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JoVE Journal Developmental Biology
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Developmental Biology

Detecção rápida de desenvolvimento neurológico fenótipos nas células precursoras neurais humanas (NPCs)

Published: March 2, 2018 doi: 10.3791/56628
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 3, 3, 4, 5, 2, 1
1Department of Neuroscience and Cell Biology, Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 2Center for Advanced Biotechnology and Medicine, Department of Neuroscience and Cell Biology, Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 3The Child Health Institute of NJ, Department of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Services, Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 4The Child Health Institute of NJ, Department of Neuroscience and Cell Biology, Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 5Department of Genetics, Rutgers University
* These authors contributed equally

Summary

Desenvolvimento neurológico processos tais como consequência natural do axônio, migração e proliferação são frequentemente perturbadas em doenças neuropsiquiátricas. Assim, apresentamos protocolos para rapidamente e reproducibly avaliar estes processos de desenvolvimento neurológico em NPCs de iPSC-derivado humanos. Estes protocolos permitem também a avaliação dos efeitos da terapêutica e fatores de crescimento relevantes no desenvolvimento do NPC.

Abstract

Desenvolvimento do cérebro humano procede através de uma série de precisamente processos orquestradas, com fases anteriores distinguidos pela proliferação, migração e consequência do axônio; e estágios posteriores, caracterizados pela formação de consequência e sinapse axônio/dendrito. Em transtornos do desenvolvimento neurológico, muitas vezes um ou mais destes processos são rompidas, levando a anormalidades na formação do cérebro e função. Com o advento da tecnologia de células-tronco (hiPSC) humanas pluripotentes induzidas, os pesquisadores têm agora uma fonte abundante de células humanas que podem ser diferenciados em praticamente qualquer tipo de célula, incluindo os neurônios. Estas células podem ser usadas para estudar o desenvolvimento normal do cérebro e patogênese da doença. Um número de protocolos utilizando hiPSCs para modelar doença Neuropsiquiátrica uso terminalmente diferenciadas neurônios ou uso de sistemas de cultura 3D denominado organoids. Enquanto estes métodos provaram ser inestimáveis em estudar a patogênese de doenças humanas, existem alguns inconvenientes. Diferenciação de hiPSCs em neurônios e geração de organoids são longos e onerosos processos que podem afetar o número de experimentos e variáveis que podem ser avaliadas. Além disso, enquanto organoids e neurônios pós mitóticos permitem o estudo dos processos relacionados a doença, incluindo consequência dendrito e sinaptogênese, eles impedem o estudo de processos anteriores, como a proliferação e migração. Em transtornos do desenvolvimento neurológico, como o autismo, abundantes provas genéticas e post-mortem indicam defeitos em processos de desenvolvimento precoce. As células precursoras neurais (NPCs), uma população altamente proliferativa da célula, podem ser um modelo adequado em que perguntas sobre processos ontogenéticos e iniciação de doença. Agora estendemos metodologias aprendidas estudando desenvolvimento em camundongo e rato de culturas corticais para NPCs humanas. O uso de NPCs nos permite investigar doença relacionada com fenótipos e definir como diferentes variáveis (por exemplo, fatores de crescimento, drogas) impacto do desenvolvimento processos incluindo proliferação, migração e diferenciação em poucos dias. Em última análise, este conjunto de ferramentas pode ser usado de forma reprodutível e elevado-throughput para identificar mecanismos de doenças específicas e fenótipos em transtornos do desenvolvimento neurológico.

Introduction

A utilização de organismos mais simples e modelos de rato tem elucidados os mecanismos do desenvolvimento cerebral básica, bem como a patogênese da doença. Apesar destes avanços, a etiologia de muitos distúrbios neuropsiquiátricos continua elusiva, porque nem todos os achados em organismos mais simples são diretamente relevantes para os aspectos complexos das doenças humanas. Além disso, a maior complexidade do cérebro humano muitas vezes torna difícil para o modelo de desenvolvimento humano e distúrbios nos animais. Com a evolução e o progresso da tecnologia de células-tronco (hiPSCs) humanas pluripotentes induzidas, as células somáticas podem ser reprogramadas em células-tronco e em seguida diferenciadas em células neuronais para estudar doenças humanas. Avanços em tecnologias hiPSCs e "omic" (genômica, transcriptomics, proteômica, metabolomics) prometem revolucionar a compreensão do desenvolvimento do cérebro humano. Estas tecnologias agora tornam possível uma abordagem de "medicina de precisão" para a caracterização das doenças neuropsiquiátricas em uma base caso-a-caso.

O grampo atual no campo de modelagem de doença hiPSC é para diferenciar as células em subtipos neuronais específicos em uma monocamada ou usar um sistema de cultura 3D chamado um organoides para recapitular aspectos do cérebro desenvolvimento1,2, 3. Estes sistemas foram incrivelmente valiosos em estudando e descobrindo aspectos únicos do desenvolvimento humano e doença4,5,6,7. No entanto, tanto culturas neuronal e organoids muitas vezes exigem em qualquer lugar de semanas a meses na cultura antes de estarem prontos para estudar. A natureza demorada esses protocolos e o montante dos recursos necessários para manter que estes sistemas de cultura muitas vezes limitam o número de experiências que podem ser executadas e o número de variáveis (como fatores de crescimento ou drogas) que podem ser testados. Além disso, muitos estudos utilizando organoids e neurônios pós mitóticos concentraram-se em processos como formação de consequência ou sinapse dendrito, que ocorrem mais tarde, em desenvolvimento. Enquanto estes processos têm sido implicados na patologia dos transtornos globais do desenvolvimento como autismo e esquizofrenia, no início do desenvolvimento eventos que ocorrem antes de diferenciação neuronal definitiva também são importantes para a patogênese da doença8 ,9,10,11,12,13. De fato, estudos genômicos recentes mostram que o período de meados de-fetal, que é composto de proliferação, migração e consequência natural do processo, é particularmente importante na patogênese de autismo11,14. Assim, é importante estudar o tronco neural e populações de células progenitoras para entender melhor estes processos anteriores. Sistemas de organoides que são recapitular considerado para melhor desenvolvimento do cérebro humano devido à sua natureza 3D e estrutura organizada, contêm um pool de progenitor que tem sido utilizado para estudar alguns desses eventos anteriores. No entanto, a população do progenitor em organoids muitas vezes é escassa e mais como células gliais radiais que neural tronco ou progenitoras células5,15. Assim, seria benéfico ter um método de alto throughput para estudar os estágios iniciais de neurodesenvolvimento em uma população de células ativamente proliferativa.

No laboratório, nós criamos um protocolo que utiliza células precursoras neurais hiPSC-derivado (NPCs), uma população mista de haste neural e de células progenitoras que é altamente proliferativas, para estudar processos de desenvolvimento neurológico, como a proliferação, migração celular, e extensão do processo inicial (axônio). Estes ensaios foram desenvolvidos a partir de técnicas utilizadas em nosso laboratório durante décadas para estudar com sucesso neurodesenvolvimento em rato e rato culturas cortical16,17,18,19,20, 21,22,23. Importante, também foi mostrado que fenótipos e sinais regulamentares definidos nos sistemas de cultura de rato e rato são altamente preditivos dos mecanismos que estão ativos na vivo, indicando o valor destas técnicas16, 17,18,19,24. Após a diferenciação inicial de hiPSCs para NPCs, estes métodos permitem estudar processos de desenvolvimento vitais, em questão de dias. Esses métodos têm muitas vantagens: (1) exigem equipamentos pouco sofisticados e são fáceis de implementar, (2) numerosas repetições experimentais podem ser realizadas em um curto período de tempo, permitindo a rápida confirmação da reprodutibilidade dos resultados e (3) variáveis de cultura como matrizes de revestimento, os efeitos de fatores de crescimento e atividade de fármacos podem ser testadas de forma rápida e econômica. Além disso, aproveitamos o papel bem estabelecido extracelulares de fatores de crescimento como reguladores da críticos dos diversos processos de desenvolvimento. NPCs foram expostos para selecionar sinais do desenvolvimento que diretamente estimulam eventos como consequência de axônio, proliferação e migração celular e tem encontrado que eles aprimoram a capacidade de identificar defeitos que não são aparentes em condições de controle19 , 25 , 26 , 27 , 28. da mesma forma, a facilidade de avaliar drogas fornece uma poderosa Avenida para adotar técnicas de medicina de precisão para testar a eficácia de diversas intervenções terapêuticas. Assim, este protocolo facilita um alto throughput, reprodutível e uma metodologia simples para estudar o desenvolvimento precoce do cérebro, patogênese da doença e os potenciais efeitos benéficos de drogas e fatores de crescimento no desenvolvimento neurológico fenótipos.

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Protocol

1. segurança procedimentos e manutenção do gabinete de segurança biológica

  1. Procedimentos de segurança de nível de biossegurança 2 (BSL-2)
    1. Siga as orientações da instituição sobre como trabalhar com materiais BSL-2. Descarte de materiais de BSL-2 de acordo com as práticas da instituição. Indica os quartos e equipamentos que são usados para materiais BSL-2. Use todos os equipamento protetor pessoal (PPE), incluindo luvas e jaleco.
  2. Manutenção do gabinete de segurança biológica
    1. Use um gabinete de segurança biológica certificado para uso de materiais de nível BSL-2.
    2. Ligue a luz UV na biossegurança do armário pelo menos 15 min e em seguida pulverizar as superfícies com solução 10%. Permitir que a solução de lixívia a descansar por 15 min, limpar o gabinete e ativar o fluxo de ar antes de usar.
  3. Tritiada radioativa [3H]-timidina (trítio) os procedimentos de segurança
    Nota: O trítio é uma fonte radioativa de categoria 5, 'o mais improvável que seja perigoso' Categoria. Siga as diretrizes da instituição para trabalhar com radioactividade. Algumas instituições podem exigir certificados ou autorizações para lidar com trítio.
    1. Recebem treinamento da instituição sobre como manipular e alienar trítio corretamente. Descarte de resíduos radioactivos em recipientes adequados, de acordo com as políticas da instituição. Use o EPI quando se trabalha com trítio.

2. neural indução de iPSCs

Nota: Para tornar NPCs, foi seguida uma versão ligeiramente modificada de um protocolo que acompanha um kit de indução neural disponíveis comercialmente. O kit é composto por mídia Neurobasal (NB) e um suplemento de indução Neural (NIS), que é usado para fazer um 1 x médio de indução Neural (NIM) de 50x. NIS também é usado para fazer 100% médio de expansão (ver secção 3.1). Um link para o protocolo encontra-se a seção de materiais e equipamentos e referências43.

  1. Passagem iPSCs quando eles se tornam confluente de 70-80%.
  2. Placa 300.000 iPSCs em 1 bem de um qualificado hESC extracelulares matriz-imitam gel (gel de ECM-mímico) revestido 6 placa contendo 2 mL do meio de iPSC alimentador-livre com 5 μM de inibidor ROCK. Ver seção 3.2 para obter instruções sobre poços de revestimento com gel de ECM-mímico.
  3. Um dia depois, remova o iPSC médio + ROCK iPSCs inibidor e lave uma vez com 1X PBS. Adicione 2 mL de NIM para o iPSCs.
    Nota: 50ml de NIM é feita pela adição de 1 mL de 50 x NIS e 250 µ l (50 unidades/mL, 5 µ l/mL) de penicilina/estreptomicina (P/S) a 49 mL de NB Media.
  4. Mudança de mídia da indução neural aspirando a cada 2 dias gasto médio e substituindo com 2 mL de NIM até as células que se tornam confluentes (em torno de 4-5 dias). Mudar a mídia diariamente, uma vez que as células são confluentes.
  5. As células de passagem após 7 dias no NIM e placa em um gel de ECM-mímico revestido 6 placa contendo 2 mL de 100% de expansão de mídia e inibidor ROCK 5 μM. As células são consideradas passagem 0 (P0) NPCs neste ponto. Consulte a secção 3.1 abaixo para obter instruções fazer a mídia de expansão de 100%.
  6. Células de passagem usando os métodos descritos na seção 3.4. Espere até que as células chegaram a P2 e são confluentes antes dissociando para manchar para marcadores NPC e chapeamento para experimentos (Figura 1).

3. meios de cultura, revestimento e manutenção de NPCs

  1. Preparação de mídia para a manutenção de NPCs (Media de 100% de expansão):
    1. Faça 50 mL de 100% expansão mídia combinando 24,5 mL de DMEM/F12 com 24,5 mL de NB.
    2. Adicione 1 mL de 50 x NIS para o DMEM/F12 + solução NB. Adicione 250 μL de solução de P/S para a mídia.
      Nota: A mídia pode ser refrigerado (4 ° C) e usado por até 2 semanas. Menores volumes de meios de comunicação podem ser feitas ajustando os volumes de DMEM / F12 + NB + NIS usando os mesmos índices quanto o volume de 50 mL.
  2. Preparação de ECM-mímico Gel revestido placas de cultura para a manutenção do NPC
    1. Alíquota gel de ECM-imitam o volume necessário para fazer 6 mL da solução de trabalho. Calcule o volume de alíquota por olhar para a folha de certificado de análise desde ECM-mímico gel fator de diluição varia de lote para lote e o lote a lote.
    2. Descongelar uma alíquota de gel de ECM-mímico no gelo e dissolver-se 6 mL de DMEM/F12 criogênicos.
    3. Adicione 1 mL de solução de ECM-mímico gel/DMEM/F12 para cada poço de uma placa bem 6. Incubar a placa de 6 com ECM-mímico-solução de gel por 30 min a 37 ° C.
    4. Aspirar a solução de ECM-mímico gel após 30 min de incubação e substituir com a mídia de expansão de 100% ou refrigerar placas (4 ° C, até 1 semana) sem aspirar a solução de gel-ECM-mímico.
  3. Manutenção de NPCs
    1. NPCs de placa em uma densidade de 1,5 milhões de células em um ECM-mímico gel-revestido bem contendo 2 mL de mídia de expansão de 100%.
    2. NPCs, incube a 37 ° C, em um ambiente úmido com 5% de CO2.
    3. Adicione 5 μM de inibidor ROCK para a mídia por NPCs em P3 ou inferior, ou por NPCs descongeladas, para evitar a morte celular excessiva. Mudar a mídia após 24 h para remover o inibidor ROCK.
    4. Células de passagem em 4-9 dias, dependendo de quando eles se tornam confluentes. As células são consideradas confluentes quando eles se tornam um monolayer densamente cobrindo toda a parte inferior da superfície do prato.
    5. Placa de NPCs em uma densidade de 1 a 1,5 milhões de células por um poço de uma placa de 6 (ver seção 3.4). Remova a mídia gasta cada 48 h e substitua com 2 mL de mídia de expansão de 100%.
  4. Levante, dissociar, pelota e NPCs para manutenção e/ou chapeamento para condições experimentais
    1. Aspire células médias, lave uma vez com 1X PBS. Aspire PBS e adicione 500 μL de solução de destacamento 1 x celular em 1 bem de confluente NPCs. Incubar durante 10 minutos a 37 ° C.
    2. Adicionar 500 μL de temperatura (RT) PBS e lave-o bem com uma pipeta P-1000 para assegurar a remoção das células. Colete as células + solução de PBS em um tubo cônico de 15 mL. Lavar a placa novamente com 1 mL de PBS e adicione o líquido no tubo.
    3. Gire as células para baixo a 300 x g por 5 min granular.
    4. Remova o centrifugado sobrenadante e ressuspender as células em 1-5 mL de mídia DMEM/F12 previamente aquecida. Dilua as células de uma densidade de 1 a 4 milhões de células/mL de mídia. Quantificar células usando um hemocytometer.
    5. Placa o número necessário de células, específicas para manutenção NPC (seção 3.3) ou o ensaio individual sendo realizado (ver seções subsequentes para mais detalhes).
    6. Ajuste o volume de suspensão celular com meios de comunicação para que entre 15 a 100 μL de células são usadas para cada poço/prato. Este volume de pequenas garante que não há distribuição de celular mesmo e que fatores de crescimento, drogas ou substratos no meio não são diluídos.
    7. Incubar as células a 37 ° C. Mudar a mídia todas as 48 h para a manutenção do NPC ou Ver os detalhes específicos para ensaios individuais.
  5. Preparação de mídia para condições experimentais (Media de 30% de expansão)
    1. Diluir a mídia de expansão de 100% de 70% (denominado 30% expansão) pela adição de 1:1 DMEM/F12 + solução NB para tornar a mídia para condições experimentais.
    2. Faça 20 mL de mídia de expansão de 30% adicionando 6 mL de mídia de expansão de 100% e diluir com 7 mL de NB e 7 mL de DMEM/F12 mídia. Adicione 5 µ l/mL da solução de P/S.
      Nota: Se a mídia 100% já contém P/S, em seguida, adicione 5 µ l/mL para o combinado-DMEM / F12 + NB = (14 mL) x (5 µ l/mL) = 70 μL de P/S em vez de 100 µ l.
    3. Adicione carcaças do revestimento e fatores de crescimento em concentrações desejadas para a mídia de expansão de 30%.

4. avaliar a síntese do ADN, fase S entrada e número de células de NPCs

  1. Preparação para a síntese de DNA, fase S entrada e ensaio de número de células
    1. Faça um 1 mg/mL de solução de poli-D-lisina (PDL) em dH2O e filtro esterilizar. Dilua 01:10 em dH2O para fazer um 0,1 mg/mL solução PDL e adicionar 300 μL de cada poço de uma placa bem 24 ou 1 mL para um prato de 35 mm. Incubar durante 20 min em RT.
    2. Lavar os poços do PDL 3 vezes por 5 min com dH2aspirado O. dH2O e adicionar 300 μL/poço ou 1 mL/prato de laminina (5 μg/mL) diluído em 1X PBS. Cobrir as placas com parafilm e manter em uma estéril, biossegurança do armário a noite no RT (12 a 24 h).
    3. Preparar a mídia de expansão de 30% (ver secção 3.5) após 12 a 24 h. Add veículos, fatores de crescimento ou drogas de interesse na concentração desejada em volumes que são menos de 10% da solução para evitar a diluição NIS em 30% do total médio de expansão.
    4. Cada um Lave bem da placa 24-bem duas vezes com PBS 1x (5 min cada). Aspire 1X PBS e adicionar 450 μL de mídia (sem ou com fatores de crescimento/drogas). Incube a placa a 37 ° C durante pelo menos 15 minutos antes de chapear pilhas.
    5. Para cada experimento, configure 2-3 poços ou pratos por condição.
    6. NPCs de placa (ver secção 3.4):
    7. Ensaio de síntese de DNA NPC: 100.000 células/poço em um prato bem 24
    8. Fase S entrada: prato de mm 500.000 células/35
    9. Ensaio de número de celular: 50.000 células/poço em uma placa de 24
  2. Ensaio de síntese de DNA de células neurais Precursor
    1. Placa de 100.000 células/poço em uma placa de 24 e avaliar em triplicado/condição.
    2. Adicionar tritiada radioativa, [3H]-timidina ao meio de cultura (1,5 μCi/mL) em cada poço após 46 h na cultura. Incube as células a 37 ° C por 2 h.
      Nota: Quando utilizar materiais radioativos, recebem treinamento da sua instituição, segue os protocolos de segurança de radioactividade e descarte de materiais radioativos nos receptáculos apropriadamente designados de resíduos.
    3. Remover e corretamente descarte radioativa mídia após 2 h. Adicionar 300 μL de pré aquecido 0,25% do trypsin-EDTA (0,5 mM) a cada poço e incube por 20 min a 37 ° C.
    4. Ligue a colhedora de célula (ver materiais e equipamento seção) e a bomba e verifique se a pressão da bomba está abaixo de 200 PSI. Coloque o papel de filtro através do espaço na colhedora de célula e arrancar no canto direito para marcar a orientação do papel.
    5. Colocar tubos de coletando da ceifeira de célula em uma bandeja vazia "em branco" e pressione prélavagem para umedecer o papel de filtro. Coloque os tubos de coletando em poços de amostra e execute (start).
    6. Quando a colhedora de célula terminou a coleta de amostras, levante a braçadeira e avanço de papel de filtro para repetir para todos os conjuntos de amostra. Sempre pré-lavagem em um prato vazio, "em branco".
    7. Secar com papel de filtro sob uma fonte de luz e configurar correspondentes frascos em uma bandeja. Um soco chads de papel dentro dos frascos e adicione 2 mL de coquetel de cintilação líquida a cada frasco. Frascos tampa e rótulo.
    8. Incube frascos de cintilação líquida cocktail pelo menos 1h antes de ler as contagens por minuto (CPMs) em uma máquina de cintilação.
  3. Ensaio de fase NPC S entrada
    1. Consulte a seção 3.4 para obter as etapas para levantar, dissociar, pelota e re-suspender as células.
    2. Placa de 500.000 células por prato para os 35mm pratos preparados na seção 4.1, somente 1 prato/condição para esta etapa.
    3. Agite os pratos e para trás em todas as direções para garantir uma distribuição uniforme de células. Incube as células a 37 ° C para 46 h.
    4. Prepare três placas de 35 mm, revestidas com PDL/laminina por condição após 24 h. Por exemplo, se existe um prato de 35 milímetros de mídia de expansão de 30% e um prato de 35 milímetros de mídia de expansão de 30% + FGF (10 ng/mL) em seguida casaco 6 PDL/laminina placas para uso no dia seguinte.
    5. Adicione 2 µ l/mL de 5mm EdU para culturas após 46 h. Incubar por 2 h.
    6. Dissociar e as células (ver secção 3.4) de Pelotas. Ressuspender o sedimento celular em 3 mL de mídia de expansão de 30% ou 3 mL de mídia de expansão de 30% + fatores de crescimento desejadas/drogas.
    7. Placa 1 mL por prato pré-revestida PDL/laminina pratos. Agite os pratos e para trás em todas as direções para garantir uma distribuição uniforme de células. Incube a 37 ° C por 2 h permitir que as células aderir ao prato. Consulte a Figura 2 para um cronograma simplificado.
  4. Análise de fase S entrada
    1. Corrigir os pratos com gelada 4% paraformaldeído (PFA em 1X PBS) por 20 min. Em seguida, lave a louça por 5 min com PBS 1x por 3 vezes.
    2. Adicionar 1 mL de 1X PBS com 0,05% de azida de sódio para evitar o crescimento de bactérias e fungo. As células podem ser armazenadas a 4 ° C por até 6 meses se pratos (selados com parafilm) são mantidos no PBS + sódio solução de azida, embora não todos imunológicos antígenos são bem preservados após longos atrasos na análise.
    3. Ensaio de células usando uma reação de EdU comercial kit (Veja o protocolo do fabricante). Mancha de células usando o DAPI ou outro marcador nuclear e imagem usando microscopia de fluorescência.
    4. Avalie a proporção de células positivas EdU sobre cortinas de total de células vivas (número total de células) em 10 campos sistematicamente aleatórios (10x). Não incluem as células mortas em análise.
    5. Utilizam ambas imagens de contraste de fase e imagens fluorescentes para determinar coloração positiva de EdU e para determinar quais células estão mortas ou vivos (Figura 3).
    6. Contagem de todas as células que têm ambos liso e nem membrana celular nas configurações de contraste de fase e um grande núcleo desfragmentado pelo fluorescente DAPI nuclear mancham, estas células são vida (Figura 3A-B).
    7. Excluir todas as células que são a fase brilhante, ter uma partido desigual da membrana celular e têm um núcleo pequeno, condensado, como visualizado por fluorescentes DAPI de imagens, como estas células são mortas (Figura 3A-B). Avalie células vivas para a expressão do EdU, identificando as células com EdU fluorescente brilhante mancha cobrindo o núcleo inteiro ou coloração fluorescente salpicados no núcleo (Figura 3).
  5. Ensaio número de células NPC
    1. Depois de 2 dias em cultura, rotular e preparar tubos de microcentrifuga de 1,5 mL e 0,5 mL microcentrifuge tubos. Em cada tubo de 0,5 mL, adicione 5 μL de Trypan azul.
    2. A cada poço de uma placa bem 24, remover médio e adicionar 200 μL de 1 x solução de desprendimento de célula e lugar na incubadora para 10 a 15 min.
    3. Após o limite de tempo, uma vez que as células têm levantado, adicione a quantidade desejada de 1X PBS a cada poço.
      Nota: Normalmente, no dia 2, adicione 300 μL de 1X PBS para as células contendo bem mais 200 μL da solução de desprendimento, para um volume total de 500 μL. Com o tempo de incubação adicional de cultura, como as células se tornam mais confluentes, aumente o volume de diluição conforme necessário. Por exemplo, no dia 4, adicionar 500 μL de 1 x PBS e no dia 6, adicionar 800 μL de 1X PBS. Volumes totais serão 700 μL e 1 mL, respectivamente.
    4. Usando uma pipeta P-1000, pipete acima e para baixo em cada bem 4 a 5 vezes para remover as células. Examine a placa sob um microscópio para garantir que todas as células têm destacado. Transferência de células para tubos de 1,5 mL.
    5. Inverta os tubos de 1,5 mL com células diluídos 2 a 3 vezes. Então pegue um 50 μL alíquota de células do meio do tubo e adicionar aos tubos de 0,5 mL com Trypan azul (ver 4.5.1).
    6. Solução de célula de pipeta e descer 2 a 3 vezes. Adicionar células para o hemocytometer e analisar imediatamente. À espera de mais do que 10 min pode aumentar a morte celular ou a presença de células que assumiram Trypan azul.
    7. Cuidadosamente, adicione 10 µ l de celular + azul Trypan mistura para cada lado da hemocytometer para realizar contagens de replicar. Contar as células usando o microscópio de contraste de fase. Não contam as células mortas ou as células de azuis escuras que assumiram Trypan azul.
    8. Para obter o número, use de célula total à média celular contados de 4 cantos do hemocytometer e aplicar a seguinte equação:
      Quer dizer o número do celular x volume de mídia (mL) x 10,000 = número da célula Total/poço
    9. Aspire e repita o procedimento em poços restantes. Altere os meios de comunicação sobre as células que não estão sendo contadas, cada ensaio de repetição de 48 h. em dias 4 e 6.

5. NPC axônio ensaio

  1. Preparação de pratos e mídia para o ensaio do axônio
    1. Faça um 1 mg/mL de solução de poli-d-lisina (PDL) em dH2O e filtro esterilizar. Dilua 01:10 em dH2O para fazer uma solução PDL de 0,1 mg/mL e adicionar 1 mL para cada prato de 35 mm. Incubar durante 20 min em RT.
    2. Entretanto, preparar a mídia de expansão de 30% (ver secção 3.5) e adicionar 5 μg/mL (5 µ l/mL) de solução de fibronectina (estoque de 1 mg/mL) para a mídia.
    3. Uma vez que a mídia está preparada, adicione veículos, fatores de crescimento ou drogas de interesse em concentrações desejadas.
      Nota: Recomenda-se adicionar o veículo, fatores de crescimento ou drogas, em volumes < 10% da solução total para evitar diluir a fibronectina e outros componentes no meio de expansão de 30%.
    4. Depois de 20 min, lave pratos PDL 3 vezes por 5 min com dH2O para remover o excesso PDL. Certifique-se de pratos estão secos antes de adicionar mídia.
    5. Coloque 1 mL de mídia (com ou sem fatores de crescimento/drogas) + solução de fibronectina em cada prato revestido de PDL.
    6. Incube os pratos a 37 ° C durante pelo menos 30 min antes de chapear pilhas para garantir a adequada fixação da fibronectina para o PDL.
    7. Para cada experimento, configure 2-3 pratos por condição (por exemplo, veículo contendo 3 pratos, 3 pratos contendo fármaco).
  2. Chapeamento de NPCs para o ensaio do axônio
    1. Consulte a seção 3.4 para obter as etapas para levantar, dissociar, de pelotas e ressuspender as células.
    2. Placa de 50.000 células por prato para os pratos preparados na secção 5.1. Agite os pratos e para trás em todas as direções para garantir uma distribuição uniforme de células.
    3. Incube as células a 37 ° C por 48 h.
  3. Análise de neuritos
    1. Após incubação de células por 48 h, Aspire o meio e corrigir pratos com gelo frio 4% PFA por 20 min.
    2. Depois de 20 min, lave pratos, 3 vezes por 5 min com PBS 1x. Após a lavagem final, adicionar 1 mL de 1X PBS com 0,05% de azida de sódio.
    3. Analise pratos cegamente em um microscópio de contraste de fase em 32 X. Contar células totais e células com neuritos em 3 linhas de 1 cm, escolhidos aleatoriamente posições mas pode ser reproduzidas. Conte com um mínimo de 150 células por prato para garantir a amostragem adequada.
      Nota: Um axônio é definido como uma extensão (processo) do corpo do celular é > 2 diâmetros do corpo celular de comprimento. Para as células com vários processos, o processo mais longo é considerado para o critério. Células com processos que são < 2 corpo celular diâmetros de comprimento não são incluídos (Figura 4).
    4. Somar o número total de células e o número total de células com neuritos em cada prato. Calcule a % de células com neuritos. A percentagem de células com neuritos em replicar pratos de média. Confiança na reprodutibilidade experimental é estabelecida quando todas as linhas dentro de cada prato são semelhantes, e as médias entre os pratos são altamente similares, com o erro padrão da média (SEM) < 10%.
    5. Alternativamente, analisar neuritos através da realização de imunocitoquímica para marcadores tais como beta-III-tubulina (TUJ1) ou MAP2. Depois da coloração para o marcador de interesse, com 10 imagens sistematicamente aleatórias em um microscópio fluorescente em 10x. Imagem de pelo menos 200 células. Neste caso, adquira as imagens não muito próximo à borda do prato. Analise a percentagem de células com TUJ1 ou MAP2 + neuritos (veja a Figura 10 , por exemplo).

6. NPC Neurosphere ensaio de migração

  1. Formação neurosphere
    1. Adicione 1 mL de mídia de expansão de 100% em um prato de 35 mm com substrato sem revestimento. Incube os pratos pelo menos 15 min a 37 ° C antes do chapeamento NPCs. preparar pratos de 2-3 para garantir que não haja será suficiente neurospheres para o ensaio de migração celular.
      Nota: A ausência de um substrato de revestimento assegura que NPCs permanecem suspensas nos meios de comunicação, que é essenciais para a formação de neurosphere. Pratos de revestimento impedirá a formação de neurosphere.
    2. Ver seção 3.4 sobre as etapas para levantar, dissociar e células de Pelotas. Resuspenda o pellet celular em 2-5 mL de pré-aquecido 100% meios de expansão. Placa 1 milhão NPCs em cada prato de 35mm preparado na secção 6.1.1.
    3. NPCs, incube a 37 ° C por 48 a 96 h permitir NPCs para agregação e forma neurospheres. Avalie a esfera tamanho usando uma régua ao vivo em um microscópio de contraste de fase. Esperar que a maioria das esferas para atingir um diâmetro aproximado de 100 µm (± 20 μm) (Figura 5). Esferas menores completamente irão dispersar e se quebram durante o ensaio de migração.
  2. Preparação de placas para ensaio de migração de Neurosphere
    1. Dissolva o ECM-mímico gel de alíquotas (ver seção 3.2) em 6 mL de mídia de expansão de 30%. Uma vez ECM-mímico gel/30% expansão mídia solução é preparada, adicionar veículos, fatores de crescimento ou drogas de interesses nas concentrações desejadas.
      Nota: Veículo, droga e concentrações de fator de crescimento precisam ser aumentado para conta para a adição de 200 µ l de neurospheres na seção 6.3.
    2. Placa 1 mL da ECM-mímica gel solução de mídia de expansão de 30% (± veículos, fatores de crescimento ou drogas) em um poço de uma placa de 6. Faça 2-3 poços por condição experimental. Alternativamente, podem ser usados 35mm pratos. Incubar as placas durante pelo menos 30 min a 37 ° C.
      Nota: Não aspire o ECM-mímico gel/30% solução de mídia de expansão para este ensaio. Chapeamento de esferas em um gel de ECM-mímico aspirado levará a migração rápida e excesso.
  3. Neurospheres de chapeamento
    1. Recolher neurospheres formada em secção 6.1 e colocá-los em um tubo cônico. Lave a 35mm pratos com 1 mL de 1X PBS para garantir todos os neurospheres são coletados. Spin para baixo o neurospheres coletados em 100 x g durante 5 min.
    2. Ressuspender o neurospheres em 1-3 mL de pré-aquecido 30% meios de expansão. Se 1 prato de neurospheres é coletado, 1 mL de mídia é usado para Ressuspender as esferas. Se 2 pratos são coletados, 2 mL de mídia são adicionados para Ressuspender as esferas, etc. Pipetar suavemente e use apenas um P-1000 para esferas não sejam quebradas.
    3. Placa de 200 μL da ressuspensão neurospheres para o ECM-mímico gel/30% solução de expansão feita na seção 6.2. Placas de pedra em todas as direções para distribuir uniformemente o neurospheres. Incubar as placas por 48 h a 37° C.
    4. Remover solução de mídia de expansão gel/30% ECM-mímico e reparar células em 4% PFA, lavar e manter as células em 1X PBS + 0,05% de azida de sódio.
  4. Análise de Neurospheres
    1. Adquira imagens de neurospheres inteiro usando as configurações de contraste de fase em 10 X. Certifique-se de esferas não estão tocando um ao outro. Medida média migração usando o software ImageJ.
    2. Trace o contorno externo do neurosphere usando a ferramenta de linha à mão livre. A linha à mão livre pode ser acessada clicando no ícone "reta". Manualmente o rastreamento usando um mouse.
    3. Use a função de medida para calcular a área do rastreamento. Certifique-se de que a "área" é selecionada como uma leitura na janela "Definir medições" encontrada sob a guia de analisar. Veja a Figura 6 para rastreamento de contorno externo em azul.
    4. Rastrear a massa celular interna da área de esfera e medida. Veja a Figura 6 para rastreamento do contorno interior em vermelho. Quantificar migração média subtraindo-se a massa celular interna da área total de neurosphere.
    5. Neurospheres medida que apresentam uma massa celular interna densamente com células migrando para fora como um tapete contíguo (Figura 6).
    6. Não incluem as células fora da passadeira ou desligado do neurosphere para a medição. Veja a Figura 6 para obter exemplos de células (circulados em branco) que são excluídos da medição tapete exterior. Analise um mínimo de 20 neurospheres para cada condição.

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Representative Results

Um dos objetivos desses estudos é definir a atividade proliferativa dos NPCs, ou seja, um aumento no número de células. Isto é conseguido através da avaliação de síntese de DNA da população total da célula, uma abordagem de alto rendimento que mede a incorporação de timidina tritiada de traçador radioativo em extratos de células e reflete todas as células empenhadas fase S, se eles são sintetizando, por 5 minutos ou as duas horas inteiras. Além disso, estes ensaios permitem a determinação da proporção de células que entrar fase S e o número de células totais, um ensaio mais trabalhoso de células únicas. Células sintetizam DNA na fase S, uma etapa que precede a mitose e a divisão celular, que deve ocorrer a fim de aumentar o número de células. Desde estes processos demorar algum tempo, alterações na síntese de DNA, avaliadas em 48 horas não podem estar associadas com alterações no número de células neste ponto do tempo. No entanto, verificou-se que as alterações na síntese de DNA em 48 horas confiável preveem aumentos do número de células nos dias 4 e 6.

Na apreciação da síntese de DNA, as células são banhadas em uma densidade de 100.000 células (~ 50% confluente) em uma placa de 24 em podem crescer durante 48 horas antes de fazer medições. Usar esta densidade garante que as células se assemelham a seu ambiente monocamada, mas também não cresce tão rapidamente em um período de 48 h que a mídia se torna muito ácida. Meios de comunicação que é muito ácidos podem afetar significativamente o metabolismo celular e assim, alterar os resultados de proliferação. Se as linhas de célula específica são altamente proliferativas, o pesquisador deve considerar alterar a densidade celular, volume de mídia, ou mídia troca de frequência para evitar condições altamente ácidas. Se as condições forem alteradas, é fundamental para ser consistente quando comparando linhas celulares diferentes porque contatos alterações dependentes de célula para célula certamente afetam as taxas de crescimento. O design simples destes ensaios nos permite testar diferentes fatores de crescimento. Como visto na Figura 7, a adição do fator de crescimento fibroblástico (FGF, 10 ng/mL) para 48 horas aumenta a síntese de DNA em ~ 40%. Além disso, o ensaio de síntese de DNA é reprodutível como todos os clones e os indivíduos mostram um aumento na síntese de DNA após estimulação de FGF. O potencial de variabilidade da linha de base e FGF estimulou a síntese de DNA entre diferentes indivíduos afetados, bem como o potencial para variabilidade clonal no mesmo indivíduo é demonstrada na tabela 1. Devido a essa variabilidade, é importante testar vários clones de iPSC por indivíduo, bem como avaliar um mínimo de 3 a 5 linhas NPC derivado de cada clone de iPSC diferentes. Realizou-se um mínimo de 3 experimentos para cada linha NPC.

O ensaio de síntese de DNA nos permite avaliar rapidamente numerosos grupos experimentais em uma moda de alta produtividade e a medida reflete a soma total da síntese de DNA, independentemente da duração da fase S (5 minutos a 2 horas). Para definir a proporção de células em fase S, utilizou-se o ensaio de entrada da fase S. Para este ensaio, as células são cultivadas na mesma densidade, como mencionada anteriormente para permitir monocamada, como dinâmica ocorrer, mas então eles são dissociados após 2 dias e permitiu a aderir brevemente ao placas para realizar análise de célula única. Contar células em um monolayer pode ser difícil devido ao elevado contato célula a célula e variabilidade regional na placa. Este paradigma nos permite modelar as células como uma monocamada e em seguida, analisá-los como células únicas. Ele também atua como uma confirmação metodologicamente independente dos dados obtidos no ensaio de síntese de DNA. Como pode ser visto na Figura 8, 48 horas de estimulação de FGF (10 ng/mL) aumenta a proporção de células entrando em fase S ~ 25%.

Ao avaliar o número de células, uma menor densidade celular é usada do que em ensaios os acima mencionados, com 50.000 células sendo banhadas por alvéolo de um 24 bem a placa. Novamente, esta densidade foi escolhida para assegurar que linhas de celulares mais rápidas não crescem tão rapidamente ao longo do período de 6 dias que o pH do meio torna-se muito ácido e fica amarelo. Na Figura 9, enquanto o número de células não pode ser significativamente diferente entre controle e grupos FGF (10 ng/mL) em 2 dias, as alterações na síntese de DNA a 48 h (Figura 7) são preditivas de mudanças no número de células com 4 e 6 dias.

Enquanto NPCs são normalmente cultivadas em alta densidade, o ensaio de axônio é conduzido em uma densidade de 50.000 células banhado em um prato de 35 mm para avaliar células únicas. Mesmo com essa baixa densidade, o NPC culturas cytoskeletal expressam proteínas e fatores de transcrição característicos de NPCs como NESTIN, SOX2 e PAX6 (Figura 10 A-D). Isto indica que uma baixa densidade de cultivo não significativamente alterar destino célula neste período de tempo. Além disso, condições de baixa densidade semelhantes têm sido utilizadas em sistemas de cultura de rato e rato para detectar fenótipos que foram, finalmente, pode ser reproduzido na vivo16,17,18,19, 20,21,22,23. Após 48 horas de incubação, uma pequena proporção de NPCs começam a estender neuritos como visto na Figura 11A e B e quantificado no gráfico na Figura 11. A proporção de células que se estendem de neuritos, o comprimento de neuritos e o número de neuritos/célula pode ser medida para avaliar parâmetros do desenvolvimento. Para avaliar com precisão o percentual de células com consequência do axônio, é importante que as células são banhadas como células únicas ou de aglomerados de < 5 células e agregados não tão grandes. Como visto na Figura 10 E-F, células rolamento neuritos (seta branca) também expressam tubulina de marcador neuronal imaturo beta-III (TUJ1). Como mencionado nos métodos, imagens fluorescentes podem ser adquiridas de TUJ1 manchado NPCs e então estas imagens podem ser contadas para a proporção de TUJ1 + neuritos para garantir a origem neuronal dos processos. Em nosso laboratório, análises por ambos os métodos têm rendido resultados estatisticamente semelhantes.

O design simples e a natureza rápida do ensaio do axônio também permitem testar os efeitos de desenvolvimento relevantes de fatores de crescimento, citocinas e peptídeos. Por exemplo, a Figura 11 mostra que a hipófise neuropeptide adenilato ciclase ativando polipeptídeo (PACAP, 3 nM) consequência de axônio aumentos em NPCs. PACAP é um importante factor de desenvolvimento que tem grande expressão no SNC e tem se mostrado ser importante no desenvolvimento do cérebro. Roedores estudos em nosso laboratório e outros laboratórios descobriram que PACAP tem generalizados dependente da fase do desenvolvimento efeitos tais como a regulação axônio consequência natural, migração e proliferação em ambos o rombencéfalo e prosencéfalo16,22, 29,30,31. Estudos recentes pelo Ataman et al (2016) usando culto humano fetais células corticais indicam que a atividade neuronal induz um 9-fold aumento da expressão do gene PACAP, indicando a importância dos peptídeos em desenvolvimento neuronal humana32. Com efeito, a tabela 2 mostra o percentual de neuritos no controle e PACAP (3 nM) condições entre inúmeras linhas derivado de indivíduos afetados. Como pode ser visto na tabela 2, há uma variabilidade no percentual de neuritos expressados em linhas de células derivadas de clones diferentes do mesmo indivíduo e de NPCs derivados de indivíduos diferentes. No entanto, estes indivíduos afetados têm um aumento em consequência do axônio em resposta a PACAP, indicando a reprodutibilidade dos ensaios.

Como consequência do axônio, migração celular é um importante processo de desenvolvimento essencial para a conexão adequada, organização e fiação do cérebro. Neurospheres nos permitem estudar a migração de NPC em uma condição de alta densidade típica que mantém contato célula-célula entre NPCs (Figura 12). Factores relevantes desenvolvente também podem ser testados em neurospheres para avaliar seus efeitos sobre a migração. Por exemplo, a Figura 12 mostra que PACAP (10 nM) aumenta a migração de NPCs.

Figure 1
Figura 1: NPCs na passagem 3. NPCs em P3 expressam vários marcadores de estágio específico, incluindo (A) fator de transcrição pluripotentes, SOX2 (B) fator de transcrição específico para prosencéfalo NPCs, PAX6, e proteínas do citoesqueleto NPC NESTIN. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: esquemática de ensaio de entrada da fase S. Cronograma de entrada de S-fase do ensaio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: quantificar a entrada da fase S. (A) fase imagem apresentando fase-escuro viver células (setas brancas), uma célula morta fase-brilhante (estrela branca) e uma célula viva fase-brilhante (seta verde). (B) fluorescente DAPI mancha mostrando núcleo condensado em uma célula morta (estrela branca) e núcleos grandes em uma célula viva (setas brancas e verdes). (C) fluorescente EdU imagem mostrando brilhantes núcleos positivos de EdU (seta vermelha) e salpicados núcleos positivos de EdU (estrela vermelha). (D) fase e fluorescente mesclagem de imagens 3A - 3C.

Figure 4
Figura 4: identificação de neuritos. Imagens de contraste de fase de NPCs. (A) A célula com um processo > 2 corpos celulares em comprimento, encontrando, assim, o critério de um axônio. (B) uma célula com um processo < 2 corpos celulares no comprimento e, portanto, não considerado axônio-rolamento. (C) representa uma célula com 2 processos-o mais longo processo é avaliado para o critério do axônio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: selecionando neurospheres para ensaio de migração. Imagem de contraste de fase (A) de um campo representativo de neurospheres em 24 h. esferas têm todos menos de 100 μm e assim, não são recolhidas para o ensaio de migração. (B) imagem de contraste de fase de um campo representativo de neurospheres a 72 h. Todas as esferas estão ao alcance 100 μm ± 20 µm, indicando que eles estão prontos para ser recolhida para o ensaio de migração.

Figure 6
Figura 6: quantificar migração. (A) imagem de contraste de fase de um representante neurosphere. (B) o contorno azul exibe o rastreamento para medir a área total de neurosphere. Vermelho mostra o contorno usado para medir a área da célula interna em massa. Migração é definida como área de massa celular interno-área total neurosphere. Nota, os círculos brancos mostram células que não estão em um tapete contíguo, como estas células são excluídas os contornos de migração. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: avaliando a síntese do ADN. Resultados representativos de controle versus FGF-tratados NPCs. FGF (10 ng/mL) a síntese do DNA aumenta a 48 h (p ≤ 1 x 10-3). (n = 2-4 poços/grupo/experimento; 3 experiências). Barras de erro representam SEM.

Figure 8
Figura 8: proporção de células entrando em fase S. Imagens de contraste de fase (A) de células NPC incubada no controle versus mídia tratada do FGF (10 ng/mL) para inserções de 48 h. representam a maior ampliação de imagens de células coradas para marcador fluorescente do EdU no controle e mídia FGF 10 ng/mL. Setas vermelhas indicam as células que são EdU positivas e brancas setas indicam as células que são negativos de EdU. (B) gráfico de resultados representativos de controle versus FGF (10 ng/mL) tratada NPCs. FGF aumentos fase S entrada em 48 h (p ≤ 1 x 10-3). (n = 2-4 pratos/grupo/experimento; 3 experiências). Barras de erro representam SEM.

Figure 9
Figura 9: enumerar as células nos dias 2, 4 e 6. (A) fase imagens de contraste de células em controle e FGF (10 ng/mL) mídia tratada nos dias 2, 4 e 6. (B) gráfico de resultados representativos; Nota o FGF (10 ng/mL) não sempre aumenta o número de células em 2 dias, mas no dias 4 e 6 aumentos são aparentes (p. ≤0.05). (n = 2-4 poços/grupo/experimento; 3 experiências). Barras de erro representam SEM.

Figure 10
Figura 10: caracterização dos NPCs em condições de baixa densidade. (A, C, E) Imagens de contraste de fase de NPCs em condições de baixa densidade. (B) NPCs expressam marcadores de células tronco/progenitoras NESTIN (verde), SOX2 (vermelho) e marcador nuclear DAPI (azul). (D) PAX6 (vermelho), DAPI (azul). (F) em baixa densidade, células estendendo neuritos (seta branca) também expressam marcador imaturo neurônio TUJ1 (verde). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 11
Figura 11: consequência do axônio. (A) imagem de contraste de fase de NPCs. As setas pretas apontam para as células com neuritos. (B) adição de neuropeptídeo PACAP (3 nM) aumenta a porcentagem de células com neuritos (p ≤ 1 x 10-2). (C) a quantificação da consequência natural do axônio no controle e 3 nM PACAP contendo meios de comunicação. (n = 2-4 pratos/grupo/experimento; 3 experiências). Barras de erro representam SEM.

Figure 12
Figura 12: migração de Neurosphere. (A) imagens de contraste de neurospheres de fase. (B) adição de PACAP (10 nM) aumenta a migração de células neurosphere (p ≤ 10-2) (C) a quantificação da migração celular. (n = 20 esferas/grupo/experimento, 3 experiências). Barras de erro representam SEM.

Meios de comunicação
Paciente Clone # CTRL FGF
(10 ng/mL)
Paciente 1 1 21.853 47.538
2 20.336 38.070
Paciente 2 1 7.664 14.060
2 16.573 30.087

Tabela 1: Síntese de DNA. Um resumo dos valores de síntese de DNA (em CPMs) de NPCs derivado de dois clones de iPSC por dois indivíduos afetados.

Meios de comunicação
Paciente Clone # CTRL PACAP
(3 nM)
Paciente 1 1 13.60% 18.10%
2 16,50% 21,10%
Paciente 2 1 8,90% 14.10%
2 14.20% 21,10%

Tabela 2: Percentagem de células com neuritos. Um resumo da percentagem de células tendo neuritos em NPCs derivado de dois clones de iPSC por dois indivíduos afetados.

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Discussion

Os protocolos apresentados aqui ilustram métodos rápidos e simples para estudar processos fundamentais de desenvolvimento neurológico e testar drogas usando células precursoras neurais derivadas hiPSC e fatores de crescimento. hiPSC tecnologia revolucionou o estudo da patogênese de doenças do desenvolvimento neurológico, fornecendo-em um acesso sem precedentes para viver humanas células neuronais de indivíduos afetados. De fato, há inúmeros estudos de hiPSC de transtornos de desenvolvimento neurológico, incluindo a síndrome de Rett, síndrome de Timothy, síndrome do X frágil, e esquizofrenia, que desenterraram as aberrações de doenças específicas em dendritos, sinapses e neuronal função4,33,34,35,36. A maioria destes estudos têm focado principalmente nas terminalmente diferenciadas, neurônios pós mitóticos que, embora considerado relativamente funcionalmente imaturo, exclui o estudo do desenvolvimento neurológico anterior processos tais como a proliferação e migração. Estes últimos processos têm sido fortemente implicados na patogênese de transtornos do desenvolvimento neurológico e mandado mais estudar8,9,10,11,12 , 35 , 37 , 38. o uso de NPCs permite-nos estudar esses importantes eventos anteriores, proporcionando também a oportunidade de investigar os processos mais maduros, como a capacidade das células de estender axônios imaturos/dendrites (neuritos). Além disso, alguns destes ensaios também podem ser estendido para estudar outros parâmetros, tais como o comprimento do axônio, número e ramificação ou pela distância mais distante por uma célula.

Alguns estudos mais recentes usaram sistemas de modelo organoides para estudar no início do desenvolvimento eventos em um 3-d "sistema mini cérebro"1,39,40. Ainda, mesmo em sistemas estes organoides, população celular proliferativa precursor é limitada e no início da maturação e migração são difíceis de estudar15,39. Além de limitar o estudo de fenómenos mais cedo no desenvolvimento, o uso de terminais diferenciadas neurônios ou organoids muitas vezes é demorado, caro e limita o número de variáveis que podem ser avaliados no sistema. Isto é porque os neurônios a fazer e organoids podem exigir que os protocolos de indução viral, incubadoras especiais e equipamentos, várias semanas de tempo e grandes quantidades de meios. Em contraste, com a exceção do ensaio de síntese do DNA (que é abordada mais tarde abaixo), este protocolo pode ser facilmente aplicado ao estudo dos transtornos do desenvolvimento neurológico e não requer treinamento extensivo, caras ferramentas e recursos ou software. A facilidade e o custo relativamente baixo de adição de drogas e fatores de crescimento destes ensaios, em fazer esta tecnologia de protocolo um alto rendimento útil para testar vários tratamentos potenciais para o desenvolvimento neurológico e doenças neuropsiquiátricas. Além disso, como fatores de crescimento ato através de definidos vias de sinalização celulares, eles podem também ser usados como ferramentas para testar para o potencial de defeitos no desenvolvimento de sistemas de sinalização. Finalmente, desde NPCs são uma população auto renovadora proliferativa, grandes quantidades de células podem ser produzidas e criopreservado permitindo experiências conduzidas com eficiência sem ter que fazer NPCs de iPSCs cada vez.

Para empregar com êxito estes ensaios, é importante observar as seguintes etapas críticas. Este protocolo coloca NPCs em diferentes condições de manutenção e expansão contra a experimentação. Especificamente, enquanto os NPCs são induzidos, crescido e passadas em meio contendo Neural indução complementar (NIS), nossas condições experimentais reduzem o suplemento em 70%, que coloca as células em um ambiente limitante, permitindo-na oportunidade de adicionar de volta e testar os efeitos de importantes fatores de crescimento. Em segundo lugar, é essencial para controlar a passagem dos NPCs. Em nossos estudos, nós geralmente têm restrito número de passagem das linhas celulares de P3 - P8. Em passagens anteriores ao P3, algumas linhas não robustamente expressam marcadores característicos. Em passagens superiores, enquanto algumas linhas celulares têm taxas de crescimento muito consistente ou respostas a fatores de crescimento, outras linhas de células podem ter mudanças dramáticas no crescimento celular ou resposta. Embora não rotineiramente relatado, nós e muitos outros experimentaram esta mudança dramática em taxas proliferativas em passagens superiores. A razão para isto é incerto, mas essa alteração pode refletir uma capacidade limitada de auto-renovação de NPCs. definindo o porquê e como taxas de proliferação mudam sobre passagens estendidas pode fornecer insights sobre desenvolvimento e patogênese da doença, mas uma pesquisa mais adicional terá de ser feito. Finalmente, o protocolo de indução neural comercial que estamos usando pode às vezes produzir células-tronco neurais má qualidade, particularmente se as iPSCs inicial não são de alta qualidade (i. e., ter diferenciação de células nas fronteiras das colônias da célula, anomalias do cariótipo). Em alguns casos, a morfologia celular é distorcida e expressão dos marcadores não está presente. Não use essas culturas. Em outros casos, NPCs crescem com mais planas células "contaminante", que podem ser removidas usando um tratamento de solução de desprendimento celular diferencial para garantir praticamente puras populações NPC antes da utilização em experimentos. Ter NPCs de alta qualidade é fundamental para resultados adequados: Ver os materiais e equipamentos seção para um link para um protocolo de indução Neural onde imagens dos NPCs de altas e de baixa qualidade podem ser encontradas.

Para cada um dos ensaios apresentados, é importante observar as seguintes etapas críticas, possíveis erros e dicas de solução de problemas. Para o número do celular, síntese de DNA e ensaios de axônio, é importante para as células da placa como dissociado células únicas e não como aglomerados, como isto podem distorcer DNA síntese medidas, contagem de células e comportamento do axônio. Para assegurar-se de aglomerações de células não são banhadas, saborear um pequeno volume de células com um P1000, placa em um slide e verificar se os grupos de células estão presentes. Se forem observadas touceiras, pipete células acima e para baixo para quebrar manualmente grupos separados antes de chapeamento. Para a síntese de DNA e o ensaio de número de células, as células são levantadas com enzimas para contagem e análise. É fundamental para confirmar visualmente células têm completamente levantada a partir do navio de cultura para obter contagens exatas e se necessário, longos períodos de incubação da enzima podem ser usados. No caso de contagem de células de baixa ou baixas CPMs para o ensaio de síntese de DNA, células podem ser chapeadas em maiores densidades iniciais, radioativa tritiada [3H] - timidina pode ser adicionado para o dobro do tempo (4 horas em vez de 2), ou tritiada [3H] - timidina concentração pode ser dobrada. Para o ensaio de axônio, densidade de chapeamento inicial pode ser dobrada sem o risco de maior contato célula a célula. Preste atenção para a distribuição de células em um prato e contar as linhas de 1 cm, tal que cada parte do prato é amostrado. Se a percentagem de axônio é muito baixa a 48 h, o ensaio pode ser alargado até 6 dias ou o tipo de substrato de revestimento ou concentração pode ser alterada para promover a maior percentagem de neuritos. No entanto, é importante observar que os tempos de revestimento e métodos que apresentámos no protocolo foram selecionados para saúde de consequência e célula ideal axônio depois de testar inúmeros substratos diferentes concentrações de substrato e vezes de revestimento. Para o ensaio de neurosphere, uso de pipetas menores (P20, P200) pode levar à corte e ruptura das esferas maiores. Assim, é imperativo que a pipetagem é feita suavemente e com um P1000 ou uma pipeta sorológica. Para o neurospheres de granulação, velocidades mais baixas (100 g de x em vez de 300 x g) também são recomendadas para evitar a dissociação do neurosphere. Durante o chapeamento de esfera, certifique-se de que as esferas são adequadamente espaçamento como esfera-para-esfera contato pode influenciar a migração. Em casos onde a migração é muito rápido ou muito lento, tempo de incubação pode ser diminuído ou aumentado, respectivamente. Carcaças do revestimento também podem ser alteradas para alterar taxas de migração.

Enquanto as técnicas utilizadas são rápidos, simples e aplicáveis ao estudo dos transtornos do desenvolvimento neurológico, há certas limitações. Por um lado, muitas das análises apresentadas (ensaio de número de celular, axônio ensaio, ensaio de migração) exigem investigadores para tomar decisões subjetivas (p. ex., isto é um axônio? É essa célula morto?) potencialmente levando à polarização de investigador e baixa reprodutibilidade. No entanto, realizando análises cegas e estabelecimento de normas estritas para cada decisão tomada dentro de um ensaio, conforme ilustrado nos métodos, amenizar esses preconceitos. Da mesma forma, estes ensaios requerem medição manual e contagens, que podem ser demorada e mão de obra intensiva. No entanto, em laboratórios com os equipamentos e recursos técnicos, estes ensaios podem ser acelerados com o uso de contadores automatizados de célula e programas que podem realizar medições automatizadas41,42. No caso do ensaio de síntese de DNA, esses métodos são específicos para a nossa máquina de colheitadeira e cintilação de célula (ver materiais e equipamentos); no entanto, existem outros modelos disponíveis e métodos que podem ser usados para obter as mesmas informações, tais como a ceifeira de célula Omnifilter-95. Para algumas instituições, a utilização de fontes radioactivas pode não ser viável. Neste caso, um método alternativo usando uma fluorescente timidina analógica, como EdU, analisado em um leitor de microplacas fluorescente, permitirá a aquisição das mesmas informações na análise de volume de síntese de DNA44.

Nosso sistema de cultura de baixa densidade separa NPCs em células individuais ou pequenos grupos, uma condição que difere a natureza densamente de NPCs no tubo neural em desenvolvimento. No entanto, os NPCs são saudáveis e expressas marcadores adequados (Figura 1, Figura 10). Além disso, nossos estudos prévios das culturas corticais rato e rato mostrando paralelo achados em culturas em vitro e em vivo modelos indicam a utilidade e o valor de usar esta abordagem16,17,18 , 19 , 24. Além disso, este sistema fornece uma poderosa abordagem para compreender a maturação das células e estudar as subpopulações de células. Por exemplo, imuno-histoquímica pode efectuar-se o ensaio de axônio para determinar que tipo de célula neuronal específica está ampliando um axônio. Em última análise, apesar de algumas limitações, este protocolo exclusivo fornece métodos simples, poderosos e rápidos para estudar transtornos do desenvolvimento neurológico.

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Disclosures

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pelo Conselho do governador de Nova Jersey para pesquisas médicas e tratamento de autismo (CAUT13APS010; CAUT14APL031; CAUT15APL041), Nancy Lurie marca fundação familiar, Mindworks Charitable Trust de chumbo e a Fundação da comunidade judaica de maior MetroWest NJ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PSC Neural Induction Medium:
Protocol Link: https://goo.gl/euub7a 		 ThermoFischer Scientific A1647801 This is a kit that consists of Neurobasal (NB) medium and a 50x Neural Induction Supplement (NIS). The NIS is used to make 1X Neural Induction Medium and 100% Expansion Medium
Advanced DMEM/F12 Medium ThermoFischer Scientific 12634-010 Component of 100% Expansion Medium
Neurobasal Medium ThermoFischer Scientific 21103049 Component of both NIM and 100% Expansion Medium 
hESC-qualified Matrigel Corning 354277 hESC-qualified extracellular matrix-mimic gel (ECM-mimic gel) 
Y-27632 (2HCl), 1 mg Stem Cell Technologies 72302 ROCK inhibitor
6 well plates Corning COR-3506 Polystyrene plates used for NPC maintenance and for Neurosphere Migration Assay 
24 well plates ThermoFischer Scientific 2021-05 Polystyrene plates: Used for NPC DNA Synthesis Assay
35 mm dishes ThermoFischer Scientific 2021-01 Polystyrene plates: Used for NPC S-Phase Entry and Neurite Assay
Natural Mouse Laminin Invitrogen 23017-015 Substrate for coating plates: Used for NPC DNA Synthesis, S-Phase Entry, and Cell Number Assays
Fibronectin Sigma F1141 Substrate for coating plates: Used for Neurite Assay 
Poly-D-Lysine Sigma P0899 Substrate for coating plates
Penicillin/Streptomycin ThermoFischer Scientific 15140122 Antibiotic, component of NIM, 100% Expansion and 30% Expansion Media 
StemPro Accutase Gibco A11105-01 1X Cell Detachment Solution 
2.5% Trypsin (10X) Gibco 15090-046 10X enzymatic solution
0.5 M EDTA ThermoFischer Scientific AM9261 used in trypsin solution for lifting cells for DNA synthesis assay
tritiated [3H]-thymidine PerkinElmer NET027E001 Radioactive tritium, thymidine
Fisherbrand 7 mL HDPE Scintillation Vials Fisherbrand 03-337-1 Vials for liquid scintillation counting
EcoLite(+) MP Biomedicals 0188247501  Liquid scintillation cocktail
LS 6500 multi-purpose liquid scintillation counter Beckman Coulter 8043-30-1194 Liquid Scintillation Counter
Skatron Semi-automactic Cell Harvester Type 11019 Molecular Devices & Skatron Instruments, Inc. Semi-automatic cell harvester
Click-iT EdU Alexa Fluor® 488 Imaging Kit ThermoFisher Scientific C10337 EdU and staining kit for S-Phase Entry Assay
Trypan Blue Solution, 0.4% ThermoFisher Scientific 15250061 Assessing viability of cells
Grade GF/C filter paper GE Healthcare Life Sciences, Whatman 1822-849 Glass fiber filter paper
Human Basic FGF-2 Peprotech 100-18B growth factor
Pituitary Adenylate Cyclase Activating Polypeptide (PACAP-38) BACHEM H-8430 neuropeptide

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References

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Williams, M., Prem, S., Zhou, X.,… More

Williams, M., Prem, S., Zhou, X., Matteson, P., Yeung, P. L., Lu, C. W., Pang, Z., Brzustowicz, L., Millonig, J. H., Dicicco-Bloom, E. Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells (NPCs). J. Vis. Exp. (133), e56628, doi:10.3791/56628 (2018).

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