Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Snabb upptäckt av neurologiska fenotyper i mänskliga neurala prekursorceller (NPC)

Published: March 2, 2018 doi: 10.3791/56628
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 3, 3, 4, 5, 2, 1
1Department of Neuroscience and Cell Biology, Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 2Center for Advanced Biotechnology and Medicine, Department of Neuroscience and Cell Biology, Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 3The Child Health Institute of NJ, Department of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Services, Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 4The Child Health Institute of NJ, Department of Neuroscience and Cell Biology, Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 5Department of Genetics, Rutgers University
* These authors contributed equally

Summary

Neurologiska processer som spridning, migration och neurite utväxt är ofta oroade i neuropsykiatriska sjukdomar. Således presenterar vi protokoll för att snabbt och reproducibly bedöma dessa neurologiska processer i mänskliga iPSC-derived NPCs. Dessa protokoll också att bedömningen av effekterna av relevanta tillväxtfaktorer och therapeutics på NPC utveckling.

Abstract

Mänskliga hjärnans utveckling fortskrider genom en serie av just iscensatt processer, med tidigare stadier kännetecknas av spridning, migration och neurite utväxt; och senare stadierna kännetecknas av axon/dendrite utväxt och synaps bildas. I nervsystemets utveckling störs ofta en eller flera av dessa processer, leder till avvikelser i hjärnans bildning och funktion. Med tillkomsten av mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPSC) teknik har forskare nu ett rikligt utbud av mänskliga celler som kan differentieras till praktiskt taget vilken celltyp, inklusive nervceller. Dessa celler kan användas för att studera både hjärnans normala utveckling och sjukdomspatogenes. Ett antal protokoll som använder hiPSCs att modellera neuropsykiatrisk sjukdom användning terminalt differentierade nervceller eller använda 3D kultur system kallas organoids. Medan dessa metoder har visat sig ovärderlig i studerar mänskliga sjukdomspatogenes, finns det vissa nackdelar. Differentiering av hiPSCs in i nervceller och generering av organoids är långdragna och kostsamma processer som kan påverka antalet experiment och variabler som kan bedömas. Dessutom, medan efter mitotiska nervceller och organoids gör studien av sjukdomsrelaterade processer, inklusive dendrite utväxt och synaptogenes, utesluter de att studera tidigare processer som spridning och migration. I nervsystemets utveckling, såsom autism, belägg riklig genetiska och post mortem defekter i tidiga utvecklingsprocesser. Neurala prekursorceller (NPC), en mycket proliferativa cell befolkning, kan vara en lämplig modell att ställa frågor om ontogenetiska processer och sjukdom initiering. Vi utökar nu metoder lärde sig från att studera utvecklingen i mus och råtta kortikala kulturer till mänskliga NPCs. Användning av NPC tillåter oss att undersöka sjukdomsrelaterade fenotyper och definiera hur olika variabler (t.ex., tillväxtfaktorer, droger) inverkan utvecklingsprocesser inklusive spridning, migration och differentiering i bara några dagar. Slutligen, denna verktygsuppsättning kan användas på ett reproducerbart och hög genomströmning sätt för att identifiera sjukdomsspecifika mekanismer och fenotyper i kind.

Introduction

Användning av enklare organismer och musmodeller har klarlagts mekanismer för grundläggande hjärnans utveckling samt sjukdomspatogenes. Trots dessa framsteg fortfarande etiologi av många neuropsykiatriska störningar gäckande eftersom inte alla fynd i enklare organismer är direkt relevanta för komplexa aspekter av mänskliga sjukdomar. Dessutom större komplexiteten i den mänskliga hjärnan ofta gör det svårt att modell mänsklig utveckling och sjukdomar hos djur. Med evolution och framsteg av mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) teknik, kan somatiska celler omprogrammeras på stamceller och sedan differentieras efter neuronala celler att studera mänskliga sjukdomar. Framsteg inom hiPSCs och ”miska” teknik (genomik, transkriptomik, proteomik, metabolomik) lovar att revolutionera förståelsen av hjärnans utveckling. Dessa tekniker gör nu möjligt ett ”precision medicine” förhållningssätt till karakterisering av neuropsykiatrisk sjukdom på fall-till-fall basis.

Den nuvarande stapelvara i fältet hiPSC sjukdom-modellering är differentieras celler till specifika neuronala undertyper i en enskiktslager eller att använda ett 3D kultur-system som kallas en organoid för att recapitulate aspekter av hjärnans utveckling1,2, 3. Dessa system har varit otroligt värdefullt i att studera och avslöja unika aspekter av mänsklig utveckling och sjukdom4,5,6,7. Dock kräver både neuronala kulturer och organoids ofta någonstans från veckor till månader i kultur innan de är redo att studera. Tidskrävande naturen av dessa protokoll och mängden resurser som krävs för att upprätthålla dessa kultur-system ofta begränsa antalet experiment som kan utföras och antalet variabler (som tillväxtfaktorer eller droger) som kan provas. Dessutom har många studier använder efter mitotiska nervceller och organoids fokuserat på processer såsom dendrite utväxt eller synapsen bildning, som inträffar senare i utvecklingen. Medan dessa processer har varit inblandade i patologi utvecklingsstörningar såsom autism och schizofreni, är tidigare utvecklande händelser som inträffar innan slutgiltig neuronal differentiering också viktiga för sjukdomspatogenes8 ,9,10,11,12,13. Senaste genomisk studier visar faktiskt att perioden mitten-fetal, som består av spridning, processen utväxt och migration, är särskilt viktigt i autism patogenes11,14. Därför är det viktigt att studera neurala stamceller och stamceller cellpopulationer att bättre förstå dessa tidigare processer. Organoid system, som anses bättre recapitulate mänskliga hjärnans utveckling för sin 3D natur och en organiserad struktur, innehåller en stamcellspoolen som har använts för att studera några av dessa tidigare händelser. Dock stamceller befolkningen i organoids är ofta glesa och mer som radiella gliaceller än neurala stamceller eller stamceller celler5,15. Alltså, det skulle vara fördelaktigt att ha en hög genomströmning metod att studera tidiga stadierna av neuroutvecklingssjukdomar i ett aktivt proliferativa cell befolkningen.

I labbet, har vi skapat ett protokoll som använder hiPSC-derived neurala prekursorceller (NPC), en blandad befolkning av neurala stamceller och stamceller som är mycket proliferativ, att studera nervsystemets processer såsom spridning, cellmigration, och inledande processen (neurite) förlängning. Dessa testmetoder har utvecklats från tekniker som används i vårt labb under årtionden framgångsrikt studera neuroutvecklingssjukdomar i råtta och mus kortikala kulturer16,17,18,19,20, 21,22,23. Ännu viktigare, det visades också att fenotyper och regulatoriska signaler definieras i råtta och mus kultur är starkt prediktivt för mekanismer som är verksamma i vivo, som visar värdet av dessa tekniker16, 17,18,19,24. Efter inledande differentiering av hiPSCs till NPC tillåter dessa metoder oss att studera avgörande utvecklingsprocesser i några dagar. Dessa metoder har många fördelar: (1) de kräver lite sofistikerad utrustning och är lätt att genomföra, (2) talrika experimentella replikat kan genomföras i en kort period av tid, vilket möjliggör snabb bekräftelse av reproducerbarheten för resultaten och (3) kultur variabler såsom beläggning matriser, effekter av tillväxtfaktorer och aktiviteten av läkemedel kan testas snabbt och kostnadseffektivt. Vi utnyttjar dessutom extracellulära tillväxtfaktorer väletablerad roll som kritisk regulatorer av olika utvecklingsprocesser. NPC utsattes Markera utvecklingsmässiga signaler som direkt stimulerar händelser som spridning, neurite utväxt och cellmigration, och har hittat de förbättra förmåga att identifiera brister som inte är uppenbara i kontroll villkor19 , 25 , 26 , 27 , 28. jämväl, lättheten att bedöma droger ger en kraftfull avenue för att anta precision medicin tekniker för att testa effekten av olika terapeutiska interventioner. Detta protokoll underlättar således en hög genomströmning, reproducerbara, och okomplicerad metod för att studera tidiga hjärnans utveckling, sjukdomspatogenes och de potentiella positiva effekterna av tillväxtfaktorer och droger på neurologiska fenotyper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. säkerhetsrutiner och biosäkerhet skåp underhåll

  1. Säkerhetsrutiner för biosäkerhet nivå 2 (BSL-2)
    1. Följ institutionens riktlinjer på arbeta med BSL-2 material. Kassera BSL-2 material enligt institutets praxis. Visa lokaler och utrustning som används för BSL-2 material. Alla personliga skyddsutrustning (PPE), inklusive labbrock och handskar.
  2. Biosäkerhet skåp underhåll
    1. Använd en biosäkerhet skåp certifierade för användning av BSL-2 nivå material.
    2. Slå på UV-ljuset i biosäkerhet skåp för minst 15 min och sedan spraya ytor med 10% blekmedel lösning. Låt blekmedel lösningen sitta i 15 min, torka av höljet och slå på luftflödet före användning.
  3. Radioaktiva tritierat [3H]-tymidin (Tritium) säkerhetsrutiner
    Obs: Tritium är en kategori 5 radioaktiv källa, 'de mest osannolika att vara farliga' kategori. Följ institutionens riktlinjer för att arbeta med radioaktivitet. Vissa institutioner kan kräva certifieringar eller tillstånd för att hantera tritium.
    1. Få utbildning från institutionen på hur man korrekt hantera och kassera tritium. Kassera radioaktivt avfall i rätt kärl, enligt institutets regler. Bär personlig skyddsutrustning när du arbetar med tritium.

2. neurala induktion från iPSCs

Obs: För att göra NPCs, följdes en något modifierad version av ett protokoll som medföljer ett kommersiellt tillgängliga neurala induktion kit. Satsen består av Neurobasal (NB) media och 50 x neurala induktion tillägg (NIS), som används för att göra en 1 x neurala induktion Medium (NIM). NIS används också för att göra 100% Expansion Medium (se avsnitt 3.1). En länk till protokollet finns i material och utrustning samt referenser avsnitt43.

  1. Passagen iPSCs när de blir 70-80% konfluenta.
  2. Plattan 300.000 iPSCs in 1 väl av en hESC-kvalificerade extracellulära matrix-härma (ECM-härma gel) belagd 6-väl gelplattan innehållande 2 mL feeder-fri iPSC medium med 5 μM av ROCK-hämmare. Se avsnitt 3.2 instruktioner om beläggning brunnar med ECM-härma gel.
  3. En dag senare, ta bort den iPSC medium + ROCK hämmare och tvätta iPSCs en gång med 1 x PBS. Tillsätt 2 mL av NIM till iPSCs.
    Obs: 50 mL NIM görs genom att tillsätta 1 mL 50 x NIS och 250 µL (50 enheter/mL, 5 μl/mL) av Penicillin/Streptomycin (P/S) till 49 mL NB Media.
  4. Ändra media av neurala induktionen varannan dag av aspirering tillbringade medium och ersätta med 2 mL NIM tills cellerna blivit konfluenta (cirka 4-5 dagar). Ändra media dagligen, när celler är konfluenta.
  5. Passagen celler efter 7 dagar i NIM och plattan in en ECM-härma gel belagd 6-väl plåt innehållande 2 mL 100% Expansion Media och 5 μM ROCK-hämmare. Cellerna är ansedda Passage 0 (P0) NPC på denna punkt. Se avsnitt 3.1 nedan instruktioner för att 100% Expansion Media.
  6. Passagen celler med hjälp av de metoder som beskrivs i avsnitt 3.4. Vänta på att celler har nått P2 och är konfluenta innan separera för att färga för NPC markörer och plätering för experiment (figur 1).

3. kultur Media, beläggning och underhåll av NPC

  1. Media förberedelse för underhåll av NPC (100% Expansion Media):
    1. Gör 50 mL 100% Expansion Media genom att kombinera 24,5 mL DMEM/F12 med 24,5 mL NB.
    2. Tillsätt 1 mL 50 x NIS till DMEM/F12 + NB lösning. Tillsätt 250 μL av P/S lösning till media.
      Obs: Media kan vara kallt (4 ° C) och användas för upp till 2 veckor. Mindre volymer av media kan göras genom att justera volymerna av DMEM / F12 + NB + NIS använder de samma förhållanden som för 50 mL volym.
  2. Beredning av ECM-härma Gel belagd kultur plattor för NPC underhåll
    1. Alikvotens ECM-härma gel med den volym som behövs för att göra 6 mL arbetslösning. Beräkna alikvotens volym genom att titta på bladet certifikat för analys eftersom ECM-härma gel utspädningsfaktorn varierar mellan tillverkningssatserna och parti till parti.
    2. Tina en ECM-härma gel alikvot på is och lös i 6 mL kall DMEM/F12 media.
    3. Tillsätt 1 mL ECM-härma gel/DMEM/F12 lösning till varje brunn 6 väl platta. Inkubera 6-väl plattan med ECM-härma gel-lösning under 30 minuter vid 37 ° C.
    4. Aspirera ECM-härma gellösningen efter 30 min inkubering och ersätta med 100% Expansion Media eller kyla plattor (4 ° C, upp till 1 vecka) utan aspirera ECM-härma gel-lösning.
  3. Underhåll av NPC
    1. Plattan NPC med en täthet av 1,5 miljoner celler i en ECM-härma gel-belagd brunn innehållande 2 mL 100% Expansion Media.
    2. Inkubera NPC vid 37 ° C i en fuktig miljö med 5% CO2.
    3. Lägg till 5 μM av ROCK-hämmare till media för NPC på P3 eller lägre, eller tinade NPC, att förhindra överdriven celldöd. Ändra media efter 24 h ta bort ROCK-hämmare.
    4. Passagen celler varje 4-9 dagar, beroende på när de blir konfluenta. Celler anses konfluenta när de blir ett tätt packade enskiktslager som täcker hela botten av skålen ytan.
    5. Plåt NPC på en densitet på 1 till 1,5 miljoner celler per ett väl 6-well platta (se avsnitt 3.4). Ta bort förbrukade media varje 48 h och ersätta med 2 mL 100% Expansion Media.
  4. Lyfta, separera och Pellet NPC för underhåll och/eller plätering för experimentella förhållanden
    1. Aspirera medium, tvätta cellerna en gång med 1 x PBS. Aspirera PBS och tillsätt 500 μL 1 x cell avlossning lösning i 1 väl av konfluenta NPCs. Inkubera i 10 minuter vid 37 ° C.
    2. Tillsätt 500 μl av rumstemperatur (RT) PBS och tvätta den väl med P-1000 pipett för borttagning av celler. Samla in de celler + PBS lösning i en 15 mL koniska rör. Tvätta plattan igen med 1 mL PBS och tillsätt flytande till röret.
    3. Snurra cellerna ner vid 300 x g i 5 min till pellet.
    4. Ta bort supernatanten från cellpelleten och Slamma upp cellerna i 1-5 mL före värmde DMEM/F12 media. Späd cellerna till en densitet av 1 till 4 miljoner celler/mL av media. Kvantifiera celler med hjälp av en hemocytometer.
    5. Plattan erforderligt antal celler, specifika för NPC underhåll (avsnitt 3.3) eller den enskilda assay genomförs (se följande avsnitt för mer detaljer).
    6. Justera suspension cellvolym med media så att mellan 15 till 100 μL av celler används för varje brunn/skålen. Denna lilla plätering volym säkerställer att det finns även cell distribution och att tillväxtfaktorer, droger eller substrat i mediet inte spädas ut.
    7. Inkubera cellerna vid 37 ° C. Ändra media varje 48 h för NPC underhåll eller se de specifika detaljerna för enskilda analyser.
  5. Media förberedelse för experimentella förhållanden (30% Expansion Media)
    1. Späd i 100% Expansion Media med 70% (kallas 30% Expansion) genom att lägga till 1:1 DMEM/F12 + NB lösning för att göra media för experimentella förhållanden.
    2. Gör 20 mL 30% Expansion Media genom att tillsätta 6 mL 100% Expansion Media och späda med 7 mL NB och 7 mL DMEM/F12 media. Tillsätt 5 µL/mL P/S-lösning.
      Obs: Om 100% media innehåller redan P/S, sedan lägga till 5 μl/mL för kombinerad-DMEM / F12 + NB = (14 mL) x (5 μl/mL) = 70 μL av P/S istället för 100 µl.
    3. Lägga till beläggning substrat och tillväxtfaktorer vid önskad koncentrationer till 30% Expansion Media.

4. bedömning av DNA-syntes, S-fas post och Cell nummer av NPC

  1. Förberedelse för DNA-syntes, S-fas post och Cell nummer Assay
    1. Gör en 1 mg/mL stamlösning av poly-D-lysin (PDL) i dH2O och filter sterilisera. Späd 1:10 i dH2O göra en 0,1 mg/mL PDL lösning och tillsätt 300 μL till varje brunn 24 väl platta eller 1 mL till en 35 mm maträtt. Inkubera i 20 min på RT.
    2. Tvätta PDL brunnar 3 gånger för 5 min med dH2O. Aspirera dH2O och Lägg 300 μL/brunn eller 1 mL/maträtt av laminin (5 μg/mL) spädd i 1 x PBS. Täck plattorna med parafilm och hålla i en steril, biosäkerhet skåp övernattning på RT (12 till 24 h).
    3. Förbereda 30% Expansion Media (se avsnitt 3.5) efter 12 till 24 h. Lägg till fordon, tillväxtfaktorer eller droger av intresse på önskad koncentration i volymer som är mindre än 10% av den totala lösningen för att undvika att späda NIS på 30% Expansion Medium.
    4. Tvätta vart väl Skyltens 24-väl två gånger med 1 x PBS (5 min varje). Aspirera 1 x PBS och tillsätt 450 μl av media (utan eller med narkotika-och/eller tillväxtfaktorer). Inkubera plattan vid 37 ° C under minst 15 minuter före plätering celler.
    5. För varje experiment, ställa in 2-3 brunnar eller rätter per tillstånd.
    6. Plattan NPCs (se avsnitt 3.4):
    7. NPC DNA syntesen Assay: 100 000 celler per brunn i en 24 väl platta
    8. S-fas Entry: 500 000 celler/35 mm maträtt
    9. Cell nummer Assay: 50.000 celler per brunn i en 24-well platta
  2. Neurala föregångare Cell DNA syntesen Assay
    1. Plåt 100 000 celler per brunn i en 24-well platta och bedöma i tre exemplar/skick.
    2. Lägg till radioaktiva, tritierat [3H]-tymidin till odlingsmediet (1,5 μCi/mL) i varje brunn efter 46 h i kultur. Inkubera cellerna vid 37 ° C i 2 h.
      Obs: När du använder radioaktiva material, få utbildning från din institution, följ radioaktivitet säkerhet protokoll och kassera radioaktivt material i de korrekt utsedda avfallsbehållare.
    3. Bort och korrekt avyttra radioaktiva media efter 2 h. Lägg till 300 μL av pre värmde 0,25% trypsin-EDTA (0.5 mM) till varje brunn och Inkubera under 20 minuter vid 37 ° C.
    4. Slå på skördaren cell (se material och utrustning avsnitt) och pumpen och se till att pumptrycket understiger 200 PSI. Placera filterpappret genom rymden i skördaren cell och riva av det högra hörnet att markera pappersorientering.
    5. Placera samlande rör cell skördare i en tom ”blank”-facket och tryck förtvätt att fukta pappersfiltret. Placera samlande rör i provet brunnar och kör (start).
    6. När cellen skördaren har avslutat att samla in prover, lyft klämman och advance filterpapper upprepa för alla provningssatser. Alltid prewash i en tom, ”tomma” plattan.
    7. Torka filtret papper under en ljuskälla och ställa in motsvarande injektionsflaskor i ett fack. Stansa ut papper chads i injektionsflaskor och tillsätt 2 mL liquid scintillation cocktail till varje injektionsflaska. Cap och etikett injektionsflaskor.
    8. Inkubera injektionsflaskor i liquid scintillation cocktail för minst 1 h innan du läser räkningarna per minut (CPMs) på en scintillation maskin.
  3. NPC S-fas inträde Assay
    1. Se avsnitt 3.4 för steg att lyfta, separera, pellet och resuspendera cellerna.
    2. Tallrik 500 000 celler per maträtt i de 35 mm-rätter som tillagas i avsnitt 4.1, endast 1 maträtt/skick för det här steget.
    3. Agitera rätter fram och tillbaka i alla riktningar för att säkerställa jämn fördelning av celler. Inkubera cellerna vid 37 ° C för 46 h.
    4. Förbered tre 35 mm plattor belagda med PDL/Laminin per skick efter 24 h. Till exempel, om det finns en 35 mm maträtt av 30% Expansion Media och en 35 mm maträtt av 30% Expansion Media + FGF (10 ng/mL) sedan kappa 6 PDL/Laminin plattor för användning på nästa dag.
    5. Tillsätt 2 μl/mL 5 mM EdU till kulturer efter 46 h. Inkubera för 2 h.
    6. Separera och pellet cellerna (se avsnitt 3.4). Återsuspendering cellpelleten i 3 mL 30% Expansion Media eller 3 mL 30% Expansion Media + önskad tillväxtfaktorer/droger.
    7. Tallrik 1 mL per maträtt på förhand belagda PDL/Laminin rätter. Agitera rätter fram och tillbaka i alla riktningar för att säkerställa jämn fördelning av celler. Inkubera vid 37 ° C i 2 h att låta cellerna att följa skålen. Se figur 2 för en förenklad tidslinje.
  4. S-fas post analys
    1. Fixa rätter med iskall 4% PARAFORMALDEHYD (PFA i 1 x PBS) i 20 min. Sedan diska 3 gånger för 5 min med 1 x PBS.
    2. Tillsätt 1 mL 1 x PBS med 0,05% natriumazid att förhindra bakterie- och tillväxt. Celler kan lagras vid 4 ° C i upp till 6 månader om rätter (förseglad med parafilm) hålls i PBS + natrium natriumazid lösning, dock inte alla immunologiska antigener är väl bevarade efter långa förseningar i analysen.
    3. Assay celler med en kommersiell EdU reaktion kit (se tillverkarens protokollet). Färga celler med hjälp av DAPI eller en annan nukleär markör, och bild med fluorescensmikroskopi.
    4. Bedöma andelen EdU positiva celler över totala levande celler (totala cell nummer) blind i 10 systematiskt slumpmässigt fält (10 x). Omfatta inte döda celler i analysen.
    5. Utnyttja både fas kontrast bilder och fluorescerande bilder att avgöra positiva EdU färgning och att fastställa vilka celler är döda eller levande (figur 3).
    6. Räkna alla celler som har både släta och även cellmembranet i fas kontrast inställningar, och en stor ofragmenterad kärna av fluorescerande DAPI nukleära fläcken, som dessa celler är live (figur 3A-B).
    7. Utesluta alla celler som är fas ljusa, har en bruten ojämn cellmembranet och har en liten, kondenserat kärnan som visualiseras av DAPI fluorescerande imaging, som dessa celler är döda (figur 3A-B). Bedöma levande celler för uttryck för EdU genom att identifiera celler som har ljusa fluorescerande EdU fläcken som täcker hela kärnan eller spräckliga fluorescerande färgning i kärnan (figur 3 c).
  5. NPC Cell nummer Assay
    1. Efter 2 dagar i kultur, etikett och förbereda 1,5 mL mikrocentrifugrör och 0,5 mL mikrocentrifugrör. I varje 0,5 mL tub, tillsätt 5 μl Trypan blå.
    2. Till varje brunn 24 väl platta, ta bort medium och tillsätt 200 μL av 1 x cell avlossning lösning och plats i inkubatorn för 10-15 min.
    3. Efter utsatt tid, när celler har lyft, tillsätt önskad mängd 1 x PBS till varje brunn.
      Obs: Vanligen på dag 2, tillsätt 300 μL 1 x PBS till väl innehållande cellerna plus 200 μL av avlossning lösningen, för en total volym av 500 μL. Med ytterligare kultur inkubationstiden, som celler blir mer konfluenta, öka utspädning volym som behövs. Exempelvis på dag 4, tillsätt 500 μl av 1 x PBS och på dag 6, tillsätt 800 μL 1 x PBS. Totala volymer kommer att vara 700 μL 1 mL, respektive.
    4. Med P-1000 pipett Pipettera upp och ner i varje väl 4 till 5 gånger att ta bort celler. Undersöka plattan under ett mikroskop för att säkerställa att alla celler har lossnat. Överföra celler till 1,5 mL rör.
    5. Invertera 1,5 mL rör med utspädda celler 2 till 3 gånger. Sedan ta en 50 μL delmängd av celler från mitten av röret och Lägg till 0,5 mL rör med Trypan blå (se 4.5.1).
    6. Pipettera cell lösning upp och ner 2 till 3 gånger. Lägga till celler i hemocytometer och analysera omedelbart. Väntar på längre än 10 min kan öka celldöd eller närvaron av celler som har tagit upp Trypan blå.
    7. Tillsätt försiktigt 10 µL cell + Trypan blå blandningen på varje sida av hemocytometer att utföra replikera räknas. Räkna celler med hjälp av mikroskopet fas kontrast. Räknas inte döda celler eller de mörka blå celler som tagit upp Trypan blå.
    8. För att erhålla den totala cell användningen Genomsnittligt antalet celler räknas från 4 hörn av hemocytometer och tillämpa följande ekvation:
      Medeltal cell x media volym (mL) x 10,000 = totala cell nummer/brunn
    9. Aspirera och upprepa proceduren på resterande brunnar. Ändra media på de celler som är inte räknas, varje 48 h. Upprepa test på dagar 4 & 6.

5. NPC Neurite Assay

  1. Beredning av rätter och Media för Neurite analys
    1. Gör en 1 mg/mL stamlösning av poly-d-lysin (PDL) i dH2O och filter sterilisera. Späd 1:10 i dH2O göra en 0,1 mg/mL PDL lösning och tillsätt 1 mL till varje 35 mm maträtt. Inkubera i 20 min på RT.
    2. Under tiden förbereda 30% Expansion Media (se avsnitt 3.5) och Lägg till 5 μg/mL (5 µL/mL) av Fibronektin lösning (1 mg/mL lager) media.
    3. När media är beredd, lägga till fordon, tillväxtfaktorer eller droger av intresse vid önskad koncentrationer.
      Obs: Det är bäst att lägga till fordon, tillväxtfaktorer eller droger, vid volymer < 10% av den totala lösningen för att undvika att späda Fibronektin och andra komponenter i 30% expansion medium.
    4. Efter 20 min, diska PDL 3 gånger för 5 min med dH2O ta bort överflödig PDL. Säkerställa rätter är torra innan du lägger till media.
    5. Placera 1 mL av media (med eller utan droger/tillväxtfaktorer) + Fibronektin lösning i varje PDL belagda maträtt.
    6. Inkubera rätter vid 37 ° C i minst 30 min före plätering celler för att säkerställa ordentlig fastsättning av Fibronektin PDL.
    7. För varje experiment, ställa in 2-3 rätter per tillstånd (t.ex., 3 fordon-innehållande rätter, 3 läkemedel innehållande rätter).
  2. Plätering NPC för Neurite analys
    1. Se avsnitt 3.4 för steg att lyfta, separera, pellet och resuspendera cellerna.
    2. Tallrik 50 000 celler per maträtt till de rätter som tillagas i avsnitt 5.1. Agitera rätter fram och tillbaka i alla riktningar för att garantera en jämn fördelning av celler.
    3. Inkubera cellerna vid 37 ° C för 48 h.
  3. Analys av neuriter
    1. Efter inkubation celler för 48 h, aspirera medium, och fixa rätter med is kallt 4% PFA i 20 min.
    2. Efter 20 min, diska 3 gånger för 5 min med 1 x PBS. Efter den sista tvättningen, tillsätt 1 mL 1 x PBS med 0,05% natriumazid.
    3. Analysera rätter blint på fas kontrast Mikroskop vid 32 X. Räkna totala celler och celler med neuriter i 3, 1 cm rader, valts ut slumpvis men reproducerbar positioner. Räkna minst 150 celler per maträtt att säkerställa adekvat provtagning.
      Obs: En neurite definieras som en förlängning (process) från cellkroppen som är > 2 cellkroppen diametrar i längd. För celler med flera processer anses den längsta processen för kriteriet. Celler med processer som är < 2 cellkroppen diametrar i längd inte är ingår (figur 4).
    4. Lägg ihop det totala antalet celler och det totala antalet celler med neuriter i varje maträtt. Beräkna % av celler med neuriter. Den genomsnittliga procentandelen celler med neuriter över replikera rätter. Förtroendet för experimentell reproducerbarhet upprättas när alla rader i varje maträtt är liknande och medelvärden bland rätter är mycket liknande, med standardavvikelsen för medelvärdet (SEM) < 10%.
    5. Du kan också analysera neuriter genom att bedriva immuncytokemi för markörer såsom beta-III-tubulin (TUJ1) eller MAP2. Efter färgning för markören sevärdheter, ta 10 systematiskt random bilder på fluorescerande Mikroskop på 10 X. Minst 200 bildceller. I detta fall förvärva bilderna inte för nära kanten av skålen. Analysera andelen celler med TUJ1 eller MAP2 + neuriter (se figur 10 för ett exempel).

6. NPC Neurosphere Migration Assay

  1. Neurosphere Formation
    1. Tillsätt 1 mL 100% Expansion Media i en 35 mm skål med ingen beläggning substrat. Inkubera rätter för minst 15 minuter vid 37 ° C innan plätering NPCs. förbereda 2-3 rätter för att säkerställa att det kommer att vara tillräckligt neurospheres för cell migration analysen.
      Obs: Avsaknad av beläggning substrat säkerställer att NPC förblir svävande i medierna, vilket är viktigt för neurosphere bildning. Beläggning rätter kommer att hindra neurosphere bildning.
    2. Se avsnitt 3.4 om åtgärder för att lyfta, separera och pellet celler. Återsuspendera cellpelleten i 2-5 mL före värmde 100% Expansion Media. Tallrik 1 miljon NPCs i varje 35 mm maträtt tillagas i avsnitt 6.1.1.
    3. Inkubera NPC vid 37 ° C för 48-96 h att låta NPC aggregat och bildar neurospheres. Bedöma sfär storlek med en levande linjal på ett faskontrastmikroskop. Vänta på de flesta områden att nå en ungefärlig diameter på 100 µm (± 20 μm) (figur 5). Mindre områdena kommer helt skingra och sönder under migration analysen.
  2. Beredning av plattor för Neurosphere Migration Assay
    1. Lös ECM-härma gel alikvoter (se avsnitt 3.2) till 6 mL 30% Expansion Media. När ECM-härma gel/30% Expansion Media lösning är beredd, lägga till fordon, tillväxtfaktorer eller droger intressen vid önskad koncentrationer.
      Obs: Fordon, läkemedel och tillväxtfaktor koncentrationer måste ökas till konto för tillägg av 200 µL neurospheres i avsnitt 6.3.
    2. Tallrik 1 mL av den ECM-härma gel /30% Expansion Media lösning (± fordon, tillväxtfaktorer, eller droger) i en brunn 6-bra platta. Gör 2-3 brunnar per experimentella villkor. Alternativt, 35 mm rätter kan användas. Inkubera plattorna under minst 30 minuter vid 37 ° C.
      Obs: Inte aspirera på ECM-härma gel/30% Expansion Media lösning för denna analys. Plätering sfärer på en aspirerade ECM-härma gel kommer leda till snabba och överflödig migration.
  3. Plätering Neurospheres
    1. Samla neurospheres bildas i avsnitt 6.1 och placera dem i ett koniskt rör. Tvätta den 35 mm rätter med 1 mL 1 x PBS att säkerställa alla neurospheres samlas. Snurra ner den insamlade neurospheres vid 100 x g i 5 min.
    2. Återsuspendering neurospheres i 1-3 mL före värmde 30% Expansion Media. Om 1 maträtt av neurospheres samlas in, används 1 mL av media att resuspendera sfärer. Om 2 rätter samlas, 2 mL av media läggs för att resuspendera sfärer, etc. Pipettera försiktigt och använder endast en P-1000 för att säkerställa sfärer inte är trasiga.
    3. Tallrik 200 μl av den återsuspenderade neurospheres in i ECM-härma gel/30% Expansion lösning gjord i avsnitt 6.2. Rock plattor i alla riktningar för att jämnt fördela neurospheres. Inkubera plattorna under 48 timmar vid 37° C.
    4. Ta bort ECM-härma gel/30% Expansion medielösning och fixa celler i 4% PFA, tvätta och hålla celler i 1 x PBS + 0,05% natriumazid.
  4. Analys av Neurospheres
    1. Skaffa bilder av hela neurospheres med fas kontrast inställningar på 10 X. Se till att kulorna inte vidrör varandra. Mäta genomsnittlig migrering med hjälp av programmet ImageJ.
    2. Spåra yttre konturen av den neurosphere som använder verktyget frihandslinje. Frihandslinje kan nås genom att högerklicka på ikonen ”fågelvägen”. Manuellt trace använder en mus.
    3. Använd funktionen åtgärd för att beräkna området för spårningen. Kontrollera att ”område” är valt som en avläsning i fönstret ”Ange mätningar” finns under fliken analysera. Se figur 6 för spår av yttre kontur i blått.
    4. Spåra den inre cellmassan av området sfär och åtgärd. Se figur 6 för spår av inre kontur i rött. Kvantifiera genomsnittliga migration genom att subtrahera den inre cellmassan från området totala neurosphere.
    5. Åtgärd neurospheres som uppvisar en tätt packade inre cellmassan med celler migrerar ut som en sammanhängande matta (figur 6).
    6. Omfatta inte celler utanför mattan eller fristående från neurosphere för mätning. Se figur 6 exempel på celler (inringad i vitt) som är undantagna från yttre mattan mätningen. Analysera ett minimum av 20 neurospheres för varje villkor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ett mål av dessa studier är att definiera NPC, det vill säga en ökning i cell nummer proliferativ verksamhet. Detta uppnås genom att bedöma DNA syntesen av befolkningens totala cell, en hög genomströmning metod som mäter införlivandet av radioaktivt spårämne tritiummärkt tymidin i cell extrakt, och återspeglar alla celler i S-fas, oavsett om de är syntetisera i 5 minuter eller hela två timmar. Dessutom tillåter dessa analyser bestämning av andelen celler som anger S-fas och totala cell nummer, en mer arbetsintensiva haltbestämning av enstaka celler. Celler syntetisera DNA i S-fas, ett steg som föregår Mitosen och celldelning, vilket måste ske för att öka cell nummer. Eftersom dessa processer tar tid, kan förändringar i DNA-syntes bedömas på 48 timmar inte associeras med förändringar i cell nummer vid denna tidpunkt. Det konstaterades dock att förändringar i DNA-syntes på 48 timmar tillförlitligt förutsäga ökningar av cell nummer dagar 4 och 6.

Vid bedömningen av DNA-syntes, cellerna är klädd med en täthet av 100 000 celler (~ 50% konfluenta) i en 24-well platta och tillåts växa för 48 timmar före att göra mätningar. Använder denna densitet garanterar att cellerna likna deras enskiktslager miljö, men också växer inte så snabbt i en 48 h period som media blir för surt. Media som är för surt kan avsevärt påverka cellernas ämnesomsättning och därmed förändra spridning resultat. Om specifika cellinjer är mycket proliferativ, forskaren bör överväga att ändra cell densiteten, media volym, eller media byta frekvens för att förhindra mycket sura förhållanden. Om villkoren ändras, är det viktigt att vara konsekvent när man jämför olika cellinjer eftersom cell till cell kontakt beroende ändringar verkligen påverkar tillväxttakten. Den enkla designen av dessa analyser tillåter oss att testa olika tillväxtfaktorer. Som ses i figur 7, tillägg av fibroblast growth factor (FGF, 10 ng/mL) för 48 timmar ökar DNA-syntes av ~ 40%. Dessutom DNA syntesen analysen är reproducerbara som alla kloner och individer uppvisar en ökning i DNA-syntes FGF stimulation. Potentialen för variationer i baslinjen och FGF stimulerade DNA-syntes bland olika opåverkade individer, liksom potentialen för klonal variabilitet i en och samma individ är visat i tabell 1. På grund av denna variation är det viktigt att testa flera iPSC kloner per individ, samt bedöma minst 3 till 5 NPC linjer härrör från varje olika iPSC-klon. Minst 3 experiment för varje NPC rad utfördes.

DNA syntesen analysen tillåter oss att snabbt bedöma talrika experimentella grupper i en hög genomströmning mode och åtgärden återspeglar summan av DNA-syntes oavsett S-fas varaktighet (5 minuter till 2 timmar). Om du vill definiera andelen celler i S-fas, var S-fas post analysen anställd. För denna analys, celler odlas på samma densitet som tidigare nämnts för att tillåta enskiktslager-liknande dynamics förekommer, men då de är separerade efter 2 dagar och tillåtet att kortfattat följa plattor att göra encelliga analys. Räkna celler i en enskiktslager kan vara svårt på grund av hög cell till cell kontakt och regionala variationer i plattan. Detta paradigm tillåter oss att modellera cellerna som en enskiktslager och sedan analysera dem som enstaka celler. Det fungerar också som ett metodologiskt oberoende bekräftelse av uppgifter som erhållits i DNA syntesen analysen. Som kan ses i figur 8, ökar 48 timmar av FGF (10 ng/mL) stimulering andelen celler in i S-fas av ~ 25%.

I bedömningen av cell nummer, används en lägre celldensitet än i tidigare nämnda analyserna, med 50.000 celler att vara pläterade per brunn en 24 väl plattan. Igen, detta densitet valdes för att säkerställa att snabbare cellinjer inte växer så snabbt under perioden 6-dagars att pH-värdet i medium blir för surt och blir gul. I figur 9, medan cell nummer inte kanske signifikant mellan kontroll och FGF (10 ng/mL) grupper på 2 dagar, är förändringar i DNA-syntes på 48 h (figur 7) förutsägande av förändringar i cell nummer 4 och 6 dagar.

Medan NPC odlas oftast på hög densitet, bedrivs neurite analysen vid en densitet av 50.000 celler klädd i en 35 mm-skålen för att bedöma enstaka celler. Även vid denna låga densitet, NPC kulturer express cytoskeletal proteiner och transkriptionsfaktorer kännetecknar NPCs såsom NESTIN, SOX2 och PAX6 (figur 10 A-D). Detta indikerar att en låg densitet odling inte väsentligt ändrar cell öde i denna tidsram. Dessutom har liknande låg densitet förhållanden använts i råtta och mus kultur för att upptäcka fenotyper som var ytterst reproducerbara i vivo16,17,18,19, 20,21,22,23. Efter 48 timmars inkubation, en liten del av NPC börja utöka neuriter som kan ses i figur 11A och B, och kvantifieras i diagrammet i figur 11C. Andelen av celler som utökar neuriter, neuriter längd och antalet neuriter/cell kan mätas för att bedöma utvecklingsmässiga parametrar. För att korrekt bedöma andelen celler med neurite utväxt, det är viktigt att cellerna är klädd som enstaka celler eller kluster av < 5 celler och inte så stora aggregat. Som kan ses i figur 10 E-F, uttrycka celler som bär neuriter (vit pil) också omogna neuronala markör beta-III tubulin (TUJ1). Som nämnts i metoderna, fluorescerande bilder kan förvärvas av TUJ1 målat NPC och sedan dessa bilder kan räknas för andelen av TUJ1 + neuriter att säkerställa neuronala ursprung av processer. I vårt labb har analyser av endera metoden gett statistiskt liknande resultat.

Den enkla konstruktionen och den snabba naturen neurite analysens också tillåter oss att testa effekterna av utvecklingsmässigt relevanta tillväxtfaktorer och cytokiner peptider. Figur 11 visar exempelvis att den neuropeptid hypofysen adenylatcyklas aktivera polypeptid (PACAP, 3 nM) ökar neurite utväxt i NPCs. PACAP är en viktig fosterskadande faktor som har brett uttryck i CNS och har visat sig vara viktigt för hjärnans utveckling. Gnagare i vårt labb och andra laboratorier har funnit att PACAP har utbredd scenen-beroende utvecklingseffekter som reglerar neurite utväxt, migration och spridning i båda hindbrain och framhjärnan16,22, 29,30,31. Nyligen genomförda studier av Ataman o.a. (2016) med hjälp av odlade mänskliga fostrets kortikala celler indikerar att neuronal aktivitet inducerar en 9-faldig ökning i PACAP genuttryck, som anger de peptider betydelse i mänskliga neuronala utvecklingen32. Faktiskt, tabell 2 visar procentandelen av neuriter i kontroll och PACAP (3 nM) villkor mellan många linjer härrör från opåverkade individer. Som kan ses i tabell 2, finns det vissa variationer i andelen neuriter uttryckt i cellinjer som härstammar från olika kloner från samma individ och från NPC som härrör från olika individer. Dessa opåverkade individer har dock en ökning i neurite utväxt svar på PACAP, som anger reproducerbarheten för analyserna.

Liksom neurite utväxt är cellmigration en viktig utvecklingsmässiga process nödvändigt för korrekt anslutning, organisation och ledningar av hjärnan. Neurospheres tillåter oss att studera NPC migration i en typisk högdensitets skick som upprätthåller cell cell kontakt bland NPCs (figur 12). Utvecklingsmässigt relevanta faktorer kan också testas på neurospheres att bedöma deras effekter på migration. Figur 12 visar exempelvis att PACAP (10 nM) ökar migration av NPC.

Figure 1
Figur 1: NPC på passage 3. NPC: er på P3 express flera scenen-specifika markörer inklusive (A) pluripotenta transkriptionsfaktor, SOX2 (B) transkriptionsfaktor specifika för framhjärnan NPC, PAX6, och NPC cytoskeletal protein NESTIN. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Schematisk av S-fas inträde assay. Tidslinje av S-fas inträde Assay. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: kvantifiera S-fas post. (A) fas bilden visar fas-dark levande celler (vita pilar), en fas-ljusa döda cell (vit stjärna) och en fas-ljusa levande cell (grön pil). (B) fluorescerande DAPI fläcken visar kondenserat kärnan i en död cell (vit stjärna) och stora kärnor i en levande cell (vita och gröna pilar). (C) fluorescerande EdU bilden visar ljusa EdU positiva kärnor (röd pil) och spräckliga EdU positiva kärnor (röda stjärnan). (D) fas och fluorescerande sammanfogning av bilder 3A - 3 C.

Figure 4
Figur 4: identifiera neuriter. Faskontrast bilder av NPCs. (A) A-cellen med en process > 2 cell organ i längd, därmed uppfyller kriteriet för en neurite. (B) en cell med en process < 2 cell organ i längd, och därför inte ansedda neurite-bärande. (C) representerar en cell med 2 processer-längre processen bedöms för kriteriet neurite. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: välja neurospheres för migration assay. (A) fas kontrast bild av ett representativt fält av neurospheres på 24 h. sfärer är alla mindre än 100 μm och således är inte samlas in för migration analysen. (B) fas kontrast bild av ett representativt fält av neurospheres på 72 h. Alla sfärer är intervallet 100 μm ± 20 µm, som anger de är redo att samlas för migration analysen.

Figure 6
Figur 6: kvantifiera Migration. (A) fas kontrast bild av en representativ neurosphere. (B) blå kontur visar spårningen för att mäta totalt neurosphere område. Rött visar konturen används för att mäta området i cellen inre massa. Migration definieras som totala neurosphere område-inner cell mass område. Obs, de vita cirklarna visar celler som inte är i en sammanhängande matta, eftersom dessa celler är undantagna från migration konturer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7: bedömning av DNA-syntes. Representativa resultat av kontrollen kontra FGF-behandlade NPCs. FGF (10 ng/mL) ökar DNA-syntes på 48 h (p ≤ 1 x 10-3). (n = 2-4 brunnar/grupp/experiment; 3 experiment). Felstaplar representera SEM.

Figure 8
Figur 8: andelen celler in i S-fas. (A) fas kontrast bilder av NPC cellerna inkuberas i kontrollen kontra FGF (10 ng/mL) behandlade media för 48 h. inläggningar representerar högre förstoring bilder av cellerna färgas för fluorescerande EdU markör i kontroll och 10 ng/mL FGF media. Röda pilarna visar celler som är EdU positiva och vita pilar visar celler som är EdU negativt. (B) grafen av representativa resultat av kontrollen kontra FGF (10 ng/mL) behandlade NPCs. FGF ökar S-fas inträde på 48 h (p ≤1 x 10-3). (n = 2-4 rätter/grupp/experiment; 3 experiment). Felstaplar representera SEM.

Figure 9
Figur 9: Enumerating celler dagar 2, 4 och 6. (A) fas kontrast bilder av celler i kontroll och FGF (10 ng/mL) behandlade media dagar 2, 4 och 6. (B) grafen av representativa resultat; Observera att FGF (10 ng/mL) ökar inte alltid cell nummer 2 dagar, men på 4 och 6 dagar ökar är uppenbara (p ≤0.05). (n = 2-4 brunnar/grupp/experiment; 3 experiment). Felstaplar representera SEM.

Figure 10
Figur 10: karakterisering av NPC i låg densitet villkor. (A, C, E) Fas bilder med kontrast av NPC låg densitet villkor. (B) NPC uttrycka stammen/progenitor cell markörer NESTIN (grön), SOX2 (röd) och nukleära markör DAPI (blå). (D) PAX6 (röd), DAPI (blå). (F) låg densitet, celler att utvidga neuriter (vit pil) också uttrycka omogen nervcell markör TUJ1 (grön). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 11
Figur 11: Neurite utväxt. (A) fas kontrast bild av NPC. De svarta pilarna peka på cellerna med neuriter. (B) tillägg av neuropeptid PACAP (3 nM) ökar procenten av celler med neuriter (p ≤1 x 10-2). (C) kvantifiering av neurite utväxt i kontroll och 3 nM PACAP innehållande media. (n = 2-4 rätter/grupp/experiment; 3 experiment). Felstaplar representera SEM.

Figure 12
Figur 12: Neurosphere Migration. (A) fas av neurospheres bilder på kontrast. (B) tillägg av PACAP (10 nM) ökar neurosphere cellmigration (p ≤ 10-2) (C) kvantifiering av cellmigration. (n = 20 kulor/grupp/experiment, 3 experiment). Felstaplar representera SEM.

Media
Patienten Klona # CTRL FGF
(10 ng/mL)
Patient 1 1 21,853 47,538
2 20,336 38,070
Patient 2 1 7,664 14,060
2 16 573 30,087

Tabell 1: DNA-syntes. En sammanfattning av DNA syntesen värden (i CPMs) av NPC härrör från två iPSC kloner per två opåverkade individer.

Media
Patienten Klona # CTRL PACAP
(3 nM)
Patient 1 1 13,60% 18.10%
2 16,50% 21.10%
Patient 2 1 8.90% 14.10%
2 14,20% 21.10%

Tabell 2: Procentandelen celler med neuriter. En sammanfattning av andelen celler som bär neuriter i NPC härrör från två iPSC kloner per två opåverkade individer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De protokoll som presenteras här visar snabba och enkla metoder för att studera grundläggande neurologiska processer och testa tillväxtfaktorer och droger med hjälp av hiPSC-derived neurala prekursorceller. hiPSC tekniken har revolutionerat studiet av patogenesen av nervsystemets sjukdomar genom att förse oss med oöverträffad tillgång till levande mänskliga neuronala celler från drabbade individer. Faktiskt, det har varit många hiPSC studier av nervsystemets inklusive Rett syndrom, Timothy syndrom, Fragile-X syndrom, och schizofreni, som grävt sjukdomsspecifika avvikelser i dendriter, synapser, och neuronala funktion4,33,34,35,36. De flesta av dessa studier har främst fokuserat på terminalt differentierade, efter mitotiska nervceller som, om anses relativt funktionellt omogna, utesluter studien av tidigare neurologiska processer som spridning och migration. Dessa senare processer har varit kraftigt inblandade i patogenesen av nervsystemets och teckningsoption ytterligare studera8,9,10,11,12 , 35 , 37 , 38. användningen av NPC tillåter oss att studera dessa viktiga tidigare händelser samtidigt ge möjlighet att undersöka mer mogna processer som cellernas förmåga att förlänga omogna axoner/dendriter (neuriter). Vidare, några av dessa analyser kan även utökas för att studera andra parametrar, såsom neurite längd, antal, och förgrening eller den längst sträcka av en cell.

Vissa nyare studier har använt organoid modellsystem för att studera tidigare utvecklande händelser i en 3-D ”mini hjärnan system”1,39,40. Men även i dessa organoid system, proliferativ föregångare cell befolkningen är begränsad och tidig mognad och migration är svåra att studera15,39. Förutom att begränsa studien av tidigare utvecklingsmässiga fenomen, användning av terminalt differentierade nervceller eller organoids är ofta tidskrävande, kostsamma och begränsar antalet variabler som kan bedömas i systemet. Detta beror på att nervceller och organoids kan kräva viral induktion protokoll, särskilda företagskuvöser och utrustning, flera veckor tid och stora mängder av media. Däremot med undantag av den test av DNA-syntes (som riktar senare nedan), detta protokoll kan appliceras lätt på studiet av nervsystemets och kräver inte omfattande utbildning, kostsamt verktyg, och resurser eller programvara. Den lätthet och relativt låg kostnad för att lägga till droger och tillväxtfaktorer i dessa analyser, göra detta protokoll en användbar hög genomströmning-teknik för att testa olika potentiella behandlingar för neurologiska och neuropsykiatriska sjukdomar. Dessutom eftersom tillväxtfaktorer lagen via definierade cellulära signalvägar, kan de också användas som verktyg för att testa för eventuell signalering defekter i utveckla system. Slutligen, eftersom NPC är en proliferativ själv förnya befolkningen, stora mängder celler kan produceras och fryst tillstånd tillåter experiment ska genomföras effektivt utan att behöva göra NPC från iPSCs varje gång.

För att framgångsrikt anställa dessa analyser, är det viktigt att notera följande kritiska steg. Detta protokoll förlägger NPCs i olika förutsättningar för underhåll och utbyggnad kontra experiment. Specifikt, medan NPC induceras, minska vuxit och anpassade i medium innehållande neurala induktion komplettera (NIS), våra experimentella förhållanden tillägget med 70 procent, vilket placerar celler i en begränsande miljö, ger oss möjlighet att lägga till tillbaka och testa effekterna av viktiga tillväxtfaktorer. För det andra är det viktigt att hålla koll på passagen av NPC. I våra studier har vi generellt begränsad passage nummer av cellinjer från P3 - P8. I passager uttrycker tidigare än P3, vissa linjer inte kraftfullt karakteristiska markörer. På högre passager, medan vissa cellinjer har mycket konsekvent tillväxt eller svar på tillväxtfaktorer, kan andra cellinjer ha dramatiska förändringar i cellernas tillväxt eller svar. Även om inte rutinmässigt rapporterade, har vi och många andra upplevt denna dramatiska prisändring proliferativ priser på högre passager. Skälet kan för detta är osäkert, men denna förändring kan återspegla en begränsad självförnyelse förmåga av NPCs. definiera varför och hur spridning priser förändras över längre passager ge insikter i utveckling och sjukdomspatogenes, men ytterligare forskning kommer att behöva göras. Slutligen, det kommersiella neurala induktion protokoll som vi använder ibland kan ge dålig kvalitet neurala stamceller, särskilt om de från iPSCs inte är av hög kvalitet (dvs., har skilja celler cell kolonier, gränser karyotyp avvikelser). I vissa fall cellmorfologi är förvrängd och uttryck av markörer är inte närvarande. Använd inte dessa kulturer. I andra fall växa NPC med plattare ”förorening” celler, som kan tas bort med en differential cell detachement upplösningsbehandlingen för att säkerställa nästan ren NPC populationer före användning i experiment. Att ha hög kvalitet NPC är kritiskt för korrekt resultat: se material och utrustning för en länk till ett Neural induktion protokoll där bilder av hög och låg kvalitet NPC kan hittas.

För varje av de analyser som presenteras, är det viktigt att notera de följande kritiska steg, potentiella fel och felsökningstips. För antalet celler, DNA-syntes och neurite analyser är det viktigt att plattan celler separerade enstaka celler och inte som klumpar, eftersom detta kan förvränga DNA syntesen åtgärder, blodkroppar och neurite beteende. Klumpar av celler inte är pläterad, prova en liten volym av celler med en P1000, plattan i en bild, och kontrollera om det finns cell klumpar. Om klumpar konstateras, pipett celler upp och ner för att manuellt bryta isär klumpar innan plätering. För DNA-syntesen och cell nummer analysen lyfts celler med enzymer för inventering och analys. Det är viktigt att bekräfta visuellt celler har helt lyfte från kultur fartyget att få korrekt räknar och om så krävs, enzym inkubation längre kan användas. Vid lågt antal eller låg CPMs för DNA syntesen analysen, celler kan beläggas vid högre initiala tätheter, radioaktiva tritierat [3H] - tymidin kan läggas för dubbel tid (4 timmar istället för 2) eller tritierat [3H] - tymidin koncentration kan dubbleras. För neurite analysen, kan inledande plätering densitet fördubblas utan att riskera ökad cell-till-cell kontakt. Uppmärksamma fördelningen av celler över en maträtt och räkna 1 cm rader så att varje del av skålen samplas. Om procentandelen neurite är för låg på 48 h, analysen kan förlängas upp till 6 dagar eller typ av beläggning substrat eller koncentration kan ändras för att främja större andel av neuriter. Det är dock viktigt att notera att beläggning tider och metoder som vi har presenterat i protokollet valdes ut för optimal neurite utväxt och cell hälsa efter att ha testat många olika substrat substrat koncentrationer och beläggning gånger. För neurosphere, kan användning av mindre pipetter (P20, P200) leda till klippning och brott på större områden. Därför är det absolut nödvändigt att pipettering sker försiktigt och med en P1000 eller serologiska pipett. För pelletering av neurospheres, rekommenderas lägre hastigheter (100 x g i stället för 300 x g) också att förhindra neurosphere dissociation. Under området plätering, garantera att sfärer är lämpligt fördelade apart sfär-till-sfären kontakt kan påverka migration. I fall där migration är för snabb eller för långsam, kan inkubationstiden vara minskade eller ökade respektive. Beläggning-substrat kan också ändras om du vill ändra migration priser.

Medan de tekniker som används är snabba, enkla och gäller för studiet av nervsystemets utveckling, finns det vissa begränsningar. För en, många av de analyser som presenterats (cell nummer test, neurite test, migration assay) kräver utredare att göra subjektiva beslut (t.ex., är detta en neurite? Är denna cell död?) vilket kan leda till utredaren bias och lägre reproducerbarhet. Dock kan genomföra analyser blinda och inställningen strikta normer för varje beslut som fattats inom ett test, som illustreras i metoderna, lindra dessa fördomar. Likaså kräver dessa analyser manuella mätningar och inventeringar, vilket kan vara tidskrävande och labor intensiv. Dock i labb som har den utrustning och de tekniska resurser, kan dessa analyser vara påskyndas med användning av automatiserad cell räknare och program som kan utföra automatiserade mätningar41,42. När det gäller DNA syntesen analysen, dessa metoder är specifika för vår cell skördare och scintillation maskin (se utrustning och material). men finns det andra tillgängliga modeller och metoder som kan användas för att få samma information, såsom Omnifilter-95 cell skördaren. För vissa institutioner kanske användning av radioaktiva källor inte genomförbart. I detta fall möjliggör en alternativ metod som använder en fluorescerande tymidin som är analog, såsom EdU, analyseras på en fluorescerande microplate reader, förvärv av samma information på massanalys av DNA syntesen44.

Vårt låg densitet kultur system separerar NPC till enskilda celler eller små klumpar, ett tillstånd som skiljer sig från den tätt packade naturen av NPC i utvecklingsländer neuralrörsdefekter. Men är NPC friska och express lämpliga markörer (figur 1, figur 10). Dessutom våra tidigare studier på mus och råtta kortikala kulturer visar parallella fynd i in vitro- kulturer och i vivo modeller visar nyttan och värdet av att använda detta tillvägagångssätt16,17,18 , 19 , 24. Dessutom detta system ger en kraftfull metod för att förstå mognaden av celler och studera cell delpopulationer. Immunohistokemi kan exempelvis utföras på neurite analysen att avgöra vilken specifik neuronala celltyp är att utvidga en neurite. I slutändan, trots vissa begränsningar, detta unika protokoll ger enkel, kraftfull och snabba metoder för att studera nervsystemets.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av New Jersey guvernörens rådet för medicinsk forskning och behandling av Autism (CAUT13APS010; CAUT14APL031; CAUT15APL041), Nancy Lurie markerar Family Foundation, Mindworks bly stiftelse och stiftelsen judiska gemenskapen av större MetroWest NJ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PSC Neural Induction Medium:
Protocol Link: https://goo.gl/euub7a 		 ThermoFischer Scientific A1647801 This is a kit that consists of Neurobasal (NB) medium and a 50x Neural Induction Supplement (NIS). The NIS is used to make 1X Neural Induction Medium and 100% Expansion Medium
Advanced DMEM/F12 Medium ThermoFischer Scientific 12634-010 Component of 100% Expansion Medium
Neurobasal Medium ThermoFischer Scientific 21103049 Component of both NIM and 100% Expansion Medium 
hESC-qualified Matrigel Corning 354277 hESC-qualified extracellular matrix-mimic gel (ECM-mimic gel) 
Y-27632 (2HCl), 1 mg Stem Cell Technologies 72302 ROCK inhibitor
6 well plates Corning COR-3506 Polystyrene plates used for NPC maintenance and for Neurosphere Migration Assay 
24 well plates ThermoFischer Scientific 2021-05 Polystyrene plates: Used for NPC DNA Synthesis Assay
35 mm dishes ThermoFischer Scientific 2021-01 Polystyrene plates: Used for NPC S-Phase Entry and Neurite Assay
Natural Mouse Laminin Invitrogen 23017-015 Substrate for coating plates: Used for NPC DNA Synthesis, S-Phase Entry, and Cell Number Assays
Fibronectin Sigma F1141 Substrate for coating plates: Used for Neurite Assay 
Poly-D-Lysine Sigma P0899 Substrate for coating plates
Penicillin/Streptomycin ThermoFischer Scientific 15140122 Antibiotic, component of NIM, 100% Expansion and 30% Expansion Media 
StemPro Accutase Gibco A11105-01 1X Cell Detachment Solution 
2.5% Trypsin (10X) Gibco 15090-046 10X enzymatic solution
0.5 M EDTA ThermoFischer Scientific AM9261 used in trypsin solution for lifting cells for DNA synthesis assay
tritiated [3H]-thymidine PerkinElmer NET027E001 Radioactive tritium, thymidine
Fisherbrand 7 mL HDPE Scintillation Vials Fisherbrand 03-337-1 Vials for liquid scintillation counting
EcoLite(+) MP Biomedicals 0188247501  Liquid scintillation cocktail
LS 6500 multi-purpose liquid scintillation counter Beckman Coulter 8043-30-1194 Liquid Scintillation Counter
Skatron Semi-automactic Cell Harvester Type 11019 Molecular Devices & Skatron Instruments, Inc. Semi-automatic cell harvester
Click-iT EdU Alexa Fluor® 488 Imaging Kit ThermoFisher Scientific C10337 EdU and staining kit for S-Phase Entry Assay
Trypan Blue Solution, 0.4% ThermoFisher Scientific 15250061 Assessing viability of cells
Grade GF/C filter paper GE Healthcare Life Sciences, Whatman 1822-849 Glass fiber filter paper
Human Basic FGF-2 Peprotech 100-18B growth factor
Pituitary Adenylate Cyclase Activating Polypeptide (PACAP-38) BACHEM H-8430 neuropeptide

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  2. Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145 (6), 831-834 (2011).
  3. Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476 (7359), 220-223 (2011).
  4. Marchetto, M. C., et al. A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143 (4), 527-539 (2010).
  5. Bershteyn, M., et al. Human iPSC-Derived Cerebral Organoids Model Cellular Features of Lissencephaly and Reveal Prolonged Mitosis of Outer Radial Glia. Cell Stem Cell. 20 (4), 435-449 (2017).
  6. Giandomenico, S. L., Lancaster, M. A. Probing human brain evolution and development in organoids. Curr Opin Cell Biol. 44, 36-43 (2017).
  7. Vaccarino, F. M., et al. Induced pluripotent stem cells: a new tool to confront the challenge of neuropsychiatric disorders. Neuropharmacology. 60 (7-8), 1355-1363 (2011).
  8. Walsh, T., et al. Rare structural variants disrupt multiple genes in neurodevelopmental pathways in schizophrenia. Science. 320 (5875), 539-543 (2008).
  9. Guilmatre, A., et al. Recurrent rearrangements in synaptic and neurodevelopmental genes and shared biologic pathways in schizophrenia, autism, and mental retardation. Arch Gen Psychiatry. 66 (9), 947-956 (2009).
  10. Pinto, D., et al. Convergence of genes and cellular pathways dysregulated in autism spectrum disorders. Am J Hum Genet. 94 (5), 677-694 (2014).
  11. Parikshak, N. N., et al. Integrative functional genomic analyses implicate specific molecular pathways and circuits in autism. Cell. 155 (5), 1008-1021 (2013).
  12. Birnbaum, R., Jaffe, A. E., Hyde, T. M., Kleinman, J. E., Weinberger, D. R. Prenatal expression patterns of genes associated with neuropsychiatric disorders. Am J Psychiatry. 171 (7), 758-767 (2014).
  13. Voineagu, I., et al. Transcriptomic analysis of autistic brain reveals convergent molecular pathology. Nature. 474 (7351), 380-384 (2011).
  14. Willsey, A. J., et al. Coexpression networks implicate human midfetal deep cortical projection neurons in the pathogenesis of autism. Cell. 155 (5), 997-1007 (2013).
  15. Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
  16. Yan, Y., et al. Pro- and anti-mitogenic actions of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide in developing cerebral cortex: potential mediation by developmental switch of PAC1 receptor mRNA isoforms. J Neurosci. 33 (9), 3865-3878 (2013).
  17. Mairet-Coello, G., et al. p57(KIP2) regulates radial glia and intermediate precursor cell cycle dynamics and lower layer neurogenesis in developing cerebral cortex. Development. 139 (3), 475-487 (2012).
  18. Tury, A., Mairet-Coello, G., DiCicco-Bloom, E. The cyclin-dependent kinase inhibitor p57Kip2 regulates cell cycle exit, differentiation, and migration of embryonic cerebral cortical precursors. Cereb Cortex. 21 (8), 1840-1856 (2011).
  19. Mairet-Coello, G., Tury, A., DiCicco-Bloom, E. Insulin-like growth factor-1 promotes G(1)/S cell cycle progression through bidirectional regulation of cyclins and cyclin-dependent kinase inhibitors via the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt pathway in developing rat cerebral cortex. J Neurosci. 29 (3), 775-788 (2009).
  20. Tury, A., Mairet-Coello, G., DiCicco-Bloom, E. The multiple roles of the cyclin-dependent kinase inhibitory protein p57(KIP2) in cerebral cortical neurogenesis. Dev Neurobiol. 72 (6), 821-842 (2012).
  21. Li, B., DiCicco-Bloom, E. Basic fibroblast growth factor exhibits dual and rapid regulation of cyclin D1 and p27 to stimulate proliferation of rat cerebral cortical precursors. Dev Neurosci. 26 (2-4), 197-207 (2004).
  22. Lu, N., DiCicco-Bloom, E. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide is an autocrine inhibitor of mitosis in cultured cortical precursor cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (7), 3357-3362 (1997).
  23. Zhou, X., Suh, J., Cerretti, D. P., Zhou, R., DiCicco-Bloom, E. Ephrins stimulate neurite outgrowth during early cortical neurogenesis. J Neurosci Res. 66 (6), 1054-1063 (2001).
  24. Falluel-Morel, A., et al. N-acetyl cysteine treatment reduces mercury-induced neurotoxicity in the developing rat hippocampus. J Neurosci Res. 90 (4), 743-750 (2012).
  25. Rossman, I. T., et al. Engrailed2 modulates cerebellar granule neuron precursor proliferation, differentiation and insulin-like growth factor 1 signaling during postnatal development. Mol Autism. 5 (1), 9 (2014).
  26. Tao, Y., Black, I. B., DiCicco-Bloom, E. In vivo neurogenesis is inhibited by neutralizing antibodies to basic fibroblast growth factor. J Neurobiol. 33 (3), 289-296 (1997).
  27. Vaccarino, F. M., Grigorenko, E. L., Smith, K. M., Stevens, H. E. Regulation of cerebral cortical size and neuron number by fibroblast growth factors: implications for autism. J Autism Dev Disord. 39 (3), 511-520 (2009).
  28. Kaplan, D. R., Miller, F. D. Neurotrophin signal transduction in the nervous system. Curr Opin Neurobiol. 10 (3), 381-391 (2000).
  29. Shen, S., Gehlert, D. R., Collier, D. A. PACAP and PAC1 receptor in brain development and behavior. Neuropeptides. 47 (6), 421-430 (2013).
  30. Suh, J., Lu, N., Nicot, A., Tatsuno, I., DiCicco-Bloom, E. PACAP is an anti-mitogenic signal in developing cerebral cortex. Nat Neurosci. 4 (2), 123-124 (2001).
  31. Falluel-Morel, A., et al. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide prevents the effects of ceramides on migration, neurite outgrowth, and cytoskeleton remodeling. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (7), 2637-2642 (2005).
  32. Ataman, B., et al. Evolution of Osteocrin as an activity-regulated factor in the primate brain. Nature. 539 (7628), 242-247 (2016).
  33. Doers, M. E., et al. iPSC-derived forebrain neurons from FXS individuals show defects in initial neurite outgrowth. Stem Cells Dev. 23 (15), 1777-1787 (2014).
  34. Pasca, S. P., et al. Using iPSC-derived neurons to uncover cellular phenotypes associated with Timothy syndrome. Nat Med. 17 (12), 1657-1662 (2011).
  35. Brennand, K., et al. Phenotypic differences in hiPSC NPCs derived from patients with schizophrenia. Mol Psychiatry. 20 (3), 361-368 (2015).
  36. Marchetto, M. C., et al. Altered proliferation and networks in neural cells derived from idiopathic autistic individuals. Mol Psychiatry. , (2016).
  37. Voineagu, I. Gene expression studies in autism: moving from the genome to the transcriptome and beyond. Neurobiol Dis. 45 (1), 69-75 (2012).
  38. Waltereit, R., Banaschewski, T., Meyer-Lindenberg, A., Poustka, L. Interaction of neurodevelopmental pathways and synaptic plasticity in mental retardation, autism spectrum disorder and schizophrenia: implications for psychiatry. World J Biol Psychiatry. 15 (7), 507-516 (2014).
  39. Quadrato, G., Brown, J., Arlotta, P. The promises and challenges of human brain organoids as models of neuropsychiatric disease. Nat Med. 22 (11), 1220-1228 (2016).
  40. Pasca, S. P., Panagiotakos, G., Dolmetsch, R. E. Generating human neurons in vitro and using them to understand neuropsychiatric disease. Annu Rev Neurosci. 37, 479-501 (2014).
  41. Huttunen, T. T., et al. An automated continuous monitoring system: a useful tool for monitoring neuronal differentiation of human embryonic stem cells. Stem Cell Studies. 1 (1), 10 (2011).
  42. Lappalainen, R. S., et al. Similarly derived and cultured hESC lines show variation in their developmental potential towards neuronal cells in long-term culture. Regen Med. 5 (5), 749-762 (2010).
  43. ThermoFisher. GIBCO Induction of Neural Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells Using PSC Neural Induction Medium. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0008031.pdf (2017).
  44. ThermoFisher. Invitrogen Click-iT EdU Microplate Assay. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/mp10214.pdf (2017).

Tags

Utvecklingsbiologi fråga 133 neuroutvecklingssjukdomar utvecklingsbiologi neurala prekursorceller iPSC hjärnsjukdom autism tillväxtfaktorer spridning neurite utväxt cellmigration
Snabb upptäckt av neurologiska fenotyper i mänskliga neurala prekursorceller (NPC)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Williams, M., Prem, S., Zhou, X.,… More

Williams, M., Prem, S., Zhou, X., Matteson, P., Yeung, P. L., Lu, C. W., Pang, Z., Brzustowicz, L., Millonig, J. H., Dicicco-Bloom, E. Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells (NPCs). J. Vis. Exp. (133), e56628, doi:10.3791/56628 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter