Summary
Mitokondrier er bare en liten prosentandel av anlegget celle, trenger de å bli renset for en rekke studier. Mitokondrier kan isoleres fra forskjellige plante organer ved homogenisering, etterfulgt av differensial og tetthet gradert sentrifugering å få en høyrenset mitokondrie brøkdel.
Abstract
Mitokondrier er viktig organelles involvert i mange metabolske veier i planter, særlig produksjon av adenosin trifosfat (ATP) fra oksidasjon av redusert forbindelser som nikotinamid adenine dinucleotide (NADH) og flavin adenine dinucleotide (FADH2). Komplett merknaden i Arabidopsis thaliana genomet har etablert det som mest brukte anlegget modellsystem, og dermed måtte rense mitokondrier fra forskjellige organer (blad, rot eller blomst) er nødvendig for å utnytte verktøyene som er nå tilgjengelig for Arabidopsis å studere mitokondrie biologi. Mitokondrier er isolert av homogenisering av vev ved hjelp av en rekke tilnærminger, etterfulgt av en rekke differensial sentrifugering trinn produsere olje mitokondrie pellets som er videre renset med kontinuerlig kolloidalt tetthet gradert sentrifugering. Kolloidalt tetthet materialet fjernes senere ved flere sentrifugering trinn. Fra 100 g av friske blad vev, finnes 2-3 mg mitokondrier rutinemessig. Åndedretts eksperimenter på disse mitokondrier Vis typiske priser med 100-250 nmol O2 min-1 mg totale mitokondrie protein-1 (NADH-avhengige rate) muligheten til å bruke ulike underlag og hemmere til å bestemme hvilke underlag er å bli oksidert og de alternative og cytochrome terminal oxidases. Denne protokollen beskriver en isolasjon metode for mitokondrier Arabidopsis thaliana blader med kontinuerlig kolloidalt tetthet forløpninger og en effektiv åndedretts målinger av renset anlegget mitokondrier.
Introduction
Mitokondrielt planteforskning historie går tilbake over 100 år1. Intakt mitokondrier ble isolert tidlig på 1950-tallet ved hjelp av differensial sentrifugering. Ankomsten av en kolloidalt tetthet gradert i 1980 tillatt mitokondrier renses uten lidelse osmotisk justering. Mens gradient renset mitokondrier er passer de fleste formål, grunn av sensitiviteten av massespektrometri, selv relativt mindre forurensning kan oppdages og kan tilordnes feilaktig mitokondrie beliggenhet2. Bruk av fri flyt geleelektroforese kan fjerne både plastidic og peroxisome forurensning3, men uten flyt gelelektroforese er en høyt spesialisert teknikk og er ikke nødvendig for det store flertallet av studier. Videre, når bestemme plasseringen av et protein må være husket at to eller flere målretting av proteiner oppstår i celler. Over 100 dobbelt målrettet proteiner er beskrevet for chloroplasts/plastids og mitokondrier4og en rekke proteiner rettet mot mitokondrier og peroxisomes er også kjent for5. Videre er re plasseringen av proteiner under bestemte stimuli, f.eks oksidativt stress, en nye tema i cellen biologi6. Dermed plasseringen av proteiner må vurderes i forbindelse med biologi studerte, og en rekke tilnærminger brukes til å finne og kontrollere plasseringen2.
Mitokondrier er vanligvis isolert fra anlegget vev av homogenisering, kreves en balanse mellom bryte åpne cellen vegg å løslate mitokondrier og ikke skade mitokondrier. Tradisjonelt med potet og blomkål innebærer homogenisering bruk av husholdningenes blender/juicer apparater for å gjøre en flytende ekstrakt i en buffer med ulike komponenter for å vedlikeholde aktivitet. Isolering av mitokondrier ert blader, (et populært materiale for mitokondrie isolasjon med unge frøplanter (~ 10 dager gamle), benytter en blender til lyse cellene som blad er myk. Med anvendeligheten av Arabidopsis thaliana T-DNA insertional banke-ut linjer, har behovet for å kunne rense mitokondrier å gjennomføre funksjonelle studier behov for utvikling av metoder for å isolere mitokondrier blad, rot eller blomst vev. Samlet jobbet metoder utviklet for andre planter godt7, med perquisite som sliping av materialet måtte optimaliseres. For Arabidopsis dette kan oppnås på en rekke måter (se nedenfor), og varierer mellom vev (rot versus skyte). Bruk av kontinuerlig graderingen kan også optimaliseres som tetthet av mitokondrier fra ulike organer eller utviklingsstadier betyr at de kan overføre annerledes. Dermed for maksimal separasjon være tettheten av graderingen raffinerte slik for å oppnå best separasjon.
Når renset mitokondrier kan brukes for en rekke studier, inkludert protein og tRNA opptak eksperimenter, enzym aktivitet analyser, åndedretts kjeden mål og western blot analyser. Isolert mitokondrier kan også brukes for massespektrometri analyser av protein overflod. Målrettet flere reaksjon overvåking (MRM) analyser tillater kvantifisering av definert proteiner, men krever betydelig analysen utvikling. Derimot gir kvantifisering av dimethyl eller andre isotop etiketter8, en oppdagelse tilnærming identifisere forskjeller over det hele proteom som kan brukes å avdekke romanen biologiske innsikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokollen brukes for isolering av intakt mitokondrier fra Arabidopsis thaliana organer dyrket på jord bruker kontinuerlig kolloidalt tetthet forløpninger. Alle prosedyrer etter samlingen av materialet blir utført på 4 ° C.
1. forberedelse sliping Medium, vaskebuffer og Gradient løsninger
- Forberede 300 mL sliping medium (minus ascorbate og cystein) og 200 mL 2 x vaskebuffer per tabell 1 én dag før isolasjon, holde dem kaldt i 4 ° C.
Merk: Legge til natrium ascorbate og L-cystein (gratis base) i en siste konsentrasjon av 17.84 mM og 20.36 mM, henholdsvis til sliping medium på morgenen isolasjon. Hvis mitokondrier skal brukes for western blot eller blå native-polyakrylamid gel geleelektroforese (BN-side) analyser, utgjør 2 x vaskebuffer uten BSA. - Forberede graderinger på morgenen mitokondrie isolasjon (figur 1 og tabell 1).
- Gjøre de tunge og lette gradient løsningene i kanner; 35 mL av hver er tilstrekkelig for to gradient rør.
- Vask kamrene av gradient måletyper og PVC peristaltiske rør med deionisert vann og sikre selv strømme gjennom slangen alle rør.
- Sted 2 sentrifuge rør (50 mL) i en liten vinkel på is med PVC peristaltiske rør utsalgssteder tapet på innsiden av rør for å sikre gradient løsningen går ned på siden av rør.
- Lukke tilkoblingen mellom indre og ytre kammer (svart spaken ned). Plass gradient måletyper på en magnetisk rørestang med lite bar i indre kammeret.
- Hell 35 mL tunge gradering løsningen i det indre kammeret (kammer rør utløp). Dispensere tunge gradering løsningen i to sentrifuge rør plassert på is inntil halvparten er igjen med peristaltiske pumpe rate satt til rask (300 mL/h).
- Hell 35 mL lys gradient løsningen i det ytre kammeret (kammer uten slangen uttaket). Åpne forbindelsen mellom kammer (push svart lever opp halvveis) og la løsninger å blande forsiktig. Bland løsningene bruker magnetisk rørestang.
- Tillate løsninger kjører sakte (60 mL/h) til alle gradient blandingen har blitt utlevert fra kammer som resulterer i to 0 - 4,4% (w/v) polyvinylpyrrolidone (PVP) forløpningsfylte rør. Holde graderingene på is inntil klar til bruk i trinn 2.12.
Merk: Når graderingen er utarbeidet, fortynne 2 x vask medium til 1 x med prechilled-ikke-ionisert vann og holde kaldt på 4 ° C.
2. homogenisering og mitokondrie isolasjon
- Kutte hele rosett vev fra 4 - uke gamle Arabidopsis planter dyrket på jord med saks, vil minst 80 planter være nødvendig for 1 prep.
Merk: 10-14 dag gammel vann kulturer, minimum 5 Potter/prep eller to - ukers gamle planter dyrket på Murashige & Skoog basale Salt blanding (MS) agar plater, minimum 4 plater, kan også brukes. - Sted halvparten av plantemateriale som har blitt kuttet i små biter i en pre-avkjølt 4 ° C store morter med 75 mL av sliping medium (tabell 1), og slipe mye i flere minutter gjenstår ingen store biter av vev.
- Pre våt 4 lag av filtrering materiale (22-25 µm porestørrelse) med sliping medium og filtrere homogenate gjennom de 4 lag av filtrering materiale gjennom en plast trakt i en 500 mL konisk kolbe.
- Male den resterende halvdelen av vev med en annen 75 mL sliping medium.
- Kombinere homogenates i materialet filtrering og filtrere så mye som mulig homogenate gjennom.
- Grind gjenværende vevet gjenværende filtrering materiale igjen med den gjenværende 150 mL sliping medium, filter i 500 mL konisk kolbe.
- Sentrifuge den filtrerte homogenate i 8 pre kjølt 50 mL plast sentrifuge rør 2500 x g på 4 ° C i en fast vinkel rotor i 5 min.
- Hell nedbryting i ren sentrifuge rør (50 mL, unngå å forstyrre den grønne pellet) og sentrifuge 17.500 x g på 4 ° C for 20 min i en fast vinkel rotor.
- Forkaste alle men < 3 mL nedbryting av aspirasjon (eller forsiktig helle av uten å forstyrre pellet). Forsiktig resuspend pellet i gjenværende nedbryting ved hjelp av en liten fin pensel.
- Legge til 10 mL av 1 x vaskebuffer hver rør og kombinerer 4 rør i 1 ren sentrifuge tube (dvs. som fører til 2 rør).
- Gjenta trinnene 2.7-2.9 fylle disse rør med 1 x vaskebuffer til 50 ml passer.
- Bassenget råolje mitokondrie pellets til 1 rør med en dropper og spre jevnt med fin pensel (en liten mengde vaskebuffer kan brukes, men det endelige volumet må være mindre enn 3 mL passer på graderingen). Forsiktig laget mitokondrie suspensjon med en dropper på den 2 sammenhengende 0 - 4,4% (w/v) PVP forløpninger.
- Balanse rør vekt (med 1 x vaskebuffer) og sentrifuge 40.000 x g ved 4 ° C i 40 min. sikre pause er deaktivert. Mitokondrier vil migrere til et band nederst på røret, eller i den tunge løsningen på bunnen av røret (identifisert av en skyet, gulaktig bandet; Figur 2).
- Fjern forsiktig den øverste 5 cm løsning over mitokondrie bandet av aspirasjon.
- Distribuere gjenværende løsningen som inneholder mitokondrier i 2 ren rør og fyll med 1 x vaskebuffer. Jevnt distribuere kolloidalt tetthet gradert og mitokondrier dekker munnen av rør med en plast parafin film og snu flere ganger. Sentrifuger i 15 min 31 000 x g på 4 ° C med langsom bremsing.
Merk: Før sentrifugering, kontroller at mitokondrier og gjenværende kolloidalt tetthet graderingen fordeles jevnt. Ellers kan kolloidalt tetthet graderingen konsentrere seg på bunnen av røret og hindre pelleting av mitokondrier. - Fjerne nedbryting av aspirasjon, fyll røret med 1 x vask buffer opptil 50 mL og invertere igjen for å sikre miksing. Sentrifuger i 15 min 31 000 x g på 4 ° C med langsom bremsing.
- Sug opp nedbryting og samle mitokondrie pellets i liten et volum (~ 500 µL) som mulig med en pipette endret 200 µL tips (kutte spissen litt over slutten å øke åpningen). Plasser mitokondrier i en 1,5 mL tube og holde på is for umiddelbar bruk eller butikken på-80 ° C.
Merk: Hvis mitokondrier skal brukes for natrium dodecyl sulfat-polyakrylamid gel geleelektroforese (SDS-side), BN-side eller immunoblot analyser, bruke 1 x vaskebuffer uten BSA for de endelige vasker (dvs., trinn 2,15 og 2,16). - Bestemme protein konsentrasjonen av mitokondrier med metoden Bradford.
Merk: For BN side sentrifuge dele 4 ° C, og butikken pellet ved-80 ° C før bruk. For oksygen forbruk målinger, kan bare fersk isolert mitokondrier brukes.
3. oksygen forbruk målinger
Merk: Oksygenforbruk av fersk isolerte anlegget mitokondrier kan analyseres med en Clark-type oksygen elektrode, aktivere fastsettelse av mitokondrie intactness, cytochrome c veien aktivitet og alternative sti aktivitet.
- Programvareinstallasjon
- Installere lisensiert oksygen avlytting programvare på datamaskinen som ble brukt for oksygen forbruk målinger.
- Utarbeidelse av åndedrett medium, underlag, kjemiske lager løsninger og Clark-type oksygen elektroden
- Forberede åndedrett medium (300 mM sukrose, 10 mM NaCl, 5 mM KH2PO4, 2 mM MgSO4, 0,1% (w/v) bovin serum albumin (BSA), 10 mM TES (pH 7.2)) brukes for oksygen forbruk analyser.
- Forberede underlag og hemmere effektor brukes for å måle mitokondrie åndedrett (tabell 2). Disse kan være forberedt tidligere og lagret på 20 ° C.
Merk: Nøytralisere pH i surt løsninger som organiske syrer til pH 7.0 med NaOH før bruk. - Varm åndedrett mediet til samme temperatur som analysen kammeret (25 ° C).
- Samle Clark-type oksygen elektroden som beskrevet i protokollen til produsenten.
- Sted 1 mL luft-mettet vann (luft-mettet vannet er oppnådd ved å riste kraftig en liten mengde deionisert vann i en stor konisk kolbe) i måling kammeret. Hvis du vil slå på rørestang, klikker du "Rørestang Speed". Klikk knappen "På" og stille rørestang til 65 rpm. Klikk "OK" for å fortsette. Rør vannet kontinuerlig på 25 ° C.
- Kalibrering av oksygen elektrode
- Varme vannet som skal brukes for kalibrering til samme temperatur som analysen kammeret (25 ° C).
- Vent til gjeldende å stabilisere og kalibrere oksygen elektroden.
- For å starte kalibrering av oksygen elektroden, klikk "Kalibrer", velg "Flytende fase kalibrering" og deretter "Air mettet vann."
- Et nytt vindu åpnes (oksygen kalibrering (flytende fase) - trinn 1 av 5). Velg kanalen kalibrere (kanalen elektrode kontrollboksen er knyttet til) og skrive inn variabler (sett "Kammertemperatur" 25 ° c og "Atmosfærisk trykk" til 101.32 kPa). Klikk "OK" for å fortsette.
- I neste trinn (trinn 2 av 5), oppsett rørestang hastigheten (65 rpm) og klikk "OK" for å fortsette.
- I trinn 3 av 5 vent på signalet til nå platå. Begrepet "platå nådd, trykker du OK" vises i boksen. Klikk "OK" for å fortsette.
- I trinn 4 av 5, etablere null oksygen i kammeret ved å legge til 5 mg natrium dithionite. Klikk "OK" for å fortsette.
Merk: En nedgang i oksygen konsentrasjon skal være synlig i sporet og skal nå 0. - I det siste trinnet i kalibrering (trinn 5 av 5), må du vente på signalet til nå platå. Begrepet "platå nådd, trykker du OK" vises i boksen. Klikk "OK" for å fortsette.
- Klikk "Lagre kalibrering" for å lagre kalibreringen. Et nytt vindu åpnes. Klikk "OK" for å bekrefte for å lagre den nye kalibreringen i boksen oksygen kontroll.
Merk: Etter vellykket kalibrering, merking "oksygen (nmol/mL)" vises på y-aksen. - Etter kalibrering, rengjør du måle kammeret ved skylling kammeret med vann (minst 5 - 10 ganger) for å sikre riktig rengjøring. Sted 1 mL av åndedrett medium i målingen kammer og la membranen til equilibrate i noen minutter før oksygen forbruk er lineær.
- Tilpasse omfanget av oksygen inntak spor å se god skråningen. Klikk "Zoom XY" og angi variabler (satt "Oksygen" til 0 - 300 og "Tidsaksen" 0 - 45 min).
- Fastsettelse av mitokondrie integritet
- Legge til 970 µL luft-mettet åndedrett medium til reaksjon chamber ventilen åpen.
- Legge til 30 µL isolert mitokondrier eller 150 µg totale mitokondrie protein som bestemmes etter mitokondrier isolasjon (totalt protein må være inkludert i etterpå) til reaksjon chamber bruker en pipette med et kutt tips.
- Rør mitokondrie suspensjon kontinuerlig med en magnetisk rørestang bar (65 rpm) ved 25 ° C til luft-mette løsningen.
- Forsegle til kammeret stempelet, klikk "Start registrering" for å registrere oksygenforbruk, og tillater oksygen forbruk spor å stabilisere (1-2 min).
- Bestemme frekvensen av oksygenforbruk manuelt etter 10 mM ascorbate og 25 µM cytochrome c i 5 minutter å få den "før vaskemiddel" rate.
Merk: Hvis etiketten underlag, hemmere og effektor direkte i sporingen, klikk "Legg til hendelsen merke" og angi tilsvarende etikett betegnelsen. Klikk "OK" for å fortsette. - Bestemme frekvensen av oksygenforbruk manuelt for 3 min etter 0,05% (v/v) vaskemiddel for å gi den "etter vaskemiddel" rate. Klikk "Stopp innspilling."
- Klikk "Priser for endring bord". 2 markører vises som loddrette linjer på diagrammet skjermen. Klikk og dra par rate pekere til de nødvendige stillingene i spor til å definere hastighet intervallet. Flytt hastighet intervallet langs spor bruke venstre hastigheten markøren. Angi hastigheten selv benytter rett hastigheten markøren. Oksygen avlytting programvare automatisk trekker en linje for beste tilpasning mellom to pekere mens du flytter rate intervall pekere langs spor.
- Når de ønsket hastighet intervall og plassering er definert, angi frekvensen i tabellen med et høyreklikk på 1 av 2 pekere, og velg "Legg Rate tabellen." Klikk "Add"-knappen for å bekrefte for å vise prisen på tabellen viktigste rente.
- Beregn mitokondrie integritet ved å dele "før vaskemiddel" hastigheten av "etter vaskemiddel" ofte, uttrykt i prosent, og trekke det fra 100.
- Fastsettelse av mitokondrie respirasjon
- Legge til 970 µL av luft-mettet åndedrett medium til reaksjon chamber ventilen åpen. Legg til 500 µM ATP og 30 µL isolert mitokondrier eller 150 µg totale mitokondrie protein bruker en pipette med kutt tips til åndedrett mediet i reaksjon kammeret.
- Rør mitokondrie suspensjon kontinuerlig med en magnetisk rørestang bar (65 rpm) på 25 ° C.
- Lukk stempelet, klikk "Start registrering" for å registrere oksygenforbruk og vente på 1-2 min for oksygen forbruksraten å stabilisere (når oksygen forbruk er lineær). Legge til 5 mM succinate. Registrere oksygen forbruksraten i ca 2 minutter.
Merk: Hvis etiketten underlag, hemmere og effektor direkte i sporingen, klikk "Legg til hendelsen merke" og angi tilsvarende etikett betegnelsen. Klikk "OK" for å fortsette. - Legg 1 mM adenosindifosfat (ADP). Fortsette innspillingen oksygen forbruksraten i 2 minutter.
- Legg 1 mM NADH. Registrere oksygen forbruksraten for 4-8 min. Denne prisen er kapasiteten til åndedrett via cytochrome oxidase.
- Legg 1 mM kalium cyanid (KCN) (eller 2,5 µM myxothiazol eller 5 µM antimycin A) å hemme den cytochrome c sti, og fortsetter å spille inn i ca 2 minutter å observere oksygenforbruk via den alternative oksidase.
- Legge til 5 mM dithiothreitol (DTT) og 10 mM pyruvate fullt aktivere den alternative oksidase. Fortsette å spille i 5-7 min: Dette er kapasiteten til den alternative oksidase.
- Legg 500 µM n-propyl gallate (nPG), og registrere i 2 minutter. Dette vurderer gjenværende oksygen forbruksraten som ikke kan bli kjemisk hemmet. Trekk denne prisen fra de andre prisene registrert, er det ikke sikkert å bli mitokondrie opprinnelse. Oksygenforbruk fortsatt oppstår etter hemming av cytochrome c og AOX sti (ved KCN og nPG) er svært sannsynlig å komme fra peroxidases tilstede som forurensninger i isolerte mitokondrier9.
- Klikk "Stopp innspilling."
- Klikk "Priser for endring bord" og angi sats i tabellen med en rett på en av to pekere, og velg "Legg til satstabell". Klikk "Add"-knappen for å bekrefte for å vise prisen på tabellen viktigste rente.
Merk: Når tilføyer effektor oppløst i organiske løsemidler (f.eks., antimycin A, nPG, myxothiazol), kammer og stempelet må være skylles med etanol og deretter vann for å sikre riktig rengjøring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bruker denne protokollen, kunne vi finne ulike mitokondrie proteiner av SDS side og immunoblotting. Som vist i figur 3A, er protein isolert fra vann kultur vev tilstrekkelig til å oppdage en svak band (2 µg). Signalet intensitet øker proporsjonalt til beløp lastet. For mitokondrier isolert fra vev vokst på plater (figur 3B), responsen på høy lys stress kan behandling i ulike genotyper analyseres av immunodetection med alternative oksidase antistoffer.
Intactness av mitokondrier, cytochrome c veien aktivitet og alternative veien kan måles fersk isolert mitokondrie utvalg. Mitokondrielt integritet er godt bevart under beskrevet isolasjon prosedyren (figur 4A). Legge forskjellige underlag, hemmere og effektor til isolerte mitokondrier, oksygenforbruk gjennom cytochrome c veien og alternative oksidase veien er påvirket (figur 4B).
Figur 1: oppsett for utarbeidelse av graderingene. Venstre: Sentrifuge rør (50 mL) med en liten vinkel plassert på is med PVC peristaltiske rør utsalgssteder teipet på innsiden av rør; Midten: Peristaltiske pumpen; Høyre: Gradient måletyper på en magnetisk rørestang som inneholder den tunge gradering (indre kammer) og lys gradient (ytre kammer) løsninger. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: rensing av mitokondrier fra Arabidopsis skyter med en sammenhengende 0 - 4,4% (w/v) PVP/28% kolloidalt tetthet gradert. Mørk grønne bandet er thylakoids og andre forurensing som angitt i toppen av gradient løsninger. Mitokondrielt brøkdel dukket opp som en hvit-grønn band nærmere til bunnen av røret. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: separasjon av mitokondrie proteiner av SDS side og immunodetection med spesifikk antistoffene. (A) mitokondrier isolert fra to uke gamle vann-kulturperler Arabidopsis thaliana wild type (Columbia-0, Col-0) planter ble utsatt for SDS side og analysert med antistoffer reist mot NADH: ubiquinone oxidoreductase delenhet S4 ( Ndufs4, At5g67590). Molekylvekt unstained kvinne markører var lastet på ytre kjørefelt av gel og størrelsen på ti representant felt i kilo Daltons (kDa). Tilsynelatende molekylær masse Ndufs4 protein oppdaget er 18 kDa. Protein overflod vises i forhold til verdien av 2 µg totale protein. (B) to-uke-gamle planter dyrket på Gamborg's B5 media med 3% (w/v) sukrose og 0,8% agar (w/v) ble utsatt for 750 µE m-2 s-1 Merk (HL) og høstet etter 6 h. mitokondrier ble renset og mitokondrie proteiner var atskilt med SDS side og analysert med antistoffer reist mot alternative oxidase (AOX). Tilstedeværelsen av en immunodetectable AOX protein med en tilsynelatende molekylær masse 34 kDa angis. Protein overflod vises i forhold til verdien for kontrollen (2 µg). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Representant spor av O2 forbruk av isolerte plante mitokondrier. (A) mitokondrier isolert fra Arabidopsis thaliana vill-type planter (Col-0) som skissert ovenfor ble analysert for ytre membran integritet før oksygen forbruk målinger. 30 µL av isolerte mitokondrier (150 µg totale mitokondrie protein) ble brukt. Mitokondrielt integritet identifiserte 90% som beskrevet ovenfor. (B) oksygen forbruk målinger ble utført med 30 µL av isolerte mitokondrier (150 µg totale mitokondrie protein) fra Arabidopsis thaliana vill-type planter. Totalt mitokondrie åndedrett og AOX veien var bestemt. Fra disse dataene, kan oksygenforbruk gjennom cytochrome c veien og AOX veien bestemmes. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Sliping medium | |
| Kjemisk | Konsentrasjon |
| Sukrose | 0,3 M |
| tetrasodium pyrophosphate (Na4P2O7 · 10 H2O) | 25 mM |
| EDTA disodium salt | 2 mM |
| Kalium fosfat monobasic (KH2PO4) | 10 mM |
| Polyvinylpyrrolidone (PVP40) | 1% (w/v) |
| Storfe serum albumin (BSA) | 1% (w/v) |
| Deionisert vann | |
| Justere pH til 7.5 (bruker HCl) | |
| Merk: For 300 mL sliping middels, 1.06 g natrium ascorbate (siste konsentrasjon: 17.84 mM) og 0.74 g cystein (siste konsentrasjon: 20.36 mM) legges bare før bruk. Kontrollere pH etter tillegg og justere til 7.5 med 1 M NaOH hvis nødvendig. | |
| 2 X vaske bufferen | |
| Kjemisk | Konsentrasjon |
| Sukrose | 0.6 M |
| TES | 20 mM |
| Storfe serum albumin (BSA) | 0,2% (w/v) |
| Deionisert vann | |
| Justere pH til 7.5 (med NaOH) | |
| Graderinger | |
| Tunge gradering løsning (4,4% (w/v) PVP) | 2 gradient rør |
| 2 X vaske bufferen | 17.5 mL |
| Colloidial tetthet gradert | 9,8 mL |
| PVP-40 (20% (w/v)) | 7.7 mL |
| Lys Gradient løsning (0% (w/v) PVP) | 2 gradient rør |
| 2 X vaske bufferen | 17.5 mL |
| Colloidial tetthet gradert | 9,8 mL |
| Deionisert vann | 7.7 mL |
Tabell 1: Sammensetning av buffere og graderinger brukes for mitokondrier isolasjon.
| Forkortelse | Konsentrasjonen av lager løsninger | Lagring | Siste konsentrasjon | Volum lagt for 1 ml reaksjon | |
| Underlag | |||||
| Cytochrome c | Cyt c | 2,5 (i H2O) | -20 ° C | 25 ΜM | 10 μl |
| NADH | NADH | 0.1 M (i H2O) | -20 ° C | 1 mM | 10 μl |
| Succinate | Succ | 500 mM (i H2O) | -20 ° C | 5 mM | 10 μl |
| Hemmere | |||||
| Antimycin A | AA | 1 mM (i EtOH) | -20 ° C | 5 ΜM | 5 μl |
| Cyanid | KCN | 100 mM (i H2O) | 4 ° C | 1 mM | 10 μl |
| Myxothiazol | Myxo | 500 μM (i EtOH) | -20 ° C | 2,5 ΜM | 5 μl |
| n-Propyl gallate | nPG | 100 mM (i EtOH) | -20 ° C | 500 ΜM | 5 μl |
| Effektor | |||||
| ADP | ADP | 100 mM (i H2O) | -20 ° C | 1 mM | 10 μl |
| Ascorbate | ASC | 500 mM (i H2O) | Gjør frisk ved bruk | 10 mM | 20 µL |
| ATP | ATP | 100 mM (i H2O) | -20 ° C | 500 ΜM | 5 μl |
| Dithiotreitol | DTT | 1 M (i H2O) | Gjør frisk ved bruk | 10 mM | 10 μl |
| Pyruvate | Pyr | 1 M (i H2O) | -20 ° C | 10 mM | 10 μl |
| Vaskemiddel | 10% (v/v) (i H2O) | 4 ° C | 0,05% (v/v) | 5 μl | |
Tabell 2: Liste over underlag, hemmere og effektor brukes for oksygen forbruk målinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vanligvis går isolering av mitokondrier fra Arabidopsis gir opp 3 mg mitokondrier fra ca 80-100 3 - 4 - uke gamle planter, men gir større enn 5 mg oppnås ofte med grundig sliping. Avkastningen varierer med vekst forhold og reduserer dramatisk som forlater senesce, selv om mitokondrier struktur synes å være godt vedlikeholdt under senescence9. En av de viktigste funksjonene for å få en god avkastning er metoden for sliping å lyse cellene å løslate mitokondrier. Mens en rekke mekaniske sliping apparater er tilgjengelig for kjøp, for Arabidopsis presterer sliping i en morter konsekvent i form av avkastning, som det lyses cellene med lite skader organeller. Mens mekaniske kverner er raske, de krever optimalisering og mengden av sliping kreves kan variere avhengig av vev. Med en morter og pistil, er det ofte praktisk og mer effektiv Hvis vevet er skiver eller kuttet med kniv eller saks før sliping. Som det fremgår, alle trinnene må utføres på 4 ° C og hele prosedyren fra slutten av sliping å oppnå vasket pellets av renset mitokondrier tar ca 4 timer. Som spor av vaskemidler eller andre reagenser på rør eller gradient tuter kan dramatisk redusere avkastning, er alle komponenter som brukes i disse prosedyrene vasket uten vaskemiddel og ikke brukes i andre prosedyrer. Til slutt, er det viktig at mitokondrier er tilstrekkelig atskilt fra andre fraksjoner i graderingen å tillate dem å bli fjernet og vasket. Hvis de er for nær bunnen av røret, betyr det at blanding av lette og tunge løsningene må justeres, slik at flere av tunge løsningen å helle før blande. Omvendt, hvis bandet vises diffus og høy i røret, blande må komme litt tidligere.
Metoden skissert her kan lett brukes for isolering av mitokondrier Arabidopsis blomst og rot vev11,12. For røtter er det praktisk å vokse i hydroponic kultur og trenger 100 g fersk vekt å få 2 mg mengder mitokondrier. For sliping røtter bør kuttes i små biter før sliping i en morter og øke avkastningen kan fås ved å slipe rot vevet, i en morter eller i en blender. For floral vev der mitokondrie er forbedret13, sliping med en morter og pistil fungerer bra, men begrenset mengde materiale betyr at må mye planter dyrkes å høste vevet. Mitokondrier er isolert fra forskjellige Arabidopsis organer med lignende metoder eller små modifikasjoner14,15 og ris (Oryza sativa)16.
Begrensningene for metoden beskrevet ovenfor er i) store mengder frø kreves for mitokondrie isolasjon, ii) bare bestemt vev fra Arabidopsis og ris brukes i denne isolasjon metoden iii) små mengder av forskjellige miljøgifter (slik som peroxisomal proteiner) fortsatt eksisterte i renset mitokondrier. Mitokondrier Hentet ved hjelp av metodene beskrevet ovenfor er egnet for en rekke studier, mellom oksygen opptak studier kvantitative massespektrometri analyser av protein overflod. Gradient renset mitokondrier fremdeles inneholder små mengder av ulike forurensning, for eksempel peroxisomal proteiner3. En sammenligning med definerte organelle lister kan brukes til å angi endringer i mitokondrie proteiner, som forurensning av ikke-Mitokondrielt proteiner er liten (< 10%) og tilsvarende prøver sammenlignes, så type og grad av ikke-Mitokondrielt proteiner ligner. Analyser av protein overflod av SDS-side eller andre gel-baserte tilnærminger kan gjennomføres med relativt små mengder mitokondrier (2-20 µg), med varierende mengder mitokondrier sjekke linearitet av gjenkjenning av antistoffer (Figur 3). Mens porin (spenning avhengig anion kanal (VDAC)) brukes ofte som en lasting for kvantifisering, vår erfaring kan relativt stor overflod av dette proteinet bety at svaret er ofte ikke lineær hvis store mengder protein er lastet på gel , så linearitet av antistoffet svaret bør sjekkes når slike lasting kontroller. Betydningen av denne tilnærmingen av aisolering mitokondrier er at i motsetning til forløpninger som bruker sukrose som materialet til tetthet graderingen, kolloidal tetthet forløpninger ikke krever osmotisk re-justering av renset mitokondrier som kreves med sukrose. Dette betyr at det er mindre sjanse rupturing renset mitokondrier og etter vask fjerne kolloidalt tetthet materialet, de kan direkte brukes i en rekke analyser eller programmer.
Vev blots, der oppdages mitokondrie proteiner fra hele blad eller vev ekstrakter, er en tiltalende tilnærming til måle mengden av mitokondrie proteiner i at vev. Gitt generelt lavt volum av mitokondrier sammenlignet med andre, ut gjenkjenning av mitokondrie protein på hele vev må tolkes med forsiktighet, som mitokondrie protein kan være utenfor gjenkjenning i slike tilnærminger. Forsiktig kontroller, der renset mitokondrier er electrophoresed sammen med vev ekstrakter å sikre identisk migrasjon og linearitet av gjenkjenning, må utføres ha tillit til disse.
Med hjelp av en Clark-type oksygen elektrode, kan endringer i oksygen delvis presset av en løsning måles. Faktiske elektroden består av en platina katode og en sølv anoden, som er forbundet med KCl bru og dekket av en elektrolytt-fuktet papir (sigarett papir) og en oksygen-gjennomtrengelig membran (polytetrafluoroethylene membran). En spenning på 600-700 mV fører til reduksjon av oksygen, gi en lineær sammenheng mellom oksygen konsentrasjon og spenning. Oksygen elektrodene er tilgjengelige kommersielt fra ulike selskaper. Hvert selskap har sine egne instruksjoner om montering og oppsett av oksygen elektroden. Men må generelt sølv anoden og platina katoden av elektroden disken renses ved hjelp av en elektrode rensing kit eller et viskelær penn før montering. Det er viktig å sikre at luftbobler ikke form under montering (f.eks mellom polytetrafluoroethylene membranen og sigarett papiret). Etter forsamling må elektrode disken knyttes til kammeret med platina katoden innsnittene i bunnen av. Kammeret selv er omgitt av en vann jakke sikre temperaturkontroll. Det er svært viktig at kammeret er alltid igjen full av vann, siden membranen vil tørke ut og sprekke ellers. Likeledes må membranen ikke bli rørt av Pipetter eller sprøyter når forbindelser til kammeret, for å unngå å rive.
Før analysen, åndedrett mediet skal være oppvarmet til samme temperatur som analysen kammeret (i de fleste tilfeller 25 ° C) og membranen bør tillates equilibrate i åndedrett buffer for et par minutter. Etter avsluttende stempelet for oksygenopptak søk, skal tillegg av effektor molekyler utføres ikke-disponible mikroliter sprøyter (f.eks mikro sprøyter) eller disponibel gel lasting pipette-spisser. Hvis bruker micro sprøyter, må det sikres at sprøyten er grundig skylt med 100% etanol og vann mellom tillegg, unngå forurensende lager løsninger. Dette gjelder også for å vaske kammer mellom målinger. De fleste reagenser i oksygen forbruk analyser er løselig i vann, og kan enkelt fjernes ved flere skylling med vann (omtrent fem ganger) mellom målinger. Men er noen kjemikalier brukes for analyser bare løselig i organiske løsemidler, for eksempel antimycin A, myxothiazol og nPG. Kammeret må derfor være skylles med en organisk løsemiddel (50% (v/v) etanol) mellom analyser fjerne gjenværende spor av disse molekyler, og deretter med vann (omtrent fem ganger) for å tømme rester.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av en australsk Research Council kompetansesenter i anlegget energi biologi CE140100008, en australsk Research Council fremtiden Fellowship (FT130100112) ÅRENE og en Fjodor Lynen forskningsstipend (Alexander von Humboldt Foundation, Tyskland) til JS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADP | Sigma-Aldrich | A2754 | Chemical |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | Chemical, dissolve in ethanol |
| AOX antibody | from Tom Elthon | Elthon et al., 1989 | |
| Ascorbate | Sigma-Aldrich | A0157 | Ascorbate Oxidase from Cucurbita sp. |
| ATP | Sigma-Aldrich | A26209 | Chemical |
| Bovine serum albumin (BSA) | Bovogen | BSAS 1.0 | Chemical |
| Clarity western ECL substrate | Bio-Rad Laboratories | 1705061 | Chemical |
| Criterion Stain-Free Precast Gels 8-16% 18 Wells | Bio-Rad Laboratories | 5678104 | Chemical |
| Cyanide | Sigma-Aldrich | 60178 | Chemical |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C3131 | Chemical |
| Difco Agar, granulated | BD Biosciences | 214530 | Chemical |
| Dithiotreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | Chemical |
| EDTA disodium salt | Sigma-Aldrich | E5134 | Chemical |
| Gamborg B-5 Basal Medium | Austratec | G398-100L | Chemical |
| Gamborg Vitamin Solution (1000x) | Austratec | G219-100ML | Chemical |
| Goat Anti-Mouse IgG (H + L)-HRP Conjugate | Bio-Rad Laboratories | 1706516-2ml | Chemical |
| Goat Anti-Rabbit IgG (H + L)-HRP Conjugate | Bio-Rad Laboratories | 1706515-2ml | Chemical |
| L-Cysteine | Sigma | C7352-100G | Chemical |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 230391 | Chemical |
| Murashige & Skoog Basal Salt Mixture (MS) | Austratec | M524-100L | Chemical |
| Myxothiazol | Sigma-Aldrich | T5580 | Chemical, dissolve in ethanol |
| NADH | Sigma-Aldrich | N8129 | Chemical |
| Ndufs4 antibody | from Etienne Meyer | Meyer et al., 2009 | |
| n-Propyl gallate | Sigma-Aldrich | P3130 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | Chemical, colloidal density gradient |
| Polyvinylpyrrolidone (PVP40) | Sigma-Aldrich | PVP40 | Chemical |
| Potassium cyanide | Sigma-Aldrich | 60178 | Chemical |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | Chemical |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | Chemical |
| Sodium chloride | Chem-Supply | SA046 | Chemical |
| Sodium dithionite | Sigma-Aldrich | 157953 | Chemical |
| Sodium L-ascorbate | Sigma | A4034-100G | Chemical |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S2378 | Chemical |
| Sucrose | Chem-Supply | SA030 | Chemical |
| TES | Sigma-Aldrich | T1375 | Chemical |
| Tetrasodium pyrophosphate (Na4P2O7 · 10H2O) | Sigma-Aldrich | 221368 | Chemical |
| Trans-Blot Turbo RTA Midi Nitrocellulose Transfer Kit | Bio-Rad Laboratories | 1704271 | Chemical |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | X100 | Chemical, detergent |
| Western Blocking Reagent | Sigma | 11921681001 | Chemical |
| Balance | Mettler Toledo | XS204 | Equipment |
| Beakers | Isolab | 50 mL | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-26XP | Equipment |
| Centrifuge tubes | Nalgene | 3117-9500 | Equipment |
| Circulator | Julabo | 1124971 | Attached to oxygen electrode chamber |
| Conical flask | Isolab | 500 mL | |
| Dropper | 3 mL | ||
| Fixed angle rotor | Beckman Coulter | JA25.5 | Equipment |
| Funnel | Per Alimenti | 14 cm | For filtering |
| Gradient pourer | Bio-Rad | 165-4120 | For preparation of gradients |
| Magnetic Stirrer ATE | VELP Scientifica | F20300165 | Equipment |
| Miracloth | VWR | EM475855-1R | Filtration material |
| Mortar and pestle | Jamie Oliver | Granite, 6 Inch | Equipment |
| O2view | Hansatech Instruments | Oxygen monitoring software | |
| Oxygraph Plus System | Hansatech Instruments | 1187253 | Clark-type oxygen electrode |
| Paintbrush | Artist first choice | 1008R-12 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | plastic paraffin film |
| Peristaltic pump | Gilson | F155001 | For preparation of gradients |
| PVC peristaltic tubing | Gilson | F117930 | For preparation of gradients |
| Water bath | VELP Scientifica | OCB | Equipment |
References
- Day, D. A. Highlights in plant mitochondrial research. Methods in molecular biology. Plant mitochondria. 1305, v-xvi (2015).
- Millar, A. H., Carrie, C., Pogson, B., Whelan, J. Exploring the function-location nexus: Using multiple lines of evidence in defining the subcellular location of plant proteins. Plant Cell. 21 (6), 1625-1631 (2009).
- Eubel, H., et al. Free-flow electrophoresis for purification of plant mitochondria by surface charge. Plant J. 52 (3), 583-594 (2007).
- Murcha, M. W., et al. Protein import into plant mitochondria: Signals, machinery, processing, and regulation. J. Exp. Bot. 65 (22), 6301-6335 (2014).
- Carrie, C., et al. Approaches to defining dual-targeted proteins in Arabidopsis. Plant J. 57 (6), 1128-1139 (2009).
- Pinto, G., Radulovic, M., Godovac-Zimmermann, J. Spatial perspectives in the redox code - Mass spectrometric proteomics studies of moonlighting proteins. Mass Spectrom. Rev. , (2016).
- Day, D. A., Neuburger, M., Douce, R. Biochemical characterisation of chlorophyll-free mitochondria from pea leaves. Aust. J. Plant Physiol. 12 (3), 219-228 (1985).
- Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nat. Protoc. 4 (4), 484-494 (2009).
- Cheah, M. H., et al. Online oxygen kinetic isotope effects using membrane inlet mass spectrometry can differentiate between oxidases for mechanistic studies and calculation of their contributions to oxygen consumption in whole tissues. Anal Chem. 86 (10), 5171-5178 (2014).
- Chrobok, D., et al. Dissecting the metabolic role of mitochondria during developmental leaf senescence. Plant Physiol. 172 (4), 2132-2153 (2016).
- Lee, C. P., Eubel, H., O'Toole, N., Millar, A. H. Combining proteomics of root and shoot mitochondria and transcript analysis to define constitutive and variable components in plant mitochondria. Phytochemistry. 72 (10), 1092-1098 (2011).
- Lee, C. P., Eubel, H., Solheim, C., Millar, A. H. Mitochondrial proteome heterogeneity between tissues from the vegetative and reproductive stages of Arabidopsis thaliana development. J. Proteome Res. 11 (6), 3326-3343 (2012).
- Millar, A. H., Whelan, J., Soole, K. L., Day, D. A. Organization and regulation of mitochondrial respiration in plants. Annu. Rev. Plant Biol. 62, 79-104 (2011).
- Peters, K., et al. Complex I - complex II ratio strongly differs in various organs of Arabidopsis thaliana. Plant Mol. Biol. 79 (3), 273-284 (2012).
- Werhahn, W. H., et al. Purification and characterization of the preprotein translocase of the outer mitochondrial membrane from Arabidopsis thaliana: Identification of multiple forms of TOM20. Plant Physiol. 125 (2), 943-954 (2001).
- Heazlewood, J. L., Howell, K. A., Whelan, J., Millar, A. H. Towards an analysis of the rice mitochondrial proteome. Plant Physiol. 132 (1), 230-242 (2003).
