Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

זיהוי מהיר של פנוטיפים התפתחותיות בתאי האדם קודמן עצבית (NPCs)

Published: March 2, 2018 doi: 10.3791/56628
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 3, 3, 4, 5, 2, 1
1Department of Neuroscience and Cell Biology, Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 2Center for Advanced Biotechnology and Medicine, Department of Neuroscience and Cell Biology, Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 3The Child Health Institute of NJ, Department of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Services, Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 4The Child Health Institute of NJ, Department of Neuroscience and Cell Biology, Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 5Department of Genetics, Rutgers University
* These authors contributed equally

Summary

התפתחותיות תהליכים כגון התפשטות ההעברה, תוצר neurite לעיתים קרובות מוטרד מנוטלי מחלות. לפיכך, אנו מציגים פרוטוקולים להעריך במהירות, reproducibly אלה בתהליכי התפתחותיות NPCs נגזר iPSC אנושי. פרוטוקולים אלה מאפשרות גם להערכת ההשפעות של גורמי גדילה הרלוונטיים הרפוי על פיתוח NPC.

Abstract

התפתחות המוח האנושי ממשיך דרך סדרה של תהליכים מתוזמר בדיוק, בשלבים מוקדמים מכובד על ידי התפשטות, הגירה, תוצר neurite; ובשלבים מאוחרים יותר מאופיין תוצר האקסון/דנדריט היווצרות סינפסה. בהפרעות התפתחותיות, לעיתים קרובות אחד או יותר של תהליכים אלה הן משובשות, שמוביל חריגות בתוך מבנה המוח ותפקודו. עם כניסתו של האדם pluripotent המושרה תא גזע (hiPSC) טכנולוגיה, חוקרים עכשיו יש אטומטי בשפע של תאים אנושיים, כי יכול להיות מובחן כמעט כל סוג התא, לרבות נוירונים. תאים אלה ניתן ללמוד גם התפתחות המוח נורמלי וגם בפתוגנזה של המחלה. מספר פרוטוקולים באמצעות hiPSCs ליצור מודל המחלה מנוטלי שימוש סופני הבדיל נוירונים או שימוש תרבות 3D מערכות הנקרא organoids. בעוד ששיטות אלה הוכיחו שלא יסולא בפז לומד פתוגנזה מחלות אנושיות, ישנם מספר חסרונות. הבידול של hiPSCs לתוך הנוירונים דור של organoids ממושך ויקר תהליכים שיכולים להשפיע מספר הניסויים ולא משתנים אשר יכולים להיות מוערך בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. בנוסף, בעוד הנוירונים הפוסט-mitotic ו organoids מאפשרים בחקר תהליכים הקשורים למחלות, לרבות תוצר דנדריט, synaptogenesis, הם למנוע בחקר תהליכים מוקדמים יותר כמו התפשטות והעברה. הפרעות התפתחותיות, כגון אוטיזם, שפע ראיות גנטיות, פוסט-מורטם מציינת פגמים בתהליכים התפתחותיים מוקדם. קודמן עצבית תאים (NPCs), אוכלוסיה מאוד proliferative תא, ייתכן מודל מתאים בו לשאול שאלות על תהליכים ontogenetic, מחלת חניכה. אנחנו עכשיו להרחיב את מתודולוגיות למד מן הלומדים פיתוח בתרבויות קורטיקלית עכבר ועכבר כדי NPCs אנושי. השימוש NPCs מאפשר לנו לחקור פנוטיפים הקשורים למחלות ולהגדיר כיצד משתנים (למשל, גורמי גדילה, סמים) השפעה התפתחותית תהליכים שונים כולל התפשטות, העברה של בידול רק אחרי כמה ימים. בסופו של דבר, כלים זה יכול לשמש באופן הדירים תפוקה גבוהה לזיהוי מנגנוני מחלות ספציפיות והן פנוטיפים בהפרעות התפתחותיות.

Introduction

השימוש של אורגניזמים פשוטים ומודלים העכבר יש מבואר על מנגנוני התפתחות המוח בסיסיים, כמו גם בפתוגנזה של המחלה. למרות ההתפתחויות הללו, האטיולוגיה של רבים מנוטלי הפרעות נשאר קשה להבנה, כי לא כל הממצאים אורגניזמים פשוטים הרלוונטיים ישירות היבטים מורכבים של מחלות אנושיות. יתר על כן, למורכבות רבה יותר של המוח האנושי לעיתים קרובות מקשה על מודל ההתפתחות האנושית, הפרעות בבעלי חיים. עם התפתחות, התקדמות הטכנולוגיה האנושית pluripotent המושרה בתאי גזע (hiPSCs), תאים סומטיים יכול להיות מחדש לתוך תאי גזע, ואז הבדיל לתוך תאים עצביים ללמוד מחלות אנושיות. ההתקדמות בטכנולוגיות hiPSCs ו "omic" (גנומיקה, transcriptomics, פרוטאומיקס, גליקומיקס) מבטיח לחולל מהפכה להבנת התפתחות המוח האנושי. טכנולוגיות אלה כעת לבצע אפשרי בגישה "דיוק רפואה" אפיון המחלה מנוטלי על בסיס מקרה לגופו.

להדק הנוכחי בתחום הדוגמנות-מחלת hiPSC הוא להתמיין לתאים ספציפי יחוברו עצביים ב טפט או לשימוש מערכת תרבות 3D בשם של תא צורב רוצה להתרכז בהיבטים של המוח פיתוח1,2, 3. מערכות אלו היה בעל ערך רב בלימודים, לחשוף את ההיבטים הייחודיים של ההתפתחות האנושית, מחלת4,5,6,7. עם זאת, תרבויות עצביים והן organoids לעיתים קרובות דורשים בכל מקום שבועות עד חודשים בתרבות לפני שהם מוכנים ללמוד. הטבע זמן רב של פרוטוקולים אלה וכמות המשאבים הדרושים כדי לשמור על שמערכות התרבות אלה מגבילים לעתים קרובות מספר ניסויים שניתן לבצע ואת מספר משתנים (כמו גורמי גדילה או תרופות), אשר יכול להיבדק. יתר על כן, מחקרים רבים הנוירונים הפוסט-mitotic וחומר organoids התמקדו תהליכים כגון היווצרות תוצר או סינפסה דנדריט, אשר מתרחשים מאוחר יותר פיתוח. בעוד תהליכים אלה היו מעורבים הפתולוגיה של הפרעות התפתחותיות כגון אוטיזם, סכיזופרניה, קודם התפתחותית אירועים שמתרחשים לפני סופי בידול עצביים חשובים גם עבור מחלת פתוגנזה8 ,9,10,11,12,13. אכן, גנומית מחקרים שנעשו לאחרונה מראים כי תקופת אמצע-עוברית, אשר מורכב של התפשטות, תוצר תהליך ההעברה, חשוב במיוחד אוטיזם פתוגנזה11,14. לכן, חשוב ללמוד גזע עצביים אוכלוסיות תאים קדמון כדי להבין טוב יותר תהליכים קודמות אלה. תא צורב מערכות, אשר מסכם את הדברים נחשב טוב יותר התפתחות המוח האנושי בגלל מבנה מאורגן ואופיים תלת-ממד, מכילות בריכת קדמון זה יש כבר מנוצל ללמוד כמה אירועים קודמות אלה. עם זאת, האוכלוסייה קדמון organoids הוא לרוב דליל, יותר כמו תאי גליה רדיאליים מ עצבית גזע או קדמון תאים5,15. לכן, יהיה זה מועיל יש שיטת תפוקה גבוהה ללמוד בשלבים המוקדמים של neurodevelopment באוכלוסיה פעיל proliferative תא.

במעבדה, יצרנו פרוטוקול העושה שימוש hiPSC-derived קודמן עצבית תאים (NPCs), אוכלוסייה מעורבת של גזע עצביים, ובתאים זה מאוד המקדימות, ללמוד תהליכים התפתחותיות כגון התפשטות, נדידת תאים, ו הרחבת תהליך ראשוני (neurite). מבחני אלה פותחו מתוך טכניקות המשמשות במעבדה שלנו במשך עשרות שנים ללימוד בהצלחה neurodevelopment עכבר ועכבר תרבויות קורטיקלית16,17,18,19,20, 21,22,23. חשוב, זה גם הראו כי פנוטיפים ואת אותות התקינה מוגדרת במערכות תרבות עכבר ועכבר הם מאוד חזוי של מנגנונים כי הם פעיל ויוו, המציינת את הערך של טכניקות אלה16, 17,18,19,24. לאחר הבידול הראשונית של hiPSCs כדי NPCs, שיטות אלה מאפשרים לנו ללמוד תהליכים פיתוחיים חיוני תוך מספר ימים. שיטות אלה יש יתרונות רבים: (1) הן דורשות ציוד מתוחכם יותר, קלים ליישום, משכפל ניסיוני הרבות (2) יכול להתבצע תוך תקופה קצרה של זמן, מתן אישור מהיר הפארמצבטית של תוצאות, ו- (3) ניתן לבחון את תרבות משתנים כגון מטריצות ציפוי, ההשפעות של גורמי גדילה, פעילות של תרופות במהירות וחסכוני. יתר על כן, אנו מנצלים התפקיד ומבוססת של גורמי גדילה חוץ-תאית כמבקרי קריטי של תהליכים התפתחותיים מגוונים. NPCs נחשפו לבחירת אותות התפתחותית ישירות לעורר אירועים כמו התפשטות, תוצר neurite נדידת תאים, ומצאו שלהם לשפר את היכולת לזהות פגמים שאינם לכאורה תנאי הבקרה19 , 25 , 26 , 27 , 28. כמו כן, להקל על הערכת סמים מספק שדרה חזק לאמץ טכניקות רפואה דיוק כדי לבדוק את היעילות של התערבויות טיפוליות שונות. לפיכך, פרוטוקול זה מקלה על תפוקה גבוהה, לשחזור, ומתודולוגיה פשוטה ללמוד מוקדם התפתחות המוח בפתוגנזה של המחלה, את פוטנציאל ההשפעות המיטיבות של גורמי גדילה וסמים על פנוטיפים התפתחותיות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. נהלי בטיחות ותחזוקה אבטחה הקבינט

  1. נהלי בטיחות אבטחה ברמה-2 (BSL-2)
    1. פעל לפי ההנחיות של המוסד על עבודה עם חומרים BSL-2. תשליך BSL-2 חומרים על-פי נוהלי המוסד. מציינים חדרים וציוד המשמשים עבור חומרים BSL-2. ללבוש כל ציוד מגן אישי (PPE), כולל חלוק וכפפות.
  2. אבטחה לארון תחזוקה
    1. השתמש ארון אבטחה מאושר לשימוש בחומרים ברמה BSL-2.
    2. להדליק את האור האולטרה סגול באבטחה הקבינט למשך לפחות 15 דקות ולאחר מכן לרסס משטחים עם אקונומיקה 10% הפתרון. לאפשר הפתרון אקונומיקה כדי לשבת למשך 15 דקות לנקות את הארון, להפעיל את זרימת האוויר לפני השימוש.
  3. Tritiated רדיואקטיבי [3H]-נהלי בטיחות תימידין (טריטיום)
    הערה: טריטיום הוא קטגוריה 5 רדיואקטיבי מקור, 'סביר להיות מסוכן' קטגוריה. ההנחיות של המוסד לעבודה עם קרינה רדיואקטיבית. מוסדות מסוימים עשויים לדרוש אישורי או מאפשר לטפל טריטיום.
    1. מקבלים הכשרה מהמוסד כיצד לטפל כראוי ותיפטר טריטיום. השלך פסולת רדיואקטיבית בתוך כלי קיבול מתאים, בהתאם למדיניות של המוסד. ללבוש את עיקרון השוויון הפוליטי בעת עבודה עם טריטיום.

2. העצבית אינדוקציה של iPSCs

הערה: כדי להפוך NPCs, גירסה קצת שונה של פרוטוקול המלווה ערכת אינדוקציה עצבית זמינים מסחרית עקבו. הקיט מורכב Neurobasal (NB) מדיה של 50 x עצבית תוספת אינדוקציה (ש ח), אשר נמצא בשימוש כדי להפוך 1 x אינדוקציה עצבי בינוני (נים). ש ח משמש גם כדי להפוך 100% הרחבה בינונית (ראו סעיף 3.1). קישור לפרוטוקול נמצא על חומרים, ציוד, הפניות סעיף43.

  1. המעבר iPSCs כאשר הם הופכים confluent 70-80%.
  2. IPSCs צלחת 300,000 1 טוב של hESC-מוסמך חוץ-תאית מטריקס-לחקות הצלחת 6-ובכן ג'ל (ECM-לחקות ג'ל) מצופה המכיל 2 מיליליטר iPSC נטולת מזין בינוני עם 5 μM של רוק מעכב. ראה סעיף 3.2 להוראות ציפוי וולס עם ג'ל ECM-חיקוי.
  3. יום אחד מאוחר יותר, הסר את iPSC בינוני + iPSCs מעכב, שטיפת רוק פעם אחת עם 1 x PBS. להוסיף 2 מ של נים iPSCs.
    הערה: 50 מ של נים נעשית על-ידי הוספת 1 מ"ל של 50 ש ח ו- 250 µL (50 יחידות/mL, μL 5/mL) של פניצילין/סטרפטומיצין (P/S) 49 מ של NB מדיה.
  4. שינוי מדיה האינדוקציה עצבית כל יומיים על ידי כ רפה בעברית בילה בהחלפה עם 2 מ של נים ובינוניות עד תאים להפוך confluent (בסביבות 4-5 ימים). לשנות מדיה מדי יום, ברגע תאים confluent.
  5. מעבר תאים לאחר 7 ימים נים, צלחת לתוך ג'ל ECM-לחקות מצופה צלחת 6-ובכן המכיל 2 מ ל 100% התרחבות המדיה והמעכב רוק 5 μM. התאים נחשבים מעבר 0 (P0) NPCs בשלב זה. עיין בסעיף 3.1 להלן לקבלת הוראות לעשות 100% התרחבות המדיה.
  6. מעבר תאים באמצעות השיטות המתוארות בסעיף 3.4. לחכות עד התאים הגיעו P2 הם confluent לפני בריא כתם NPC סמנים, ציפוי לניסויים (איור 1).

3. תרבות המדיה, ציפוי ותחזוקה של NPCs

  1. הכנה מדיה עבור תחזוקת NPCs (מדיה 100% הרחבה):
    1. להפוך 50 מ של 100% הרחבה מדיה על-ידי שילוב 24.5 מ של DMEM/F12 עם 24.5 מ של NB.
    2. להוסיף 1 מ"ל של 50 ש"ח x DMEM/F12 + פתרון NB. להוסיף 250 μL של P/S פתרון המדיה.
      הערה: המדיה יכול להיות בקירור (4 ° C), המשמש עבור עד 2 שבועות. כרכים קטנים של המדיה יכול להתבצע על-ידי התאמת הכרכים של DMEM / F12 + NB + ש ח באמצעות את יחס זהה עבור אמצעי האחסון 50-mL.
  2. הכנת ג'ל ECM-לחקות מצופה לוחות תרבות לתחזוקה NPC
    1. Aliquot ג'ל ECM-לחקות את אמצעי האחסון הדרושים כדי לעשות 6 מ של הפתרון עובד. חישוב נפח aliquot מלהסתכל האישור של ניתוח גיליון מאז ECM-לחקות ג'ל דילול גורם משתנה האצווה כדי אצווה והרבה הרבה כדי.
    2. להפשיר aliquot ג'ל ECM-לחקות על קרח, להתמוסס אל תוך 6 מ של מדיה DMEM/F12 קר.
    3. להוסיף 1 מ"ל של פתרון ה-ECM-לחקות ג'ל/DMEM/F12 כל טוב של צלחת טוב 6. דגירה לצלחת 6-ובכן עם ג'ל-פתרון ECM-לחקות למשך 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.
    4. תשאף פתרון ה-ECM-לחקות ג'ל לאחר 30 דקות של דגירה, להחליף 100% הרחבה מדיה או להכניס למקרר צלחות (4 ° C, עד שבוע 1) מבלי כ רפה בעברית ECM-לחקות ג'ל-פתרון.
  3. תחזוקת NPCs
    1. NPCs צלחת על צפיפות של 1.5 מיליון תאים לתוך ECM-חיקוי טוב המכיל 2 מ"ל של התקשורת הרחבה 100% מצופי ג'ל.
    2. דגירה NPCs ב 37 מעלות צלזיוס בסביבה לחה עם 5% CO2.
    3. להוסיף 5 μM של רוק מעכב למדיה NPCs P3 או נמוכה יותר, או NPCs המופשרים, כדי למנוע מוות של תאים מוגברת. לשנות מדיה לאחר 24 שעות ביממה כדי להסיר רוק מעכב.
    4. מעבר תאים כל 4-9 ימים, תלוי מתי הם הופכים confluent. תאים נחשבים confluent כאשר הם הופכים חד שכבתי בצפיפות המכסים את כל הישבן של המשטח מאכל.
    5. צלחת NPCs על צפיפות של 1 ל- 1.5 מיליון תאים לכל אחד טוב של צלחת 6-טוב (ראה סעיף 3.4). להסיר מדיה בילה כל 48 שעות והחלף 2 מ ל 100% התרחבות המדיה.
  4. הרם מביצועם, גלולה NPCs תחזוקה ו/או ציפוי עבור תנאים ניסיוני
    1. האחות בינוני, תשטוף תאים פעם עם 1 x PBS. האחות PBS ולהוסיף μL 500 בפתרון ניתוק התא 1 x 1 טוב של confluent NPCs. Incubate 10 דקות ב 37 º C.
    2. להוסיף 500 μL בטמפרטורת החדר (RT) PBS ולשטוף היטב באמצעות פיפטה P-1000 כדי להבטיח הסרה של תאים. לאסוף את תאי + פתרון PBS לתוך צינור חרוטי 15-mL. לשטוף את הצלחת שוב עם 1 מ"ל של PBS ומוסיפים נוזלי ברכבת התחתית.
    3. ספין התאים למטה ב- g x 300 עבור 5 דקות כדי גלולה.
    4. להסיר את תגובת שיקוע בגדר תא והשהה מחדש את התאים ב- 1-5 מ של מדיה DMEM/F12 ומחוממת מראש. לדלל לתאים צפיפות של 1 ל 4 מיליון תאים למ"ל של מדיה. לכמת תאים באמצעות של hemocytometer.
    5. צלחת המספר הנדרש של תאים ספציפיים עבור תחזוקה NPC (סעיף 3.3) או וזמינותו בודדים שהודעתו (עיין בסעיפים הבאים לקבלת פרטים נוספים).
    6. להתאים נפח התאים הבולם עם המדיה כך בין 15 ל- 100 μL של תאים משמשים עבור כל מנה/טוב. אמצעי אחסון זה ציפוי קטנה מבטיחה כי יש התפלגות התא אפילו כי גורמי גדילה, סמים או מצעים בשנת המדיום הם לא מדולל.
    7. דגירה תאים ב 37 º C. לשנות מדיה כל 48 שעות לצורך תחזוקה NPC או לראות פרטים ספציפיים עבור מבחני בודדים.
  5. מדיה הכנה ניסיוני תנאים (30% הרחבה מדיה)
    1. לדלל את המדיה הרחבה של 100% עד 70% (כינה 30% הרחבה) על-ידי הוספת 1:1 DMEM/F12 + פתרון NB כדי להפוך את המדיה עבור תנאי הניסוי.
    2. להפוך 20 מ של 30% הרחבה מדיה על-ידי הוספת 6 מ של 100% התרחבות המדיה, דילול 7 מ של NB ו- mL 7 של מדיה DMEM/F12. להוסיף 5 µL/mL של פתרון P/S.
      הערה: אם כבר, מכיל מדיה 100% P/S, הוסף 5 μL/mL עבור DMEM בשילוב / F12 + NB = (14 מ"ל) x (5 μL/mL) = 70 μL של P/S במקום 100µL.
    3. להוסיף ציפוי דיאלקטריים ו פקטורי גדילה בריכוזים הרצויים בכלי התקשורת הרחבה של 30%.

4. הערכת לסינתזת DNA S-שלב הכניסה, מספרי הטלפון הנייד של NPCs

  1. הכנה לסינתזת DNA, S-שלב הכניסה ואת וזמינותו מספר התא
    1. להפוך את פתרון מניות 1 מ"ג/מ"ל של פולי-D-ליזין (PDL) ב- dH2O ולחטא מסנן. לדלל 1:10 dH2O כדי להפוך 0.1 מ"ג/מ"ל PDL פתרון ולהוסיף 300 μL כל טוב של צלחת טוב 24 או 1 מ"ל ל תבשיל 35 מ מ. תקופת דגירה של 20 דקות ב- RT.
    2. לשטוף PDL בארות 3 פעמים במשך 5 דקות ב- dH2O. וביופסיה dH2O ולהוסיף 300 μL/טוב או 1 mL/צלחת של laminin (5 μg/mL) מדולל ב- 1 x PBS. מכסה הצלחות עם מצלמות-מיקרוסקופים, לשמור על אבטחה סטרילי, ארון בן לילה-RT (12 עד 24 שעות).
    3. הכנת 30% התרחבות המדיה (ראה סעיף 3.5) לאחר ה 12 עד 24 הוסף כלי רכב, גורמי גדילה או סמים עניין-הריכוז הרצוי כרכים כי הם פחות מ 10% הפתרון הכולל כדי למנוע דילול ש ח 30% הרחבה בינונית.
    4. לשטוף כל טוב של צלחת 24-ובכן פעמיים עם PBS 1 x (5 דקות כל אחד). האחות 1 x PBS ולהוסיף μL 450 של מדיה (בלי או עם גורמי גדילה/סמים). דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס למשך לפחות 15 דקות לפני ציפוי תאים.
    5. עבור ניסוי, להגדיר 2-3 בארות או מנות לכל מצב.
    6. NPCs צלחת (ראה סעיף 3.4):
    7. Assay סינתזה של דנ א NPC: 100,000 תאים/באר היטב צלחת 24
    8. S-שלב כניסה: תאים 500,000/35 מ מ מאכל
    9. תא Assay מספר: 50,000 תאים/באר צלחת 24-ובכן
  2. קודמן עצבית תא DNA סינתזה Assay
    1. צלחת 100,000 התאים היטב לתוך צלחת 24-ובכן, להעריך במצב/בשלושה עותקים.
    2. להוסיף רדיואקטיבי, tritiated [3H]-תימידין למדיום תרבות (1.5 μCi/mL) כל היטב לאחר h 46 בתרבות. דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים.
      הערה: בעת שימוש בחומרים רדיואקטיביים, לקבל הדרכה שלך מוסד, פרוטוקול הבטיחות רדיואקטיביות בעקבות והשלך חומרים רדיואקטיביים בתוך כלי קיבול המיועדים כראוי פסולת.
    3. להסיר כראוי להיפטר מדיה רדיואקטיבי לאחר 2 ח' 300 להוסיף μL של טרום חימם 0.25% טריפסין-EDTA (0.5 מ מ) על כל טוב ואת תקופת דגירה של 20 דקות ב 37 º C.
    4. להפעיל את הכריה תא (ראה חומרים וציוד סעיף), המשאבה ולהבטיח כי הלחץ משאבה היא להלן 200 PSI. מניחים נייר סינון דרך החלל הכריה תא והרימו בפינה הימנית כדי לסמן כיוון הנייר.
    5. מניחים צינורות איסוף של התא המקצרה טס "ריק" ריק ולחץ prewash כדי להרטיב נייר הסינון. מניחים צינורות איסוף הדגימה בארות ולהפעיל (התחל).
    6. כאשר הכריה תא סיום איסוף דגימות, הרם נייר סינון קלאמפ ולהתקדם לחזור עבור כל קבוצות המדגם. תמיד prewash בתוך צלחת ריקה, "ריק".
    7. יבש נייר סינון תחת מקור אור ולהגדיר בקבוקונים המתאימים במגש. אגרוף צ'דס נייר לתוך מבחנות ולהוסיף 2 מ של קוקטייל גזים כל מבחנה. בקבוקונים והמעיל תווית.
    8. דגירה בקבוקונים של גזים קוקטייל במשך לפחות שעה לפני קריאת הסעיפים לדקה (CPMs) על מכונת נצנוץ.
  3. NPC S-שלב הכניסה Assay
    1. ראה סעיף 3.4 עבור שלבים כדי להרים, מביצועם, גלולה, וכן להשעות מחדש תאים.
    2. צלחת תאים 500,000 לכל מאכל לתוך מנות 35 מ מ סעיף 4.1, דיש רק 1/תנאי בשלב זה.
    3. להתסיס מנות הלוך ושוב בכל הכיוונים כדי להבטיח אפילו חלוקת תאים. דגירה תאים ב 37 ° C עבור 46 h.
    4. להכין שלוש צלחות 35 מ מ מצופה PDL/Laminin לכל תנאי לאחר 24 שעות. לדוגמה, אם יש צלחת אחת 35 מ מ של 30% התרחבות המדיה, צלחת אחת 35 מ מ של 30% הרחבה מדיה + FGF (10 ng/mL) ואז מעיל 6 צלחות PDL/Laminin לשימוש ביום הבא.
    5. להוסיף 2 μL/mL של 5 מ מ אדו תרבויות לאחר 46 ה Incubate כבר שעתיים.
    6. מביצועם, גלולה התאים (ראה סעיף 3.4). מחדש להשעות בגדר תא ב- 3 מ"ל של התקשורת הרחבה 30% או 3 מ"ל של 30% הרחבה מדיה + גורמי גדילה הרצוי/סמים.
    7. בצלחת 1 מ"ל לכל מאכל על מנות PDL/Laminin מצופים מראש. להתסיס מנות הלוך ושוב בכל הכיוונים כדי להבטיח אפילו חלוקת תאים. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים לאפשר את התאים לדבוק המנה. ראה איור 2 ציר זמן פשוטה.
  4. S-שלב הכניסה לניתוח
    1. לתקן מנות עם קרח 4% Paraformaldehyde (PFA ב- 1 x PBS) במשך 20 דקות. לאחר מכן, לשטוף כלים 3 פעמים במשך חמש דקות עם 1 x PBS.
    2. להוסיף 1 מ"ל של PBS 1 x עם 0.05% אזיד הנתרן, כדי למנוע צמיחה של חיידקים ופטריות. תאים שניתן לאחסן ב 4 ° C עד 6 חודשים אם מנות (אטום עם מצלמות-מיקרוסקופים) נשמרים ב- PBS + נתרן אזיד פתרון, אנטיגנים אבל לא כל אימונולוגי הם שהשתמרה היטב לאחר עיכובים ממושכים בניתוח.
    3. Assay תאים באמצעות תגובה אדו מסחרי קיט (ראה הפרוטוקול של היצרן). כתם תאים באמצעות דאפי או עוד סמן גרעינית, תמונה באמצעות מיקרוסקופ זריחה.
    4. להעריך את הפרופורציה של תאים חיוביים אדו על תאים חיים הכולל (מספר בתא סכום), עיוור 10 שדות אקראיים באופן שיטתי (10 x). אינם כוללים תאים מתים בניתוח.
    5. לנצל הן תמונות חדות שלב פלורסנט תמונות כדי לקבוע מכתים אדו חיובי וכדי לברר אילו תאים מתים או חי (איור 3).
    6. ספירת התאים יש שניהם חלקה אפילו קרום התא בהגדרות חדות שלב, ואת גרעין גדול מפוצל על ידי גרעיני פלורסנט דאפי כתם, תאים אלה הם חיים (איור 3 א-ב).
    7. לא לכלול כל התאים הנמצאים בשלב החיובי, יש קרום התא לא אחידה שבור, יש גרעין קטן, צפוף כמו דמיינו ידי דאפי פלורסנט הדמיה, כמו אלו תאים מתים (איור 3 א-ב). להעריך תאים חיים עבור ביטוי של עידו על-ידי זיהוי תאים בעלי אדו ניאון בהיר מכתים את הגרעין כולו או צביעת פלורסנט מנומר בגרעין (איור 3C).
  5. NPC תא Assay מספר
    1. לאחר יומיים בתרבות, תווית, להכין צינורות microcentrifuge 1.5 mL, 0.5 mL microcentrifuge צינורות. כל שפופרת 0.5 mL, הוסף 5 μL של Trypan Blue.
    2. כדי כל טוב של צלחת טוב 24, הסר בינוני ולהוסיף μL 200 1 x תא ניתוק פתרון ומקום בתוך חממה למשך 10-15 דקות.
    3. לאחר הזמן המוקצב, ברגע תאים יש הרים, להוסיף את הסכום הרצוי של 1 x PBS מכל קידוח.
      הערה: בדרך כלל, ביום 2, להוסיף μL 300 ל- PBS 1 x התאים המכילים טוב פלוס 200 μL של הפתרון ניתוק, עבור הנפח הכולל של 500 μL. עם זמן הדגירה תרבות נוספים, כמו תאים להפוך confluent יותר, להגביר עוצמת דילול לפי הצורך. לדוגמה, ביום הרביעי, להוסיף μL 500 1 x PBS, ביום השישי, להוסיף μL 800 ל- 1 x PBS. נפחים יהיה 700 μL 1 מ"ל, בהתאמה.
    4. באמצעות פיפטה P-1000, פיפטה למעלה ולמטה כל טוב 4 עד 5 פעמים כדי להסיר תאים. בוחנים את הצלחת תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח כי כל התאים יש מנותק. העברת תאים 1.5 mL צינורות.
    5. היפוך 1.5 mL צינורות עם תאים מדולל פי 2 עד פי 3. ואז לקחת את μL 50 aliquot של תאים מהאמצע של הצינור, להוסיף 0.5 mL צינורות עם Trypan Blue (ראה 4.5.1).
    6. פיפטה תא פתרון לכל אורך 2 כדי 3 פעמים. להוסיף תאים hemocytometer ולנתח באופן מיידי. מחכים זמן רב יותר 10 דקות עשוי להגדיל את מות תאים או הנוכחות של תאים יש לקחת Trypan Blue.
    7. להוסיף בזהירות µL 10 לתא + התערובת Trypan Blue בכל צד של hemocytometer כדי לבצע ספירות שכפל. ספירת תאים באמצעות המיקרוסקופ ניגודיות שלב. לא לספור תאים מתים או בתאים כחול כהה לקחו על עצמם Trypan Blue.
    8. כדי לקבל שימוש מספר, בתא סכום הממוצע מספר הטלפון הנייד מתוך 4 הפינות של hemocytometer ולהחיל המשוואה הבאה:
      תא מספר x נפח המדיה (mL) x 10,000 ממוצע = cell סך הכל מספר/טוב
    9. האחות וחזור את ההליך על בארות הנותרים. שינוי בתקשורת על התאים לא להיות נספרים, כל assay חוזר ה 48 על 4 ימים & 6.

5. NPC Neurite Assay

  1. הכנה של מנות, מדיה Neurite Assay
    1. להפוך את פתרון מניות 1 מ"ג/מ"ל של פולי-d-ליזין (PDL) ב- dH2O ולחטא מסנן. לדלל 1:10 dH2O כדי להפוך את פתרון PDL 0.1 מ"ג/מ"ל ולהוסיף 1 מ"ל כל מנה 35 מ מ. תקופת דגירה של 20 דקות ב- RT.
    2. בינתיים, מכינים 30% התרחבות המדיה (ראה סעיף 3.5) ולהוסיף 5 μg/mL (5 µL/mL) של פתרון Fibronectin (מניות 1 מ"ג/מ"ל) בכלי התקשורת.
    3. ברגע שהתקשורת מוכן, להוסיף כלי רכב, גורמי גדילה או סמים עניין בריכוזים הרצויים.
      הערה: מומלץ להוסיף רכב, גורמי גדילה או סמים, בעוצמות < 10% הפתרון הכולל כדי למנוע דילול fibronectin ורכיבים אחרים של המדיום הרחבה 30%.
    4. לאחר 20 דקות, לשטוף כלים PDL 3 פעמים במשך חמש דקות עם dH2O כדי להסיר עודפי PDL. ודא מאכלים יבשים לפני הוספת מדיה.
    5. מניחים 1 מ"ל של מדיה (עם או בלי גורמי גדילה/סמים) + פתרון Fibronectin כל מנה מצופה PDL.
    6. דגירה מנות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות לפני ציפוי תאים כדי להבטיח החזקה נכונה של Fibronectin PDL.
    7. עבור ניסוי, להגדיר 2-3 מנות לכל תנאי (למשל, 3 רכב המכיל מנות, 3 מנות המכילות סמים).
  2. ציפוי NPCs עבור Neurite Assay
    1. ראה סעיף 3.4 עבור שלבים כדי להרים מביצועם, גלולה, resuspend תאים.
    2. צלחת 50,000 תאים לכל מאכל לתוך המנות המבושלות סעיף 5.1. להתסיס מנות הלוך ושוב בכל הכיוונים כדי להבטיח ריפודי כתופיים של תאים.
    3. דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות.
  3. ניתוח של Neurites
    1. לאחר המקננת תאים עבור 48 שעות, תשאף בינוני, ולתקן מנות עם קרח קר 4% מחברים עבור 20 דקות.
    2. לאחר 20 דקות, לשטוף כלים 3 פעמים במשך חמש דקות עם 1 x PBS. לאחר השטיפה הסופית להוסיף 1 מ"ל של PBS 1 x עם 0.05% אזיד הנתרן.
    3. לנתח את מנות באופן עיוור על מיקרוסקופ לעומת זאת שלב בגיל 32 X. לספור הכולל תאים ותאים עם neurites ב-3, שורות 1 ס מ, נבחרו באקראי עמדות אבל לשחזור. לספור מינימום של 150 תאים לכל מאכל על מנת להבטיח דגימה מספקת.
      הערה: neurite מוגדר כהרחבה (תהליך) מתוך הגוף תא > קטרים גוף התא 2 אורך. עבור תאים עם תהליכים מרובים, נחשב את התהליך הארוך על הקריטריון. תאים עם תהליכים הם < 2 גוף התא קטרים אורך אינם כלולים (איור 4).
    4. להוסיף יחד את המספר הכולל של התאים ואת המספר הכולל של תאים עם neurites בכל צלחת. לחשב את אחוז תאים עם neurites. ממוצע אחוז תאים עם neurites על פני מאכלים שכפל. אמונם ניסויית הפארמצבטית נוצר כאשר כל השורות בתוך כל מנה דומה הינם ממוצעים בין מאכלים דומים מאוד, עם שגיאת התקן של הממוצע (SEM) < 10%.
    5. לחלופין, לנתח neurites על-ידי עריכת immunocytochemistry עבור סמני כגון בטא-III-טובולין (TUJ1) או MAP2. לאחר צביעת עבור דה מרקר עניין, קח 10 תמונות אקראיות באופן שיטתי על מיקרוסקופ פלואורסצנטי 10 X. תמונה תאים לפחות 200. במקרה זה, רוכשים את התמונות לא. קרוב מדי לקצה של המנה. לנתח את אחוז תאים עם TUJ1 או MAP2 + neurites (לקבלת דוגמה, ראה איור 10 ).

6. NPC Neurosphere Assay ההעברה

  1. היווצרות Neurosphere
    1. להוסיף 1 מ"ל של 100% הרחבה מדיה לתוך תבשיל 35 מ מ עם סובסטרט ללא ציפוי. דגירה מנות לפחות 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס לפני ציפוי NPCs. להכין 2-3 מנות להבטיח כי שם יהיה מספיק neurospheres עבור תא העברה וזמינותו.
      הערה: בהעדר מצע ציפוי מבטיחה כי NPCs נשארים תלויים בתקשורת, אשר חיוני היווצרות neurosphere. ציפוי מנות ימנע היווצרות neurosphere.
    2. ראה סעיף 3.4 על מדרגות הרם, מביצועם של גלולה תאים. Resuspend תא גלולה ב- 2-5 מ ל 100% מראש ומחוממת התרחבות המדיה. בצלחת 1 מיליון NPCs לתוך כל מנה 35 מ מ מוכן סעיף 6.1.1.
    3. דגירה NPCs ב 37 מעלות צלזיוס במשך 48 ל 96 h כדי לאפשר NPCs צבירה וטופס neurospheres. להעריך את גודל הכדור בעזרת סרגל בשידור חי במיקרוסקופ שלב-ניגודיות. לחכות ברוב התחומים להגיע של הקוטר המשוער של 100 מיקרומטר (± 20 μm) (איור 5). התחומים קטנים לחלוטין להתפזר, להתפרק במהלך ההעברה וזמינותו.
  2. הכנה של צלחות Neurosphere Assay ההעברה
    1. יתמוסס ECM-לחקות ג'ל aliquots (ראה סעיף 3.2) 6 מ של 30% התרחבות המדיה. ברגע ECM-לחקות gel/30% מדיה הרחבת פתרון מוכן, להוסיף כלי רכב, גורמי גדילה או סמים אינטרסים בריכוזים הרצויים.
      הערה: הרכב, סמים ו פקטורי גדילה ריכוזי צריך להיות מוגברת לחשבון עבור התוספת של 200 µL של neurospheres ב סעיף 6.3.
    2. בצלחת 1 מ"ל של החיקוי ECM ג'ל פתרון התקשורת הרחבה /30% (± כלי רכב, גורמי גדילה או תרופות) לתוך אחד טוב של צלחת 6-. טוב. לעשות 2-3 בארות לכל תנאי הניסוי. לחלופין, ניתן להשתמש מנות 35 מ מ. דגירה צלחות במשך לפחות 30 דקות ב ° 37 C.
      הערה: לא תשאף gel/30% ECM-לחקות את התרחבות המדיה לפתרון זה וזמינותו. ציפוי הספירות על גבי ג'ל ECM-לחקות aspirated יוביל העברה מהירה של עודף.
  3. Neurospheres יופיצ
    1. לאסוף neurospheres שהוקמה ב סעיף 6.1 ולמקם אותם לתוך צינור חרוטי. לשטוף את מ מ 35 מנות עם 1 מ"ל של PBS 1 x כדי להבטיח neurospheres כל נאספים. ספין למטה neurospheres שנאספו ב g x 100 למשך 5 דקות.
    2. מחדש להשעות את neurospheres ב 1-3 מ"ל של טרום ומחוממת 30% במדיה הרחבה. אם המנה 1 של neurospheres נאסף, 1 מ"ל של התקשורת משמשת resuspend הספירות. אם 2 מנות נאספים, 2 מ של מדיה נוספים resuspend הספירות, וכו פיפטה בעדינות ולהשתמש רק עם P-1000 להבטחת הספירות אינם שבורים.
    3. צלחת 200 μL של neurospheres resuspended לתוך gel/30% ECM-לחקות הרחבת פתרון ב סעיף 6.2. לוחות אבן לכל הכיוונים לפיזור אחיד neurospheres. דגירה של הלוחות עבור h 48-37מעלות צלזיוס.
    4. הסרת ה-ECM-לחקות gel/30% מדיה הרחבת פתרון ולתקן תאים 4% מחברים, שטיפת ותאים לשמור 1 x PBS + 0.05% אזיד הנתרן.
  4. ניתוח של Neurospheres
    1. לרכוש תמונות של neurospheres כולו באמצעות הגדרות חדות שלב 10 X. ודא הספירות לא נוגעים אחד בשני. למדוד הממוצע העברה באמצעות התוכנה ImageJ.
    2. לאתר את קווי המתאר החיצוני של neurosphere שימוש בכלי קו ביד חופשית. קו ביד חופשית ניתן לגשת על ידי לחיצה ימנית על סמל הקו "ישר". באופן ידני מעקב באמצעות עכבר.
    3. השתמש בפונקציה מידה כדי לחשב את השטח של המעקב. ודא כי "אזור" נבחר בתור read-out בחלון "הגדרת המידות" נמצא תחת הלשונית נתח. ראה איור 6 . עקבות של המתאר החיצוני בכחול.
    4. לעקוב אחר המסה התא הפנימי של האזור כדור ולמדוד. ראה איור 6 זכר מתאר הפנימי בצבע אדום. לכמת ההעברה הממוצע על-ידי חיסור המסה הפנימית תאים מהאזור neurosphere הכולל.
    5. Neurospheres מידה כי התערוכה מסה בצפיפות תא פנימי עם תאים נודדים החוצה כמו שטיח רציף (איור 6).
    6. אינם כוללים תאים מחוץ לשטיח או מנותק מן neurosphere למדידה. ראה איור 6 דוגמאות של תאים (מסומן בעיגול לבן) אינם נכללים המדידה השטיח החיצוני. לנתח את מינימום של 20 neurospheres עבור כל תנאי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מטרה אחת של מחקרים אלה הוא להגדיר את הפעילות המקדימות של NPCs, כלומר, עלייה מספרי הטלפון הנייד. זו מושגת על-ידי הערכת לסינתזת DNA של האוכלוסייה בתא סכום, בגישה תפוקה גבוהה זה מודד את ההתאגדות של תימידין tritiated מעקב רדיואקטיבי לתוך התא תמציות, ומשקף את כל התאים עוסקת S-שלב, בין אם הם סינתזה במשך 5 דקות או את כל שעתיים. בנוסף, מבחני אלה מאפשרות קביעת היחס של תאים מזינים S-פאזי ומספרים בתא סכום, assay יותר לתקיפות של תאים בודדים. תאים לסנתז DNA ב S-שלב, שלב המופיע לפני מיטוזה, חלוקת התא, אשר חייב להופיע על מנת להגביר את מספרי הטלפון הנייד. מאז תהליכים אלה לקחת קצת זמן, שינויים לסינתזת DNA מוערך ב 48 שעות אינן ניתנות לשיוך עם שינויים במספרים תא בנקודת זמן זו. עם זאת, נמצא כי שינויים לסינתזת DNA ב 48 שעות בצורה אמינה לחזות עולה של מספרי הטלפון הנייד ימים 4 ו- 6.

בהערכת לסינתזת DNA, התאים הם מצופה ב צפיפות של תאים 100,000 (~ 50% confluent) צלחת 24-ובכן, מותר לגדל למשך 48 שעות לפני ביצוע מדידות. שימוש צפיפות זו מבטיח כי התאים דומים סביבתם חד שכבתי, אבל גם לא גדלים כל כך מהר תוך תקופה 48 שעות זה והופך להיות חומצי מדי. מדיה זה חומצי מדי יכול להשפיע באופן משמעותי על חילוף החומרים, לכן, לשנות תוצאות התפשטות. אם תא מסוים קווים מאוד המקדימות, החוקר צריך לשקול את שינוי תא צפיפות, אמצעי התקשורת, או מדיה להחליף תדר כדי למנוע מצבים מאוד חומצי. אם התנאים ישתנו, זה קריטי להיות עקבי בהשוואת שורות תאים שונים בגלל שינויים תלוי הקשר-לתא בהחלט משפיעים על שיעורי צמיחה. העיצוב פשוט של מבחני אלה מאפשר לנו לבחון את גורמי גדילה שונים. כפי שניתן לראות באיור 7, התוספת של פיברובלסט גורם גידול (FGF, 10 ng/mL) במשך 48 שעות מגדילה לסינתזת DNA ~ 40%. יתר על כן, וזמינותו סינתזת ה-DNA הוא כמו שיבוטים כל לשחזור ולהציג יחידים עלייה בלסינתזת DNA לאחר FGF גירוי. פוטנציאל ההשתנות של תוכנית בסיסית, FGF מגורה לסינתזת DNA בין אנשים אינה מושפעת שונים, כמו גם את הפוטנציאל של השתנות המשובטים באותו הפרט זה הפגינו טבלה 1. עקב ההשתנות, חשוב לבדוק מספר שיבוטים iPSC לכל אדם, כמו גם להעריך מינימום של 3 עד 5 שורות NPC נגזר כל המשובטים iPSC שונים. מינימום של 3 ניסויים עבור כל קו NPC בוצעה.

וזמינותו סינתזת ה-DNA מאפשר לנו להעריך במהירות קבוצות ניסיוני הרבות אופנה תפוקה גבוהה, המדד ומשקף את המכלול לסינתזת DNA בין משך שלב S (5 דקות עד שעתיים). כדי להגדיר את הפרופורציה של תאים עוסקת S-פאזי, הועסק S-שלב הכניסה וזמינותו. עבור זה assay, התאים גדלים על צפיפות זהה כאמור כדי לאפשר טפט דמוי dynamics להתרחש, אבל אז הם חלופה מועדפת לאחר יומיים, מותר לדבוק בקצרה צלחות לערוך ניתוח מתא בודד. ספירת תאים טפט יכול להיות קשה, בגלל קשר לתא גבוה ולשינויים אזוריים בצלחת. פרדיגמה זו מאפשרת לנו מודל התאים כמו טפט ולנתח אותם ואז כמו תאים בודדים. היא גם פועלת כמו אישור methodologically עצמאית של נתונים שהושגו ב וזמינותו סינתזת ה-DNA. כפי שניתן לראות באיור8, 48 שעות של גירוי (10 ng/mL) FGF מגביר את הפרופורציה של תאים הזנת S-שלב ב- ~ 25%.

בהערכת מספרי הטלפון הנייד, צפיפות התא התחתון משמש מאשר ב- מבחני הנ ל, עם 50,000 תאים להיות מצופה לכל טוב של בגודל 24 טוב בצלחת. שוב, צפיפות זו נבחרה על מנת להבטיח כי מהר יותר שורות תאים לא גדלים כל כך מהר על התקופה 6 ימים כי ה-pH של המדיום הופך חומצי מדי, לצהוב. איור 9, בעוד מספרי הטלפון הנייד לא יכול להיות שונה באופן משמעותי בין שליטה לקבוצות (10 ng/mL) FGF-2 ימים, השינויים לסינתזת DNA ב 48 שעות (איור 7) הינם חזוי של שינויים מספרי הטלפון הנייד 4 ו 6 ימים.

בעוד NPCs בדרך כלל מתורבתים-צפיפות גבוהה, וזמינותו neurite מתנהל על צפיפות של תאים 50,000 מצופה לתוך תבשיל 35 מ מ כדי להעריך תאים בודדים. אפילו בשעה זו צפיפות נמוכה, NPC תרבויות חלבונים cytoskeletal אקספרס ו גורמי שעתוק האופייניים NPCs כגון NESTIN, SOX2 PAX6 (איור 10 A-D). אפשרות זו מציינת כי culturing בצפיפות נמוכה לא לשנות משמעותית את גורל במסגרת זמן זו. יתר על כן, תנאי בצפיפות נמוכה דומים שימשו במערכות תרבות עכבר ועכבר כדי לזהות פנוטיפים שהיו בסופו של דבר לשחזור ויוו16,17,18,19, 20,21,22,23. לאחר 48 שעות של דגירה, אחוז קטן של NPCs להתחיל להרחיב neurites כפי שניתן לראות באיור 11 א ו- B, לכמת בגרף ב- 11C איור. ניתן למדוד את הפרופורציה של תאים המרחיבים neurites, האורך של neurites, ואת המספר של תא neurites להערכת פרמטרים התפתחותית. כדי להעריך באופן מדויק את אחוז תאים עם תוצר neurite, חשוב כי התאים הם מצופים תאים בודדים או אשכולות של < 5 תאים, אגרגטים לא גדול. כפי שניתן לראות באיור 10 E-F, תאים הנושאת neurites (חץ לבן) גם מבטאים את סמן עצביים ילדותי בטא-III טובולין (TUJ1). כפי שצוין לעיל, השיטות, ניתן לרכוש תמונות פלורסנט של TUJ1 צבעונית NPCs, אז התמונות האלה ניתן לספור על היחס TUJ1 + neurites כדי להבטיח מקור עצביים של תהליכים. במעבדה שלנו, ניתוחים בשיטה גם הניבו תוצאות דומות מבחינה סטטיסטית.

העיצוב פשוט ולאופי וזמינותו neurite מהירה גם מאפשרים לנו לבחון את ההשפעה של גורמי גדילה התפתחותי הרלוונטי, ציטוקינים פפטידים. לדוגמה, באיור 11 מראה כי את neuropeptide יותרת המוח אדנילאט cyclase הפעלת מפוליפפטיד (PACAP, 3 ננומטר) תוצר neurite גדל ב- NPCs. PACAP הוא גורם התפתחותי חשוב יש ביטוי רחב של מערכת העצבים, הוכח להיות חשוב בהתפתחות המוח. מכרסמים מחקרים במעבדה שלנו, מעבדות נוספות מצאו כי PACAP יש אפקטים התפתחותית נרחבת, תלוית שלב כגון ויסות תוצר neurite ההעברה, התפשטות בשני hindbrain ו הקדמי16,22, 29,30,31. מחקרים שנעשו לאחרונה על ידי ם. et al. (2016) שימוש תרבותי אנושי תאים בקליפת המוח העוברי מציינים כי פעילות. עצבית מעוררת עלייה 9-fold ב PACAP גנים, המציין חשיבות של פפטידים ההתפתחות העצבית32. אכן, בטבלה 2 מציג את אחוז neurites שליטה, PACAP (3 ננומטר) תנאים בין שורות רבות נגזר יחידים מעושה. כפי שניתן לראות בטבלה מס ' 2, יש כמה השתנות באחוזים של neurites לידי ביטוי שורות תאים שמקורם שיבוטים שונים באותו הפרט ומן NPCs נגזר מאנשים שונים. עם זאת, אנשים לא מושפע אלה יש עלייה neurite תוצר בתגובה PACAP, המציין את הפארמצבטית של מבחני.

כמו תוצר neurite, נדידת תאים הוא תהליך התפתחותי חשוב חיוני עבור חיבור תקין, הארגון, חיווט המוח. Neurospheres מאפשרים לנו ללמוד NPC ההעברה במצב בצפיפות גבוהה טיפוסי תאים תאים קשר בין NPCs (איור 12). הגורמים הרלוונטיים נכה יכול להיבדק גם על neurospheres כדי להעריך את ההשפעות שלהם על הגירה. לדוגמה, איור 12 מראה כי PACAP (10 ננומטר) מגבירה את ההעברה של NPCs.

Figure 1
איור 1: NPCs-מעבר 3. NPCs-P3 אקספרס מספר סמני הבמה ספציפיים לרבות גורם שעתוק pluripotent (א) , SOX2 (B) גורם שעתוק ספציפיים עבור הקדמי NPCs, PAX6, וחלבון cytoskeletal NPC NESTIN. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: סכימטי של S-שלב הכניסה assay. ציר הזמן של S-שלב הכניסה וזמינותו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: לכימות כניסה שלב S. (א) בסה כ מציג תמונת שלב שלב-כהה חיים תאים (החצים הלבנים), תא שלב בהיר מת (כוכב לבן) לבין תא שלב בהיר חי (חץ ירוק). (B) דאפי פלורסנט כתם מציג גרעין מרוכז בתוך תא מת (כוכב לבן) ואת הגרעינים גדולים בתא חי (לבן וירוק חצים). (ג) אדו פלורסנט תמונת מראה אדו בהיר חיובי גרעינים (חץ אדום) עידו מנומר חיובי גרעינים (הכוכב האדום). (ד) שלב, פלורסנט מיזוג תמונות 3A - 3 C.

Figure 4
איור 4: זיהוי neurites. תמונות בניגודיות שלב של התא NPCs. (א) A עם תהליך > שתי גופות תא אורך, ובכך להכיר את קריטריון neurite. (B) תא עם תהליך < שתי גופות תא אורך, neurite מניבי ולכן לא נחשב. (ג) מייצג תא עם 2 תהליכים-תהליך ארוך יותר שקובעת הקריטריון neurite. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: בחירת neurospheres עבור ההעברה assay. (א) שלב חדות תמונה של שדה נציג של neurospheres ב- 24 ח' ספירות הם כל פחות מ- 100 μm ואינם לפיכך, שנאספו עבור ההעברה וזמינותו. (B) שלב חדות תמונה של שדה נציג של neurospheres-72 h. בכל התחומים הם בטווח 100 μm ± 20 מיקרומטר, המציין הם מוכנים להיות שנאספו עבור ההעברה וזמינותו.

Figure 6
איור 6: לכימות ההעברה. (א) שלב חדות תמונה של neurosphere נציג. (B) קו המתאר הכחול מציג את המעקב כדי למדוד את אזור neurosphere הכולל. אדום מציג את קווי המתאר נהגו למדוד את השטח של התא הפנימי המוני. העברה מוגדר כאזור המונית באזור-הפנימית תא neurosphere הכולל. שימו לב, העיגולים הלבנים להראות תאים שאינם נמצאים שטיח רציפים, תאים אלה יכללו את קווי המתאר של ההעברה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 7
איור 7: הערכת לסינתזת DNA- התוצאות נציג של שליטה לעומת לסינתזת DNA של עליות (10 ng/mL) שטופלו FGF NPCs-FGF-48 שעות (p ≤ 1 x 10-3). (n = 2-4 בארות/קבוצה/ניסוי; 3 ניסויים). קווי שגיאה מייצגים ב- SEM.

Figure 8
איור 8: פרופורציה של תאים הזנת שלב S. (א) שלב תמונות חדות של תאים NPC מודגרות בשליטה לעומת FGF (10 ng/mL) התייחס מדיה עבור ה 48 כניסות מייצגים תמונות הגדלה גבוהה יותר של תאים צבעונית עבור פלורסנט אדו סמן בקרת ומדיה FGF 10 ng/mL. חצים אדומים מציינים תאים שהם חצים חיובי ולבן אדו לציין תאים שנמצאים אדו שלילי. (B) גרף תוצאות נציג של שליטה לעומת FGF (10 ng/mL) התייחסו NPCs-FGF מגביר S-שלב הכניסה ב- 48 שעות (≤1 p x 10-3). (n = 2-4 מנות/קבוצה/ניסוי; 3 ניסויים). קווי שגיאה מייצגים ב- SEM.

Figure 9
איור 9: ספירת תאים ימים 2, 4 ו- 6- (א) שלב תמונות חדות של תאים שליטה ומדיה FGF (10 ng/mL) שטופלו ב ימים 2, 4 ו- 6. (B) גרף של נציג תוצאות; הערה FGF הזה (10 ng/mL) לא תמיד להגדיל את מספרי הטלפון הנייד-יומיים, אבל ב 4 ו 6 ימים עליות הן לכאורה (≤0.05 p). (n = 2-4 בארות/קבוצה/ניסוי; 3 ניסויים). קווי שגיאה מייצגים ב- SEM.

Figure 10
איור 10: אפיון NPCs בתנאי צפיפות נמוכה- (A, C, E) שלב חדות תמונות של NPCs בתנאים בצפיפות נמוכה. (B) NPCs אקספרס סמני תא גזע/קדמון NESTIN (ירוק) SOX2 (אדום), סמן גרעיני דאפי (כחול). (ד) PAX6 (אדום), דאפי (כחול). (נ) -בצפיפות נמוכה, תאים הרחבת neurites (חץ לבן) גם מבטאים נוירון ילדותי סמן TUJ1 (ירוק). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 11
איור 11: תוצר Neurite. (א) שלב חדות התמונה של NPCs. החצים השחורים הצבע התאים עם neurites. (B) תוספת של neuropeptide PACAP (3 ננומטר) מגדילה את אחוז תאים עם neurites (≤1 p x 10-2). (ג) כימות של תוצר neurite שליטה ומדיה 3 ננומטר PACAP המכיל. (n = 2-4 מנות/קבוצה/ניסוי; 3 ניסויים). קווי שגיאה מייצגים ב- SEM.

Figure 12
איור 12: Neurosphere ההעברה. (א) שלב תמונות חדות של neurospheres. תוספת של PACAP (B) (10 ננומטר) מגבירה את נדידת תאים neurosphere (p ≤10-2) (ג) כימות של נדידת תאים. (n = 20 כדורים/קבוצה/ניסוי, 3 ניסויים). קווי שגיאה מייצגים ב- SEM.

מדיה
החולה שיבוט # CTRL FGF
(10 ng/mL)
החולה 1 1 21,853 47,538
2 20,336 38,070
החולה 2 1 7,664 14,060
2 16,573 30,087

טבלה 1: לסינתזת DNA- סיכום של הערכים סינתזה של דנ א (ב CPMs) NPCs נגזר שני שכפולים iPSC לכל שני אנשים נפגעו.

מדיה
החולה שיבוט # CTRL PACAP
(3 ננומטר)
החולה 1 1 13.60% 18.10%
2 16.50% 21.10%
החולה 2 1 8.90% 14.10%
2 14.20% 21.10%

בטבלה 2: אחוז תאים עם Neurites. סיכום של האחוז של תאים זוקף neurites NPCs נגזר שני שכפולים iPSC לכל שני אנשים נפגעו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפרוטוקולים המובאת כאן להדגים שיטות מהיר ופשוט ללמוד התפתחותיות היסוד תהליכים ולבדוק גורמי צמיחה ותרופות באמצעות תאים hiPSC-derived קודמן עצבית. hiPSC טכנולוגיה יש מהפכה בחקר בפתוגנזה של מחלות התפתחותיות במתן גישה חסרת תקדים לחיות תאים עצביים האנושי של אנשים מושפעים. אכן, היו מחקרים רבים hiPSC של הפרעות התפתחותיות כולל תסמונת רט, תסמונת טימותי, תסמונת X שביר, וסכיזופרניה, אשר גילית סטיות מחלות ספציפיות, דנדריטים, synapses, ו עצביים הפונקציה4,33,34,35,36. רוב מחקריו התמקדו בעיקר על סופני הבדיל, שלאחר mitotic נוירונים אשר, למרות נחשב יחסית מבחינה תפקודית לא בוגר, אינו כולל את חקר התפתחותיות מוקדם יותר תהליכים כגון התפשטות והעברה. תהליכים אלה האחרונים היו מעורבים בכבדות בפתוגנזה של הפרעות התפתחותיות וללמוד עוד צו8,9,10,11,12 , 35 , 37 , 38. השימוש NPCs מאפשר לנו ללמוד אלה אירועים חשובים קודמות גם בעת מתן ההזדמנות לחקור תהליכים בוגרים יותר כמו היכולת של תאים להרחיב אקסונים לא בוגר/דנדריטים (neurites). עוד יותר, חלק מבחני אלה גם ניתן להאריך ללמוד פרמטרים אחרים, כגון אורך neurite, מספר, ומסעף או את המרחק הרחוק בתא.

מחקרים חדשים יותר השתמשו תא צורב דגם מערכות ללמוד קודם לכן התפתחותית אירועים תלת-ממדי "המוח מיני מערכת"39,1,40. ובכל זאת, אפילו במערכות אלו תא צורב, האוכלוסיה תא קודמן המקדימות היא מוגבלת ותחילת התבגרות, הגירה קשה ללמוד15,39. בנוסף הגבלת המחקר של קודם לכן תופעה התפתחותית, השימוש סופני הבדיל נוירונים או organoids הוא לעיתים קרובות, גוזלת זמן יקר, מגבילה את מספר משתנים אשר יכולים להידרש במערכת. כי נוירונים, organoids עשויים לדרוש אינדוקציה ויראלי פרוטוקולים, חממות מיוחדים וציוד, שבועות מרובים של זמן, כמויות גדולות של מדיה. לעומת זאת, עם היוצא מן הכלל של וזמינותו סינתזה של דנ א (אשר מופנית מאוחר יותר מתחת), פרוטוקול זה יכול להיות מיושם בקלות לחקר הפרעות התפתחותיות, אינה דורשת הכשרה נרחבת, כלי יקר, ולא משאבים או תוכנה. נוחות ועלות נמוכה יחסית של הוספת תרופות ו פקטורי גדילה אלה מבחני, להפוך טכנולוגיה זו פרוטוקול תפוקה גבוהה שימושי כדי לבדוק טיפולים פוטנציאליים שונים עבור התפתחותיות ומחלות מנוטלי. יתר על כן, מאז גורמי גדילה מעשה באמצעות הגדרת הסלולר איתות המסלולים, הם יכולים גם לשמש כלי לבדיקת פוטנציאל איתות פגמים בפיתוח מערכות. לבסוף מאז NPCs אוכלוסיה עצמי המתחדש המקדימות, כמויות גדולות של תאים יכול להיות מיוצר, cryopreserved ניסויים מאפשר להתנהל ביעילות מבלי לגרום NPCs מ iPSCs בכל פעם.

להעסיק בהצלחה את מבחני אלה, חשוב לציין את השלבים הקריטיים הבאים. פרוטוקול זה ממקם NPCs בתנאים שונים עבור תחזוקה והרחבה נגד ניסויים. באופן ספציפי, בעוד NPCs הם המושרה, גדל, passaged בינוני המכיל עצבית אינדוקציה תוספת (ש ח), תנאי הניסוי שלנו להפחית את תוספת בכ-70%, שממקם תאים בסביבה המגביל, ומאפשר לנו את האפשרות להוסיף בחזרה ולבדוק את ההשפעות של גורמי גדילה חשוב. שנית, זה חיוני כדי לעקוב אחר חלוף NPCs... במחקרים שלנו, אנו יש בדרך כלל מוגבל המעבר מספר הקווים תא P3 - P8. קטעים מוקדם יותר P3, כמה שורות לא robustly אקספרס סמנים אופייניים. -מעברים גבוהה יותר, בעוד כמה שורות תאים יש שיעורי צמיחה עקבי או תגובות על גורמי הגדילה שורות תאים אחרים ייתכן שינויים דרמטיים צמיחת תאים או תגובה. על פי דיווח לא שגרתי, אנחנו, ועוד רבים אחרים חוו את השינוי הדרמטי שחל במחירי proliferative מעברים גבוה יותר. הסיבה. זה לא בטוח, אך שינוי זה עשוי לשקף יכולת התחדשות עצמית מוגבלת של NPCs. הגדרה למה ואיך המחירים התפשטות להשתנות לאורך מעברי המורחבת עשויה לספק תובנות בפתוגנזה של המחלה ופיתוח, אבל מחקר נוסף יהיה עליך לעשות זאת. לבסוף, פרוטוקול אינדוקציה עצבית מסחרי אנו משתמשים יכולים לפעמים תשואות תאי גזע עצביים באיכות ירודה, במיוחד אם iPSCs התחלה אינם באיכות גבוהה (כלומר., שיש המבדילים תאים על גבולות התא מושבות, קריוטיפ מומים). במקרים מסוימים, מורפולוגיה תאים תסולף, ביטוי של סמני אינו נוכח. אל תשתמש תרבויות אלה. במקרים אחרים, NPCs לגדול עם תאי "מזהם" להחמיא, אשר ניתן להסירו באמצעות טיפול פתרון ניתוק התא דיפרנציאלית כדי להבטיח כמעט טהור אוכלוסיות NPC לפני שימוש בניסויים. לאחר איכותיות NPCs הוא קריטי לקבלת תוצאות נאות: ראה החומרים והציוד בסעיף קישור לפרוטוקול אינדוקציה עצבית שבה ניתן למצוא תמונות של NPCs גבוהה ו באיכות נמוכה.

לכל אחד מבחני שהוצגו, חשוב לציין את השלבים הקריטיים הבאים, שגיאות פוטנציאליות ועצות לפתרון בעיות. מספר הטלפון הנייד, לסינתזת DNA של מבחני neurite, חשוב לתאי צלחת כמו הפומבית תאים בודדים, לא כמו גושים, כמו זה יכול להטות אמצעים סינתזה של דנ א, תא ספירת ובאופן הפעולה neurite. כדי להבטיח גושים של תאים הם לא מצופה, לדגום נפח קטן של תאים עם P1000, צלחת בשקופית, ולבדוק אם קיימים תאים גושים. אם גושים מצוינים, פיפטה תאים למעלה ולמטה לפרוץ ידנית גושים בנפרד לפני ציפוי. את סינתזת ה-DNA ואת וזמינותו מספר תאים, התאים מורם עם אנזימים ספירת וניתוח. חיוני לאשר באופן חזותי תאים לקחתם לחלוטין מכלי הקיבול תרבות כדי לקבל ספירת מדויק, במידת הצורך, ניתן להשתמש ממושכות הדגירה אנזים. במקרה של ספירת נמוכה או CPMs נמוך עבור וזמינותו סינתזת ה-DNA, תאים יכול להיות מצופה ב צפיפויות הראשונית גבוהה יותר, tritiated רדיואקטיבי [3H] - יכולים להתווסף תימידין כפול זמן (4 שעות במקום 2), או tritiated [3H] - תימידין ריכוז יכול להיות מוכפל. עבור וזמינותו neurite, צפיפות ציפוי הראשוני יכול להיות מוכפל מבלי להסתכן קשר לתא מוגברת. שים לב חלוקת התאים על פני צלחת, לספור שורות 1 ס מ כך נדגמים כל חלק של המנה. אם האחוז neurite הוא נמוך מדי ב- 48 שעות, ניתן להרחיב את הבדיקה עד 6 ימים או לסוג המצע ציפוי או ריכוז יכול להשתנות כדי לקדם את אחוז גדול של neurites. עם זאת, חשוב לציין כי ציפוי פעמים ופעולות שהוצגו בפרוטוקול נבחרו לבריאות תוצר ותא neurite אופטימלית לאחר בדיקות רבות סובסטרטים, ריכוז המצע ושעות ציפוי. עבור וזמינותו neurosphere, השימוש קטנים פיפטורים (P20, P200) יכול להוביל הגז ואת שבירה של כדורים גדולים יותר. לכן, זה הכרחי כי pipetting נעשה בעדינות, עם P1000 או על פיפטה סרולוגית. עבור pelleting את neurospheres, במהירויות נמוכות (100 g x במקום 300 גרם x) מומלץ גם כדי למנוע neurosphere דיסוציאציה. במהלך ספירת ציפוי, ודא כי הספירות כראוי ירווחו לגזרים כמו כדור לספירת-קשר יכולים להשפיע על ההעברה. במקרים בהם ההעברה מהר מדי או לאט מדי, זמן הדגירה יכולה להיות ירידה או גדל בהתאמה. ציפוי דיאלקטריים יכול להשתנות גם לשנות את מחירי ההעברה.

בעוד טכניקות השתמשו מהירה, פשוטה, החלים על המחקר של הפרעות התפתחותיות, ישנן הגבלות מסוימות. למשל, רבים מן הבדיקות הציג (assay מספר התא, neurite assay, הגירה assay) מצריכים החוקרים לקבל החלטות סובייקטיבית (למשלזה neurite? תא זה? מת) שעלול כדי החוקר דעה קדומה או הפארמצבטית נמוכה יותר. עם זאת, ביצוע ניתוחים עיוור, הגדרת תקנים מחמירים עבור כל החלטה בתוך assay, כמופיע בשיטות, ניתן להפחיתם הטיות אלה. באופן דומה, מבחני אלה דורשים מדידות ידניות וספירות, אשר יכול להיות זמן רב של עבודה אינטנסיבית. עם זאת, במעבדות שיש להם את הציוד ואת משאבים טכניים, מבחני אלה יכול האיץ את זה עם השימוש של מוני תא אוטומטיות והתוכניות יכול לערוך מדידות אוטומטיות41,42. במקרה של סינתזת ה-DNA וזמינותו, השיטות הספציפיות למכונה שלנו תא קומביין, נצנוץ (ראה חומרים וציוד); עם זאת, ישנם דגמים זמינים אחרים, שיטות שבהן ניתן להשתמש כדי להשיג את אותו מידע, כגון הכריה תא Omnifilter-95. עבור מוסדות מסוימים, השימוש של מקורות רדיואקטיביים לא יכול להיות ריאלי. במקרה זה, שיטה חלופית באמצעות של תימידין פלורסנט אנלוגי, כגון אדו, מנותח על קורא microplate פלורסנט, יאפשר רכישת מידע זהה על ניתוח בצובר של סינתזה של דנ א44.

המערכת שלנו תרבות בצפיפות נמוכה מפריד NPCs לתוך תאים בודדים או גושים קטנים, מצב זה שונה של מהות בצפיפות NPCs בצינור העצבי המתפתח. ובכל זאת, NPCs are סמני המתאים, בריאים, אקספרס (איור 1, איור 10). יתר על כן, שלנו מחקרים קודמים של תרבויות קורטיקלית עכבר ועכברוש, מציג מקבילי ממצאים בתרבויות במבחנה , מודלים ויוו לציין השירות והערך של שימוש זה לגשת16,17,18 , 19 , 24. בנוסף, מערכת זו מספקת גישה רב-עוצמה להבין ההבשלה של תאי וללמוד תא תת אוכלוסיות. לדוגמה, אימונוהיסטוכימיה יכול להתבצע על וזמינותו neurite כדי לקבוע איזה סוג תאים עצביים מסוים היא הרחבת של neurite. בסופו של דבר, למרות מספר מגבלות, פרוטוקול ייחודי זה מספק שיטות ישיר, חזק, מהיר ללמוד הפרעות התפתחותיות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמך על ידי המושל ניו ג'רזי המועצה למחקר רפואי, טיפול של אוטיזם (CAUT13APS010; CAUT14APL031; CAUT15APL041), ננסי לוריא מסמן קרן נאמנות עופרת Mindworks, קרן הקהילה היהודית של מטרווסט רבתי.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PSC Neural Induction Medium:
Protocol Link: https://goo.gl/euub7a 		 ThermoFischer Scientific A1647801 This is a kit that consists of Neurobasal (NB) medium and a 50x Neural Induction Supplement (NIS). The NIS is used to make 1X Neural Induction Medium and 100% Expansion Medium
Advanced DMEM/F12 Medium ThermoFischer Scientific 12634-010 Component of 100% Expansion Medium
Neurobasal Medium ThermoFischer Scientific 21103049 Component of both NIM and 100% Expansion Medium 
hESC-qualified Matrigel Corning 354277 hESC-qualified extracellular matrix-mimic gel (ECM-mimic gel) 
Y-27632 (2HCl), 1 mg Stem Cell Technologies 72302 ROCK inhibitor
6 well plates Corning COR-3506 Polystyrene plates used for NPC maintenance and for Neurosphere Migration Assay 
24 well plates ThermoFischer Scientific 2021-05 Polystyrene plates: Used for NPC DNA Synthesis Assay
35 mm dishes ThermoFischer Scientific 2021-01 Polystyrene plates: Used for NPC S-Phase Entry and Neurite Assay
Natural Mouse Laminin Invitrogen 23017-015 Substrate for coating plates: Used for NPC DNA Synthesis, S-Phase Entry, and Cell Number Assays
Fibronectin Sigma F1141 Substrate for coating plates: Used for Neurite Assay 
Poly-D-Lysine Sigma P0899 Substrate for coating plates
Penicillin/Streptomycin ThermoFischer Scientific 15140122 Antibiotic, component of NIM, 100% Expansion and 30% Expansion Media 
StemPro Accutase Gibco A11105-01 1X Cell Detachment Solution 
2.5% Trypsin (10X) Gibco 15090-046 10X enzymatic solution
0.5 M EDTA ThermoFischer Scientific AM9261 used in trypsin solution for lifting cells for DNA synthesis assay
tritiated [3H]-thymidine PerkinElmer NET027E001 Radioactive tritium, thymidine
Fisherbrand 7 mL HDPE Scintillation Vials Fisherbrand 03-337-1 Vials for liquid scintillation counting
EcoLite(+) MP Biomedicals 0188247501  Liquid scintillation cocktail
LS 6500 multi-purpose liquid scintillation counter Beckman Coulter 8043-30-1194 Liquid Scintillation Counter
Skatron Semi-automactic Cell Harvester Type 11019 Molecular Devices & Skatron Instruments, Inc. Semi-automatic cell harvester
Click-iT EdU Alexa Fluor® 488 Imaging Kit ThermoFisher Scientific C10337 EdU and staining kit for S-Phase Entry Assay
Trypan Blue Solution, 0.4% ThermoFisher Scientific 15250061 Assessing viability of cells
Grade GF/C filter paper GE Healthcare Life Sciences, Whatman 1822-849 Glass fiber filter paper
Human Basic FGF-2 Peprotech 100-18B growth factor
Pituitary Adenylate Cyclase Activating Polypeptide (PACAP-38) BACHEM H-8430 neuropeptide

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  2. Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145 (6), 831-834 (2011).
  3. Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476 (7359), 220-223 (2011).
  4. Marchetto, M. C., et al. A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143 (4), 527-539 (2010).
  5. Bershteyn, M., et al. Human iPSC-Derived Cerebral Organoids Model Cellular Features of Lissencephaly and Reveal Prolonged Mitosis of Outer Radial Glia. Cell Stem Cell. 20 (4), 435-449 (2017).
  6. Giandomenico, S. L., Lancaster, M. A. Probing human brain evolution and development in organoids. Curr Opin Cell Biol. 44, 36-43 (2017).
  7. Vaccarino, F. M., et al. Induced pluripotent stem cells: a new tool to confront the challenge of neuropsychiatric disorders. Neuropharmacology. 60 (7-8), 1355-1363 (2011).
  8. Walsh, T., et al. Rare structural variants disrupt multiple genes in neurodevelopmental pathways in schizophrenia. Science. 320 (5875), 539-543 (2008).
  9. Guilmatre, A., et al. Recurrent rearrangements in synaptic and neurodevelopmental genes and shared biologic pathways in schizophrenia, autism, and mental retardation. Arch Gen Psychiatry. 66 (9), 947-956 (2009).
  10. Pinto, D., et al. Convergence of genes and cellular pathways dysregulated in autism spectrum disorders. Am J Hum Genet. 94 (5), 677-694 (2014).
  11. Parikshak, N. N., et al. Integrative functional genomic analyses implicate specific molecular pathways and circuits in autism. Cell. 155 (5), 1008-1021 (2013).
  12. Birnbaum, R., Jaffe, A. E., Hyde, T. M., Kleinman, J. E., Weinberger, D. R. Prenatal expression patterns of genes associated with neuropsychiatric disorders. Am J Psychiatry. 171 (7), 758-767 (2014).
  13. Voineagu, I., et al. Transcriptomic analysis of autistic brain reveals convergent molecular pathology. Nature. 474 (7351), 380-384 (2011).
  14. Willsey, A. J., et al. Coexpression networks implicate human midfetal deep cortical projection neurons in the pathogenesis of autism. Cell. 155 (5), 997-1007 (2013).
  15. Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
  16. Yan, Y., et al. Pro- and anti-mitogenic actions of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide in developing cerebral cortex: potential mediation by developmental switch of PAC1 receptor mRNA isoforms. J Neurosci. 33 (9), 3865-3878 (2013).
  17. Mairet-Coello, G., et al. p57(KIP2) regulates radial glia and intermediate precursor cell cycle dynamics and lower layer neurogenesis in developing cerebral cortex. Development. 139 (3), 475-487 (2012).
  18. Tury, A., Mairet-Coello, G., DiCicco-Bloom, E. The cyclin-dependent kinase inhibitor p57Kip2 regulates cell cycle exit, differentiation, and migration of embryonic cerebral cortical precursors. Cereb Cortex. 21 (8), 1840-1856 (2011).
  19. Mairet-Coello, G., Tury, A., DiCicco-Bloom, E. Insulin-like growth factor-1 promotes G(1)/S cell cycle progression through bidirectional regulation of cyclins and cyclin-dependent kinase inhibitors via the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt pathway in developing rat cerebral cortex. J Neurosci. 29 (3), 775-788 (2009).
  20. Tury, A., Mairet-Coello, G., DiCicco-Bloom, E. The multiple roles of the cyclin-dependent kinase inhibitory protein p57(KIP2) in cerebral cortical neurogenesis. Dev Neurobiol. 72 (6), 821-842 (2012).
  21. Li, B., DiCicco-Bloom, E. Basic fibroblast growth factor exhibits dual and rapid regulation of cyclin D1 and p27 to stimulate proliferation of rat cerebral cortical precursors. Dev Neurosci. 26 (2-4), 197-207 (2004).
  22. Lu, N., DiCicco-Bloom, E. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide is an autocrine inhibitor of mitosis in cultured cortical precursor cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (7), 3357-3362 (1997).
  23. Zhou, X., Suh, J., Cerretti, D. P., Zhou, R., DiCicco-Bloom, E. Ephrins stimulate neurite outgrowth during early cortical neurogenesis. J Neurosci Res. 66 (6), 1054-1063 (2001).
  24. Falluel-Morel, A., et al. N-acetyl cysteine treatment reduces mercury-induced neurotoxicity in the developing rat hippocampus. J Neurosci Res. 90 (4), 743-750 (2012).
  25. Rossman, I. T., et al. Engrailed2 modulates cerebellar granule neuron precursor proliferation, differentiation and insulin-like growth factor 1 signaling during postnatal development. Mol Autism. 5 (1), 9 (2014).
  26. Tao, Y., Black, I. B., DiCicco-Bloom, E. In vivo neurogenesis is inhibited by neutralizing antibodies to basic fibroblast growth factor. J Neurobiol. 33 (3), 289-296 (1997).
  27. Vaccarino, F. M., Grigorenko, E. L., Smith, K. M., Stevens, H. E. Regulation of cerebral cortical size and neuron number by fibroblast growth factors: implications for autism. J Autism Dev Disord. 39 (3), 511-520 (2009).
  28. Kaplan, D. R., Miller, F. D. Neurotrophin signal transduction in the nervous system. Curr Opin Neurobiol. 10 (3), 381-391 (2000).
  29. Shen, S., Gehlert, D. R., Collier, D. A. PACAP and PAC1 receptor in brain development and behavior. Neuropeptides. 47 (6), 421-430 (2013).
  30. Suh, J., Lu, N., Nicot, A., Tatsuno, I., DiCicco-Bloom, E. PACAP is an anti-mitogenic signal in developing cerebral cortex. Nat Neurosci. 4 (2), 123-124 (2001).
  31. Falluel-Morel, A., et al. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide prevents the effects of ceramides on migration, neurite outgrowth, and cytoskeleton remodeling. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (7), 2637-2642 (2005).
  32. Ataman, B., et al. Evolution of Osteocrin as an activity-regulated factor in the primate brain. Nature. 539 (7628), 242-247 (2016).
  33. Doers, M. E., et al. iPSC-derived forebrain neurons from FXS individuals show defects in initial neurite outgrowth. Stem Cells Dev. 23 (15), 1777-1787 (2014).
  34. Pasca, S. P., et al. Using iPSC-derived neurons to uncover cellular phenotypes associated with Timothy syndrome. Nat Med. 17 (12), 1657-1662 (2011).
  35. Brennand, K., et al. Phenotypic differences in hiPSC NPCs derived from patients with schizophrenia. Mol Psychiatry. 20 (3), 361-368 (2015).
  36. Marchetto, M. C., et al. Altered proliferation and networks in neural cells derived from idiopathic autistic individuals. Mol Psychiatry. , (2016).
  37. Voineagu, I. Gene expression studies in autism: moving from the genome to the transcriptome and beyond. Neurobiol Dis. 45 (1), 69-75 (2012).
  38. Waltereit, R., Banaschewski, T., Meyer-Lindenberg, A., Poustka, L. Interaction of neurodevelopmental pathways and synaptic plasticity in mental retardation, autism spectrum disorder and schizophrenia: implications for psychiatry. World J Biol Psychiatry. 15 (7), 507-516 (2014).
  39. Quadrato, G., Brown, J., Arlotta, P. The promises and challenges of human brain organoids as models of neuropsychiatric disease. Nat Med. 22 (11), 1220-1228 (2016).
  40. Pasca, S. P., Panagiotakos, G., Dolmetsch, R. E. Generating human neurons in vitro and using them to understand neuropsychiatric disease. Annu Rev Neurosci. 37, 479-501 (2014).
  41. Huttunen, T. T., et al. An automated continuous monitoring system: a useful tool for monitoring neuronal differentiation of human embryonic stem cells. Stem Cell Studies. 1 (1), 10 (2011).
  42. Lappalainen, R. S., et al. Similarly derived and cultured hESC lines show variation in their developmental potential towards neuronal cells in long-term culture. Regen Med. 5 (5), 749-762 (2010).
  43. ThermoFisher. GIBCO Induction of Neural Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells Using PSC Neural Induction Medium. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0008031.pdf (2017).
  44. ThermoFisher. Invitrogen Click-iT EdU Microplate Assay. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/mp10214.pdf (2017).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 133 neurodevelopment ביולוגיה התפתחותית תאים עצביים קודמן iPSC מחלת מוח אוטיזם גורמי גדילה התפשטות תוצר neurite נדידת תאים
זיהוי מהיר של פנוטיפים התפתחותיות בתאי האדם קודמן עצבית (NPCs)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Williams, M., Prem, S., Zhou, X.,… More

Williams, M., Prem, S., Zhou, X., Matteson, P., Yeung, P. L., Lu, C. W., Pang, Z., Brzustowicz, L., Millonig, J. H., Dicicco-Bloom, E. Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells (NPCs). J. Vis. Exp. (133), e56628, doi:10.3791/56628 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter