によって異なります。モルタルと乳棒、しばしば便利と効率的組織のスライスまたは研削前にナイフやハサミでカット。4 ° C で実施される必要があるすべてのステップのとおりと精製ミトコンドリアの洗浄ペレットを取得するために研削の端から全体の手順は、約 4 時間を取る必要があります。洗剤または管またはグラデーションのメルターで他の試薬の痕跡は、収量を減らすことができます劇的に、これらの手順で使用されるすべてのコンポーネントは、洗剤なしで洗浄、その他の手順では使用されません。最後に、ミトコンドリアを除去し、洗浄するためグラデーションの他の一部分から十分に区切ることが重要です。彼らは管の下部にも、光と重いソリューションの混合を混合する前に注ぐ重いソリューションの詳細を許可するように調整する必要があることを意味します。逆に、バンドは拡散反射光が表示されます、管内高、少し前に発生する必要がありますを混合します。

ここで概説している方法は、シロイヌナズナの花と根組織11,12からミトコンドリアの分離を容易に使用できます。根、水耕栽培で成長してミトコンドリアの 2 mg の量を得るために新鮮な重量の 100 g を必要に便利です。根を研削の乳鉢と乳棒、研削の前に小さな断片にカットする必要があり、再研削ルート組織、乳鉢と乳棒またはミキサーで収量を増加させることができます。花組織でミトコンドリアの機能が強化された13乳鉢で粉砕ではしばしば杵がうまく、材料の限られた量は、大量の植物の組織を収穫するために栽培される必要があります。ミトコンドリアは、同様のメソッドまたはわずかな変更14,15を用いたシロイヌナズナ器官の様々 なから、イネ (イネ)16から分離されています。

上記の方法の限界は、i) シロイヌナズナ、イネのこの分離の方法、iii) (など、様々 な汚染物質の少量の適用から ii) のみ特定組織のミトコンドリアの分離に必要な種子の大量ペルオキシソームのタンパク質) はまだ精製のミトコンドリアに存在します。上記の方法を使用して得られたミトコンドリアは酸素吸収研究から蛋白質量の定量的質量分析に至るまで、研究のさまざまなに適しています。グラデーションの精製されたミトコンドリア ペルオキシソームのタンパク質3などのさまざまな汚染物質の少量が保持されます。非ミトコンドリア蛋白質による汚染の量が小さい限り、ミトコンドリア蛋白質の変化を調べることで定義された細胞小器官のリストとの比較を使用できます (< 10%) と似たようなサンプルを比較、種類と程度非ミトコンドリア蛋白質は似ています。比較的少量のミトコンドリア (2-20 μ g)、(図 3) の抗体による検出の直線性を確認するミトコンドリアの変化量を用いた SDS ページまたはゲルから他のアプローチによって蛋白質量の解析が行なえます。ポリン (電圧依存イオン チャネル (VDAC)) はしばしば定量化のためローディング コントロールとして使用して、我々 の経験で、このタンパク質の比較的大きい豊かさにより可能性が応答が線形大量蛋白質のゲルで読み込まれている場合多くの場合、抗体応答の直線性は、このような荷重コントロールを使用する場合常にチェックする必要がありますので。ミトコンドリアを分離するこのアプローチの意義は、密度勾配を形成する材料としてショ糖を使用しているグラデーションとは異なりコロイドの密度勾配を必要としない精製ミトコンドリアの浸透圧の再調整で必要なショ糖。つまり、少ないチャンスは、コロイド密度材料を除去する精製のミトコンドリアを破裂のと洗濯後、さまざまな試金またはアプリケーションで直接使用できます。

組織のしみ、全体の葉や組織の抽出物からミトコンドリア蛋白質が検出された場所は、その組織のミトコンドリア蛋白質の量を測定する魅力的な方法です。ミトコンドリア蛋白質はそのようなアプローチで検出できない、全体組織のミトコンドリア蛋白質の検出と比較する他の細胞器官とミトコンドリアの一般的に低ボリュームを考えると、慎重に解釈する必要がありますを抽出します。どこ精製ミトコンドリアは同一の移行および検出の直線性を確保するためティッシュ エキスと共に electrophoresed は、注意のコントロールは、このようなアプローチに自信が実施される必要があります。

クラーク型の酸素電極の助けを借りて、ソリューションの酸素分圧の変化を測定できます。実際の電極は白金陰極と KCl 橋によって接続され、電解液でぬらした紙 (タバコ紙) と酸素透過性膜 (ポリテトラフルオロ エチレン膜) で覆われている銀陽極から成っています。600-700 mV の電圧は、酸素濃度と電圧の線形関係を与えて、酸素の還元に します。別の会社から商業的酸素電極があります。各会社はアセンブリおよび酸素電極のセットアップに関する独自の指示をだろうただし、一般的に電極ディスクの銀アノード ・ プラチナは電極クリーニング キットや組み立て前に消しゴム ペンの助けを借りて掃除する必要。アセンブリ (例えばポリテトラフルオロ エチレン ダイアフラムとシガレット ペーパーの) 中に空気泡を形作らないことを確認することが重要です。組立後電極ディスクはプラチナの陰極反応チャンバのベースで上向きに商工会議所に添付する必要があります。部屋自体が温度制御を確保するウォーター ジャケットに囲まれて。商工会議所は、常に完全な左ことがきわめて重要ですので、膜を乾燥し、亀裂のそれ以外の場合、水の。同様に、膜に触れてはならないピペットまたは注射器によってテアリングを回避する商工会議所に化合物を追加する場合。

試金、前に呼吸媒体は、分析室と同じ温度に暖められる必要があります (ほとんどの場合 25 の ° C) 膜を数分間呼吸バッファーで平衡に許可します。試金の酸素消費量のプランジャーを閉じる後エフェクター分子添加実施されなければならない 1 マイクロリットル非使い捨て注射器 (例えばマイクロ注射器) またはピペット チップ使い捨てゲルを使用します。マイクロ注射器を使用している場合は、注射器は 100% エタノールと原液が汚れないように、追加の水ですすいでを確保するが。これは測定値の間の部屋の洗濯にも適用されます。酸素消費量試金で使用されるほとんどの試薬は水に溶けるし、簡単に測定間の水 (約 5 倍) で複数洗浄によって除去することができます。ただし、いくつかの化学物質のアッセイに使用、アンチマイシン A などの有機溶剤、myxothiazol、nPG で水溶性のみです。したがって、商工会議所は、残基を破壊する残留のトレースこれらの分子と水 (約 5 倍) を削除するアッセイ間 (50% (v/v) エタノール) の有機溶剤で洗浄する必要です。

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Disclosures

著者は利害の衝突を宣言しません。

Acknowledgments

この研究、オーストラリア研究協議会優秀センターのプラント エネルギー生物学 CE140100008、オーストラリア研究協議会未来フェローシップ (FT130100112) を MWM とフョードル ・ リュネン研究員 (アレクサンダー ・ フォン ・ フンボルトによって支えられました財団、ドイツ) JS に。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ADP Sigma-Aldrich A2754 Chemical
Antimycin A Sigma-Aldrich A8674 Chemical, dissolve in ethanol
AOX antibody from Tom Elthon Elthon et al., 1989
Ascorbate Sigma-Aldrich A0157 Ascorbate Oxidase from Cucurbita sp.
ATP Sigma-Aldrich A26209 Chemical
Bovine serum albumin (BSA) Bovogen BSAS 1.0 Chemical
Clarity western ECL substrate Bio-Rad Laboratories 1705061 Chemical
Criterion Stain-Free Precast Gels 8-16% 18 Wells Bio-Rad Laboratories 5678104 Chemical
Cyanide Sigma-Aldrich 60178 Chemical
Cytochrome c Sigma-Aldrich C3131 Chemical
Difco Agar, granulated BD Biosciences 214530 Chemical
Dithiotreitol Sigma-Aldrich D0632 Chemical
EDTA disodium salt Sigma-Aldrich E5134 Chemical
Gamborg B-5 Basal Medium Austratec G398-100L Chemical
Gamborg Vitamin Solution (1000x) Austratec G219-100ML Chemical
Goat Anti-Mouse IgG (H + L)-HRP Conjugate Bio-Rad Laboratories 1706516-2ml Chemical
Goat Anti-Rabbit IgG (H + L)-HRP Conjugate Bio-Rad Laboratories 1706515-2ml Chemical
L-Cysteine Sigma C7352-100G Chemical
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich 230391 Chemical
Murashige & Skoog Basal Salt Mixture (MS) Austratec M524-100L Chemical
Myxothiazol Sigma-Aldrich T5580 Chemical, dissolve in ethanol
NADH Sigma-Aldrich N8129 Chemical
Ndufs4 antibody from Etienne Meyer Meyer et al., 2009
n-Propyl gallate Sigma-Aldrich P3130 Chemical, dissolve in ethanol
Percoll GE Healthcare 17-0891-01 Chemical, colloidal density gradient
Polyvinylpyrrolidone (PVP40) Sigma-Aldrich PVP40 Chemical
Potassium cyanide Sigma-Aldrich 60178 Chemical
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich P5655 Chemical
Pyruvate Sigma-Aldrich P2256 Chemical
Sodium chloride Chem-Supply SA046 Chemical
Sodium dithionite Sigma-Aldrich 157953 Chemical
Sodium L-ascorbate Sigma A4034-100G Chemical
Succinate Sigma-Aldrich S2378 Chemical
Sucrose Chem-Supply SA030 Chemical
TES Sigma-Aldrich T1375 Chemical
Tetrasodium pyrophosphate (Na4P2O7 · 10H2O) Sigma-Aldrich 221368 Chemical
Trans-Blot Turbo RTA Midi Nitrocellulose Transfer Kit Bio-Rad Laboratories 1704271 Chemical
Triton-X 100 Sigma-Aldrich X100 Chemical, detergent
Western Blocking Reagent Sigma 11921681001 Chemical
Balance Mettler Toledo XS204 Equipment
Beakers Isolab 50 mL
Centrifuge Beckman Coulter Avanti J-26XP Equipment
Centrifuge tubes Nalgene 3117-9500 Equipment
Circulator Julabo 1124971 Attached to oxygen electrode chamber
Conical flask Isolab 500 mL
Dropper 3 mL
Fixed angle rotor Beckman Coulter JA25.5 Equipment
Funnel Per Alimenti 14 cm For filtering
Gradient pourer Bio-Rad 165-4120 For preparation of gradients
Magnetic Stirrer ATE VELP Scientifica F20300165 Equipment
Miracloth VWR EM475855-1R Filtration material
Mortar and pestle Jamie Oliver Granite, 6 Inch Equipment
O2view Hansatech Instruments Oxygen monitoring software
Oxygraph Plus System Hansatech Instruments 1187253 Clark-type oxygen electrode
Paintbrush Artist first choice 1008R-12
Parafilm Bemis PM-996 plastic paraffin film
Peristaltic pump Gilson F155001 For preparation of gradients
PVC peristaltic tubing Gilson F117930 For preparation of gradients
Water bath VELP Scientifica OCB Equipment

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References

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Tags

生化学、問題 131、シロイヌナズナ、ミトコンドリアの分離、密度勾配、純度、分別、呼吸測定、ブルー ネイティブ ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (BN ページ)、ナトリウム dodecyl 硫酸塩ポリアクリルアミドゲルの電気泳動 (SDS-PAGE)、西部にしみが付くこと
分離と<em>シロイヌナズナ</em>由来のミトコンドリアの呼吸測定
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Lyu, W., Selinski, J., Li, L., Day,More

Lyu, W., Selinski, J., Li, L., Day, D. A., Murcha, M. W., Whelan, J., Wang, Y. Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. (131), e56627, doi:10.3791/56627 (2018).

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