Summary
Mitokondrierna är endast en liten andel av cellen växt, behöver de renas för en rad studier. Mitokondrier kan isoleras från en mängd växt organ av homogenisering, följt av differential- och täthet lutning centrifugering att erhålla en högrenade mitokondriell fraktion.
Abstract
Mitokondrierna är väsentliga organeller inblandade i många metaboliska vägar i växter, särskilt produktionen av adenosintrifosfat (ATP) från oxidation av reducerade föreningar som nikotinamid-adenin-dinukleotid (NADH) och flavin adenin dinukleotid (Fransson2). Komplett annotering av Arabidopsis thaliana genomet har fastställt det som mest använda växten modellsystem, och därmed behovet av att rena mitokondrier från en mängd olika organ (blad, rot eller blomma) är nödvändigt att fullt ut utnyttja verktyg som är nu tillgängliga för Arabidopsis att studera mitokondriell biologi. Mitokondrierna är isolerade genom homogenisering av vävnaden med hjälp av olika metoder, följt av en serie differentiell centrifugering steg producerar en rå mitokondriell pellet som renas ytterligare med hjälp av kontinuerlig kolloidal täthetlutning centrifugering. Kolloidalt densitet materialet avlägsnas därefter genom flera centrifugering steg. Start från 100 g färska löv-vävnad, kan 2-3 mg av mitokondrier erhållas rutinmässigt. Respiratoriska experiment på dessa mitokondrier visar typiska priser 100-250 nmol O2 min-1 mg totalprotein mitokondrie-1 (NADH-anhörigen klassar) med möjlighet att använda olika substrat och hämmare för att avgöra vilka substrat som oxideras och kapaciteten för de alternativa och cytokrom terminal oxidases. Det här protokollet beskriver en metod för isolering av mitokondrier från Arabidopsis thaliana blad med kontinuerlig kolloidal densitetsgradienter och en effektiv respiratoriska mätningar av renat växt mitokondrier.
Introduction
Historien om anläggningen mitokondriell forskning går tillbaka över 100 år1. Intakt mitokondrier isolerades först på tidiga 1950-talet med hjälp av differentiell centrifugering. Tillkomsten av en kolloidal täthetlutning på 1980-talet tillät mitokondrier som renas utan lidande osmotisk justering. Medan gradient renat mitokondrierna är lämplig för de flesta ändamål, på grund av känsligheten hos masspektrometri, även relativt mindre föroreningar kan upptäckas och kan tilldelas felaktigt en mitokondriell läge2. Användning av fritt flöde elektrofores kan ta bort båda plastidic och peroxisomal kontaminering3, men gratis flow elektrofores är en högt specialiserad teknik och krävs inte för den stora majoriteten av studier. Dessutom uppstår när fastställandet av lokalisering av ett protein som den behöver vara ihågkommen som dubbla eller flera inriktning av proteiner i celler. Över 100 dubbla riktade proteiner beskrivs för kloroplaster/plastids och mitokondrier4och ett antal proteiner riktade till mitokondrierna och peroxisomes är också kända5. Dessutom är åter platsen för proteiner under specifika stimuli, t ex oxidativ stress, en framväxande tema i cellbiologi6. Således, platsen för proteiner måste beaktas i samband med biologi studerade, och en mängd olika metoder används för att bestämma och Kontrollera läge2.
Mitokondrierna är normalt isolerade från växt vävnader av homogenisering, det krävs en balans mellan bryta öppna cellväggen att släppa mitokondrier och inte skadar mitokondrierna. Traditionellt, med potatis och blomkål innebär homogenisering att använda hushållens blender/juicer apparater för att göra en flytande extrakt i en buffert med olika komponenter att bibehålla aktivitet. Isolering av mitokondrier från ärt blad, (ett populärt materiellt för mitokondriell isolering använder unga plantor (~ 10 dagar gamla), använder tredjeparts en mixer för att lysera celler som leaf materialet är mjukt. Med tillgängligheten av Arabidopsis thaliana T-DNA insertional knock-out linjer, har behovet av att kunna rena mitokondrierna att utföra funktionella studier nödvändiggjort utveckling av metoder att isolera mitokondrier från blad, rot eller blomma vävnad. Totalt arbetade de metoder som utvecklats för andra växter väl7, med en naturaförmån som slipning av materien som behövs för att optimeras. För Arabidopsis detta kan uppnås på olika sätt (se nedan), och skiljer sig mellan vävnadstyper (root kontra skjuta). Användning av kontinuerlig gradient kan även optimeras som tätheten av mitokondrier från olika organ eller utvecklingsstadier innebär de kan migrera annorlunda. Således, för maximal separation tätheten av övertoningen kan förfinas för att uppnå bästa separation.
En gång renat mitokondrierna kan användas för en mängd studier, bland annat protein och tRNA upptag experiment, enzym aktivitet analyser, respiratorisk kedja mätningar och western blot analyser. Isolerade mitokondrier kan också användas för masspektrometri analyser av protein överflöd. Riktade flera reaktion övervakning (MRM) analyser möjliggör kvantifiering av definierade proteiner, men kräver betydande assay utveckling. Kvantifiering av dimetylfumarat eller andra isotopen etiketter8, ger däremot en discovery strategi i identifiera skillnader över det hela proteomet som kan användas för att avslöja nya biologiska insikter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta protokoll används för isolering av intakt mitokondrier från Arabidopsis thaliana organ odlas på jorden med kontinuerlig kolloidal täthetlutningar. Alla procedurer efter insamlingen av materialet utförs vid 4 ° C.
1. beredning av slipning Medium, tvättbuffert och Gradient lösningar
- Förbereda 300 mL slipning medium (minus askorbat och cystein) och 200 mL 2 x Tvättbuffert per tabell 1 en dag före isolering, hålla dem kallt vid 4 ° C.
Obs: Lägga till natriumaskorbat och L-cystein (gratis bas) till en slutkoncentration av 17.84 mM och 20.36 mM, respektive till slipning medium på morgonen av isolering. Om mitokondrierna är att användas för western blot eller blå native-polyakrylamid gel elektrofores (BN-sidan) analyser, se upp 2 x Tvättbuffert utan BSA. - Förbereda lutningar på morgonen den mitokondriella isolering (figur 1 och tabell 1).
- Göra de tunga och lätta gradient lösningarna i två bägare; 35 mL av varje räcker för två gradient rör.
- Tvätta kamrarna av gradient pourer och PVC peristaltiska slangar med avjoniserat vatten och säkerställa jämt flöde genom slangen från alla slangar.
- Plats 2 centrifugrör (50 mL) i en liten vinkel på isen med PVC peristaltiska slangar uttagen tejpade på insidan av rören för att säkerställa lutning lösningen rinner ner sidan av rören.
- Stäng anslutningen mellan inre och yttre kamrarna (svart spak ner). Placera gradient pourer på en magnetomrörare med små rör bar i den inre kammaren.
- Häll över 35 mL tunga gradient lösningen i den inre kammaren (avdelningen med slangar utlopp). Fördela den tunga gradient lösningen i två Centrifugera rören placeras på is tills hälften återstår med den peristaltiska pumpen inställd på snabb (300 mL/h).
- Häll över 35 mL ljus toning lösningen i den yttre kammaren (avdelningen utan slangar uttag). Öppna anslutningen mellan kamrarna (push svart spak upp halvvägs) och Tillåt lösningar att blanda försiktigt. Blanda de med magnetomröraren.
- Tillåta lösningarna går långsamt (60 mL/h) tills alla gradient mixen har hällts från kamrarna resulterar i två 0 - 4,4% (w/v) polyvinylpyrrolidon (PVP) gradient-fyllda rören. Hålla lutningarna på is tills det ska användas i steg 2.12.
Obs: När toningen har förberetts, späd 2 x tvätta medium till 1 x med prechilled-avjoniserat vatten och håll kallt vid 4 ° C.
2. homogenisering och mitokondrie isolering
- Skär hela rosett vävnad från 4 - vecka-gammal Arabidopsis växter som odlas på mark med sax, kommer minst 80 växter att krävas för 1 prep.
Obs: 10-14 dag gammal vatten kulturer, minst 5 pots/prep, eller 2 - vecka gamla plantor odlas på Murashige & Skoog Basal Salt blandning (MS) agarplattor, minst 4 tallrikar, kan också användas. - Placera hälften av växtmaterial som har skurits i små bitar i en nedkylda 4 ° C stor mortel och stöt med 75 mL slipning medium (tabell 1) och slipa utförligt i flera minuter tills inga stora bitar av vävnad är kvar.
- Pre våt 4 lager av filtrering material (22-25 µm porstorlek) med slipning medium och filtrera Homogenatet genom de 4 lagrarna av filtrering material genom en plast tratt till en 500 mL konisk kolv.
- Slipa den återstående hälften av vävnaden med ytterligare 75 mL slipning medium.
- Kombinera homogenates i filtermaterial och filtrera så mycket som möjligt Homogenatet genom.
- Slipa den kvarvarande vävnad kvar på filtrering materialet igen med de resterande 150 mL slipning medium, filtret igen i en 500 mL konisk kolv.
- Centrifugera filtrerade Homogenatet i 8 pre kylda 50 mL plast centrifugrör vid 2500 x g vid 4 ° C i en fast vinkel rotor för 5 min.
- Häll supernatanten i ren centrifugrör (50 mL, undvika att störa den gröna pelleten) och centrifugera vid 17.500 x g vid 4 ° C i 20 min i en fast vinkel rotor.
- Ignorera alla men < 3 mL av supernatanten med aspiration (eller häll försiktigt av utan att störa pelleten). Försiktigt återsuspendera pelleten i resterande supernatanten med hjälp av en liten fin pensel.
- Tillsätt 10 mL av 1 x Tvättbuffert i varje rör och kombinera 4 rör i 1 ren centrifugrör (dvs. vilket resulterar i 2 rör).
- Fyll dessa rör med 1 x Tvättbuffert till 50 mL och upprepa steg 2,7-2,9.
- Pool rå mitokondriell pellets in 1 tube med hjälp av en pipett och sprida jämnt med fin pensel (en liten mängd av tvättbuffert kan användas men den slutliga volymen måste vara mindre än 3 mL passar ovanpå övertoningen). Försiktigt lager mitokondriell fjädringen med en pipett till 2 kontinuerlig 0 - 4,4% (w/v) PVP Övertoningarna.
- Balansera rör viktprocent (med 1 x Tvättbuffert) och centrifugera 40 000 x g vid 4 ° C i 40 min. se till pausen är avstängd. Mitokondrier kommer att migrera till ett band nära botten av röret, eller kan förekomma i tunga lösningen vid botten av röret (som identifieras av ett molnigt, gulaktigt band; (Se figur 2).
- Ta försiktigt bort den övre 5 cm av lösningen ovan mitokondriell bandet av aspiration.
- Fördela återstående lösningen innehållande mitokondrierna i 2 rena rör och fyll med 1 x tvättbuffert. Jämnt fördela den kolloidal täthetlutning och mitokondrier genom täcker mynningen av röret med en plast paraffin film och vända flera gånger. Centrifugera i 15 min på 31.000 x g vid 4 ° C med långsam bromsning.
Obs: Före centrifugering, kontrollera att mitokondrierna och återstående kolloidal täthetlutningen fördelas jämnt. Annars kan kolloidal täthetlutningen koncentrera sig på botten av röret och förhindra pelletering av mitokondrierna. - Ta bort supernatanten genom aspiration, Fyll röret med 1 x tvätta buffra upp till 50 mL och Invertera igen för att säkerställa blandning. Centrifugera i 15 min på 31.000 x g vid 4 ° C med långsam bromsning.
- Aspirera supernatanten och samla mitokondriell pellets i som liten en volym (~ 500 µL) som möjligt med hjälp av en pipett med modifierad 200 µL tips (skär spetsen lite ovanför dess avsluta att öka dess öppning). Placera mitokondrierna i en 1,5 mL tub och hålla på is för användas omedelbart eller förvaras vid-80 ° C.
Obs: Om mitokondrier kommer att användas för sodium dodecyl sulfate-polyakrylamid gelelektrofores (SDS-PAGE), BN-sida eller immunoblot analyser, använder 1 x Tvättbuffert utan BSA för de slutliga tvättarna (dvs, steg 2.15 och 2.16). - Bestämma proteinkoncentration av mitokondrier med Bradford metoden.
Obs: För BN-sida centrifug alikvoter vid 4 ° C, och store pellets vid-80 ° C fram till användning. För syre förbrukning mätningar, kan endast färska isolerade mitokondrier användas.
3. syre förbrukning mätningar
Obs: Syreförbrukning av nymalen isolerad växt mitokondrier kan analyseras med en Clark-typ syre elektrod, möjliggör bestämning av mitokondriell orördhet, cytokrom c väg aktivitet och alternativa vägen aktivitet.
- Installation av programvara
- Installera licensierade syre övervakning programvara på datorn som används för syre förbrukning mätningar.
- Beredning av respiration medium, substrat, kemiska stamlösningar och Clark-typ syre elektroden
- Förbereda respiration medium (300 mM sackaros, 10 mM NaCl, 5 mM KH2PO4, 2 mM MgSO4, 0,1% (w/v) bovint serum albumin (BSA), 10 mM TES (pH 7,2)) som används för syre förbrukning analyser.
- Förbereda substrat, hämmare och effektorer som används för att mäta mitokondriell respiration (tabell 2). Dessa kan vara förberett tidigare och lagras vid-20 ° C.
Obs: Neutralisera pH-värdet i sura lösningar såsom organiska syror till pH 7.0 med hjälp av NaOH före användning. - Varma respiration medellång till samma temperatur som assay kammaren (25 ° C).
- Montera Clark-typ syre elektroden som beskrivs i protokollet av tillverkaren.
- Placera 1 mL mättad luft vatten (luft-mättade vatten erhålls genom att skaka kraftigt en liten mängd avjoniserat vatten i en stor konisk kolv) i mätkammaren. Växla på omröraren, klicka på knappen ”omrörare Speed”. Klicka på knappen ”On” och Ställ in omröraren hastighet till 65 rpm. Klicka på ”OK” för att fortsätta. Rör om vattnet kontinuerligt vid 25 ° C.
- Kalibrering av syre elektrod
- Varma vattnet som kommer att användas för kalibrering till samma temperatur som assay kammaren (25 ° C).
- Vänta tills aktuellt att stabilisera och kalibrera syre elektroden.
- Starta Kalibrering av syre elektroden, klicka på knappen ”Kalibrera”, Välj ”flytande fas kalibrering” och sedan ”luft mättat vatten”.
- Ett nytt fönster öppnas (syre kalibrering (flytande fas) - steg 1 av 5). Välj kanalen du vill kalibrera (kanalen elektrod kontrollboxen bifogas) och ange variabler (set ”kammartemperatur” till 25 ° C och ”lufttryck” till 101.32 kPa). Klicka på ”OK” att fortsätta.
- I nästa steg (steg 2 av 5), setup omrörare hastigheten (65 rpm) och klicka på ”OK” för att fortsätta.
- I steg 3 av 5, vänta för signalen att nå en platå. Termen ”platå nått, tryck OK för att fortsätta” visas i rutan. Klicka på ”OK” för att fortsätta.
- I steg 4 av 5, upprätta noll syre i kammaren genom att lägga till 5 mg natrium Ditionit. Klicka på ”OK” för att fortsätta.
Obs: En minskning av syrekoncentrationen ska vara synliga i spårningen och bör nå 0. - I det sista steget av kalibrering (steg 5 av 5), vänta för signalen att nå en platå. Termen ”platå nått, tryck OK för att fortsätta” visas i rutan. Klicka på ”OK” för att fortsätta.
- Klicka på ”Spara kalibrering” för att spara kalibreringen. Ett nytt fönster öppnas. Klicka på ”OK” för att bekräfta att du vill spara den nya kalibreringen för syre kontrollboxen.
Obs: Efter lyckad kalibrering, märkning ”syre (nmol/mL)” visas på y-axeln. - Efter kalibrering, ren mätkammaren genom sköljning kammaren med vatten (minst 5 - 10 gånger) för att säkerställa korrekt rengöring. Placera 1 mL respiration medium till mätning kammare och tillåta membranet temperera i några minuter tills syre förbrukning tracen är linjär.
- Anpassa omfattningen av syre förbrukning spårningen att se bra lutning. Klicka på ”Zoom XY” och ange variabler (ange ”syre” till 0 - 300 och ”tidsaxeln” till 0 - 45 min).
- Bestämning av mitokondriernas integritet
- Med kolven öppna, lägga till 970 µL luft-mättade respiration medium till reaktionskammaren.
- Lägg till 30 µL isolerade mitokondrier eller 150 µg totalt mitokondriell protein som bestäms efter mitokondrier isolering (totalt protein måste inkluderas i beräkningarna efteråt) till reaktionskammaren med pipett med skuren spets.
- Rör om mitokondriell suspensionen kontinuerligt med en magnetomrörare bar (65 rpm) vid 25 ° C luft-mätta lösningen.
- Försegla kammaren med kolven, klicka på ”Starta inspelning” för att spela in syreförbrukning, och ge syre förbrukning spårningen att stabilisera (1-2 min).
- Fastställa vilken syreförbrukning manuellt efter att lägga till 10 mM ascorbaten och 25 µM cytokrom c för 5 min att få andelen ”innan tvätt-och rengöringsmedel.
Obs: Etikettera tillägg av substrat, hämmare och effektorer direkt i spårningen, klicka på knappen ”Lägg till händelse märke” och ange motsvarande etikett beteckningen. Klicka på ”OK” för att fortsätta. - Fastställa vilken syreförbrukning manuellt för 3 min efter att lägga till 0,05% (v/v) rengöringsmedel för att ge kursen ”efter tvätt-och rengöringsmedel. Klicka på ”Stop Recording”.
- Klicka på knappen ”priser på Ändra tabell”. 2 markörer visas som lodräta linjer på skärmen graf. Klicka och dra para av ränta markörer krävs ståndpunkter i spårningen att definiera hastighet intervallet. Flytta hastighet intervallet längs spårningen använder markören vänster kurs. Ange hastighet intervallet själv med rätt hastighet. Syret övervakning programvara automatiskt ritar en linje av bästa passform mellan de två markörerna medan du flyttar takt intervall markörerna längs spåret.
- När den önskade hastighet intervallet och placering har definierats, ange tariffen i tabellen med en rätt klick på 1 av 2 markörerna och välj ”Lägg ränta till bord”. Klicka på ”Lägg till” knappen för att bekräfta att du vill visa kursen på den huvudsakliga kostnadstabell.
- Beräkna mitokondriernas integritet genom att dividera andelen ”innan tvätt-och rengöringsmedel av” efter tvätt-och rengöringsmedel andelen, uttryckt i procent, och subtrahera det från 100.
- Bestämning av mitokondriell respiration
- Med kolven öppna, lägga till 970 µL av air-mättade respiration medium till reaktionskammaren. Lägga till 500 µM ATP och 30 µL isolerade mitokondrier eller 150 µg totalt mitokondriell protein med pipett med skuren spets till respiration medium i reaktionskammaren.
- Rör om mitokondriell suspensionen kontinuerligt med en magnetomrörare bar (65 rpm) vid 25 ° C.
- Nära kolven, klicka på ”Starta inspelning” för att registrera syreförbrukning, och vänta 1-2 min för syre materialåtgången att stabilisera (när syre förbrukning tracen är linjär). Lägg till 5 mM succinat. Rekord av syreförbrukningen i ca 2 min.
Obs: Etikettera tillägg av substrat, hämmare och effektorer direkt i spårningen, klicka på knappen ”Lägg till händelse märke” och ange motsvarande etikett beteckningen. Klicka på ”OK” för att fortsätta. - Lägg till 1 mM adenosindifosfat (ADP). Fortsätt inspelning av syreförbrukningen i 2 min.
- Lägg till 1 mM NADH. Rekord av syreförbrukning för 4-8 min. Denna kurs är kapaciteten för andning via cytokrom oxidas.
- Lägg 1 mM kaliumcyanid (KCN) (eller 2,5 µM myxothiazol eller 5 µM antimycin A) för att hämma cytokrom c vägen och fortsätta att registrera i ca 2 min att iaktta syreförbrukning via den alternativa oxidasen.
- Lägga till 5 mM Ditiotreitol (DTT) och 10 mM pyruvat till fullo aktivera den alternativa oxidasen. Fortsätta att registrera för 5-7 min: Detta är kapaciteten för den alternativa oxidasen.
- Tillsätt 500 µM n-propylgallat (nPG), och spela in i 2 min. Detta bedömer kvarvarande syre materialåtgången som kemiskt inte hämmas. Subtrahera denna kurs från de andra priserna som registreras, eftersom det inte är sannolikt att vara mitokondriell ursprung. Syreförbrukning som fortfarande förekommer efter hämning av cytokrom c och AOX väg (genom KCN och nPG) är mycket sannolikt att komma från peroxidaser förekommer som föroreningar i den isolera mitokondrier9.
- Klicka på ”Stop Recording”.
- Klicka på ”priser på Ändra tabell”-knappen och ange tariffen i tabellen med en rätt klick på en av de två markörerna och välj ”Lägg till tabell”. Klicka på ”Lägg till” knappen för att bekräfta att du vill visa kursen på den huvudsakliga kostnadstabell.
Obs: När du lägger till effektorer upplöst i organiska lösningsmedel (t.ex., antimycin A, nPG, myxothiazol), plenisalen och kolven sköljas med etanol och sedan vatten för att säkerställa korrekt rengöring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Använder det här protokollet, kunde vi upptäcka olika mitokondrie proteiner av SDS-PAGE och immunoblotting. Som visas i figur 3A, är det protein som isolerats från vatten kultur vävnad tillräcklig för att upptäcka ett svagt band (2 µg). Signalintensitet ökar proportionellt till de belopp som laddas. För mitokondrierna isolerade från vävnader som odlas på plattor (figur 3B), svaret på hög ljus stress kan behandling i olika genotyper analyseras med immunodetection med alternativa oxidas antikroppar.
Obrutna av mitokondrier, cytokrom c väg aktivitet och alternativa vägen kan mätas med nymalen isolerade mitokondriell prover. Mitokondriernas integritet är väl bevarad under förfarandet beskrivs isolering (figur 4A). Lägga till olika substrat, hämmare och effektorer till isolerade mitokondrier, syreförbrukning genom cytokrom c väg och alternativa oxidas signalvägen påverkas (figur 4B).
Figur 1: Setup för beredning av Övertoningarna. Vänster: Centrifugrör (50 mL) med en liten vinkel placeras på is med PVC peristaltiska slangar försäljningsställen tejpade på insidan av rören; Mitten: Peristaltiska pumpen; Höger: Gradient pourer ovanpå en magnetomrörare som innehåller tunga gradient (inre kammaren) och ljus toning (yttre kammaren) lösningar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: rening av mitokondrier från Arabidopsis skjuter med en kontinuerlig 0 - 4,4% (w/v) PVP/28% kolloidal täthetlutning. Mörkt gröna bandet är thylakoids och andra föroreningar som anges i toppen av gradient lösningarna. Mitokondriell fraktion dök upp som en vit-grönaktigt band närmare till botten av röret. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Separation av mitokondrie proteiner av SDS-PAGE och immunodetection med specifika antikroppar. (A) mitokondrier isolerade från två veckor gamla vatten-odlade Arabidopsis thaliana vilda skriver (Columbia-0, Col-0) växter utsattes för SDS-PAGE och utforskad med antikroppar mot NADH: ubikinon mitokondriskt subenhet () S4 Ndufs4, At5g67590). Molekylvikt ofärgade markörer lastades på den yttersta lanen av gel och storleken på tio representativa band anges i kilo Dalton (kDa). Den skenbara molekylärt samlas av proteinet Ndufs4 upptäckt är 18 kDa. Protein överflöd visas i förhållande till värdet av 2 µg totalt protein. (B) två veckor gamla plantor odlas på Gamborg's B5 media med 3% (w/v) sackaros och 0,8% agar (w/v) utsattes för 750 µE m-2 s-1 Markera (HL) och skördas efter 6 h. mitokondrierna var renas och mitokondriella proteinerna var åtskilda av SDS-PAGE och utforskad med antikroppar mot alternativa oxidas (AOX). Närvaron av en immunodetectable AOX protein med en skenbar molekylärt samlas av 34 kDa indikeras. Protein överflöd visas i förhållande till värdet av kontroll (2 µg). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Representativa spår av O2 konsumtion av isolerad växt mitokondrierna. (A) mitokondrier isolerade från Arabidopsis thaliana vildtyp växter (Col-0) enligt ovan analyserades för yttre membran integritet före syre förbrukning mätningar. 30 µL av isolerade mitokondrier (150 µg totalt mitokondriell protein) användes. Mitokondriernas integritet fastställdes som 90% enligt ovan. (B) syre förbrukning mätningar utfördes med 30 µL av isolerade mitokondrier (150 µg totalt mitokondriell protein) från Arabidopsis thaliana vildtyp växter. Totala mitokondriell respiration och AOX vägen bestämdes. Från dessa data, kan syreförbrukning genom cytokrom c väg och AOX väg bestämmas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Slipning medium | |
| Kemiska | Koncentration |
| Sackaros | 0,3 M |
| tetranatrium pyrofosfat (Na4P2O7 · 10 H2O) | 25 mM |
| EDTA dinatriumsalt | 2 mM |
| Monobasiskt kaliumfosfat (KH2PO4) | 10 mM |
| Polyvinylpyrrolidon (PVP40) | 1% (w/v) |
| Bovint serumalbumin (BSA) | 1% (w/v) |
| Avjoniserat vatten | |
| Justera pH till 7,5 (använder HCl) | |
| Obs: för 300 mL slipning medium, 1,06 g natriumaskorbat (slutlig koncentration: 17.84 mM) och 0,74 g cystein (slutlig koncentration: 20.36 mM) läggs bara före användning. Kontrollera pH efter tillsats och justera 7.5 med 1 M NaOH om det behövs. | |
| 2 X tvätta buffert | |
| Kemiska | Koncentration |
| Sackaros | 0,6 M |
| TES | 20 mM |
| Bovint serumalbumin (BSA) | 0,2% (w/v) |
| Avjoniserat vatten | |
| Justera pH till 7,5 (med NaOH) | |
| Övertoningar | |
| Tunga Gradient lösning (4,4% (w/v) PVP) | 2 gradient rör |
| 2 X tvätta buffert | 17,5 mL |
| Colloidial täthetlutning | 9,8 mL |
| PVP-40 (20% (w/v)) | 7,7 mL |
| Lätt tonad lösning (0% (w/v) PVP) | 2 gradient rör |
| 2 X tvätta buffert | 17,5 mL |
| Colloidial täthetlutning | 9,8 mL |
| Avjoniserat vatten | 7,7 mL |
Tabell 1: Sammansättningen av buffertar och övertoningar används för mitokondrierna isolering.
| Förkortning | Koncentration av stamlösningar | Förvaring | Slutlig koncentration | Volym för 1 ml reaktion | |
| Substrat | |||||
| Cytokrom c | CYT c | 2,5 mM (i H2O) | -20 ° C | 25 ΜM | 10 μl |
| NADH | NADH | 0,1 M (i H2O) | -20 ° C | 1 mM | 10 μl |
| Succinat | Succ | 500 mM (H2O) | -20 ° C | 5 mM | 10 μl |
| Hämmare | |||||
| Antimycin A | AA | 1 mM (EtOH) | -20 ° C | 5 ΜM | 5 μl |
| Cyanid | KCN | 100 mM (H2O) | 4 ° C | 1 mM | 10 μl |
| Myxothiazol | Myxo | 500 μM (i EtOH) | -20 ° C | 2,5 ΜM | 5 μl |
| n-propylgallat | nPG | 100 mM (EtOH) | -20 ° C | 500 ΜM | 5 μl |
| Effektorer | |||||
| ADP | ADP | 100 mM (H2O) | -20 ° C | 1 mM | 10 μl |
| Askorbat | ASC | 500 mM (H2O) | Gör färska på dagen för användning | 10 mM | 20 μl |
| ATP | ATP | 100 mM (H2O) | -20 ° C | 500 ΜM | 5 μl |
| Dithiotreitol | DTT | 1 M (i H2O) | Gör färska på dagen för användning | 10 mM | 10 μl |
| Pyruvat | Pyr | 1 M (i H2O) | -20 ° C | 10 mM | 10 μl |
| Rengöringsmedel | 10% (v/v) (i H2O) | 4 ° C | 0,05% (v/v) | 5 μl | |
Tabell 2: Lista av substrat, hämmare och effektorer användas för oxygen konsumtion mått.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vanligtvis, isolering av mitokondrier från Arabidopsis lämnar räntorna upp 3 mg av mitokondrier från ca 80-100 3 - 4 vecka gamla växter, även om avkastning på mer än 5 mg kan ofta uppnås med noggrann slipning. Avkastningen varierar med tillväxt villkorar och minskar dramatiskt som lämnar senesce, även om mitokondrier struktur verkar vara väl underhållna under åldras9. En av de mest kritiska funktionerna att få en bra avkastning är metoden för slipning för att lysera celler för att släppa mitokondrier. Medan ett antal mekaniska slipning utrustning finns att köpa, för Arabidopsis uppnår slipning i en mortel och stöt genomgående goda resultat när det gäller avkastningen, som det lyserar cellerna med liten skada till organeller. Även mekaniska slipmaskiner är snabb, de kräver optimering och mängden slipning krävs kan variera beroende på vävnaden. Med en mortel och mortelstöt, det ofta bekvämt och effektivare om vävnaden är skivad eller skär med en kniv eller sax före malning. Som anges är alla åtgärder behöver utföras vid 4 ° C och hela proceduren från slutet av slipning till att erhålla en tvättad pellet av renat mitokondrier bör ta ca 4 h. Eftersom spår av rengöringsmedel eller andra reagenser på rör eller lutning pourers kan dramatiskt minska avkastningen, alla komponenter som används i dessa förfaranden tvättas utan rengöringsmedel och inte används i andra förfaranden. Slutligen är det viktigt att mitokondrierna är tillräckligt åtskilda från andra fraktioner på övertoningen för att kunna tas ut och tvättas. Om de är alltför nära botten av röret, betyder det att blandning av lätta och tunga lösningar behöver justeras, så att mer av den tunga lösningen att hälla innan blandning. Omvänt, om bandet visas diffusa och är hög i röret, blandning behöver uppstå lite tidigare.
Den metod som beskrivs här kan lätt användas för isolering av mitokondrier från Arabidopsis blomma och root vävnad11,12. För rötter är det praktiskt att växa i hydrokultur kultur och behöver 100 g färsk vikt att erhålla 2 mg mängder av mitokondrier. För slipning rötter bör skäras i små bitar före malning i en mortel och stöt och öka avkastningen kan erhållas genom åter slipning root vävnad, antingen i en mortel och stöt eller i en mixer. För blommig vävnad där mitokondriefunktion är ofta förbättrade13, slipning med en mortel och mortelstöt fungerar bra, men den begränsade mängden material innebär att behöver en stor mängd växter odlas att skörda vävnad. Mitokondrierna har isolerats från en mängd Arabidopsis organ med liknande metoder eller smärre ändringar14,15 och ris (Oryza sativa)16.
Begränsningarna av den ovan beskrivna metoden är i) de stora mängder frön som krävs för mitokondriell isolering, ii) endast specifika vävnader från Arabidopsis och ris som tillämpas i denna isolering metod, iii) små mängder av olika föroreningar (såsom) peroxisomal proteiner) fanns fortfarande i renat mitokondrier. Mitokondrierna som erhållits med metoderna som beskrivs ovan är lämplig för en mängd studier, alltifrån syre upptaget studier till kvantitativa masspektrometri analyser av protein överflöd. Gradient renat mitokondrierna fortfarande innehåller små mängder av olika föroreningar, såsom peroxisomal proteiner3. En jämförelse med definierade organell listor kan användas för att fastställa förändringar i mitokondrie proteiner, så länge av kontaminering av icke-mitokondrie proteiner är liten (< 10%) och liknande prover jämförs, så typ och grad av icke-mitokondrie proteiner är liknande. Analyser av protein överflöd av SDS-PAGE eller andra gel-baserade metoder kan utföras med relativt små mängder av mitokondrier (2-20 µg), med varierande mängder av mitokondrierna för att kontrollera linearitet inom detektering av antikroppar (figur 3). Medan knezerna (spänning beroende anjon kanal (VDAC)) används ofta som en lastning kontroll för kvantifiering, kan relativt stora överflödet av detta protein i vår erfarenhet betyda att svaret ofta inte är linjära om stora mängder protein är inlästa på gel , så Linjäriteten av antikroppssvaret bör alltid kontrolleras när du använder kontrollerna lastning. Betydelsen av denna metod att isolera mitokondrier är att till skillnad från övertoningar som använder sackaros som materialet för att bilda täthetlutningen, kolloidal täthetlutningar inte kräver osmotisk omställningskostnad av renat mitokondrierna som krävs med sackaros. Detta innebär att det är mindre chans spricker renat mitokondrierna och efter tvätt att ta bort kolloidalt densitet materialet, de direkt kan användas i en mängd olika analyser eller program.
Vävnaden blotting, där upptäcks mitokondrie proteiner från hela blad eller vävnad extrakt, är en attraktiv metod för att mäta mängden mitokondrie proteiner i denna vävnad. Med tanke på den generellt låga volymen av mitokondrierna jämfört med andra organeller, extraherar detektion av mitokondriell protein på hela vävnad behov tolkas med viss försiktighet, eftersom mitokondrie protein kan vara bortom upptäckt i sådana strategier. Noggranna kontroller, där renat mitokondrier är electrophoresed tillsammans med vävnad extrakt att säkerställa identiska migration och linjäritet för upptäckt, behöver utföras för att ha förtroende för sådana metoder.
Med hjälp av en Clark-typ syre elektrod, kan förändrad partialtrycket syrgas i en lösning mätas. Den faktiska elektroden består av en platina katod och en silver anod, som KCl broförbindelse och omfattas av en elektrolyt-fuktade papper (cigarett papper) och ett syre-permeabel membran (polytetrafluoreten membran). En spänning på 600-700 mV leder till en minskning av syre, vilket ger en linjär relation mellan syrekoncentration och spänning. Syre elektroder finns kommersiellt från olika företag. Varje företag har sina egna instruktioner om montering och installation av syre elektroden. Dock måste i allmänhet silver anoden och platina katoden av elektroden disken rengöras med hjälp av en elektrod rengöring kit eller ett radergummi penna innan montering. Det är viktigt att se till att luftbubblor inte utgör under monteringen (t.ex. mellan polytetrafluoreten membranet och cigarett papper). Efter monteringen måste elektrod disken anslutas till kammaren med platina katoden uppåt vid basen av reaktionskammaren. Kammaren själv omges av vattenmantlad temperatur kontroll. Det är oerhört viktigt att kammaren alltid lämnas full av vatten, eftersom membranet kommer att torka ut och spricka annars. Likaså måste membranet inte vidröras av pipetter eller sprutor när du lägger föreningar till kammaren, för att undvika att slita.
Innan analysen, respiration medium bör värmas till samma temperatur som assay kammaren (i de flesta fall 25 ° C) och membranet bör tillåtas temperera i andning buffert för några min. Efter stängning kolven i syreförbrukning-analyser, bör tillägg av effektor molekyler utföras med hjälp av icke-engångstyp mikroliter sprutor (e.g. micro sprutor) eller engångs gel lastning pipettspetsar. Om använder micro sprutor, måste det säkerställas att sprutan är sköljas med 100% etanol och vatten mellan kompletteringar, undvika kontaminering av stamlösningar. Detta gäller även för tvättning av kammaren mellan mätningarna. De flesta reagenser som används i syre förbrukning analyser är lösliga i vatten och kan enkelt avlägsnas genom flera sköljning med vatten (cirka fem gånger) mellan mätningarna. Vissa kemikalier som används för analyser är dock endast lösliga i organiska lösningsmedel, såsom antimycin A, myxothiazol och nPG. Därför måste kammaren sköljas med ett organiskt lösningsmedel (50% (v/v) etanol) mellan analyser ta bort rester av dessa molekyler, och sedan med vatten (cirka fem gånger) för att tömma rester.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar någon intressekonflikt.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av en australiensisk forskning rådet Centre of Excellence i växten energi biologi CE140100008, en australiensisk forskning rådet framtid gemenskap (FT130100112) till MWM och en Feodor Lynen Research Fellowship (Alexander von Humboldt Foundation, Tyskland) till JS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADP | Sigma-Aldrich | A2754 | Chemical |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | Chemical, dissolve in ethanol |
| AOX antibody | from Tom Elthon | Elthon et al., 1989 | |
| Ascorbate | Sigma-Aldrich | A0157 | Ascorbate Oxidase from Cucurbita sp. |
| ATP | Sigma-Aldrich | A26209 | Chemical |
| Bovine serum albumin (BSA) | Bovogen | BSAS 1.0 | Chemical |
| Clarity western ECL substrate | Bio-Rad Laboratories | 1705061 | Chemical |
| Criterion Stain-Free Precast Gels 8-16% 18 Wells | Bio-Rad Laboratories | 5678104 | Chemical |
| Cyanide | Sigma-Aldrich | 60178 | Chemical |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C3131 | Chemical |
| Difco Agar, granulated | BD Biosciences | 214530 | Chemical |
| Dithiotreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | Chemical |
| EDTA disodium salt | Sigma-Aldrich | E5134 | Chemical |
| Gamborg B-5 Basal Medium | Austratec | G398-100L | Chemical |
| Gamborg Vitamin Solution (1000x) | Austratec | G219-100ML | Chemical |
| Goat Anti-Mouse IgG (H + L)-HRP Conjugate | Bio-Rad Laboratories | 1706516-2ml | Chemical |
| Goat Anti-Rabbit IgG (H + L)-HRP Conjugate | Bio-Rad Laboratories | 1706515-2ml | Chemical |
| L-Cysteine | Sigma | C7352-100G | Chemical |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 230391 | Chemical |
| Murashige & Skoog Basal Salt Mixture (MS) | Austratec | M524-100L | Chemical |
| Myxothiazol | Sigma-Aldrich | T5580 | Chemical, dissolve in ethanol |
| NADH | Sigma-Aldrich | N8129 | Chemical |
| Ndufs4 antibody | from Etienne Meyer | Meyer et al., 2009 | |
| n-Propyl gallate | Sigma-Aldrich | P3130 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | Chemical, colloidal density gradient |
| Polyvinylpyrrolidone (PVP40) | Sigma-Aldrich | PVP40 | Chemical |
| Potassium cyanide | Sigma-Aldrich | 60178 | Chemical |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | Chemical |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | Chemical |
| Sodium chloride | Chem-Supply | SA046 | Chemical |
| Sodium dithionite | Sigma-Aldrich | 157953 | Chemical |
| Sodium L-ascorbate | Sigma | A4034-100G | Chemical |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S2378 | Chemical |
| Sucrose | Chem-Supply | SA030 | Chemical |
| TES | Sigma-Aldrich | T1375 | Chemical |
| Tetrasodium pyrophosphate (Na4P2O7 · 10H2O) | Sigma-Aldrich | 221368 | Chemical |
| Trans-Blot Turbo RTA Midi Nitrocellulose Transfer Kit | Bio-Rad Laboratories | 1704271 | Chemical |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | X100 | Chemical, detergent |
| Western Blocking Reagent | Sigma | 11921681001 | Chemical |
| Balance | Mettler Toledo | XS204 | Equipment |
| Beakers | Isolab | 50 mL | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-26XP | Equipment |
| Centrifuge tubes | Nalgene | 3117-9500 | Equipment |
| Circulator | Julabo | 1124971 | Attached to oxygen electrode chamber |
| Conical flask | Isolab | 500 mL | |
| Dropper | 3 mL | ||
| Fixed angle rotor | Beckman Coulter | JA25.5 | Equipment |
| Funnel | Per Alimenti | 14 cm | For filtering |
| Gradient pourer | Bio-Rad | 165-4120 | For preparation of gradients |
| Magnetic Stirrer ATE | VELP Scientifica | F20300165 | Equipment |
| Miracloth | VWR | EM475855-1R | Filtration material |
| Mortar and pestle | Jamie Oliver | Granite, 6 Inch | Equipment |
| O2view | Hansatech Instruments | Oxygen monitoring software | |
| Oxygraph Plus System | Hansatech Instruments | 1187253 | Clark-type oxygen electrode |
| Paintbrush | Artist first choice | 1008R-12 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | plastic paraffin film |
| Peristaltic pump | Gilson | F155001 | For preparation of gradients |
| PVC peristaltic tubing | Gilson | F117930 | For preparation of gradients |
| Water bath | VELP Scientifica | OCB | Equipment |
References
- Day, D. A. Highlights in plant mitochondrial research. Methods in molecular biology. Plant mitochondria. 1305, v-xvi (2015).
- Millar, A. H., Carrie, C., Pogson, B., Whelan, J. Exploring the function-location nexus: Using multiple lines of evidence in defining the subcellular location of plant proteins. Plant Cell. 21 (6), 1625-1631 (2009).
- Eubel, H., et al. Free-flow electrophoresis for purification of plant mitochondria by surface charge. Plant J. 52 (3), 583-594 (2007).
- Murcha, M. W., et al. Protein import into plant mitochondria: Signals, machinery, processing, and regulation. J. Exp. Bot. 65 (22), 6301-6335 (2014).
- Carrie, C., et al. Approaches to defining dual-targeted proteins in Arabidopsis. Plant J. 57 (6), 1128-1139 (2009).
- Pinto, G., Radulovic, M., Godovac-Zimmermann, J. Spatial perspectives in the redox code - Mass spectrometric proteomics studies of moonlighting proteins. Mass Spectrom. Rev. , (2016).
- Day, D. A., Neuburger, M., Douce, R. Biochemical characterisation of chlorophyll-free mitochondria from pea leaves. Aust. J. Plant Physiol. 12 (3), 219-228 (1985).
- Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nat. Protoc. 4 (4), 484-494 (2009).
- Cheah, M. H., et al. Online oxygen kinetic isotope effects using membrane inlet mass spectrometry can differentiate between oxidases for mechanistic studies and calculation of their contributions to oxygen consumption in whole tissues. Anal Chem. 86 (10), 5171-5178 (2014).
- Chrobok, D., et al. Dissecting the metabolic role of mitochondria during developmental leaf senescence. Plant Physiol. 172 (4), 2132-2153 (2016).
- Lee, C. P., Eubel, H., O'Toole, N., Millar, A. H. Combining proteomics of root and shoot mitochondria and transcript analysis to define constitutive and variable components in plant mitochondria. Phytochemistry. 72 (10), 1092-1098 (2011).
- Lee, C. P., Eubel, H., Solheim, C., Millar, A. H. Mitochondrial proteome heterogeneity between tissues from the vegetative and reproductive stages of Arabidopsis thaliana development. J. Proteome Res. 11 (6), 3326-3343 (2012).
- Millar, A. H., Whelan, J., Soole, K. L., Day, D. A. Organization and regulation of mitochondrial respiration in plants. Annu. Rev. Plant Biol. 62, 79-104 (2011).
- Peters, K., et al. Complex I - complex II ratio strongly differs in various organs of Arabidopsis thaliana. Plant Mol. Biol. 79 (3), 273-284 (2012).
- Werhahn, W. H., et al. Purification and characterization of the preprotein translocase of the outer mitochondrial membrane from Arabidopsis thaliana: Identification of multiple forms of TOM20. Plant Physiol. 125 (2), 943-954 (2001).
- Heazlewood, J. L., Howell, K. A., Whelan, J., Millar, A. H. Towards an analysis of the rice mitochondrial proteome. Plant Physiol. 132 (1), 230-242 (2003).
