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Developmental Biology

Rápida detección de los fenotipos del neurodesarrollo en las células precursoras neuronales humanos (PNJ)

Published: March 2, 2018 doi: 10.3791/56628
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 3, 3, 4, 5, 2, 1
1Department of Neuroscience and Cell Biology, Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 2Center for Advanced Biotechnology and Medicine, Department of Neuroscience and Cell Biology, Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 3The Child Health Institute of NJ, Department of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Services, Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 4The Child Health Institute of NJ, Department of Neuroscience and Cell Biology, Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 5Department of Genetics, Rutgers University
* These authors contributed equally

Summary

Desarrollo neurológico procesos como proliferación, migración y consecuencia del neurite son a menudo perturbados en enfermedades neuropsiquiátricas. Así, presentamos protocolos evaluar rápida y reproducible estos procesos del neurodesarrollo en NPCs humanos derivado de iPSC. Estos protocolos permiten la evaluación de los efectos relevantes factores de crecimiento y terapias en desarrollo de NPC.

Abstract

Desarrollo del cerebro humano se desarrolla a través de una serie de procesos precisamente orquestadas, con etapas anteriores distinguidos por la proliferación, la migración y la consecuencia del neurite; y etapas posteriores, caracterizadas por la formación de fruto y sinapsis axón/dendrita. En trastornos del desarrollo neurológico, a menudo uno o más de estos procesos se interrumpen, conduciendo a anormalidades en la formación del cerebro y la función. Con el advenimiento de la tecnología de la célula de vástago (hiPSC) pluripotentes inducidas humanas, los investigadores ahora tienen una fuente abundante de células humanas que pueden diferenciarse en cualquier tipo de célula, incluyendo las neuronas. Estas células pueden utilizarse para estudiar el desarrollo cerebral normal y patogénesis de la enfermedad. Un número de protocolos utilizando hiPSCs para modelar enfermedades neuropsiquiátricas uso terminal distinguido neuronas o uso cultura 3D sistemas llaman organoides. Mientras que estos métodos han probado inestimables en el estudio de la patogénesis de la enfermedad humana, existen algunos inconvenientes. Diferenciación de hiPSCs en neuronas y la generación de organoides son procesos largos y costosos que pueden afectar el número de experimentos y las variables que pueden evaluarse. Además, mientras que organoides y poste-mitotic neuronas permiten el estudio de los procesos relacionados con la enfermedad, como consecuencia de la dendrita y sinaptogénesis, impide el estudio de anteriores procesos como proliferación y migración. En trastornos del neurodesarrollo como autismo, abundante evidencia genética y post-mortem indica defectos en los procesos de desarrollo tempranos. Células precursoras neuronales (PNJ), una población altamente proliferativa de la célula, pueden ser un modelo adecuado en el que hacer preguntas sobre los procesos ontogenéticos y la iniciación de la enfermedad. Ahora extendemos metodologías aprendidas del estudio de desarrollo en ratón y rata culturas corticales a NPCs humanos. El uso de NPCs nos permite investigar los fenotipos relacionados con la enfermedad y definir cómo diferentes variables (p. ej., factores de crecimiento, medicamentos) impacto del desarrollo procesos como proliferación, migración y diferenciación en pocos días. En definitiva, este conjunto de herramientas puede utilizarse de forma reproducible y alto rendimiento para identificar mecanismos específicos de la enfermedad y fenotipos en trastornos del neurodesarrollo.

Introduction

El uso de organismos más simples y modelos de ratón ha dilucidado los mecanismos de desarrollo básico del cerebro así como la patogénesis de la enfermedad. A pesar de estos avances, la etiología de muchos desordenes neuropsiquiátricos permanece esquiva porque no todos los resultados en los organismos más simples son directamente pertinentes a aspectos complejos de la enfermedad humana. Además, la mayor complejidad del cerebro humano a menudo hace difícil para el desarrollo humano modelo y trastornos en los animales. Con la evolución y progreso de la tecnología de células madre (hiPSCs) pluripotentes inducidas humanas, células somáticas pueden ser reprogramadas en células madre y entonces diferenciar en células neuronales para estudiar enfermedades humanas. Avances en las tecnologías hiPSCs y "ómicas" (genómica, transcriptómica, proteómica, metabolómica) prometen revolucionar la comprensión del desarrollo del cerebro humano. Estas tecnologías ahora hacen posible un enfoque de "medicina de precisión" a la caracterización de enfermedades neuropsiquiátricas en caso por caso.

La grapa tipo actual en el campo de la enfermedad-modelado hiPSC es diferenciar las células en determinados subtipos neuronales en una monocapa o utilizar un sistema de cultivo 3D llamado un organoide para recapitular los aspectos del cerebro desarrollo1,2, 3. Estos sistemas han sido increíblemente valiosos en el estudio y descubrimiento de aspectos singulares del desarrollo humano y la enfermedad4,5,6,7. Sin embargo, culturas neuronales y organitas a menudo requieren en cualquier lugar desde semanas a meses en la cultura antes de estar listos para estudiar. La naturaleza desperdiciadora de tiempo de estos protocolos y la cantidad de recursos necesarios para mantener que estos sistemas de cultivo a menudo limitan el número de experimentos que se pueden realizar y el número de variables (como factores de crecimiento o drogas) que se puede probar. Por otra parte, muchos estudios utilizando organoides y poste-mitotic neuronas se han centrado en procesos como la formación del fruto o sinapsis dendrita, que ocurren más adelante en el desarrollo. Mientras que estos procesos han sido implicados en la patología de trastornos del desarrollo tales como autismo y esquizofrenia, antes del desarrollo eventos que ocurren antes de la diferenciación neuronal definitiva también son importantes para la patogénesis de la enfermedad8 ,9,10,11,12,13. De hecho, recientes estudios genómicos muestran que el período mediados de-fetal, que se compone de la migración, proliferación y consecuencia del proceso, es particularmente importante en la patogenesia de autismo11,14. Por lo tanto, es importante estudiar el tallo neural y poblaciones de la célula progenitora para entender mejor estos procesos anteriores. Sistemas de organoide, que están considerado mejor Recapitulemos el desarrollo del cerebro humano debido a su naturaleza 3D y estructura organizada, contienen una piscina del progenitor que se ha utilizado para estudiar algunos de estos eventos anteriores. Sin embargo, a menudo es escasa la población progenitora de organoides y más como las células gliales radiales que nervios madre o progenitora células5,15. Por lo tanto, sería beneficioso tener un método de alto rendimiento para estudiar las primeras etapas de desarrollo neurológico en una población activamente proliferativa de la célula.

En el laboratorio, hemos creado un protocolo que utiliza células precursora neuronal hiPSC derivados (PNJ), una población mezclada del tallo neural y células progenitoras que es altamente proliferativas, para el estudio del neurodesarrollo procesos como proliferación, migración de la célula, y extensión del proceso inicial (neurita). Estos ensayos se desarrollaron de las técnicas utilizadas en nuestro laboratorio durante décadas para estudiar con éxito neurodesarrollo en rata y ratón culturas corticales16,17,18,19,20, 21,22,23. Lo importante, también fue demostrado que señales regulatorias definidas en los sistemas de cultivo de rata y ratón y fenotipos son altamente predictivas de mecanismos que son activos en vivo, indicando el valor de estas técnicas16, 1718,de,19,24. Tras la diferenciación inicial de hiPSCs a NPCs, estos métodos nos permiten estudiar los procesos de desarrollo vitales en cuestión de días. Estos métodos tienen muchas ventajas: (1) requieren equipos poco sofisticados y son fáciles de implementar, (2) numerosas repeticiones experimentales pueden llevarse a cabo en un corto periodo de tiempo, lo que permite la confirmación rápida de la reproducibilidad de los resultados y (3) variables de cultura como matrices de capa, efectos de factores de crecimiento y actividad de las drogas se pueden probar rápidamente y rentable. Además, aprovechamos el papel bien establecido extracelulares de factores de crecimiento como reguladores críticos de diversos procesos de desarrollo. NPCs fueron expuestas para seleccionar las señales del desarrollo que directamente estimulan eventos como proliferación, consecuencia del neurite y migración celular y han encontrado que aumentar la capacidad de identificar defectos que no son evidentes en condiciones de control19 , 25 , 26 , 27 , 28. Asimismo, la facilidad de evaluar drogas ofrece una vía poderosa para adoptar técnicas de la medicina de precisión para comprobar la eficacia de diferentes intervenciones terapéuticas. Así, este protocolo facilita un alto rendimiento, reproducible y sencilla metodología para estudiar el desarrollo temprano del cerebro, patogénesis de la enfermedad y los efectos beneficiosos potenciales factores de crecimiento y fármacos en fenotipos del neurodesarrollo.

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Protocol

1. procedimientos y seguridad mantenimiento del gabinete de seguridad de la biotecnología

  1. Procedimientos de seguridad de nivel de bioseguridad 2 (BSL-2)
    1. Siga las directrices de la institución en el trabajo con materiales de BSL-2. Disponer de materiales de BSL-2 según las prácticas de la institución. Indican salas y equipos que se utilizan para materiales de BSL-2. Use todo el equipo protector personal (PPE), incluyendo guantes y bata de laboratorio.
  2. Mantenimiento del gabinete de seguridad de la biotecnología
    1. Uso de un gabinete de bioseguridad certificado para el uso de materiales nivel BSL-2.
    2. Encienda la luz UV en la bioseguridad gabinete durante al menos 15 minutos y luego rocíe las superficies con solución de lejía del 10%. Deje que la solución de blanqueador de reposar 15 minutos, limpie el gabinete y activar la circulación de aire antes de usar.
  3. Origanum radiactivo [3H]-timidina (tritio) los procedimientos de seguridad
    Nota: El tritio es una fuente radiactiva de categoría 5, 'el más poco probable que sea peligroso ' categoría. Siga las directrices de la institución para trabajar con radiactividad. Algunas instituciones pueden requerir certificaciones o permisos para manejar tritio.
    1. Reciben capacitación de la institución sobre cómo manejar correctamente y disponer de tritio. Disponer de los residuos radiactivos en recipientes adecuados, según las políticas de la institución. Use PPE cuando trabaje con tritio.

2. nerviosas inducción de iPSCs

Nota: Para hacer NPCs, una versión ligeramente modificada de un protocolo que acompaña a un kit de inducción neural comercialmente disponible fue seguida. El kit consta de Neurobasal (NB) media y una 50 x suplemento de inducción Neural (NIS), que se utiliza para hacer un 1 x medio de la inducción Neural (NIM). NIS también se utiliza para hacer 100% medio de expansión (ver sección 3.1). Un enlace en el protocolo se encuentra en la sección de materiales y equipos y referencias43.

  1. Paso iPSCs cuando se vuelven confluentes de 70-80%.
  2. Placa 300.000 iPSCs en 1 bien de hESC-calificado extracelular matriz-mimic gel (gel de ECM-imitador) revestido placa de 6 pozos que contiene 2 mL de medio libre de alimentador de iPSC con 5 μM de inhibidor de la roca. Ver sección 3.2 para obtener instrucciones sobre pozos de capa con gel de ECM-mimic.
  3. Un día después, retire el iPSC mediana + ROCK iPSCs inhibidor y lavado una vez con 1 x PBS. Añadir 2 mL de NIM a la iPSCs.
    Nota: 50 mL de NIM se hace añadiendo 1 mL de 50 x NIS y 250 μl (50 unidades/mL, 5 μL/mL) de penicilina/estreptomicina (P/S) y 49 mL de Nota Media.
  4. Medios de comunicación de cambio de la inducción neural cada 2 días por aspiración pasaron medio y sustitución con 2 mL de NIM hasta convertirse en confluentes de células (alrededor de 4-5 días). Cambiar los medios de comunicación diariamente, una vez que las células son confluentes.
  5. Células de paso después de 7 días en NIM y la placa en un gel de ECM-mimic cubierta placa de 6 pozos que contienen 2 mL de inhibidor de la roca de 5 μM y 100% Media expansión. Las células se consideran paso 0 (P0) NPCs en este punto. Ver sección 3.1 a continuación las instrucciones hacer los medios de expansión de 100%.
  6. Células de paso mediante los métodos descritos en la sección 3.4. Espere hasta que las células han llegado a P2 y son confluentes antes de disociar para teñir para marcadores NPC y galjanoplastia para experimentos (figura 1).

3. medios de cultivo, recubrimiento y mantenimiento de NPCs

  1. Preparación de medios para el mantenimiento de NPCs (expansión 100% Media):
    1. Tomar 50 mL de medio de expansión 100% combinando 24,5 mL de DMEM/F12 con 24,5 mL de NB.
    2. Añadir 1 mL de 50 NIS x DMEM/F12 + solución NB. Añadir 250 μL de solución P/S a los medios de comunicación.
      Nota: Los medios de comunicación pueden ser refrigeradas (4 ° C) y utilizan durante 2 semanas. Pequeños volúmenes de medios de comunicación se pueden hacer mediante el ajuste de los volúmenes de DMEM / F12 + NB + NIS utilizando los mismo ratios en cuanto a volumen de 50 mL.
  2. Preparación del Gel de ECM-mimic cubierta placas para mantenimiento NPC
    1. Gel de alícuota ECM-imitador en el volumen necesario para hacer 6 mL de solución de trabajo. Calcular el volumen de la alícuota al mirar la hoja del certificado de análisis desde ECM-mimic gel factor de dilución varía de lote a lote y lote a lote.
    2. Descongelar una alícuota de gel ECM-imitador en el hielo y disolver en 6 mL de medio DMEM/F12 frío.
    3. Añadir 1 mL de solución de ECM-mimic gel/DMEM/F12 a cada pocillo de una placa bien 6. Incubar la placa de la pozo de 6 con ECM-imitador-la solución en gel por 30 min a 37 ° C.
    4. Aspirar solución de ECM-mimic gel después de 30 min de incubación y reemplazar con 100% expansión medios o refrigerar placas (4 ° C, hasta una semana) sin aspiración gel-solución de ECM-mimic.
  3. Mantenimiento de NPCs
    1. PNJs de la placa a una densidad de 1,5 millones de células en un ECM-imitador bien que contiene 2 mL de medio de expansión de 100% gel-revestida.
    2. Incubar NPCs a 37 ° C en un ambiente húmedo con 5% CO2.
    3. Añadir 5 μM de inhibidor de la roca a los medios de comunicación para NPCs en P3 o inferior, o para NPCs descongelados, para evitar la muerte celular excesiva. Cambiar los medios de comunicación después de 24 h para eliminar el inhibidor de la roca.
    4. Células de paso cada 4-9 días, dependiendo de Cuándo se vuelven confluentes. Las células se consideran confluentes cuando llegan a ser una monocapa densamente cubriendo la parte inferior entera de la superficie del plato.
    5. PNJs de la placa a una densidad de 1 a 1,5 millones de células por un pozo de una placa de 6 pozos (ver sección 3.4). Eliminar medios gastados cada 48 h y reemplazar con 2 mL de medio de expansión de 100%.
  4. Levante, se disocian y NPCs de pellets para el mantenimiento o galjanoplastia para condiciones experimentales
    1. Aspirar las células medianas, lave una vez con 1 x PBS. Aspire PBS y agregar 500 μL de solución de separación de células 1 x en 1 bien de confluente NPCs. Incubar 10 min a 37 ° C.
    2. Añadir 500 μL de temperatura (RT) PBS y lave el bien con una pipeta P-1000 para asegurar la eliminación de las células. Recoger las células + solución de PBS en un tubo cónico de 15 mL. Lave la placa otra vez con 1 mL de PBS y añadir líquido al tubo.
    3. Las células de la vuelta abajo a 300 x g durante 5 minutos para que sedimenten.
    4. Quite el sobrenadante pellets celulares y resuspender las células en 1-5 mL de medio DMEM/F12 precalentado. Diluir las células a una densidad de 1 a 4 millones de células/mL de medios de comunicación. Cuantificar las células usando un hemocitómetro.
    5. Placa el número de células específicas para el mantenimiento NPC (sección 3.3) o el ensayo individual está llevando a cabo (ver secciones siguientes para obtener más detalles).
    6. Ajustar volumen de suspensión celular con los medios de comunicación para que entre 15 y 100 μL de células se utilizan para cada pozo/plato. Este pequeño volumen asegura que no hay distribución de células incluso y que factores de crecimiento, medicamentos o sustratos en el medio no se diluyen.
    7. Incube las células a 37 ° C. Cambiar los medios de comunicación cada 48 h para el mantenimiento NPC o ver los detalles específicos para los ensayos individuales.
  5. Preparación de medios de comunicación para las condiciones experimentales (Media de expansión de 30%)
    1. Diluir los medios de comunicación de expansión de 100% en un 70% (llamado 30% extensión) mediante la adición de 1:1 DMEM/F12 + solución NB para hacer los medios de comunicación para las condiciones experimentales.
    2. Agregar 6 mL de medio de expansión de 100% y diluir con 7 mL de NB y 7 mL de medio DMEM/F12 para hacer 20 mL de medio de expansión de 30%. Añadir 5 μl/mL de solución P/S.
      Nota: Si los medios de comunicación 100% ya contiene P/S, luego añadir 5 μL/mL de DMEM combinado / F12 + NB = (14 mL) x (5 μL/mL) = 70 μL de P/S en lugar de 100μl.
    3. Añadir sustratos de capa y factores de crecimiento en las concentraciones deseadas a los medios de comunicación de expansión de 30%.

4. evaluación de la síntesis de ADN, fase S entrada y número de células de NPCs

  1. Preparación para la síntesis de ADN, fase S entrada y ensayo número de células
    1. Hacer una solución de poly-D-lisina (PDL) en dH2O 1 mg/mL y esterilizar un filtro. Diluir 1:10 en dH2O hacer un 0,1 mg/mL solución PDL y añadir 300 μL a cada pocillo de una placa de la pozo 24 o 1 mL en un plato de 35 mm. Incubar por 20 min a TA.
    2. Lavar los pocillos PDL durante 5 min con dH2O. aspirado dH2O 3 veces y añadir 300 μL/pocillo o 1 mL/plato de laminina (5 μg/mL) diluido en 1 x PBS. Cubrir las placas con parafilm y mantener una bioseguridad estéril, gabinete durante la noche a temperatura ambiente (12-24 h).
    3. Preparar medios de expansión de 30% (ver sección 3.5) después de 12 a 24 h. agregar vehículos, factores de crecimiento o fármacos de interés en la concentración deseada en volúmenes que son menos del 10% de la solución total para evitar diluir el NIS en el 30% medio de expansión.
    4. Lavar cada pozo de la placa de 24 pocillos dos veces con PBS 1 x (5 minutos cada uno). Aspire de 1 x PBS y añadir 450 μL de medio (sin o con factores de crecimiento drogas). Incubar la placa a 37 ° C durante al menos 15 minutos antes de las células de la galjanoplastia.
    5. Para cada experimento, establecido 2-3 pocillos o platos por condición.
    6. PNJs de la placa (ver sección 3.4):
    7. Análisis de síntesis de ADN de NPC: 100.000 células/pozo en una placa bien 24
    8. Entrada en la fase S: plato 500.000 células/35 mm
    9. Ensayo número de células: 50.000 células/pozo en una placa de 24 pocillos
  2. Análisis de precursores neuronales de la célula ADN síntesis
    1. 100.000 células/pozo en una placa de 24 pocillos de la placa y evaluar en condiciones de triplicado.
    2. Añadir criterio radiactivo, [3H]-timidina en el medio de cultivo (1.5 μCi/mL) en cada pocillo h 46 en cultura. Incube las células a 37 ° C por 2 h.
      Nota: Cuando se usa material radiactivo, reciben capacitación de su institución, seguir protocolos de seguridad de radiactividad y deseche materiales radiactivos en los recipientes de basura debidamente designados.
    3. Eliminar correctamente disponer de medios radiactivos después de 2 h. Añadir 300 μL de pre calentado 0.25% tripsina-EDTA (0.5 mM) a cada pocillo e incubar por 20 min a 37 ° C.
    4. Encienda la máquina segador de la célula (ver materiales y equipos sección) y la bomba y asegúrese de que la presión de la bomba es inferior a 200 PSI. Coloque papel de filtro a través del espacio en la cosechadora de la célula y arrancar a la derecha para marcar la orientación del papel.
    5. Colocar tubos de recogida de máquina segador de la célula en una bandeja "en blanco" vacía y pulse prelavado para humedecer el papel filtro. Colocar tubos recogidos en pozos de muestra y ejecutar (Inicio).
    6. Cuando la cosechadora de la célula ha terminado de recoger muestras, levantar la abrazadera y avance de papel de filtro para repetir para todos los conjuntos de muestras. Prelavado siempre en un plato vacío, "en blanco".
    7. Secar el papel filtro en una fuente de luz y configurar viales correspondientes en una bandeja. Perfore chads de papel en los frascos y agregar 2 mL del cóctel de centelleo líquido a cada frasco. Frascos tapa y etiqueta.
    8. Incube los frascos de centelleo líquido coctel para al menos 1 h antes de leer las cuentas por minuto (CPM) en una máquina de centelleo.
  3. Análisis de NPC S-fase entrada
    1. Ver sección 3.4 para obtener los pasos para levantar, disociar, pellets y resuspender las células.
    2. Placa de 500.000 células por plato en los platos de 35 mm en la sección 4.1, sólo 1 plato o condición para este paso.
    3. Agitar platos en todas las direcciones para asegurar una distribución uniforme de las células. Incube las células a 37 ° C durante 46 horas.
    4. Preparar tres placas de 35 mm revestidas con PDL/laminina por condición después de 24 h. Por ejemplo, si hay un plato de 35 mm de Media de expansión de 30% y un plato de 35 mm de Media de expansión de 30% + FGF (10 ng/mL) luego de la capa 6 PDL/laminina placas para uso en el día siguiente.
    5. Añadir 2 μL/mL de 5 mM EdU a culturas después de 46 h. Incubar por 2 h.
    6. Disocian y sedimenten las células (ver sección 3.4). Resuspenda el precipitado de células en 3 mL de medio de expansión de 30% o 3 mL de medio de expansión de 30% + factores de crecimiento deseadas, drogas.
    7. Placa 1 mL por plato platos PDL/laminina prelacado. Agitar platos en todas las direcciones para asegurar una distribución uniforme de las células. Incubar a 37 ° C por 2 h para permitir que las células se adhieran al plato. Vea la figura 2 para una línea de tiempo simplificada.
  4. Análisis de la entrada en la fase S
    1. Fijar platos con helada 4% paraformaldehido (PFA en PBS 1 x) por 20 min. Luego, lavar los platos 3 veces durante 5 minutos con PBS 1 x.
    2. Añadir 1 mL de PBS 1 x con 0.05% de azida sódica para prevenir el crecimiento de bacterianos y hongo. Las células pueden almacenarse a 4 ° C hasta 6 meses si platos (sellados con parafilm) se mantienen en el PBS + sodio solución de azida, aunque no todo inmunológicos antígenos son conservados después de largas demoras en el análisis.
    3. Análisis de las células mediante una reacción de EdU comercial kit (ver protocolo del fabricante). Tinción con DAPI u otro marcador nuclear de las células y la imagen utilizando microscopía de fluorescencia.
    4. Evaluar la proporción de células positivas de EdU sobre ciego de (número total de la célula) de células vivas total en 10 campos sistemáticamente al azar (10 x). En el análisis no incluyen las células muertas.
    5. Utilizar tanto imágenes de contraste de fase e imágenes fluorescentes para determinar la coloración positiva de EdU y comprobar que las células están muertas o vivos (figura 3).
    6. Cuenta todas las celdas que tienen ambos liso e incluso la membrana de la célula en ajustes de contraste de fase y un gran núcleo no fragmentado por nuclear fluorescente DAPI manchan, estas células son vivo (Figura 3A-B).
    7. Excluir todas las celdas que son fase brillante, tienen una membrana de la célula irregular rota y un núcleo pequeño, condensado como visualizado por fluorescente DAPI la proyección de imagen, ya que estas células son muertas (Figura 3A-B). Evaluar células vivas para la expresión de EdU mediante la identificación de las células que tienen EdU fluorescente brillante mancha que cubre el núcleo entero o tinción fluorescente manchado en el núcleo (figura 3).
  5. Ensayo de número de células NPC
    1. Después de 2 días en la cultura, la etiqueta y preparar tubos de microcentrífuga de 1,5 mL y 0.5 mL a tubos de microcentrífuga. En cada tubo 0.5 mL, añadir 5 μL de azul tripán.
    2. En cada pocillo de una placa de la pozo 24, quite medio y añada 200 μL de 1 x solución de separación celular y lugar en incubadora durante 10 a 15 min.
    3. Después del tiempo asignado, una vez que las células han levantado, agregue la cantidad deseada de 1 x PBS a cada pocillo.
      Nota: Por lo general, en el día 2, añadir 300 μL de PBS 1 x a las células así que contiene más de 200 μL de la solución de separación, para un volumen total de 500 μL. Con el tiempo de incubación adicional de la cultura, como las células se convierten más confluentes, aumentar el volumen de dilución según sea necesario. Por ejemplo, en el día 4, Añadir 500 μL de 1 x PBS y el día 6, añadir 800 μL de PBS 1 x. Volumen total serán 700 μL y 1 mL, respectivamente.
    4. Con una pipeta P-1000, pipeta hacia arriba y hacia abajo en cada pozo de 4 a 5 veces para eliminar las células. Examinar la placa bajo un microscopio para asegurarse de que todas las células se han separado. Transferir las células a tubos de 1,5 mL.
    5. Invertir a tubos de 1,5 mL con células diluidos 2 a 3 veces. Luego tomar 50 μL alícuotas de células desde el centro del tubo y añadir a los tubos de 0.5 mL con azul de tripán (véase 4.5.1).
    6. Pipeta de la célula solución arriba y abajo de 2 a 3 veces. Añadir las células al hemocitómetro y analizar inmediatamente. La espera de más de 10 minutos puede incrementar la muerte celular o la presencia de células que se han tomado con azul de tripano.
    7. Cuidadosamente añadir 10 μl de células + mezcla de azul de tripano a cada lado del hemocitómetro para realizar recuentos de replicar. Contar las células con el microscopio de contraste de fase. No cuentan las células muertas o las células azul oscuras que han tomado con azul de tripano.
    8. Para obtener el uso número, célula total el promedio celular número contados a partir de las 4 esquinas del hemocitómetro y aplicar la siguiente ecuación:
      Significa el número de células x volumen (mL) x 10,000 de los medios de comunicación = número Total células/bien
    9. Aspire y repita el procedimiento en pozos restantes. Cambiar los medios de comunicación en las células que no se cuentan, cada análisis de repetición 48 h. en días 4 y 6.

5. NPC Neurite ensayo

  1. Preparación de platos y medios para análisis de neurita
    1. Hacer una solución de poly-d-lisina (PDL) en dH2O 1 mg/mL y esterilizar un filtro. Diluir 1:10 en dH2O para hacer una solución PDL de 0,1 mg/mL y añadir 1 mL a cada plato de 35 mm. Incubar por 20 min a TA.
    2. Mientras tanto, preparar medios de expansión de 30% (ver sección 3.5) y añadir 5 μg/mL (5 μl/mL) de solución de fibronectina (stock de 1 mg/mL) a los medios de comunicación.
    3. Una vez que los medios de comunicación está preparado, agregar vehículos, factores de crecimiento o medicamentos de interés en las concentraciones deseadas.
      Nota: Lo mejor es agregar vehículo, factores de crecimiento o fármacos, en volúmenes < 10% de la solución total para evitar diluir la fibronectina y otros componentes en el medio de expansión de 30%.
    4. Después de 20 minutos, lavar platos PDL 3 veces durante 5 min con dH2O quitar exceso PDL. Asegúrese de platos estén secos antes de agregar los medios de comunicación.
    5. Coloque 1 mL de media (con o sin factores de crecimiento drogas) + solución de fibronectina en cada plato cubierto de PDL.
    6. Incubar placas a 37 ° C durante al menos 30 min antes de platear las células para asegurar el correcto acoplamiento de la fibronectina a la PDL.
    7. Para cada experimento, establecido 2-3 platos por condición (por ejemplo, 3 que contiene el vehículo platos, 3 platos que contienen la droga).
  2. PNJs de la galjanoplastia para ensayo de neurita
    1. Ver sección 3.4 para obtener los pasos para levantar, disociar, pellets y resuspender las células.
    2. Placa de 50.000 células por plato en los platos preparados en la sección 5.1. Agitar platos en todas las direcciones para asegurar una distribución uniforme de las células.
    3. Incube las células a 37 ° C durante 48 h.
  3. Análisis de neuritas
    1. Después de las células durante 48 h de incubación, aspirar medio y fijar platos con hielo frío 4% PFA por 20 min.
    2. Después de 20 minutos, lavar los platos 3 veces durante 5 minutos con PBS 1 x. Después del último lavado, añade 1 mL de PBS 1 x con 0.05% de azida sódica.
    3. Analizar platos ciegamente en un microscopio de contraste de fase a 32 X. Cuenta de células totales y células con neurites en 3, filas de 1 cm, elegidos al azar posiciones pero reproducibles. Contar un mínimo de 150 células por plato para asegurar la adecuada toma de muestras.
      Nota: Una neurita se define como una extensión (proceso) del cuerpo de la célula que es > 2 diámetros del cuerpo de la célula en longitud. Células con múltiples procesos, se considera el proceso más largo para el criterio. Células con procesos que son < cuerpo de la célula 2 diámetros de longitud no están incluidos (figura 4).
    4. Sume el número total de células y el número total de células con neurites en cada plato. Calcular el % de células con neuritas. Media del porcentaje de células con neurites en platos repetidos. Confianza en reproducibilidad experimental se establece cuando todos los registros dentro de cada plato son similares, y promedios entre platos son muy similares, con el error estándar de la media (SEM) < 10%.
    5. Por otra parte, analizar neurites realizando immunocytochemistry para marcadores tales como beta-III-tubulina (TUJ1) o MAP2. Después de la tinción para el marcador de interés, tomar 10 imágenes sistemáticamente al azar en un microscopio de fluorescencia a 10 X. Imagen por lo menos 200 células. En este caso, adquirir las imágenes no demasiado cerca del borde del plato. Analizar el porcentaje de células con neuritas TUJ1 o MAP2 + (vea la figura 10 por ejemplo).

6. NPC desarrolló análisis de migración

  1. Desarrolló la formación
    1. Añadir 1 mL de 100% medios de expansión en una placa de 35 mm con ningún sustrato de capa. Incubar platos durante al menos 15 min a 37 ° C antes de galjanoplastia NPCs. Prepare platos de 2-3 para asegurarse de que hay suficiente neuroesferas para el ensayo de migración celular.
      Nota: La ausencia de un sustrato de la capa asegura que NPCs permanecen suspendidas en los medios de comunicación, que es esencial para la formación desarrolló. Platos de capa evitará que desarrolló la formación.
    2. Vea sección 3.4 pasos para levantar, disociar y las células de la pelotilla. Resuspender el precipitado de células en 2-5 mL con 100% Media expansión. Placa de 1 millón de NPCs en cada plato de 35 mm en la sección 6.1.1.
    3. Incubar NPCs a 37 ° C durante 48 a 96 h permitir NPCs neuroesferas agregado y forma. Evaluar el tamaño de la esfera utilizando una regla vivo en un microscopio de contraste de fase. Espere más esferas llegar a un diámetro aproximado de 100 μm (± 20 μm) (figura 5). Esferas más pequeñas se dispersará totalmente y se romperán durante el ensayo de migración.
  2. Preparación de placas para el ensayo de migración desarrolló
    1. Disolver alícuotas de gel ECM-mimic (véase sección 3.2) en 6 mL de medio de expansión de 30%. Gel/30% una vez ECM-imitador se prepara solución de expansión Media, añadir vehículos, factores de crecimiento o medicamentos de interés en las concentraciones deseadas.
      Nota: Vehículo, droga y concentraciones de factor de crecimiento necesitan incrementarse para tener en cuenta la adición de 200 μL de neuroesferas en la sección 6.3.
    2. Placa 1 mL del ECM-mimic gel solución de expansión Media de 30% (± vehículos, factores de crecimiento o medicamentos) en un pocillo de una placa de 6 pozos. Haga 2-3 por condición experimental. Alternativamente, pueden utilizarse platos de 35-mm. Incubar las placas durante al menos 30 min a 37 ° C.
      Nota: No aspirar la gel/30% ECM-mimic solución de Media expansión para este ensayo. Galjanoplastia de esferas en un gel de ECM-Mimic aspirado provocará migración rápida y exceso.
  3. Galjanoplastia de neuroesferas
    1. Recoger neuroesferas formado en la sección 6.1 y colocarlos en un tubo cónico. Lave el 35 mm se recogen platos con 1 mL de 1 x PBS para todos neuroesferas. Desactivación de las neuroesferas recogido a 100 x g durante 5 minutos.
    2. Vuelva a suspender las neuroesferas en 1-3 mL de precalentado 30% Media expansión. Si se recoge 1 plato de neuroesferas, 1 mL de medio se utiliza para volver a suspender las esferas. Si se recogen 2 platos, se agregan 2 mL de medio para suspender de nuevo las esferas, etc. pipetee suavemente y utilizar sólo un P-1000 para esferas no están rotas.
    3. Placa de 200 μL de las neuroesferas resuspendidos en la gel/30% ECM-mimic solución de expansión en la sección 6.2. Placas de roca en todas las direcciones para distribuir uniformemente las neuroesferas. Incubar las placas durante 48 h a 37° C.
    4. Quite la solución de expansión Media de gel/30% de ECM-mimic y células en 4% PFA, lavado y mantener las células en 1 x PBS + 0.05% de azida sódica.
  4. Análisis de neuroesferas
    1. Adquirir imágenes de neuroesferas todo con ajustes de contraste de fase 10 X. Asegúrese de que las esferas no toquen entre sí. Medir la migración promedio utilizando el software ImageJ.
    2. Trace el contorno externo de la desarrolló con la herramienta de línea a mano alzada. La línea a mano alzada puede accederse haciendo clic derecho sobre el icono de "recta". Manualmente rastro usando un ratón.
    3. Utilice la función de medida para calcular el área de la traza. Asegúrese de selecciona "área" como una lectura en la ventana de "Establecer medidas" encontrada bajo la pestaña analizar. Vea la figura 6 para seguimiento de contorno exterior en azul.
    4. Seguimiento de la masa celular interna de la esfera y medida. Vea la figura 6 para seguimiento de contorno interior en rojo. Cuantificar la migración promedio restando la masa celular interna de la zona total desarrolló.
    5. Neuroesferas medida que muestran una masa celular interna densamente con las células que migran hacia fuera como una alfombra contigua (figura 6).
    6. No incluyen las células fuera de la alfombra o de la desarrolló para la medición. Vea la figura 6 ejemplos de células (un círculo blanco) que se excluyen de la medida de alfombra exterior. Analizar un mínimo de 20 neuroesferas para cada condición.

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Representative Results

Uno de los objetivos de estos estudios es definir la actividad proliferativa de los PNJs, es decir, un aumento en el número de células. Esto se logra mediante la evaluación de la síntesis de ADN de la población celular total, un enfoque de alto rendimiento que mide la incorporación de timidina tritiado de trazador radioactivo en extractos celulares y refleja todas las células en fase S, ya sean sintetizar por 5 minutos o las dos horas enteras. Además, estos ensayos permiten la determinación de la proporción de células que entran en fase S y un número total de células, un análisis más intensivo de las células. Las células sintetizan ADN en fase S, un paso que precede a mitosis y división celular, que debe ocurrir con el fin de aumentar el número de células. Ya que estos procesos toman tiempo, cambios en la síntesis de ADN evaluados a las 48 horas no pueden ser asociados con cambios en el número de células en este momento. Sin embargo, se encontró que cambios en la síntesis de ADN a las 48 horas predicen confiablemente aumentos del número de células en los días 4 y 6.

En la evaluación de la síntesis de ADN, las células son plateadas con una densidad de 100.000 células (~ 50% confluente) en una placa de 24 pocillos y se les permite crecer durante 48 horas antes de hacer las mediciones. Usando esta densidad asegura que las células se asemejan a su entorno de monocapa, pero también no crecen tan rápido en un período de 48 horas que los medios de comunicación se convierte en demasiado ácido. Los medios de comunicación que es demasiado ácida pueden afectar significativamente el metabolismo de la célula y así, alterar los resultados de la proliferación. Si las líneas celulares específicas son altamente proliferativas, el investigador debe considerar modificar la densidad de la célula, volumen de medios de comunicación, o intercambio de media frecuencia para prevenir las condiciones altamente ácidas. Si se cambian las condiciones, es fundamental ser constante cuando se comparan diferentes líneas celulares debido a cambios dependientes contacto célula a célula sin duda afectarán las tasas de crecimiento. El diseño sencillo de estos ensayos nos permite probar diferentes factores de crecimiento. Como se ve en la figura 7, la adición de factor de crecimiento fibroblástico (FGF, 10 ng/mL) por 48 horas aumenta la síntesis de ADN por ~ 40%. Además, el análisis de la síntesis de ADN es reproducible como todos los clones y personas muestran un aumento en la síntesis de ADN después de la estimulación de la FGF. El potencial de variabilidad de la línea de base y FGF estimula la síntesis de ADN entre diferentes individuos no afectados, así como el potencial de variabilidad clonal en el mismo individuo se demuestra en la tabla 1. Debido a esta variabilidad, es importante probar varios clones de iPSC por persona, así como evaluar un mínimo de 3 a 5 líneas NPC derivadas de cada clon de iPSC diferentes. Se realizó un mínimo de 3 experimentos para cada línea NPC.

El análisis de la síntesis de ADN nos permite evaluar rápidamente numerosos grupos experimentales en forma de alto rendimiento y la medida refleja la suma total de la síntesis de ADN independientemente de la duración de la fase S (a 5 minutos a 2 horas). Para definir la proporción de células en fase S, se empleó la prueba de entrada de fase S. Para este ensayo, las células se cultivan en la misma densidad como se mencionó anteriormente permitir monocapa-como dinámica que se produzca, pero luego son disociados después de 2 días y permitió brevemente se adhieren a las placas para llevar a cabo análisis unicelular. Puede ser difícil debido a alto contacto de célula a célula y variabilidad regional en la placa de recuento de células en una monocapa. Este paradigma nos permite modelar las células como una monocapa y luego analizarlos como células individuales. También actúa como una confirmación metodológicamente independiente de los datos obtenidos en el ensayo de síntesis de ADN. Como se ve en la figura 8, 48 horas de estimulación de FGF (10 ng/mL) aumenta la proporción de células en fase S por ~ 25%.

Evaluar el número de células, se utiliza una menor densidad de células que en los ensayos antes mencionados, con 50.000 células ser plateadas por pozo de 24 bien placa. Otra vez, esta densidad fue elegida para que más líneas celulares no crecen tan rápidamente durante el período de 6 días que el pH del medio se convierte en demasiado ácido y se vuelve amarillo. En la figura 9, mientras que el número de células no sean significativamente diferente entre los grupos FGF (10 ng/mL) y control en 2 días, los cambios en la síntesis de ADN a las 48 h (figura 7) son predictivos de los cambios en el número de células en 4 y 6 días.

Mientras que el PNJ se cultiva normalmente en alta densidad, el ensayo de neurita se lleva a cabo con una densidad de 50.000 células plateado en una placa de 35 mm con el fin de evaluar las células. Incluso a esta baja densidad, el NPC culturas expresan citoesqueleto proteínas y factores de transcripción de NPCs como NESTIN, SOX2 y PAX6 (figura 10 A-D). Esto indica que una baja densidad de cultivo no alterar significativamente sino de la célula en este período de tiempo. Por otra parte, condiciones similares de baja densidad han sido utilizadas en los sistemas de cultivo de rata y el ratón para detectar fenotipos que fueron en definitiva reproducible en vivo16,17,18,19, 20,21,22,23. Después de 48 horas de incubación, una pequeña proporción de NPCs comienzan a extender neurites como se ve en la Figura 11A y B y cuantificado en el gráfico de la figura 11. La proporción de células que se extienden de neuritas, la longitud de las neuritas y el número de neuritas celular puede medirse para evaluar los parámetros del desarrollo. Para evaluar con precisión el porcentaje de células con neurite consecuencia, es importante que las células se platean como células individuales o grupos de < 5 células y no como grandes agregados. Como se ve en la figura 10 E-F, células teniendo neuritas (flecha blanca) también expresan tubulina beta III de marcador neuronal inmaduro (TUJ1). Como se mencionó en los métodos, pueden adquirirse imágenes fluorescentes de TUJ1 manchado NPCs y luego estas imágenes pueden ser contadas para la proporción de TUJ1 + neurites para asegurar el origen neuronal de los procesos. En nuestro laboratorio, el análisis por cualquiera de los métodos han dado resultados estadísticamente similares.

El diseño simple y a la naturaleza rápida del ensayo neurite también permiten probar los efectos de desarrollo relevantes factores de crecimiento, citocinas y péptidos. Por ejemplo, la figura 11 muestra que el neuropéptido pituitaria adenilato ciclasa polipéptido que activa (PACAP, 3 nM) aumentos neurite consecuencia en NPCs. PACAP es un factor de desarrollo importante que tiene gran expresión en el SNC y se ha demostrado que ser importante en el desarrollo cerebral. Estudios de roedores en nuestro laboratorio y otros laboratorios han encontrado que el PACAP tiene generalizadas dependen de la etapa desarrollo efectos como regular neurite consecuencia, la migración y la proliferación tanto del cerebelo y cerebro anterior16,22, 29,30,31. Estudios recientes por Ataman et al. (2016) usando cultivados humanos células corticales fetales indican que la actividad neuronal provoca un aumento de 9-fold en la expresión génica PACAP, indicando la importancia de los péptidos en el desarrollo neuronal humano32. De hecho, la tabla 2 muestra el porcentaje de neuritas en control y PACAP (3 nM) entre numerosas líneas derivadas de individuos no afectados. Como se ve en la tabla 2, existe cierta variabilidad en el porcentaje de neurites expresados en líneas celulares derivadas de diferentes clones del mismo individuo y de NPCs derivados de diferentes individuos. Sin embargo, estos individuos no afectados tienen un aumento en consecuencia del neurite en respuesta al PACAP, indicando que la reproducibilidad de los ensayos.

Como consecuencia del neurite, migración celular es un proceso importante de desarrollo esencial para la correcta conexión, organización y cableado del cerebro. Neuroesferas nos permiten estudiar la migración de NPC en una condición de alta densidad típica que mantiene un contacto célula-célula entre NPCs (figura 12). Los factores pertinentes al desarrollo también pueden ser probados en neuroesferas para evaluar sus efectos sobre la migración. Por ejemplo, la figura 12 muestra que el PACAP (10 nM) aumenta la migración de los NPCs.

Figure 1
Figura 1: NPCs en el paso 3. NPCs en el P3 expresan múltiples marcadores específicos de etapa incluyendo (A) factor de transcripción pluripotenciales, SOX2 (B) factor de transcripción específico de forebrain NPCs, PAX6, y proteína citoesquelética NPC NESTIN. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: esquema de ensayo de entrada de fase S. Línea de tiempo de entrada en la fase S ensayo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: cuantificación de la entrada en la fase S. (A) fase de imagen mostrando fase oscura vivo células (flechas blancas), una célula muerta fase brillante (estrella blanca) y un fase brillante vivo de la célula (flecha verde). (B) mancha fluorescente DAPI mostrando núcleo condensado en una célula muerta (estrella blanca) y núcleos grandes en una célula viva (flechas blancas y verdes). (C) EdU fluorescente imagen brillante EdU núcleos positivos (flecha roja) y moteados EdU núcleos positivos (estrella roja). (D) fase y fluorescente fusión de imágenes 3A - 3C.

Figure 4
Figura 4: identificación de neuritas. Imágenes de contraste de fase de NPCs. (A) A la célula con un proceso de > 2 cuerpos de la célula en longitud, cumpliendo así el criterio de una neurita. (B) una célula con un proceso < 2 cuerpos de la célula, y por lo tanto no se consideran neurita-cojinete. (C) representa una célula con 2 procesos-se evalúa el proceso más largo para el criterio de la neurita. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: selección de neuroesferas para ensayo migración. Imagen de contraste de fase (A) de un campo representativo de neuroesferas en 24 h. esferas son todos menos de 100 μm y por lo tanto, no se recogen para el ensayo de migración. (B) imagen de contraste de fase de un campo representativo de neuroesferas a las 72 h. Todas las esferas están dentro de las 100 μm ± 20 μm rango, indicando que están listos para ser recogidos para el análisis de la migración.

Figure 6
Figura 6: cuantificación de la migración. (A) imagen de contraste de fase de un representante desarrolló. (B) contorno azul muestra la traza para medir área total desarrolló. Rojo muestra el contorno usado para medir el área de la célula interna masiva. Migración se define como área total de desarrolló total área interior de la célula. Nota, los círculos blancos muestran las células que no están en una alfombra contigua, como estas células quedan excluidas de los contornos de la migración. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: evaluación de la síntesis de ADN. Resultados representativos de control versus tratamiento FGF NPCs. FGF (10 ng/mL) aumenta la síntesis de ADN a las 48 h (p ≤ 1 x 10-3). (n = 2-4 pozos/grupo/experimento; 3 experimentos). Barras de error representan SEM.

Figure 8
Figura 8: proporción de células en fase S. Imágenes de contraste de fase (A) de las células NPC se incubaron en control versus medios tratados de FGF (10 ng/mL) para 48 h. márgenes representan mayor imágenes de aumento de células teñidas para marcador fluorescente de EdU en el control y 10 ng/mL FGF los medios de comunicación. Flechas rojas indican las células que son EdU positivas y blanco las flechas indican células que son negativos de EdU. (B) gráfica de resultados representativos de control versus FGF (10 ng/mL) tratamiento NPCs. FGF aumenta S fase entrada en 48 h (p ≤ 1 x 10-3). (n = 2-4 platos/grupo/experimento; 3 experimentos). Barras de error representan SEM.

Figure 9
Figura 9: la enumeración de las células en los días 2, 4 y 6. (A) fase de imágenes de contraste de las células en el control y los medios tratados de FGF (10 ng/mL) a los días 2, 4 y 6. (B) gráfica de resultados representativos; Nota que FGF (10 ng/mL) no siempre aumenta el número de células en 2 días, pero a los días 4 y 6 aumentos son evidentes (p ≤0. 05). (n = 2-4 pozos/grupo/experimento; 3 experimentos). Barras de error representan SEM.

Figure 10
Figura 10: caracterización de personajes no jugadores en condiciones de baja densidad. (A, C, E) Imágenes de contraste de fase de NPCs en condiciones de baja densidad. (B) NPCs expresan marcadores de células madre/progenitoras NESTINA (verde), SOX2 (rojo) y el marcador nuclear DAPI (azul). (D) PAX6 (rojo), DAPI (azul). (F) a baja densidad, células extensión de neuritas (flecha blanca) también expresan inmadurez neuronal marcador TUJ1 (verde). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 11
Figura 11: consecuencia del Neurite. (A) imagen de contraste de fase de NPCs. Las flechas negras indican las células con neuritas. (B) adición de neuropéptido PACAP (3 nM) aumenta el porcentaje de células con neuritas (p ≤ 1 x 10-2). (C) cuantificación de la consecuencia del neurite en 3 nM PACAP que contienen los medios de comunicación y control. (n = 2-4 platos/grupo/experimento; 3 experimentos). Barras de error representan SEM.

Figure 12
Figura 12: desarrolló la migración. (A) imágenes de neuroesferas de contraste de fase. (B) adición de PACAP (10 nM) aumenta la migración celular de desarrolló (p ≤10-2) (C) la cuantificación de la migración de la célula. (n = 20 esferas/grupo/experimento, 3 experimentos). Barras de error representan SEM.

Los medios de comunicación
Paciente # La copia CTRL FGF
(10 ng/mL)
Paciente 1 1 21.853 47.538
2 20.336 38.070
Paciente 2 1 7.664 14.060
2 16.573 30.087

Tabla 1: La síntesis de ADN. Un resumen de los valores de la síntesis de ADN (en CPM) de NPCs deriva de dos clones de iPSC por dos individuos no afectados.

Los medios de comunicación
Paciente # La copia CTRL PACAP
(3 nM)
Paciente 1 1 13.60% 18.10%
2 16.50% 21.10%
Paciente 2 1 8,90% 14.10%
2 14.20% 21.10%

Tabla 2: Porcentaje de células con neuritas. Un resumen del porcentaje de células teniendo neurites en NPCs deriva de dos clones de iPSC por dos individuos no afectados.

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Discussion

Los protocolos presentados aquí ilustran métodos rápidos y simples para estudiar los procesos fundamentales del desarrollo neurológico y factores de crecimiento y fármacos mediante células precursoras neuronales derivados de hiPSC. hiPSC tecnología ha revolucionado el estudio de la patogénesis de las enfermedades del neurodesarrollo nos proporciona un acceso sin precedentes a vivir las células neuronales humanas de los individuos afectados. De hecho, se han realizado numerosos estudios hiPSC de trastornos del desarrollo neurológico como el síndrome de Rett, síndrome de Timothy, síndrome frágil-X, y esquizofrenia, que han desenterrado las aberraciones de enfermedades específicas en las dendritas, sinapsis, neuronales y función4,33,34,35,36. La mayoría de estos estudios ha centrado sobre todo en terminal distinguido, poste-mitotic neuronas que, aunque se considera relativamente funcionalmente inmaduro, excluye el estudio del neurodesarrollo anterior procesos como la proliferación y migración. Estos últimos procesos han sido fuertemente implicados en la patogénesis de trastornos del neurodesarrollo y orden de otro estudio de8,9,10,11,12 , 35 , 37 , 38. el uso de NPCs nos permite estudiar estos importantes acontecimientos anteriores mientras que también proporciona la oportunidad de investigar los procesos más maduros como la capacidad de las células para extender axones inmaduras/dendritas (neuritas). Además, algunos de estos ensayos pueden extenderse también para estudiar otros parámetros como longitud de neurita, número y ramificación o la más distancia recorrida por una célula.

Algunos estudios más recientes han utilizado sistemas de modelo organoide para eventos antes del desarrollo en un 3-d "sistema mini-brain"1,39,40. Sin embargo, incluso en estos sistemas de organoide, la población de células precursoras proliferativa es limitada y temprana maduración y migración son difíciles de estudiar15,39. Además de limitar el estudio de los anteriores fenómenos del desarrollo, el uso de terminales diferenciadas neuronas u organitas es a menudo costoso, desperdiciador de tiempo y limita el número de variables que pueden ser evaluadas en el sistema. Esto es porque las neuronas y organitas pueden requerir protocolos de inducción viral, incubadoras especiales y equipo, varias semanas de tiempo y grandes cantidades de medios de comunicación. En cambio, con la excepción del ensayo de síntesis de ADN (que se trata más adelante abajo), este protocolo puede ser fácilmente aplicado al estudio de trastornos del neurodesarrollo y no requieren un entrenamiento extensivo, costosas herramientas y recursos o software. La facilidad y costo relativamente bajo de la adición de medicamentos y factores de crecimiento en estos ensayos, hacer que esta tecnología de protocolo un alto rendimiento útil para probar varios tratamientos posibles para el desarrollo neurológico y enfermedades neuropsiquiátricas. Por otra parte, puesto que el acto de factores de crecimiento a través de definir vías de señalización celulares, pueden también ser utilizados como herramientas para probar el potencial de defectos en el desarrollo de sistemas de señalización. Finalmente, como NPCs son una población auto renovación proliferativa, grandes cantidades de células pueden ser producidas y cryopreserved experimentos que permite llevar a cabo eficientemente sin tener que hacer NPCs de iPSCs cada vez.

Para emplear con éxito estas pruebas, es importante tener en cuenta los siguientes pasos críticos. Este protocolo pone NPCs en distintas condiciones de mantenimiento y expansión versus experimentación. Específicamente, mientras que los PNJ es inducido, crecido y pasados en medio que contiene nervios inducción suplemento (NIS), nuestras condiciones experimentales reducen el suplemento en un 70%, que coloca a las células en un ambiente limitante, que nos permite la oportunidad de agregar nuevo y probar los efectos de factores de crecimiento importantes. En segundo lugar, es esencial para mantener el paso de los PNJs. En nuestros estudios, generalmente hemos restringido número de paso de las líneas celulares de P3 - P8. En pasajes anteriores a P3, algunas líneas no robusta expresan marcadores característicos. En los pasajes más altos, mientras que algunas líneas celulares tienen tasas de crecimiento muy consistente o respuestas a factores de crecimiento, otras líneas celulares pueden tener cambios dramáticos en crecimiento de la célula o respuesta. Aunque no sistemáticamente, nosotros y muchos otros hemos experimentado este cambio dramático en proliferativas precios en los pasajes más altos. La razón para esto es incierto, pero este cambio puede reflejar una capacidad limitada de auto renovación de NPCs. definir por qué y cómo las tasas de proliferación cambian sobre pasajes extendidos puede proporcionar penetraciones en el desarrollo y patogénesis de la enfermedad, pero más investigación tendrá que hacerse. Finalmente, el protocolo de inducción neural comercial que estamos utilizando a veces puede producir células madre neurales de mala calidad, sobre todo si las partida iPSCs no son de alta calidad (es decir., se diferenciar las células en las fronteras de las colonias de células, anomalías del cariotipo). En algunos casos, se distorsiona la morfología celular y expresión de marcadores no está presente. No utilice estas culturas. En otros casos, NPCs crecen con más células de "contaminante", que pueden eliminarse con un tratamiento de solución de separación celular diferencial para asegurar poblaciones casi puras de NPC antes de su uso en experimentos. PNJs de la alta calidad es crítica para obtener resultados adecuados: vea sección un enlace a un protocolo de inducción Neural donde se pueden encontrar imágenes de PNJs de alta y baja calidad de los materiales y equipos.

Para cada uno de los ensayos presentados, es importante tener en cuenta los siguientes pasos críticos, posibles errores y consejos para solucionar problemas. Para el numero de celular, la síntesis de ADN y ensayos de neurite, es importante para las células de la placa como disociaron las células y no como grupos, como esto pueden sesgar medidas de síntesis de ADN, un recuento y neurita comportamiento. Para asegurar que no se platean grumos de células, un volumen pequeño de células con una P1000, placa en un portaobjetos, la muestra y compruebe si existen grupos de células. Si se observan grumos, pipetear celdas hacia arriba y hacia abajo para romper manualmente matas apartes antes de la galjanoplastia. Para la síntesis de ADN y el análisis del número de celular, las células se levantan con enzimas para el conteo y análisis. Es fundamental para confirmar visualmente las células han sacado totalmente de la nave de cultura para obtener la cuenta exacta y si es necesario, pueden utilizarse más largos períodos de incubación de la enzima. En el caso de recuento bajo o bajo CPM para el ensayo de síntesis de ADN, las células se pueden platear en mayores densidades iniciales, Origanum radiactivo [3H] - timidina puede ser añadido para doble el tiempo (4 horas en lugar de 2), u Origanum [3H] - timidina concentración puede ser doblada. Para el análisis de la neurita, densidad de placas inicial puede ser doblado sin arriesgar mayor contacto de célula a célula. Prestar atención a la distribución de células en un plato y contar filas de 1 cm que se muestrea cada parte del plato. Si el porcentaje de neurita es demasiado bajo en 48 h, el análisis puede extenderse hasta 6 días o el tipo de sustrato de la capa o concentración puede cambiarse para promover la mayor porcentaje de neuritas. Sin embargo, es importante tener en cuenta que los tiempos de capa y métodos que hemos presentado en el protocolo se seleccionaron para óptima neurite consecuencia y celular salud después de probar numerosos sustratos diferentes concentraciones de sustrato y veces capa. Para el análisis de desarrolló, uso de pipetas pequeñas (P20, P200) puede llevar a la corte y rotura de las esferas más grandes. Por lo tanto, es imperativo que pipetear es hecho con cuidado y con una P1000 o una pipeta serológica. Para la granulación de las neuroesferas, velocidades más bajas (100 g de x en vez de 300 x g) también se recomiendan para prevenir la disociación desarrolló. Durante chapado esfera, asegúrese de que las esferas apropiadamente son espaciadas como contacto de esfera a esfera puede influir en la migración. En casos donde la migración es demasiado rápido o demasiado lento, tiempo de incubación puede ser reducida o aumentada respectivamente. Sustratos de la capa también pueden ser modificados para cambiar tasas de migración.

Mientras que las técnicas utilizadas son rápido, simple y aplicable al estudio de trastornos del neurodesarrollo, hay ciertas limitaciones. ¿Por ejemplo, muchos de los análisis presentados (ensayo número celular, neurite ensayo, ensayo de migración) requieren los investigadores a tomar decisiones subjetivas (p. ej., esto es una neurita? Es esta célula muerta?) puede conducir a sesgos del investigador y reproducibilidad inferior. Sin embargo, llevar a cabo análisis ciegos y establecimiento de normas estrictas para cada decisión tomada dentro de un ensayo, como se ilustra en los métodos, puede mejorar estos sesgos. Asimismo, estos ensayos requieren mediciones manuales y cuentas, que pueden ser desperdiciador de tiempo y mano de obra intensiva. Sin embargo, en los laboratorios que tienen el equipo y recursos técnicos, estos ensayos pueden ser acelerados con el uso de contadores celulares automatizados y programas que pueden llevar a cabo mediciones automatizadas41,42. En el caso del ensayo de síntesis de ADN, estos métodos son específicos de nuestra máquina de la máquina segador y centelleo de celular (ver materiales y equipos); sin embargo, hay otros modelos disponibles y los métodos que pueden utilizarse para obtener la misma información, como la cosechadora de la célula de Omnifilter-95. Para algunas instituciones, el uso de las fuentes radiactivas puede no ser factible. En este caso, un método alternativo usando una timidina fluorescente analógica, como EdU, analizada en un lector de microplacas fluorescente, permitirá para la adquisición de la misma información en el análisis de la mayor parte de ADN síntesis44.

Nuestro sistema de cultura baja densidad separa NPCs en células individuales o grupos pequeños, una condición que difiere de lo densamente de NPCs en el tubo neural en desarrollo. Sin embargo, los PNJs están sanos y expresados marcadores apropiados (figura 1, figura 10). Además, nuestros estudios previos de ratón y rata culturas corticales que muestra en paralelo los resultados en cultivos en vitro y en vivo los modelos indican la utilidad y el valor de la utilización de este enfoque16,17,18 , 19 , 24. Además, este sistema ofrece un poderoso enfoque para entender la maduración de las células y estudiar las subpoblaciones celulares. Por ejemplo, puede realizarse inmunohistoquímica en el ensayo de neurite para determinar qué tipo de célula neuronal específica está extendiendo una neurita. En definitiva, a pesar de algunas limitaciones, este protocolo único proporciona métodos sencillos, potentes y rápidos para estudiar trastornos del neurodesarrollo.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por el Consejo del gobernador de Nueva Jersey para investigación médica y el tratamiento del autismo (CAUT13APS010; CAUT14APL031; CAUT15APL041), Nancy Lurie marca Family Foundation, Mindworks fondo plomo benéfico y la Fundación de la comunidad judía de Nueva Jersey mayor de MetroWest.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PSC Neural Induction Medium:
Protocol Link: https://goo.gl/euub7a 		 ThermoFischer Scientific A1647801 This is a kit that consists of Neurobasal (NB) medium and a 50x Neural Induction Supplement (NIS). The NIS is used to make 1X Neural Induction Medium and 100% Expansion Medium
Advanced DMEM/F12 Medium ThermoFischer Scientific 12634-010 Component of 100% Expansion Medium
Neurobasal Medium ThermoFischer Scientific 21103049 Component of both NIM and 100% Expansion Medium 
hESC-qualified Matrigel Corning 354277 hESC-qualified extracellular matrix-mimic gel (ECM-mimic gel) 
Y-27632 (2HCl), 1 mg Stem Cell Technologies 72302 ROCK inhibitor
6 well plates Corning COR-3506 Polystyrene plates used for NPC maintenance and for Neurosphere Migration Assay 
24 well plates ThermoFischer Scientific 2021-05 Polystyrene plates: Used for NPC DNA Synthesis Assay
35 mm dishes ThermoFischer Scientific 2021-01 Polystyrene plates: Used for NPC S-Phase Entry and Neurite Assay
Natural Mouse Laminin Invitrogen 23017-015 Substrate for coating plates: Used for NPC DNA Synthesis, S-Phase Entry, and Cell Number Assays
Fibronectin Sigma F1141 Substrate for coating plates: Used for Neurite Assay 
Poly-D-Lysine Sigma P0899 Substrate for coating plates
Penicillin/Streptomycin ThermoFischer Scientific 15140122 Antibiotic, component of NIM, 100% Expansion and 30% Expansion Media 
StemPro Accutase Gibco A11105-01 1X Cell Detachment Solution 
2.5% Trypsin (10X) Gibco 15090-046 10X enzymatic solution
0.5 M EDTA ThermoFischer Scientific AM9261 used in trypsin solution for lifting cells for DNA synthesis assay
tritiated [3H]-thymidine PerkinElmer NET027E001 Radioactive tritium, thymidine
Fisherbrand 7 mL HDPE Scintillation Vials Fisherbrand 03-337-1 Vials for liquid scintillation counting
EcoLite(+) MP Biomedicals 0188247501  Liquid scintillation cocktail
LS 6500 multi-purpose liquid scintillation counter Beckman Coulter 8043-30-1194 Liquid Scintillation Counter
Skatron Semi-automactic Cell Harvester Type 11019 Molecular Devices & Skatron Instruments, Inc. Semi-automatic cell harvester
Click-iT EdU Alexa Fluor® 488 Imaging Kit ThermoFisher Scientific C10337 EdU and staining kit for S-Phase Entry Assay
Trypan Blue Solution, 0.4% ThermoFisher Scientific 15250061 Assessing viability of cells
Grade GF/C filter paper GE Healthcare Life Sciences, Whatman 1822-849 Glass fiber filter paper
Human Basic FGF-2 Peprotech 100-18B growth factor
Pituitary Adenylate Cyclase Activating Polypeptide (PACAP-38) BACHEM H-8430 neuropeptide

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Rápida detección de los fenotipos del neurodesarrollo en las células precursoras neuronales humanos (PNJ)
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Williams, M., Prem, S., Zhou, X., Matteson, P., Yeung, P. L., Lu, C. W., Pang, Z., Brzustowicz, L., Millonig, J. H., Dicicco-Bloom, E. Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells (NPCs). J. Vis. Exp. (133), e56628, doi:10.3791/56628 (2018).

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