Summary
Como as mitocôndrias são apenas uma pequena percentagem da célula vegetal, eles precisam ser purificado para uma gama de estudos. Mitocôndrias podem ser isoladas em uma variedade de órgãos da planta por homogeneização, seguida de centrifugação gradiente diferencial e densidade para obter uma fração mitocondrial altamente purificada.
Abstract
As mitocôndrias são organelas essenciais envolvidos em diversas vias metabólicas nas plantas, mais notavelmente a produção de adenosina trifosfato (ATP) a partir da oxidação de compostos reduzidos como o dinucleótido de nicotinamida e adenina (NADH) e adenina flavina dinucleótido (DANIII2). A anotação completa do genoma de Arabidopsis thaliana tem estabelecido como o mais amplamente utilizado sistema modelo de planta, e assim a necessidade de purificar a mitocôndria de uma variedade de órgãos (folha, raiz ou flor) é necessária utilizar plenamente as ferramentas que estão agora disponíveis para Arabidopsis estudar Biologia mitocondrial. As mitocôndrias são isoladas por homogeneização do tecido usando uma variedade de abordagens, seguido por uma série de etapas de centrifugação diferencial, produzindo uma pelota mitocondrial bruta que é ainda mais purificada usando gradiente de densidade colloidal contínua centrifugação. O material de densidade coloidal é posteriormente removido por várias etapas de centrifugação. A partir de 100 g de tecido foliar fresco, 2-3 mg de mitocôndrias pode ser rotineiramente obtido. Experiências respiratórias com essas mitocôndrias exibir as taxas típicas de 100-250 nmol O2 min-1 mg proteína mitocondrial total-1 (taxa de NADH-dependente) com a capacidade de usar diferentes substratos e inibidores para determinar quais substratos estão sendo oxidados e a capacidade das alternativa e citocromo oxidases terminais. Este protocolo descreve um método de isolamento de mitocôndrias de Arabidopsis thaliana folhas usando gradientes de densidade colloidal contínua e uma eficiente medições respiratória de mitocôndrias de plantas purificada.
Introduction
A história da pesquisa mitocondrial planta remonta a mais de 100 anos1. Mitocôndrias intactas foram primeiramente isoladas no início de 1950 usando centrifugação diferencial. O advento de um gradiente de densidade coloidal na década de 1980 permitiu a mitocôndria ser purificado sem sofrer ajuste osmótico. Enquanto as mitocôndrias purificadas gradientes são adequadas para os fins mais, devido à sensibilidade de espectrometria de massa, mesmo relativamente menores contaminantes podem ser detectados e podem ser inadequadamente atribuídos uma localização mitocondrial2. O uso de fluxo livre eletroforese pode remover ambos plastidic e Peroxissoma contaminação3, mas o livre fluxo de electroforese é uma técnica altamente especializada e não é necessária para a grande maioria dos estudos. Além disso, quando determinar a localização de uma proteína que precisa ser lembrado que dupla ou múltipla segmentação das proteínas ocorre nas células. Mais de 100 proteínas alvo duplas são descritas por cloroplastos/plastídios e mitocôndrias4e um número de proteínas direcionados para mitocôndrias e peroxissomos são também conhecidos5. Além disso, a re-localização de proteínas sob estímulos específicos, por exemplo, estresse oxidativo, é um tema emergente na célula biologia6. Assim, a localização de proteínas precisa ser considerado no contexto da biologia estudou, e uma variedade de abordagens são usadas para determinar e verificar o local2.
As mitocôndrias são tipicamente isoladas de tecidos vegetais por homogeneização, um equilíbrio é necessário entre quebrar aberto a parede celular para liberar as mitocôndrias e não danificar as mitocôndrias. Tradicionalmente, com batata e couve-flor, homogeneização envolve o uso de aparelhos domésticos de liquidificador/espremedor para fazer um extrato líquido em um buffer com vários componentes para manter a atividade. Isolamento de mitocôndrias de folhas de ervilha, (um material popular para isolamento mitocondrial usando mudas jovens (~ 10 dias de idade), utiliza um liquidificador para lyse pilhas como o material da folha é macio. Com a disponibilidade de linhas de nocaute insercional Arabidopsis thaliana T-DNA, a necessidade de ser capaz de purificar as mitocôndrias para realizar estudos funcionais exigiu o desenvolvimento de métodos para isolar mitocôndrias de folha, raiz ou flor tecido. No geral, os métodos desenvolvidos para outras plantas trabalharam bem7, com a gratificação que moagem do material necessário para ser otimizado. Para Arabidopsis, isto pode ser alcançado em uma variedade de maneiras (veja abaixo) e difere entre os tipos de tecido (raiz contra atirar). O uso do gradiente contínuo também pode ser otimizado como a densidade de mitocôndrias de diferentes órgãos ou fases do desenvolvimento, eles podem migrar de forma diferente. Assim, para a separação máxima a densidade do gradiente pode ser refinada para garantir para alcançar a melhor separação.
Uma vez purificado a mitocôndria pode ser usada para uma variedade de estudos, incluindo experimentos de absorção de proteína e tRNA, ensaios de atividade enzimática, borrão ocidental análises e medições de cadeia respiratória. Mitocôndrias isoladas também podem ser usadas para análise de espectrometria de massa da abundância de proteína. Alvo de reação múltiplas análises (MRM) de monitoramento permite a quantificação de definidas proteínas, mas exigem o desenvolvimento significativo do ensaio. Em contraste, quantificação de dimetil ou outros rótulos de isótopo8, fornece uma abordagem de descoberta em identificar diferenças entre o proteome inteiro que pode ser usado para descobrir novos insights biológicas.
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Protocol
Este protocolo é usado para a isolação de mitocôndrias intactas de órgãos de Arabidopsis thaliana cultivadas em solo usando gradientes de densidade colloidal contínua. A coleta do material a seguir todos os procedimentos são realizados a 4 ° C.
1. preparação de moagem média, Wash Buffer e soluções de gradientes
- Preparar 300 mL de moagem média (menos ascorbato e cisteína) e 200 mL de tampão de lavagem 2 x por tabela 1 um dia antes do isolamento, mantê-los frios a 4 ° C.
Nota: Adicione ascorbato de sódio e L-cisteína (base livre) a uma concentração final de 17,84 e 20,36 mM, respectivamente, para o meio de moagem na manhã do isolamento. Se as mitocôndrias são a ser usado para o borrão ocidental ou nativo-poliacrilamida azul gel análises de eletroforese (BN-página), compõem 2x do tampão de lavagem sem BSA. - Prepare-se gradientes na manhã do isolamento mitocondrial (Figura 1 e tabela 1).
- Fazer as soluções gradientes pesadas e leves dois copos; 35 mL de cada uma é suficiente para dois tubos de gradientes.
- Lave as câmaras do gradiente com bico e peristáltico tubos de PVC com água desionizada e garantir o mesmo fluxo através do tubo do tubo todas.
- Colocar 2 tubos de centrífuga (50 mL) em um ângulo ligeiro no gelo com as tomadas de tubulação peristáltica PVC colado no interior dos tubos para assegurar que a solução de gradiente é executada pelo lado dos tubos.
- Feche a conexão entre as câmaras internas e externas (manípulo preto para baixo). Coloque o gradiente com bico em um agitador magnético com um bar pequeno rebuliço na câmara interna.
- Despeje a 35 mL de solução de gradiente pesado a câmara interna (câmara com saída de tubulação). Dispense o pesado gradiente de solução para os tubos de dois centrífuga colocados no gelo até metade está permanecendo com a taxa de bomba peristáltica definida como rápida (300 mL/h).
- Despeje a 35 mL de solução de gradiente luz câmara exterior (câmara sem saída de tubulação). Abrir a conexão entre as câmaras (alavanca de empurrão preto acima do outro) e permitir soluções misturar suavemente. Misture as soluções usando o agitador magnético.
- Permitir que as soluções executar lentamente (60 mL/h) até que todos da mistura gradiente tem sido dispensado das câmaras resultando em dois 0 - 4,4% (p/v) polivinilpirrolidona (PVP) preenchido com gradiente tubos. Manter os gradientes no gelo até estar pronto para usar no passo 2.12.
Nota: Uma vez que o gradiente foi preparado, diluir 2 x médio e lavagem 1X com prechilled-deionizada e manter fria a 4 ° C.
2. homogeneização e isolamento mitocondrial
- Cortar o tecido todo roseta de 4 semana de idade Arabidopsis plantas cultivadas em solos com uma tesoura, pelo menos 80 plantas serão necessárias para a 1 preparação.
Nota: 10-14 dias velho água culturas, mínimo 5 potes/prep, ou 2 - semana velhas mudas cultivadas em placas de ágar de Murashige & Skoog Basal sal mistura (MS), mínimas de 4 placas, também podem ser usadas. - Coloque metade do material vegetal que foi cortado em pedaços pequenos em um pre-refrigeração a 4 ° C grande pilão com 75 mL de esmeris (tabela 1) e moer extensivamente por vários minutos até que não há grandes pedaços de tecido são deixados.
- Pre-molhado 4 camadas de material de filtragem (22-25 µm poro tamanho) com moagem média e filtrar homogenate através das 4 camadas de material de filtragem através de um funil de plástico num erlenmeyer de 500 mL.
- Triture a restante metade do tecido com outro 75 mL de meio de moagem.
- Combine homogenates nos materiais de filtração e, tanto quanto possível homogenate através do filtro.
- Triture o tecido restante restante sobre o material de filtração novamente com o restante 150 mL de moagem média, filtro novamente para o balão de Erlenmeyer de 500 mL.
- Centrifugue o homogenate filtrada em 8 tubos de centrífuga plástico 50ml pre-refrigerados a 2.500 x g a 4 ° C, em um rotor de ângulo fixo por 5 min.
- Despeje o sobrenadante em tubos de centrífuga limpo (50ml; evitar perturbar a pelota verde) e centrifugar 17.500 x g a 4 ° C por 20 min em um rotor de ângulo fixo.
- Descartar tudo, mas < 3 mL do sobrenadante por aspiração (ou Despeje delicadamente sem perturbar o sedimento). Delicadamente, resuspenda o pellet no sobrenadante residual usando um pincel bem pequeno.
- Adicionar 10 mL de tampão de lavagem 1x a cada tubo e combinar 4 tubos em 1 tubo limpo (i.e., resultando em 2 tubos).
- Encha esses tubos com tampão de lavagem 1 x 50 ml e repetir os passos 2,7-2,9.
- Piscina brutas pelotas mitocondriais em 1 tubo usando um conta-gotas e dispersarem uniformemente com o pincel fino (uma pequena quantidade de tampão de lavagem pode ser utilizada, mas o volume final deve ser menor que 3 mL para caber no topo do gradiente). Suavemente da camada da suspensão mitocondrial com um conta-gotas para os 2 contínua 0 - 4,4% (p/v) PVP gradientes.
- Equilibrar os tubos por peso (usando o tampão de lavagem 1X) e centrifugar a 40.000 x g a 4 ° C por 40 min. Certifique-se o intervalo estiver desligado. As mitocôndrias migrarão para uma banda na parte inferior do tubo, ou podem estar presentes na solução pesada na parte inferior do tubo (identificado por uma banda nublada, amarelada; A Figura 2).
- Remova cuidadosamente o superior 5 cm da solução acima da faixa mitocondrial por aspiração.
- Distribuir o restante da solução contendo as mitocôndrias em 2 tubos limpos e encha com tampão de lavagem 1X. Distribua uniformemente o gradiente de densidade coloidal e mitocôndrias cobrindo a boca do tubo com uma película de plástico da parafina e invertendo várias vezes. Centrifugar por 15 min a 31.000 x g a 4 ° C, com frenagem lenta.
Nota: Antes da centrifugação, certifique-se que as mitocôndrias e o gradiente de densidade coloidal restantes estão distribuídas uniformemente. Caso contrário, o gradiente de densidade coloidal pode concentrar-se na parte inferior do tubo e impedir a granulação das mitocôndrias. - Retire o sobrenadante por aspiração, preencher o tubo com lavagem 1X buffer até 50 mL e inverter novamente para garantir a mistura. Centrifugar por 15 min a 31.000 x g a 4 ° C, com frenagem lenta.
- Aspirar o sobrenadante e recolher as pelotas mitocondriais em como pequeno um volume (~ 500 µ l) possível, usando uma pipeta com modificados 200 µ l dicas, (cortadas a ponta um pouco acima de sua extremidade para aumentar sua abertura). Coloque as mitocôndrias em um tubo de 1,5 mL e manter no gelo para uso imediato ou loja a-80 ° C.
Nota: Se mitocôndrias serão usadas para eletroforese em gel polyacrylamide do sulfato dodecyl de sódio (SDS-PAGE), BN-página, ou análises de immunoblot, usam 1x tampão de lavagem sem BSA para as lavagens finais (ou seja, passo 2.15 e 2.16). - Determine a concentração de proteína mitocondrial usando o método de Bradford.
Nota: Para alíquotas de centrífuga BN-página a 4 ° C e pellet loja a-80 ° C até o uso. Para as medições de consumo de oxigênio, única mitocôndria recentemente isolada pode ser usada.
3. as medições de consumo de oxigênio
Nota: Consumo de oxigênio pelo recém isolado planta mitocôndrias podem ser analisadas com um eletrodo de oxigênio Clark-tipo, permitindo a determinação da atividade da via alternativa, atividade de via do citocromo c e integridade mitocondrial.
- Instalação do software
- Instale oxigênio licenciado que monitora o software para o computador usado para as medições de consumo de oxigênio.
- Preparação de meio de respiração, substratos, soluções químicas de estoque e o eletrodo de oxigênio tipo Clark
- Prepare o suporte de respiração (300 mM sacarose, 10 mM de NaCl, 5mm KH2PO4, 2mm MgSO4, 0,1% (p/v) albumina de soro bovino (BSA), 10 mM TES (pH 7,2)) usado para ensaios de consumo de oxigênio.
- Prepare substratos, inibidores e efetores usados para medir a respiração mitocondrial (tabela 2). Estes podem ser preparados anteriormente e armazenados a-20 ° C.
Nota: Neutralizar o pH das soluções ácidas tais como ácidos orgânicos com pH 7.0 usando NaOH antes do uso. - Aquecer o meio de respiração para a mesma temperatura da câmara de ensaio (25 ° C).
- Monte o eletrodo de oxigênio tipo Clark, conforme descrito no protocolo do fabricante.
- Colocar água saturada com ar de 1 mL (água saturada com ar é obtida agitando vigorosamente uma pequena quantidade de água deionizada em um balão de Erlenmeyer grande) na câmara de medição. Para ligar o agitador, clique no botão "Velocidade do agitador". Clique no botão "On" e definir a velocidade do misturador para 65 rpm. Clique em "Okey" para continuar. Misture a água continuamente a 25 ° C.
- Calibração do eletrodo de oxigênio
- Aquecer a água que será usada para a calibração para a mesma temperatura da câmara de ensaio (25 ° C).
- Espere a corrente estabilizar e calibrar o eletrodo de oxigênio.
- Para iniciar a calibração do eletrodo de oxigênio, clique no botão "Calibrar", selecione "Calibração de fase líquida" e "Água saturada de ar."
- Uma nova janela será aberta (oxigênio calibração (fase líquida) - etapa 1 de 5). Selecione o canal para calibrar (o canal que a caixa de controle do eletrodo é anexada ao) e digite variáveis (conjunto "Temperatura de câmara" e 25 ° C e a "Pressão atmosférica"-101.32 kPa). Clique em "Okey" para continuar.
- Na próxima etapa (etapa 2 de 5), a instalação a velocidade do agitador (65 rpm) e clique em "Okey" para continuar.
- Na etapa 3 de 5, aguarde o sinal atingir um platô. O termo "platô atingido, pressione Okey para continuar" irá aparecer na caixa. Clique em "Okey" para continuar.
- Na etapa 4 de 5, estabelece zero oxigênio na câmara adicionando ditionito de sódio 5 mg. Clique em "Okey" para continuar.
Nota: Um declínio na concentração de oxigênio deve ser visível no rastreamento e deve chegar a 0. - Na última etapa de calibração (etapa 5 de 5), aguarde o sinal atingir um platô. O termo "platô atingido, pressione Okey para continuar" irá aparecer na caixa. Clique em "Okey" para continuar.
- Clique em "Salvar a calibração" para salvar a calibragem. Abrirá uma nova janela. Clique em "Okey" para confirmar para salvar a nova calibração para a caixa de controle de oxigênio.
Nota: Após a calibração bem sucedida, o rotulagem "oxigênio (nmol/mL)" aparecerá no eixo y. - Após a calibração, limpe a câmara de medição enxaguando a câmara com água (pelo menos 5 - 10 vezes) para garantir a limpeza apropriada. Coloque 1 mL de meio de respiração para a medição de câmara e permitir que a membrana equilibrar por alguns minutos até que o rastreamento do consumo de oxigênio é linear.
- Adaptar-se a escala do rastreamento do consumo de oxigênio em uma inclinação boa vista. Clique em "Zoom XY" e digite variáveis (posição "Oxigênio" 0 - 300 e o eixo de"tempo" para 0 - 45 min).
- Determinação da integridade mitocondrial
- Com êmbolo aberto, adicione meio de respiração de ar saturado 970 µ l para a câmara de reação.
- Adicionar 30 mitocôndrias µ l isolado ou 150 µ g de proteína mitocondrial total conforme determinado após isolamento de mitocôndrias (proteína total deve ser incluído nos cálculos depois) para a câmara de reação, com uma pipeta com uma ponta de corte.
- Agite a suspensão mitocondrial continuamente, utilizando um agitador magnético bar (65 rpm) a 25 ° C ar-saturar a solução.
- Veda-se a câmara com o êmbolo, clique em "Iniciar gravação" para registrar o consumo de oxigênio e permitir o rastreamento do consumo de oxigênio para estabilizar (1-2 min).
- Determine a taxa de consumo de oxigênio manualmente após a adição de ascorbato de 10 mM e 25 µM citocromo c por 5 min obter a taxa de "antes de detergente".
Nota: Para rotular a adição de substratos, inibidores e efetores diretamente no rastreamento, clique no botão "Adicionar evento marca" e digite a designação de rótulo correspondente. Clique em "Okey" para continuar. - Determine a taxa de consumo de oxigênio manualmente por 3 min após a adição de detergente de 0,05% (v/v) para dar a taxa de "depois de detergente". Clique em "Parar gravação".
- Clique no botão "Tabela de taxas de alteração". 2 cursores aparecerão como linhas verticais na tela do gráfico. Clique e arraste o par de cursores de taxa para as posições necessárias no rastreamento para definir o intervalo de taxa. Mova o intervalo de taxa ao longo do rastreamento usando o cursor esquerdo taxa. Defina o intervalo de taxa usando o cursor direito taxa em si. O oxigênio que monitora o software automaticamente desenha uma linha de melhor ajuste entre os dois cursores enquanto movendo os cursores de intervalo de taxa ao longo do traço.
- Uma vez que o intervalo de taxa desejada e a posição foi definido, introduza a taxa na tabela com um clique direito em 1 dos 2 cursores e selecione "Adicionar taxa de tabela". Clique no botão "Adicionar" para confirmar para exibir a taxa na tabela principal taxa.
- Calcular a integridade mitocondrial dividindo a taxa de "antes de detergente" pela "depois detergente" taxa, expressada em percentagem e subtrair-100.
- Determinação da respiração mitocondrial
- Com êmbolo aberto, adicione 970 µ l de meio de respiração de ar saturado para a câmara de reação. Adicione 500 µM ATP e 30 mitocôndrias µ l isolado ou 150 µ g de proteína mitocondrial total usando uma pipeta com uma ponta cortada ao meio de respiração na câmara de reação.
- Agitar a suspensão mitocondrial continuamente, utilizando um agitador magnético bar (65 rpm) a 25 ° C.
- Êmbolo de fechar, clique em "Iniciar gravação" para registrar o consumo de oxigênio e esperar pelo 1-2 min para a taxa de consumo de oxigênio estabilizar (quando o rastreamento do consumo de oxigênio é linear). Adicione o succinato de 5 mM. A taxa de consumo de oxigênio por cerca de 2 min de registro.
Nota: Para rotular a adição de substratos, inibidores e efetores diretamente no rastreamento, clique no botão "Adicionar evento marca" e digite a designação de rótulo correspondente. Clique em "Okey" para continuar. - Adicione 1 mM difosfato de adenosina (ADP). Continue gravando a taxa de consumo de oxigênio por 2 min.
- Adicione 1 mM NADH. Recorde, a taxa de consumo de oxigênio por 4-8 min. Esta taxa é a capacidade de respiração através do citocromo oxidase.
- Adicionar 1 mM cianeto de potássio (KCN) (ou 2,5 µM myxothiazol ou 5 µM antimycin A) para inibir a via de citocromo c e continuar a gravar por cerca de 2 min observar o consumo de oxigênio através da oxidase alternativa.
- Adicione 5 mM ditiotreitol (DTT) e piruvato de 10 mM para ativar completamente a oxidase alternativa. Continuar a gravar por 5-7 min: esta é a capacidade da oxidase alternativa.
- Adicionar 500 µM n-propil galato (nPG) e gravar por 2 min. Este avalia a taxa de consumo de oxigênio residual que não pode ser inibida quimicamente. Subtrai a este ritmo de outras taxas de gravado, que não seja susceptível de ser mitocondrial na origem. Consumo de oxigênio ainda ocorrendo após a inibição do citocromo c e caminho AOX (por KCN e nPG) é muito provável que venha de peroxidases presentes como contaminantes em mitocôndrias isoladas9.
- Clique em "Parar gravação".
- Clique no botão "Tabela de taxas de alteração" e inserir a taxa na tabela com um clique direito em um dos dois cursores e selecione "Adicionar a tabela de taxas". Clique no botão "Adicionar" para confirmar para exibir a taxa na tabela principal taxa.
Nota: Quando adicionar efetores dissolvida em solventes orgânicos (ex., antimycin A, nPG, myxothiazol), a câmara e o atuador deve ser lavados com etanol e depois água para garantir a limpeza apropriada.
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Representative Results
Usando este protocolo, fomos capazes de detectar diferentes proteínas mitocondriais por SDS-PAGE e immunoblotting. Como mostrado na Figura 3A, a proteína isolada do tecido de cultura de água é suficiente para detectar uma banda fraca (2 µ g). Intensidade do sinal aumenta proporcionalmente aos montantes carregados. Por mitocôndrias isoladas de tecidos cultivados em placas (Figura 3B), a resposta ao estresse de luz alta o tratamento em diferentes genótipos pode ser analisado pelo immunodetection com anticorpos oxidase alternativa.
A integridade de mitocôndrias, atividade de via do citocromo c e via alternativa pode ser medida usando amostras mitocondriais recém isoladas. Integridade mitocondrial está bem preservada durante o procedimento de isolamento descrito (Figura 4A). Adição de diferentes substratos, inibidores e efetores de mitocôndrias isoladas, consumo de oxigênio através do caminho de citocromo c e via oxidase alternativa é influenciado (Figura 4B).
Figura 1: configuração para a preparação dos gradientes. Esquerda: Tubos de centrífuga (50 mL), com um ligeiro ângulo colocado no gelo com PVC tubo peristáltico tomadas gravadas no interior dos tubos; Médio: Bomba peristáltica; Direito: Dosador de gradiente em cima de um agitador magnético contendo o pesado gradiente (câmara) e soluções de luz gradiente (Câmara exterior). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: purificação de mitocôndrias de Arabidopsis atira usando uma contínua 0 - 4,4% (p/v) gradiente de densidade coloidal PVP/28%. A banda verde escura é o contém e outras contaminações, conforme indicado na parte superior das soluções de gradiente. Fração mitocondrial apareceu como uma banda de branco-esverdeada mais perto para o fundo do tubo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: separação de proteínas mitocondriais por SDS-PAGE e immunodetection usando anticorpos específicos. (A) mitocôndrias isoladas de duas semanas de idade água-cultivadas Arabidopsis thaliana selvagem tipo (Columbia-0, Col-0) plantas foram submetidas a SDS-PAGE e analisadas com anticorpos levantados contra a subunidade de NADH: ubiquinona oxidorredutase (S4 Ndufs4, At5g67590). Marcadores de peso molecular imaculados foram carregados na pista externa do gel e do tamanho de dez bandas representativas são indicados em quilo Daltons (kDa). A massa molecular aparente da proteína Ndufs4 detectada é 18 kDa. Abundância de proteína é mostrada em relação ao valor de 2 µ g de proteína total. (B) duas semanas mudas cultivadas em B5 de Gamborg mídia com 3% (p/v) de agar sacarose e 0,8% (p/v) foram expostas a 750 µE m-2 s-1 destacar (HL) e colhida após 6 h. mitocôndrias foram purificadas e as proteínas mitocondriais foram separados por SDS-PAGE e analisados com anticorpos produzidos contra oxidase alternativa (AOX). A presença de uma proteína AOX immunodetectable com uma massa molecular aparente de 34 kDa é indicada. Abundância de proteína é mostrada em relação ao valor do controle (2 µ g). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Representante vestígios de consumo de O2 por isolado da planta mitocôndrias. (A) mitocôndrias isoladas de plantas de tipo selvagem de Arabidopsis thaliana (Col-0) acima descritos foram analisadas pela integridade de membrana exterior antes as medições de consumo de oxigênio. 30 µ l de mitocôndrias isoladas (150 µ g total proteína mitocondrial) foram utilizados. Integridade mitocondrial foi determinada como 90% conforme descrito acima. (B) oxigênio as medições de consumo foram realizadas usando 30 µ l de isolado mitocôndrias (150 µ g total proteína mitocondrial) de plantas de tipo selvagem de Arabidopsis thaliana . Determinaram-se total respiração mitocondrial e a via AOX. A partir destes dados, consumo de oxigênio através do caminho de citocromo c e caminho AOX pode ser determinado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Esmeris | |
| Produto químico | Concentração |
| Sacarose | 0.3 M |
| Pirofosfato de sódio (Na4P2O7 · 10 H2O) | 25 mM |
| Sal dissódico de EDTA | 2 mM |
| Fosfato monobásico de potássio (KH2PO4) | 10 mM |
| Polivinilpirrolidona (PVP40) | 1% (p/v) |
| Albumina de soro bovino (BSA) | 1% (p/v) |
| Água desionizada | |
| Ajustar o pH a 7,5 (usando HCl) | |
| Nota: para 300 mL moagem média, 1,06 g ascorbato de sódio (concentração final: 17,84 mM) e 0,74 g cisteína (concentração final: 20,36 mM) são adicionados apenas antes de usar. Verificar o pH após adição e ajustar a 7.5 com 1 M de NaOH, se necessário. | |
| 2 X tampão de lavagem | |
| Produto químico | Concentração |
| Sacarose | 0,6 M |
| TES | 20 mM |
| Albumina de soro bovino (BSA) | 0,2% (p/v) |
| Água desionizada | |
| Ajustar o pH a 7,5 (usando NaOH) | |
| Gradientes | |
| Solução de gradiente pesada (4,4% (p/v) PVP) | 2 tubos de gradientes |
| 2 X tampão de lavagem | 17,5 mL |
| Gradiente de densidade colloidial | 9,8 mL |
| PVP-40 (20% (p/v)) | 7,7 mL |
| Solução de gradiente de luz (0% (p/v) PVP) | 2 tubos de gradientes |
| 2 X tampão de lavagem | 17,5 mL |
| Gradiente de densidade colloidial | 9,8 mL |
| Água desionizada | 7,7 mL |
Tabela 1: Composição de buffers e gradientes usados para isolamento de mitocôndrias.
| Abreviatura | Concentração de soluções estoque | Armazenamento | Concentração final | Adicionado por reação de 1 ml de volume | |
| Substratos | |||||
| Citocromo c | CYT-c | 2,5 mM (H2O) | -20 ° C | 25 ΜM | 10 μl |
| NADH | NADH | 0,1 M (na H2O) | -20 ° C | 1 mM | 10 μl |
| Succinato de | Succ | 500 mM (H2O) | -20 ° C | 5 mM | 10 μl |
| Inibidores da | |||||
| Antimycin A | AA | 1mm (EtOH) | -20 ° C | 5 ΜM | 5 μl |
| Cianeto | KCN | 100 mM (H2O) | 4 ° C | 1 mM | 10 μl |
| Myxothiazol | Myxo | 500 μM (EtOH) | -20 ° C | 2,5 ΜM | 5 μl |
| n-propil galato | nPG | 100 mM (EtOH) | -20 ° C | 500 ΜM | 5 μl |
| Efetores | |||||
| ADP | ADP | 100 mM (H2O) | -20 ° C | 1 mM | 10 μl |
| Ascorbato | ASC | 500 mM (H2O) | Certifique-se fresco no dia da utilização | 10 mM | 20 μl |
| ATP | ATP | 100 mM (H2O) | -20 ° C | 500 ΜM | 5 μl |
| Dithiotreitol | DTT | 1 M (na H2O) | Certifique-se fresco no dia da utilização | 10 mM | 10 μl |
| Piruvato | Pyr | 1 M (na H2O) | -20 ° C | 10 mM | 10 μl |
| Detergente | 10% (v/v) (em H2O) | 4 ° C | 0,05% (v/v) | 5 μl | |
Tabela 2: Lista de substratos, inibidores e efetores utilizados para as medições de consumo de oxigênio.
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Discussion
Normalmente, isolamento de mitocôndrias de Arabidopsis deixa rendimentos acima de 3 mg de mitocôndrias de aproximadamente 80-100 3 - 4 semana de idade plantas, embora rendimentos superiores a 5 mg, muitas vezes podem ser alcançados com moagem completa. O rendimento varia com as condições de crescimento e diminui drasticamente, como deixa senesce, embora as mitocôndrias estrutura parece ser bem conservado durante a senescência9. Uma das características mais importantes para obter um bom rendimento é o método de moagem para lyse pilhas para liberar as mitocôndrias. Enquanto um número de instrumento mecânico de moagem está disponível para compra, para Arabidopsis moagem em um almofariz e um pilão atinge consistentemente bons resultados em termos de rendimento, como que lise das células com pouco dano de organelas. Enquanto moedores mecânicos são rápidos, eles exigem a otimização e a quantidade de moagem exigida pode variar de acordo com o tecido. Com um almofariz e um pilão, é frequentemente conveniente e mais eficiente se o tecido é cortado ou corte com uma faca ou tesoura antes da trituração. Conforme descrito, todas as etapas precisam ser efectuada a 4 ° C e todo o processo do fim da moagem para obtenção de um pellet lavado de mitocôndrias purificadas deve levar aproximadamente 4 h. Como vestígios de detergentes ou outros reagentes em tubos ou doseadoras gradientes podem reduzir drasticamente o rendimento, todos os componentes usados nesses procedimentos são lavados sem detergente e não utilizados em outros procedimentos. Finalmente, é importante que as mitocôndrias são suficientemente separou as outras fracções do gradiente para permitir a ser removido e lavado. Se eles são demasiado perto da parte inferior do tubo, isso significa que a mistura das soluções leves e pesadas precisa ser ajustado, para permitir que mais a pesado solução para servir antes de misturar. Por outro lado, se a banda aparece difusa e é alta no tubo, mistura precisa ocorrer um pouco antes.
O método descrito aqui pode ser facilmente usado para isolamento de mitocôndrias de Arabidopsis flor e raiz tecido11,12. Para as raízes, é conveniente crescer em cultura hidropónica e preciso de 100 g de peso fresco para obter quantidades de 2mg de mitocôndrias. Para moagem de raízes devem ser cortadas em pedaços pequenos antes da moagem em um almofariz e um pilão, e aumento de rendimentos podem ser obtidos por re-moer o tecido de raiz, em um almofariz e um pilão ou em um liquidificador. Para o tecido floral, onde função mitocondrial é muitas vezes reforçada13, moagem com um almofariz e um pilão funciona bem, mas a quantidade limitada de material significa que uma grande quantidade de plantas precisa ser cultivada para a colheita de tecidos. As mitocôndrias foram isoladas de uma variedade de órgãos de Arabidopsis usando métodos semelhantes ou pequenas modificações14,15 e do arroz (Oryza sativa)16.
As limitações do método descrito acima são i) à grande quantidade de sementes necessárias para o isolamento mitocondrial, ii) apenas específicos tecidos de Arabidopsis e arroz aplicado neste método de isolamento, iii) pequenas quantidades de vários contaminantes (tais como proteínas Peroxissômicos) ainda existiam nas mitocôndrias purificadas. As mitocôndrias obtidas usando os métodos descritos acima são adequadas para uma variedade de estudos, que vão desde estudos de absorção de oxigênio para análises quantitativas espectrometria de massa de abundância de proteína. Gradiente de mitocôndrias purificadas ainda irão conter pequenas quantidades de contaminantes diversos, tais como proteínas Peroxissômicos3. Uma comparação com listas de organela definido pode ser usada para determinar alterações em proteínas mitocondriais, enquanto a quantidade de contaminação por proteínas não-mitocondrial é pequena (< 10%) e amostras similares são comparadas, então o tipo e o grau de proteínas não-mitocondrial é semelhante. Podem efectuar-se análises de abundância de proteína por SDS-PAGE ou outras abordagens baseadas em gel com quantidades relativamente pequenas de mitocôndrias (2-20 µ g), usando diferentes quantidades de mitocôndrias para verificar a linearidade da deteção por anticorpos (Figura 3). Enquanto porin (voltagem dependente ânion canal (proporção)) é usado frequentemente como um controle de carregamento para quantificação, em nossa experiência relativamente grande abundância desta proteína pode significar que a resposta muitas vezes não é linear, se grandes quantidades de proteína são carregadas no gel , então a linearidade de resposta do anticorpo deve ser sempre verificada ao usar esses controles de carregamento. A importância desta abordagem de isolar a mitocôndria é que ao contrário de gradientes que usam sacarose como o material para formar o gradiente de densidade, gradientes de densidade coloidal não requer osmótico reajustamento das mitocôndrias purificados como é necessário com sacarose. Isto significa que há menos chance de ruptura da mitocôndria purificada e após a lavagem para remover o material coloidal densidade, eles podem ser usados diretamente em uma variedade de ensaios ou aplicações.
Manchas de tecido, onde as proteínas mitocondriais são detectadas de extratos de folha ou tecido inteiro, são uma abordagem atraente para medir a quantidade de proteínas mitocondriais, em que o tecido. Dado o volume geralmente baixo das mitocôndrias em comparação com outras organelas, a detecção de proteína mitocondrial em todo tecido extrai precisa ser interpretado com alguma cautela, como proteína mitocondrial pode ser além da deteção em tais abordagens. Cuidado controles, onde purificadas mitocôndrias são electrophoresed juntamente com extratos de tecido para garantir a migração idêntica e linearidade da deteção, precisam ser realizados para ter confiança em tais abordagens.
Com a ajuda de um eletrodo de oxigênio tipo Clark, alterações da pressão parcial de oxigênio de uma solução podem ser medidas. O eletrodo real é composto por um catodo de platina e um ânodo de prata, que são ligadas por uma ponte de KCl e coberto por um eletrólito-umedecido (papel cigarro) e uma membrana permeável ao oxigênio (membrana de politetrafluoroetileno). Uma tensão de 600-700 mV leva à redução de oxigênio, dando uma relação linear entre concentração de oxigênio e tensão. Eletrodos de oxigênio estão disponíveis comercialmente de empresas diferentes. Cada empresa terá seus próprio instruções sobre a montagem e instalação do eletrodo de oxigênio. No entanto, em geral a prateado ânodo e o cátodo de platina do disco eletrodo precisam ser limpa com a ajuda de um eletrodo de limpeza kit ou uma caneta apagador antes da montagem. É importante garantir que não formem bolhas de ar durante a montagem (por exemplo, entre o diafragma de politetrafluoroetileno e o papel de cigarro). Após a montagem, o disco de eletrodo precisa ser anexada à câmara com o catodo de platina para cima na base da câmara de reação. A câmara está rodeada por uma camisa de água, garantindo o controle de temperatura. É extremamente importante que a câmara fica sempre cheia de água, uma vez que a membrana vai secar e rachar, caso contrário. Da mesma forma, a membrana não deve ser tocada pela pipetas ou seringas ao adicionar compostos para a câmara, para evitar rasgar.
Antes do ensaio, o médio de respiração deve ser aquecido para a mesma temperatura da câmara de ensaio (na maioria dos casos a 25 ° C) e a membrana deveria ser permitida equilibrar no buffer de respiração durante alguns minutos. Depois de fechar o êmbolo para o consumo de oxigênio, os ensaios, a adição de moléculas efetoras efectuar usando gel descartável de carregamento pontas de pipetas ou seringas não-descartáveis microlitro (por exemplo, micro seringas). Se usando micro seringas, tem que ser assegurado que a seringa está completamente enxaguada com 100% de etanol e água entre adições, para evitar a contaminação de soluções estoque. Isto também se aplica para a lavagem da câmara entre medições. A maioria dos reagentes utilizados em ensaios de consumo de oxigênio são solúveis em água e podem ser facilmente removidos enxaguando múltiplas com água (cerca de cinco vezes) entre as medições. No entanto, alguns produtos químicos utilizados para os ensaios só são solúveis em solventes orgânicos, tais como antimycin A, myxothiazol e nPG. Portanto, a câmara precisa ser lavada com um solvente orgânico (álcool etílico a 50% (v/v)) entre ensaios para remover traços residuais destas moléculas e em seguida com água (cerca de cinco vezes) para esgotar os resíduos.
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Disclosures
Os autores declaram não há conflito de interesses.
Acknowledgments
Este estudo foi suportado por um australiano Conselho centro de excelência em pesquisa na planta de energia CE140100008 de biologia, um australiano Conselho futuro bolsa de pesquisa (FT130100112) para MWM e uma bolsa de pesquisa Feodor Lynen (Alexander von Humboldt Fundação, Alemanha) de JS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADP | Sigma-Aldrich | A2754 | Chemical |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | Chemical, dissolve in ethanol |
| AOX antibody | from Tom Elthon | Elthon et al., 1989 | |
| Ascorbate | Sigma-Aldrich | A0157 | Ascorbate Oxidase from Cucurbita sp. |
| ATP | Sigma-Aldrich | A26209 | Chemical |
| Bovine serum albumin (BSA) | Bovogen | BSAS 1.0 | Chemical |
| Clarity western ECL substrate | Bio-Rad Laboratories | 1705061 | Chemical |
| Criterion Stain-Free Precast Gels 8-16% 18 Wells | Bio-Rad Laboratories | 5678104 | Chemical |
| Cyanide | Sigma-Aldrich | 60178 | Chemical |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C3131 | Chemical |
| Difco Agar, granulated | BD Biosciences | 214530 | Chemical |
| Dithiotreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | Chemical |
| EDTA disodium salt | Sigma-Aldrich | E5134 | Chemical |
| Gamborg B-5 Basal Medium | Austratec | G398-100L | Chemical |
| Gamborg Vitamin Solution (1000x) | Austratec | G219-100ML | Chemical |
| Goat Anti-Mouse IgG (H + L)-HRP Conjugate | Bio-Rad Laboratories | 1706516-2ml | Chemical |
| Goat Anti-Rabbit IgG (H + L)-HRP Conjugate | Bio-Rad Laboratories | 1706515-2ml | Chemical |
| L-Cysteine | Sigma | C7352-100G | Chemical |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 230391 | Chemical |
| Murashige & Skoog Basal Salt Mixture (MS) | Austratec | M524-100L | Chemical |
| Myxothiazol | Sigma-Aldrich | T5580 | Chemical, dissolve in ethanol |
| NADH | Sigma-Aldrich | N8129 | Chemical |
| Ndufs4 antibody | from Etienne Meyer | Meyer et al., 2009 | |
| n-Propyl gallate | Sigma-Aldrich | P3130 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | Chemical, colloidal density gradient |
| Polyvinylpyrrolidone (PVP40) | Sigma-Aldrich | PVP40 | Chemical |
| Potassium cyanide | Sigma-Aldrich | 60178 | Chemical |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | Chemical |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | Chemical |
| Sodium chloride | Chem-Supply | SA046 | Chemical |
| Sodium dithionite | Sigma-Aldrich | 157953 | Chemical |
| Sodium L-ascorbate | Sigma | A4034-100G | Chemical |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S2378 | Chemical |
| Sucrose | Chem-Supply | SA030 | Chemical |
| TES | Sigma-Aldrich | T1375 | Chemical |
| Tetrasodium pyrophosphate (Na4P2O7 · 10H2O) | Sigma-Aldrich | 221368 | Chemical |
| Trans-Blot Turbo RTA Midi Nitrocellulose Transfer Kit | Bio-Rad Laboratories | 1704271 | Chemical |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | X100 | Chemical, detergent |
| Western Blocking Reagent | Sigma | 11921681001 | Chemical |
| Balance | Mettler Toledo | XS204 | Equipment |
| Beakers | Isolab | 50 mL | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-26XP | Equipment |
| Centrifuge tubes | Nalgene | 3117-9500 | Equipment |
| Circulator | Julabo | 1124971 | Attached to oxygen electrode chamber |
| Conical flask | Isolab | 500 mL | |
| Dropper | 3 mL | ||
| Fixed angle rotor | Beckman Coulter | JA25.5 | Equipment |
| Funnel | Per Alimenti | 14 cm | For filtering |
| Gradient pourer | Bio-Rad | 165-4120 | For preparation of gradients |
| Magnetic Stirrer ATE | VELP Scientifica | F20300165 | Equipment |
| Miracloth | VWR | EM475855-1R | Filtration material |
| Mortar and pestle | Jamie Oliver | Granite, 6 Inch | Equipment |
| O2view | Hansatech Instruments | Oxygen monitoring software | |
| Oxygraph Plus System | Hansatech Instruments | 1187253 | Clark-type oxygen electrode |
| Paintbrush | Artist first choice | 1008R-12 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | plastic paraffin film |
| Peristaltic pump | Gilson | F155001 | For preparation of gradients |
| PVC peristaltic tubing | Gilson | F117930 | For preparation of gradients |
| Water bath | VELP Scientifica | OCB | Equipment |
References
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