Summary
Как Митохондрии являются лишь небольшой процент растительной клетки, они должны быть очищены для целого ряда исследований. Митохондрии могут быть изолированы от различных органов растений, гомогенизации, следуют дифференциальных и плотность градиентного центрифугирования для получения высокоочищенных митохондриальной дроби.
Abstract
Митохондрии являются основные органеллы, участвует в многочисленных метаболических путей в растениях, прежде всего производства аденозинтрифосфата (АТФ) от окисления снижение соединений, таких как никотинамид аденин динуклеотид (NADH) и флавин аденин динуклеотид (2ГВС). Полная Аннотация Arabidopsis thaliana генома установил его как наиболее широко используемых растений модель системы, и таким образом необходимость очистить митохондрий от различных органов (лист, корень или цветок) необходимо в полной мере использовать инструменты, Теперь доступны для Arabidopsis для изучения митохондриальной биологии. Митохондрии, изолируются гомогенизацией тканей, с использованием различных подходов, последовал ряд шагов дифференциального центрифугирования, производству сырой митохондриальной Пелле, который далее очищается с помощью непрерывной коллоидных плотность градиент Центрифугирование. Коллоидный плотность материала впоследствии удаляется несколько шагов центрифугирования. Начиная с 100 г свежих листьев ткани, обычно получается 2-3 мг митохондрий. Респираторные эксперименты на этих митохондрий отображения типичный ставки 100-250 нмоль O2 мин-1 мг всего митохондриальных белок-1 (NADH-зависимая скорость) с возможностью использования различных субстратов и ингибиторов для определения субстраты окисляются и возможностей альтернативных и цитохром терминала оксидазы. Этот протокол описывает метод изоляции митохондрий от Arabidopsis thaliana листья с помощью непрерывной коллоидных плотности градиенты и эффективного дыхания измерения очищенный завод митохондрий.
Introduction
История исследования растений митохондриальной восходит более чем 100 лет1. Нетронутыми митохондрии были впервые выделен в начале 1950-х годов с помощью дифференциального центрифугирования. Появление коллоидных плотность градиента в 1980-х допускается митохондрий очищаться без страданий осмотического перестройки. В то время как градиент очищенный митохондрии подходят для большинства целей, из-за чувствительности масс-спектрометрии, даже сравнительно незначительных загрязнений могут быть обнаружены и может быть ненадлежащим образом назначен митохондриальной расположение2. Использование свободного потока электрофореза могут удалить оба plastidic и Пероксисома загрязнение3, но свободный поток электрофорез узкоспециализированные техника и не требуется для подавляющего большинства исследований. Кроме того, когда определение расположения белка, который она должна быть вспомнил, что двойное или несколько ориентации белков происходит в клетках. Более 100 двойной целевых белков описаны для хлоропластов/пластид и митохондрий4и ряд белков, ориентированные на митохондрии и пероксисомы известны также5. Кроме того перебазирования белков под конкретные стимулы, например оксидативного стресса, является новой темой в ячейки биологии6. Таким образом местоположение белков необходимо рассматривать в контексте изучения биологии, и разнообразные подходы используются для определения и проверки месте2.
Митохондрии обычно изолированы от растительных тканей, гомогенизации, баланс между разорвать открыть клеточной стенки выпустить митохондрии, а не повреждение митохондрий. Традиционно картофель и цветная капуста, гомогенизации предполагает использование бытовой блендер/соковыжималка аппарат сделать жидкого экстракта в буфере с различными компонентами для поддержания активности. Изоляция митохондрий от гороха листья, (популярный материал для митохондриального изоляции с помощью молодых саженцев (~ 10 дней), использует blender для Лизируйте клетки, как лист материала мягкой. При наличии Arabidopsis thaliana T-ДНК инсерционному нокаут-линий необходимо иметь возможность очистить митохондрий выполнять функциональные исследования потребовало разработки методов изолировать митохондрий от лист, корень или цветок ткани. В целом методы, разработанные для других растений работал хорошо7, с приработок, измельчения материала необходимо оптимизировать. Для выращивания арабидопсиса это может быть достигнуто в различных способов (см. ниже) и отличается между типами ткани (корень против съемки). Использование непрерывного градиента также могут быть оптимизированы как плотность митохондрий от различных органов или этапы развития означает, что они могут перенести по-разному. Таким образом для максимального разделения плотность градиента можно усовершенствовать для достижения лучших разделения.
Однажды очищенный, митохондрии может использоваться для различных исследований, в том числе экспериментов усвоение белков и тРНК, анализов активность фермента, дыхательной цепи измерения и Вестерн-блот анализ. Изолированных митохондриях может также использоваться для анализа масс-спектрометрии белков изобилия. Целевые несколько реакции, мониторинг (MRM) анализ позволяет для количественной оценки определенных белков, но требуют значительных пробирного развития. В отличие от этого квантификация диметил или других изотопов этикетки8, обеспечивает открытие подход в выявлении различий через весь протеом, который может использоваться для выявления роман биологические исследования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этот протокол используется для изоляции нетронутыми митохондрий от Arabidopsis thaliana органов, выращивается на земле, с помощью непрерывного коллоидных плотности градиенты. Все процедуры после сбора материала осуществляется на 4 ° C.
1. Подготовка шлифование средних, мыть буфер и градиент решения
- Подготовка 300 мл шлифовальных среднего (минус аскорбат и хвоща) и 200 мл 2 x мыть буфера в таблице 1 один день до изоляции, держать их холодной при 4 ° C.
Примечание: Добавление Аскорбат натрия и L-цистеина (бесплатная база) до конечной концентрации 17.84 и 20,36 мм, соответственно, шлифовальные средний утром в изоляции. Если митохондрии должны использоваться для западной помарки или синий родной Полиакриламид гель электрофореза (БН-страница) анализ, составляют 2 x мыть буфера без BSA. - Подготовьте градиенты утром митохондриальной изоляции (рис. 1 и Таблица 1).
- Сделать градиент решения тяжелой и легкой в двух стаканах; 35 мл каждого достаточно для двух труб градиента.
- Вымойте палаты градиента Заливщик и перистальтические трубы ПВХ деионизированной водой и обеспечить даже потока через трубы из всех труб.
- 2 место пробирок (50 мл) под небольшим углом на льду с розетками перистальтические трубы ПВХ пленку внутри трубы, чтобы убедиться, что градиент решение работает вниз стороне трубы.
- Тесной связи между внутренней и внешней камеры (черный рычаг вниз). Место градиента Заливщик на магнитной мешалкой с баром небольшой переполох во внутренней камере.
- Залейте 35 мл тяжелых градиента раствор в внутренней камере (палаты с трубки розетки). Отказаться от тяжелых градиентного раствора в двух пробирок, размещены на льду, до тех пор, пока половина остается с Перистальтический насос курсу быстро (300 мл/ч).
- Залейте 35 мл света градиента раствор в наружной палата (палата без трубки розетки). Открыть соединение между камерами (push черный рычаг вверх на полпути) и позволяют решать осторожно перемешать. Смешайте решения с использованием магнитной мешалкой.
- Разрешить решения для запуска медленно (60 мл/ч) до тех пор, пока все градиентной смеси было отказаться от камер, что привело в двух трубок градиентной заливкой 0 - 4,4% (w/v) поливинилпирролидона (ПВП). Сохранить градиенты на льду до готовности для использования в шаг 2.12.
Примечание: После того, как был подготовлен градиента, развести 2 x мыть средних и 1 x prechilled деионизированной водой и держать холодной при 4 ° C.
2. гомогенизации и митохондриальной изоляции
- Вырезать весь розетка ткани от 4 - неделя старый Arabidopsis растений, выращенных на земле с ножницами, по крайней мере 80 растения потребуются для 1 prep.
Примечание: 10-14 день старый воды культур, минимум 5 горшки/prep, или 2 - неделя старый сеянцев, выращенных на плиты агара фотосинтетическую & Скуг базальной соль смесь (МС), минимум 4 пластин, также могут быть использованы. - Место половина из растительного материала, которая была сокращена на мелкие кусочки в предварительно охлажденным 4 ° C большой ступку и пестик с 75 мл среднего помола (Таблица 1) и широко растереть несколько минут, пока слева не большие куски ткани.
- Предварительно намочить 4 слоев Биофильтрационный материал (размер пор 22-25 мкм) с измельчением среднего и фильтр огневки через 4 слои материала фильтрации через воронку пластиковые в коническую колбу 500 мл.
- Измельчить, остальная половина из ткани с другой 75 мл среднего помола.
- Объединить гомогенатах в фильтрующих материалов и максимально возможной огневки через фильтр.
- Измельчить оставшиеся ткани, оставшиеся на Биофильтрационный материал снова с оставшиеся 150 мл шлифовальных средний, фильтр снова в коническую колбу 500 мл.
- Центрифуга для отфильтрованных огневки в 8 предварительно охлажденные 50 мл пластиковых пробирок на 2500 x g при 4 ° C в фиксированный угол ротора за 5 мин.
- Налить супернатант в чистой пробирок (50 мл; не мешать зеленые гранулы) и центрифуги на 17500 x g при 4 ° C на 20 мин в фиксированный угол ротора.
- Отбросить все, но < 3 мл супернатант путем аспирации (или осторожно слить не нарушая гранулы). Нежно ресуспензируйте гранулы в остаточных супернатанта, используя небольшой тонкой кистью.
- Добавьте 10 мл 1 x мыть буфера к каждой пробке и объединить 4 трубки в 1 чистых пластиковых пробирок (то есть, что приводит к 2 трубы).
- Заполнить эти трубки с 1 x мыть буфера до 50 мл и повторите шаги 2,7-2,9.
- Бассейн сырой митохондриальной окатышей в 1 трубки с помощью капельницы и равномерно расходятся с тонкой кистью (небольшое количество мыть буфера могут быть использованы, но окончательный объем должен быть меньше чем 3 мл надеть поверх градиента). Аккуратно слоя митохондриальной подвеска с дозатором на 2 непрерывное 0 - 4,4% (w/v) PVP градиентов.
- Баланс трубы по весу (с помощью 1 x мыть буфера) и центрифуги на 40000 x g при 4 ° C на 40 мин обеспечить перерыва выключен. Митохондрии будут мигрировать полоса в нижней части трубки, или может присутствовать в решении тяжелых в нижней части трубки (идентифицируются облачно, желтоватыми полосами; Рисунок 2).
- Осторожно удалите верхний 5 см решения выше митохондриальной группы путем аспирации.
- Распределить оставшиеся раствор, содержащий митохондрий в 2 чистые пробирки и заполнить с 1 x мыть буфера. Равномерно распределять градиент плотности коллоидных и митохондрии, покрывая рот трубку с пластиковой парафин фильм и переворачивать несколько раз. Центрифуги для 15 мин на 31000 x g при 4 ° C с медленным торможения.
Примечание: Перед центрифугированием, убедитесь, что митохондрии и оставшиеся коллоидных плотность градиент равномерно распределены. В противном случае градиент плотности коллоидных могут сосредоточиться в нижней части трубки и предотвратить грануляции митохондрий. - Удалите супернатант аспирации, заполнить трубу с 1 x мыть буфера до 50 мл и инвертировать снова для обеспечения смешивания. Центрифуги для 15 мин на 31000 x g при 4 ° C с медленным торможения.
- Аспирационная супернатант и собирать митохондриальной окатышей в как малые тома (~ 500 мкл) возможно с помощью пипетки с модифицированных 200 мкл советы (вырезать кончик немного выше ее конец увеличить его открытия). Митохондрии в 1,5 мл трубку и удержание их на льду для немедленного использования или хранения при температуре-80 ° C.
Примечание: Если митохондрий будет использоваться для натрия Додециловый сульфат полиакриламидный гель-электрофорез (SDS-PAGE), BN-страницы, или immunoblot анализов, используйте 1 x мыть буфера без BSA для окончательного стирок (т.е., шаг 2.15 и 2.16). - Определите концентрацию белка митохондрий, с помощью метода Брэдфорд.
Примечание: Для центрифуг аликвоты BN-страница на 4 ° C и магазин Пелле-80 ° c до использования. Для измерения потребления кислорода могут использоваться только свежевыделенных митохондрий.
3. кислорода измерения потребления
Примечание: Потребление кислорода, свежезаваренным изолированных завод митохондрий могут быть проанализированы с электродом кислорода Кларк типа, позволяя определение митохондриальной целостности, c тситохрома пути деятельности и альтернативный путь деятельности.
- Установка программного обеспечения
- Установка лицензионной кислорода, мониторинга программного обеспечения на компьютер, используемый для измерения потребления кислорода.
- Подготовка среднего дыхания, субстратов, запасов химических растворов и Кларк тип электрода кислорода
- Подготовьте дыхания средний (300 мм сахарозы, 10 мм NaCl, 5 мм х2PO4, 2 мм MgSO4, 0,1% (w/v), бычьим сывороточным альбумином (БСА), 10 мм TES (рН 7,2)) используется для исследования потребления кислорода.
- Подготовьте субстратов, ингибиторы и эффекторы, используемых для измерения митохондриальное дыхание (Таблица 2). Они могут быть подготовленных ранее и хранятся при температуре-20 ° C.
Примечание: Нейтрализации pH кислой решений, таких как органические кислоты до pH 7.0 с использованием NaOH перед использованием. - Теплое дыхание средне-такая же температура как Пробирная палата (25 ° C).
- Соберите электрода кислорода Кларк типа, как описано в протоколе производителя.
- Место 1 мл воздуха насыщенный водой (вода, воздух насыщен получается энергично встряхивать небольшое количество обессоленной воды в большой коническую колбу) в измерительную камеру. Чтобы переключиться на мешалки, нажмите кнопку «Гребка скорость». Нажмите на кнопку «Вкл.» и установите скорость мешалки для 65 об/мин. Нажмите кнопку «ОК», чтобы продолжить. Постоянно помешивая воды 25 ° c.
- Калибровка кислорода электрода
- Теплая вода, которая будет использоваться для калибровки в такая же температура как Пробирная палата (25 ° C).
- Подождите, пока ток стабилизации и калибровки электродов кислорода.
- Чтобы начать калибровку кислорода электрода, нажмите кнопку «Калибровка», выберите «Жидкой фазы калибровка», а затем «Air насыщенных водой.»
- (Калибровка кислорода (жидкая фаза) - шаг 1 из 5) откроется новое окно. Выберите канал для калибровки (канал, придаваемое поле управления электрод) и введите переменные (набор «Температуры камеры» до 25 ° C и «Атмосферное давление» 101,32 кПа). Нажмите кнопку «OK «для продолжения.
- В следующий шаг (шаг 2 из 5), установки скорость мешалки (65 мин) и нажмите кнопку «ОК», чтобы продолжить.
- На шаге 3 из 5 дождитесь сигнала для достижения плато. Термин «плато достиг, нажмите OK, чтобы продолжить» будет отображаться в поле. Нажмите кнопку «ОК», чтобы продолжить.
- На шаге 4 раздела 5 установить нулевой кислорода в камере, добавив Дитионит натрия 5 мг. Нажмите кнопку «ОК», чтобы продолжить.
Примечание: Снижение концентрации кислорода должен быть видимым в трассировке и должен достичь 0. - На последнем шаге калибровки (шаг 5 из 5) дождитесь сигнала для достижения плато. Термин «плато достиг, нажмите OK, чтобы продолжить» будет отображаться в поле. Нажмите кнопку «ОК», чтобы продолжить.
- Нажмите кнопку «Сохранить калибровка», чтобы сохранить калибровки. Откроется новое окно. Нажмите кнопку «OK» для подтверждения, чтобы сохранить новую калибровку для окна управления кислорода.
Примечание: После успешной калибровки, обозначая «кислорода (нмоль/мл)» будет отображаться на оси y. - После калибровки очистите измерительной камеры в камеру с водой для ополаскивания (по крайней мере 5 - 10 раз) для обеспечения надлежащей очистки. Место 1 мл среды дыхания в измерительной камере и позволяют мембраны сбалансировать за несколько минут до тех пор, пока трассировка потребление кислорода является линейной.
- Адаптировать масштаб трассировки потребление кислорода для получения хорошей склона. Нажмите кнопку «Увеличить XY» и введите переменные (набор «Кислород», 0 - 300 и «Время оси» 0 - 45 мин).
- Определение митохондриальной целостности
- С открытым поршень добавьте 970 среднего насыщенного воздуха дыхания мкл реакционной камере.
- Добавить 30 мкл изолированных митохондриях или 150 мкг всего митохондриальных белок как определено после изоляции митохондрии (общий белок должен быть включен в расчеты потом) в реакционной камере с помощью пипетки с вырежьте кончиком.
- Перемешайте митохондриальной подвеска, непрерывно с помощью магнитной мешалкой бар (65/мин) при 25 ° C воздуха-насытить решения.
- Печать в камеру с поршнем, нажмите кнопку «Начать запись», чтобы записать потребление кислорода и разрешить трассировку потребление кислорода для стабилизации (1-2 мин).
- Определите скорость потребления кислорода вручную после добавления аскорбата 10 мм и 25 мкм цитохрома c 5 минут получить курс «перед моющее средство».
Примечание: Для обозначения добавления субстратов, ингибиторы и эффекторы непосредственно в трассировке, нажмите кнопку «Добавить событие Марка» и введите соответствующее обозначение метки. Нажмите кнопку «ОК», чтобы продолжить. - Определите скорость потребления кислорода вручную на 3 мин после добавления 0,05% (v/v) моющего средства, чтобы дать курс «после моющих средств». Нажмите кнопку «Остановить запись».
- Нажмите на кнопку «Темпы изменений таблицы». 2 курсоры будут отображаться как вертикальные линии на экране графика. Щелкните и перетащите пара скорость курсоров на необходимые позиции в трассировку, чтобы определить скорость интервал. Перемещение скорость интервал вдоль трассировки, используя курсор слева. Задайте интервал скорость с помощью курсора правильный курс. Кислорода, мониторинга программного обеспечения автоматически рисует линию наилучшего между двух курсоров при перемещении курсоры интервал скорость по трассе.
- После определения интервала желаемой скорости и позиции, введите стоимость в таблицу правой кнопкой мыши на 1 2 курсоров и выберите «Добавить курс в таблицу». Нажмите кнопку «Добавить», чтобы подтвердить для отображения скорость на таблице Основная ставка.
- Рассчитать митохондриальной целостность путем деления «перед моющих средств» ставка по курсу «после моющих средств», выраженный в процентах и вычесть его из 100.
- Определение митохондриальное дыхание
- С открытым поршень мкл 970 среднего насыщенного воздуха дыхания в реакционной камере. Добавьте 500 мкм СПС и 30 мкл изолированных митохондриях или 150 мкг всего митохондриальных белок с помощью пипетки с вырежьте кончиком для дыхания среде в реакционной камере.
- Перемешать митохондриальной подвеска, непрерывно с помощью магнитной мешалкой бар (65/мин) при 25 ° C.
- Закрыть поршень, нажмите кнопку «Начать запись» для записи потребления кислорода и ждать 1-2 мин на уровень потребления кислорода для стабилизации (при линейной трассировки потребление кислорода). Добавьте 5 мм сукцинат. Запись скорость потребления кислорода для около 2 мин.
Примечание: Для обозначения добавления субстратов, ингибиторы и эффекторы непосредственно в трассировке, нажмите кнопку «Добавить событие Марка» и введите соответствующее обозначение метки. Нажмите кнопку «ОК», чтобы продолжить. - Добавьте 1 мм аденозиндифосфат (ADP). Продолжить запись скорость потребления кислорода на 2 мин.
- Добавьте 1 мм НАДН. Запись скорость потребления кислорода для 4-8 мин. Этот показатель является объем дыхания через цитохрома-оксидазы.
- Добавить 1 мм цианистый калий (KCN) (или 2,5 мкм myxothiazol или 5 мкм antimycin A) препятствовать путь c тситохрома и продолжать запись для около 2 мин соблюдать потребление кислорода через альтернативные оксидазы.
- Добавление Дитиотреитол (DTT) 5 мм и 10 мм пируват полностью активировать альтернативных оксидазы. Продолжить запись для 5-7 мин: это потенциал альтернативного оксидазы.
- Добавьте 500 мкм н пропиловый галлат (НПГ) и записать на 2 мин. Это оценивает уровень потребления остаточного кислорода, который не препятствует химически. Вычтите этот показатель от других курсов, записал, как это не может быть митохондриального происхождения. Потребление кислорода, еще происходит после ингибирование цитохрома c и АОГ путь (по KCN и nPG) весьма вероятно, исходить от пероксидазы присутствует в качестве примеси в изолированных митохондриях9.
- Нажмите кнопку «Остановить запись».
- Нажмите на кнопку «Темпы изменений таблицы» и введите курс в таблицу правой кнопкой мыши на одном из двух курсоров и выберите «Добавить таблицу норм». Нажмите кнопку «Добавить», чтобы подтвердить для отображения скорость на таблице Основная ставка.
Примечание: Когда добавление эффекторов растворяется в органических растворителях (например., antimycin А, НПГ, myxothiazol), камеры и поршень необходимо промыть с этанолом и затем воды для обеспечения надлежащей очистки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Используя этот протокол, мы смогли обнаружить различные митохондриальных протеинов с SDS-PAGE и immunoblotting. Как показано на рисунке 3A, белок, изолированных от воды культуры ткани достаточно обнаружить слабые группы (2 мкг). Интенсивности сигнала увеличивается пропорционально суммам загружен. Для митохондрий изолированных от тканей, выращенных на пластины (рис. 3B), ответ на высокий свет стресс лечения в разных генотипов могут быть проанализированы по immunodetection с альтернативным оксидазы антител.
Целостности митохондрий, путь активности цитохрома c и альтернативный путь может быть измерена с помощью свежевыделенных митохондриальных образцов. Митохондриальной целостность хорошо сохранились в процедуре описано изоляции (рис. 4A). Добавление изолированных митохондриях различных субстратов, ингибиторы и эффекторы, влияние потребления кислорода через путь c тситохрома и альтернативных оксидазы путь (рис. 4В).
Рисунок 1: Установка для подготовки градиенты. Слева: Пробирок (50 мл) с небольшим углом размещены на льду с розетками перистальтические труб ПВХ, приклеенный к внутренней трубы; Средний: Перистальтический насос; Справа: Градиент Заливщик поверх магнитной мешалкой, содержащих тяжелые градиента (внутренний котел) и легких градиента (наружная камера) решения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Очистка митохондрий от Arabidopsis стреляет с помощью непрерывной градиент коллоидных плотности PVP/28% 0 - 4,4% (w/v). Темно зеленая полоса является тилакоидов и других загрязнений, как указано в верхней части градиента решений. Митохондриальной дроби появилась как белый зеленоватый группа ближе к нижней части трубки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: разделение митохондриальных протеинов SDS-PAGE и использование специфических антител immunodetection. (A) митохондрий изолированных от двух неделю Старый воды культивированный Arabidopsis thaliana диких тип (Columbia-0, Col-0) растения были подвергнуты SDS-PAGE и исследован с антителами против NADH: убихинон Оксидоредуктазы субъединицы S4 ( Ndufs4, At5g67590). Молекулярный вес неокрашенных маркеров были загружены на внешних лэйн геля и размер 10 представительных групп указаны в Кило Дальтон (кДа). Очевидной молекулярная масса белка Ndufs4 обнаружено 18 кДа. Изобилие белка показано по отношению к значению 2 мкг общего белка. (B) двух недельных саженцев, выращенных на B5 Gamborg в СМИ с 3% (w/v) сахарозы и 0,8% агар (w/v) были подвержены 750 µE m-2 s-1 Голы (HL) и собирают после 6 ч. митохондрии были очищены и митохондриальных протеинов были разделенных SDS-PAGE и исследован с антителами против альтернативных оксидазы (АОГ). Указывается наличие АОГ белка immunodetectable с очевидной молекулярной массой 34 кДа. Изобилие белка показано по отношению к значению элемента управления (2 мкг). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: Представитель следы O2 потребления отдельных растений митохондрий. (A) митохондрий изолированных от Arabidopsis thaliana одичал тип растений (Col-0), как указано выше были проанализированы на предмет целостности наружной мембраны до измерения потребления кислорода. 30 мкл изолированных митохондриях (150 мкг всего митохондриальных белок) были использованы. Митохондриальной целостности был определен как 90%, как описано выше. Кислорода (B), потребление измерения проводились с помощью 30 мкл изолированных митохондриях (150 мкг всего митохондриальных белок) от Arabidopsis thaliana одичал тип растений. Были определены общая митохондриальное дыхание и АОГ путь. Из этих данных потребление кислорода через путь c тситохрома и АОГ путь может быть определена. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Шлифование средних | |
| Химическая | Концентрация |
| Сахароза | 0,3 М |
| Пирофосфат натрия (Na4P2O7 · 10 H2O) | 25 мм |
| ЭДТА динатриевая соль | 2 мм |
| Монокальций фосфат калия (KH2PO4) | 10 мм |
| Поливинилпирролидона (PVP40) | 1% (w/v) |
| Бычьим сывороточным альбумином (БСА) | 1% (w/v) |
| Деионизированная вода | |
| Отрегулируйте пэ-аш до 7.5 (с использованием HCl) | |
| Примечание: для измельчения средних, Аскорбат натрия 1,06 g 300 мл (конечная концентрация: 17.84 мм) и 0,74 г, хвоща (конечная концентрация: 20,36 мм) добавляются только до использования. Проверить рН после добавления и приспособиться к 7,5 с 1 M NaOH, если требуется. | |
| 2 X мыть буфера | |
| Химическая | Концентрация |
| Сахароза | 0,6 М |
| TES | 20 мм |
| Бычьим сывороточным альбумином (БСА) | 0,2% (w/v) |
| Деионизированная вода | |
| Отрегулируйте пэ-аш до 7.5 (с использованием NaOH) | |
| Градиенты | |
| Тяжелые градиент решение (4,4% (w/v) PVP) | 2 трубки с градиента |
| 2 X мыть буфера | 17,5 мл |
| Градиент плотности Colloidial | 9.8 мл |
| PVP-40 (20% (w/v)) | 7.7 мл |
| Легкие градиентного раствора (0% (w/v) PVP) | 2 трубки с градиента |
| 2 X мыть буфера | 17,5 мл |
| Градиент плотности Colloidial | 9.8 мл |
| Деионизированная вода | 7.7 мл |
Таблица 1: Состав буферов и градиенты, используемые для изоляции митохондрий.
| Аббревиатура | Концентрация запасов решений | Хранения | Конечная концентрация | Объем, добавил 1 мл реакции | |
| Субстраты | |||||
| Цитохром с | CYT c | 2.5 мм (H2O) | -20 ° C | 25 МКМ | 10 мкл |
| NADH | NADH | 0,1 М (в H2O) | -20 ° C | 1 мм | 10 мкл |
| Сукцинат | SUCC | 500 мм (H2O) | -20 ° C | 5 мм | 10 мкл |
| Ингибиторы | |||||
| Antimycin A | AA | 1 мм (в EtOH) | -20 ° C | 5 МКМ | 5 мкл |
| Цианид | KCN | 100 мм (H2O) | 4 ° C | 1 мм | 10 мкл |
| Myxothiazol | Показано | 500 мкм (в EtOH) | -20 ° C | 2.5 МКМ | 5 мкл |
| n-пропиловый галлат | nPG | 100 мм (в EtOH) | -20 ° C | 500 МКМ | 5 мкл |
| Эффекторы | |||||
| ADP | ADP | 100 мм (H2O) | -20 ° C | 1 мм | 10 мкл |
| Аскорбиновая кислота | ASC | 500 мм (H2O) | Сделать свежий день использования | 10 мм | 20 мкл |
| ATP | ATP | 100 мм (H2O) | -20 ° C | 500 МКМ | 5 мкл |
| Dithiotreitol | DTT | 1 М (в H2O) | Сделать свежий день использования | 10 мм | 10 мкл |
| Пируват | Pyr | 1 М (в H2O) | -20 ° C | 10 мм | 10 мкл |
| Моющее средство | 10% (v/v) (H2O) | 4 ° C | 0,05% (v/v) | 5 мкл | |
Таблица 2: Список субстратов, ингибиторы и эффекторы, используемых для измерения потребления кислорода.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Как правило изоляции митохондрий от Arabidopsis листья урожайность до 3 мг митохондрий от примерно 80-100 3 - 4 - неделя старый растений, хотя урожайность более чем 5 мг часто может быть достигнуто с тщательного шлифования. Доходность зависит от условий роста и резко, как листья senesce, снижается, хотя митохондрии структура, как представляется, хорошо сохраняться во время старения9. Одним из наиболее важных особенностей получить хороший урожай является метод измельчения чтобы лизировать клетки выпустить митохондрий. В то время как количество механических шлифовальный аппарат доступны для покупки, для выращивания арабидопсиса измельчения в ступку и пестик достигает неизменно хорошие результаты с точки зрения доходности, как лизирует клетки с небольшой ущерб органеллы. Хотя механические мельницы быстро, они требуют оптимизации и количество шлифовальных требуется могут варьироваться в соответствии ткани. С раствором и пестик, он часто удобно и более эффективным, если кусочки ткани или срезанные с ножом или ножницами перед шлифованием. Как говорится, все шаги должны осуществляться при температуре 4 ° C и вся процедура от конца шлифовальные для получения промывают Пелле очищенный митохондрий следует принимать около 4 ч. Как следы моющих средств или других реагентов на трубы или градиент углекислотные может резко снизить доходность, все компоненты, используемые в этих процедурах мыть без моющего средства и не используется в других процедурах. Наконец важно, что митохондрии достаточно отделены от других фракций на градиент, чтобы позволить им быть удалены и промывают. Если они слишком в нижней части трубки, это означает, что смешивание легких и тяжелых решений должна быть скорректирована, чтобы позволить более тяжелые решения, чтобы вылить перед смешиванием. И наоборот если группа появляется диффузных и высоким в трубе, смешивание необходимо немного раньше.
Метод конспектированный здесь может легко использоваться для изоляции митохондрий Arabidopsis цветок и корневые ткани11,12. Для корней это удобно расти в культуре гидропоники и нужно 100 г свежего веса для получения 2 мг количество митохондрий. Для измельчения корней следует нарезать на мелкие кусочки до измельчения в ступку и пестик, и увеличение урожайности могут быть получены путем повторного помола тканей корня, в ступку с пестиком или в блендере. Для цветочные ткани где митохондриальной функции часто более13, шлифовальные с раствором и пестик работает хорошо, но ограниченное количество материала означает, что большое количество растений необходимо выращивать урожай ткани. Митохондрии были изолированы от различных органов Arabidopsis, с использованием аналогичных методов или незначительные изменения14,15 и риса (Oryza sativa)16.
Ограничения метода, описанного выше, i большое количество семян, необходимых для митохондриального изоляции, ii) только конкретные ткани Arabidopsis и применяется в этом методе изоляции, iii) небольшие количества различных загрязняющих веществ (таких, как рис пероксисомальной белки) по-прежнему существует в очищенной митохондрий. Митохондрии, полученные с помощью методов, описанных выше, подходят для различных исследований, начиная от исследования поглощение кислорода анализ количественного масс-спектрометрии белков изобилия. Градиент очищенный митохондрии по-прежнему будет содержать небольшое количество различных загрязнителей, таких как пероксисомальной белки3. Сравнение с определенных органелл списки может использоваться для определения изменений в митохондриальных протеинов, пока небольшое количество загрязнения не митохондриальных протеинов (< 10%) и аналогичные образцы сравниваются, поэтому тип и степень Аналогично не митохондриальных протеинов. Анализ плотности залегания протеина SDS-PAGE или другие подходы, основанные на гель может осуществляться с относительно небольшим количеством митохондрий (2-20 мкг), используя различное количество митохондрий для проверки линейности обнаружения антител (рис. 3). Хотя Пори (зависимые канал аниона напряжения (VDAC)) часто используется в качестве элемента управления загрузкой для количественной оценки, в наш опыт относительно большое обилие этого белка может означать, что ответ часто не является линейной, если большое количество белка, загружаются на геле , так что линейность реакции антитела всегда должны быть проверены, при использовании такой загрузки элементов управления. Значимость этого подхода изоляции митохондрий является, что в отличие от градиентов, которые используют сахарозы в качестве материала для формирования градиент плотности, коллоидное плотности градиенты не требуют осмотического перестройки очищенный митохондрий как это требуется с сахароза. Это означает, что есть меньше шансов сверлении очищенный митохондрии и после стирки для удаления коллоидных плотность материала, они могут непосредственно использоваться в различных анализов или приложений.
Ткани пятна, где обнаружены митохондриальных протеинов от весь лист или ткани экстрактов, являются привлекательным подход к измерить количество митохондриальных протеинов в этой ткани. Учитывая в целом низкий объем по сравнению с другими органеллы митохондрии, обнаружение митохондриальных белок на всей ткани экстрактов должна толковаться с определенной осторожностью, как митохондриальных белок может быть за пределы обнаружения в таких подходов. Тщательный контроль, где очищенный митохондрий electrophoresed вместе с экстрактами тканей для обеспечения одинаковых миграции и линейность обнаружения, должны осуществляться иметь уверенность в таких подходов.
С помощью электрода кислорода Кларк типа изменения в парциального давления кислорода решения может быть измерена. Фактической электрод состоит из платины катод и Серебряный анода, которые соединены мостом KCl и охватываемых электролита, смоченным бумаги (сигареты) и кислород проницаемой мембраны (политетрафторэтилен мембраны). От 600-700 мВ напряжения приводит к сокращению кислорода, давая линейную связь между концентрацией кислорода и напряжения. Электроды кислорода доступны коммерчески из разных компаний. Каждая компания будет иметь свои собственные инструкции, касающиеся Ассамблеи и установка электрода кислорода. Однако в целом Серебряный анодом и катодом Платиновый электрод диска должны быть очищены с помощью электрода очистка kit или ластик пера перед Ассамблеей. Важно обеспечить, чтобы пузырьки воздуха не образуют во время Ассамблеи (например между политетрафторэтилена диафрагмы и папиросной бумаги). После сборки электрод диск необходимо придавать в камеру с платиновым катода вверх на базе реакционной камеры. Камера сама окружен водяной рубашкой, обеспечение контроля температуры. Это чрезвычайно важно, что камера всегда остается полный воды, так как мембрана высыхает и трещины в противном случае. Аналогичным образом мембраны должна не быть тронут пипетки или шприцы при добавлении соединения в камеру, чтобы избежать разрывов.
До assay, средний дыхания следует прогреты до такая же температура как Пробирная палата (в большинстве случаев 25 ° C) и мембраны должно быть позволено сбалансировать в буфере дыхание на несколько минут. После закрытия поршнем для потребления кислорода assays, добавлением эффекторных молекул должен осуществляться с помощью шприцев не disposable микролитр (например микро шприцы) или загрузки Наконечники одноразовые гель. Если с помощью микро шприцы, она должна обеспечиваться тщательно промыть шприц, с 100% этанол и вода между дополнений, чтобы избежать загрязнения запасов решения. Это также применяется для мойки камеры между измерениями. Большинство реагентов, используемых в анализов потребление кислорода, растворимы в воде и могут быть легко удалены несколько Ополоснуть водой (примерно пять раз) между измерениями. Однако некоторые химические вещества, используемые для анализов только растворим в органических растворителях, таких как antimycin A, myxothiazol и НПГ. Таким образом палата необходимо промыть с органическим растворителем (50% (v/v) этанола) между анализов для удаления остаточных следов этих молекул, а затем с водой (примерно пять раз) чтобы истощить остатки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют никакого конфликта интересов.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано Австралийский исследовательский совет центра передового опыта в завод энергии биологии CE140100008, Австралийский исследовательский совет будущее стипендий (FT130100112) MWM и Феодор Линен стипендий (Александр фон Гумбольдт Фонд, Германия) для JS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADP | Sigma-Aldrich | A2754 | Chemical |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | Chemical, dissolve in ethanol |
| AOX antibody | from Tom Elthon | Elthon et al., 1989 | |
| Ascorbate | Sigma-Aldrich | A0157 | Ascorbate Oxidase from Cucurbita sp. |
| ATP | Sigma-Aldrich | A26209 | Chemical |
| Bovine serum albumin (BSA) | Bovogen | BSAS 1.0 | Chemical |
| Clarity western ECL substrate | Bio-Rad Laboratories | 1705061 | Chemical |
| Criterion Stain-Free Precast Gels 8-16% 18 Wells | Bio-Rad Laboratories | 5678104 | Chemical |
| Cyanide | Sigma-Aldrich | 60178 | Chemical |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C3131 | Chemical |
| Difco Agar, granulated | BD Biosciences | 214530 | Chemical |
| Dithiotreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | Chemical |
| EDTA disodium salt | Sigma-Aldrich | E5134 | Chemical |
| Gamborg B-5 Basal Medium | Austratec | G398-100L | Chemical |
| Gamborg Vitamin Solution (1000x) | Austratec | G219-100ML | Chemical |
| Goat Anti-Mouse IgG (H + L)-HRP Conjugate | Bio-Rad Laboratories | 1706516-2ml | Chemical |
| Goat Anti-Rabbit IgG (H + L)-HRP Conjugate | Bio-Rad Laboratories | 1706515-2ml | Chemical |
| L-Cysteine | Sigma | C7352-100G | Chemical |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 230391 | Chemical |
| Murashige & Skoog Basal Salt Mixture (MS) | Austratec | M524-100L | Chemical |
| Myxothiazol | Sigma-Aldrich | T5580 | Chemical, dissolve in ethanol |
| NADH | Sigma-Aldrich | N8129 | Chemical |
| Ndufs4 antibody | from Etienne Meyer | Meyer et al., 2009 | |
| n-Propyl gallate | Sigma-Aldrich | P3130 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | Chemical, colloidal density gradient |
| Polyvinylpyrrolidone (PVP40) | Sigma-Aldrich | PVP40 | Chemical |
| Potassium cyanide | Sigma-Aldrich | 60178 | Chemical |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | Chemical |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | Chemical |
| Sodium chloride | Chem-Supply | SA046 | Chemical |
| Sodium dithionite | Sigma-Aldrich | 157953 | Chemical |
| Sodium L-ascorbate | Sigma | A4034-100G | Chemical |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S2378 | Chemical |
| Sucrose | Chem-Supply | SA030 | Chemical |
| TES | Sigma-Aldrich | T1375 | Chemical |
| Tetrasodium pyrophosphate (Na4P2O7 · 10H2O) | Sigma-Aldrich | 221368 | Chemical |
| Trans-Blot Turbo RTA Midi Nitrocellulose Transfer Kit | Bio-Rad Laboratories | 1704271 | Chemical |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | X100 | Chemical, detergent |
| Western Blocking Reagent | Sigma | 11921681001 | Chemical |
| Balance | Mettler Toledo | XS204 | Equipment |
| Beakers | Isolab | 50 mL | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-26XP | Equipment |
| Centrifuge tubes | Nalgene | 3117-9500 | Equipment |
| Circulator | Julabo | 1124971 | Attached to oxygen electrode chamber |
| Conical flask | Isolab | 500 mL | |
| Dropper | 3 mL | ||
| Fixed angle rotor | Beckman Coulter | JA25.5 | Equipment |
| Funnel | Per Alimenti | 14 cm | For filtering |
| Gradient pourer | Bio-Rad | 165-4120 | For preparation of gradients |
| Magnetic Stirrer ATE | VELP Scientifica | F20300165 | Equipment |
| Miracloth | VWR | EM475855-1R | Filtration material |
| Mortar and pestle | Jamie Oliver | Granite, 6 Inch | Equipment |
| O2view | Hansatech Instruments | Oxygen monitoring software | |
| Oxygraph Plus System | Hansatech Instruments | 1187253 | Clark-type oxygen electrode |
| Paintbrush | Artist first choice | 1008R-12 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | plastic paraffin film |
| Peristaltic pump | Gilson | F155001 | For preparation of gradients |
| PVC peristaltic tubing | Gilson | F117930 | For preparation of gradients |
| Water bath | VELP Scientifica | OCB | Equipment |
References
- Day, D. A. Highlights in plant mitochondrial research. Methods in molecular biology. Plant mitochondria. 1305, v-xvi (2015).
- Millar, A. H., Carrie, C., Pogson, B., Whelan, J. Exploring the function-location nexus: Using multiple lines of evidence in defining the subcellular location of plant proteins. Plant Cell. 21 (6), 1625-1631 (2009).
- Eubel, H., et al. Free-flow electrophoresis for purification of plant mitochondria by surface charge. Plant J. 52 (3), 583-594 (2007).
- Murcha, M. W., et al. Protein import into plant mitochondria: Signals, machinery, processing, and regulation. J. Exp. Bot. 65 (22), 6301-6335 (2014).
- Carrie, C., et al. Approaches to defining dual-targeted proteins in Arabidopsis. Plant J. 57 (6), 1128-1139 (2009).
- Pinto, G., Radulovic, M., Godovac-Zimmermann, J. Spatial perspectives in the redox code - Mass spectrometric proteomics studies of moonlighting proteins. Mass Spectrom. Rev. , (2016).
- Day, D. A., Neuburger, M., Douce, R. Biochemical characterisation of chlorophyll-free mitochondria from pea leaves. Aust. J. Plant Physiol. 12 (3), 219-228 (1985).
- Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nat. Protoc. 4 (4), 484-494 (2009).
- Cheah, M. H., et al. Online oxygen kinetic isotope effects using membrane inlet mass spectrometry can differentiate between oxidases for mechanistic studies and calculation of their contributions to oxygen consumption in whole tissues. Anal Chem. 86 (10), 5171-5178 (2014).
- Chrobok, D., et al. Dissecting the metabolic role of mitochondria during developmental leaf senescence. Plant Physiol. 172 (4), 2132-2153 (2016).
- Lee, C. P., Eubel, H., O'Toole, N., Millar, A. H. Combining proteomics of root and shoot mitochondria and transcript analysis to define constitutive and variable components in plant mitochondria. Phytochemistry. 72 (10), 1092-1098 (2011).
- Lee, C. P., Eubel, H., Solheim, C., Millar, A. H. Mitochondrial proteome heterogeneity between tissues from the vegetative and reproductive stages of Arabidopsis thaliana development. J. Proteome Res. 11 (6), 3326-3343 (2012).
- Millar, A. H., Whelan, J., Soole, K. L., Day, D. A. Organization and regulation of mitochondrial respiration in plants. Annu. Rev. Plant Biol. 62, 79-104 (2011).
- Peters, K., et al. Complex I - complex II ratio strongly differs in various organs of Arabidopsis thaliana. Plant Mol. Biol. 79 (3), 273-284 (2012).
- Werhahn, W. H., et al. Purification and characterization of the preprotein translocase of the outer mitochondrial membrane from Arabidopsis thaliana: Identification of multiple forms of TOM20. Plant Physiol. 125 (2), 943-954 (2001).
- Heazlewood, J. L., Howell, K. A., Whelan, J., Millar, A. H. Towards an analysis of the rice mitochondrial proteome. Plant Physiol. 132 (1), 230-242 (2003).
