Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Hızlı algılama nörogelişimsel fenotipleri insan sinir habercisi hücrelerdeki (NPCs)

Published: March 2, 2018 doi: 10.3791/56628
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 3, 3, 4, 5, 2, 1
1Department of Neuroscience and Cell Biology, Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 2Center for Advanced Biotechnology and Medicine, Department of Neuroscience and Cell Biology, Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 3The Child Health Institute of NJ, Department of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Services, Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 4The Child Health Institute of NJ, Department of Neuroscience and Cell Biology, Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 5Department of Genetics, Rutgers University
* These authors contributed equally

Summary

Nükleer silahların yayılmasına karşı geçiş ve neurite çıkıntı kez nöropsikiyatrik hastalık tedirgin gibi nörogelişimsel işler. Böylece, biz hızla ve tekrarlanarak insan IPSC kaynaklı NPCs bu nörogelişimsel işlemlerde değerlendirmek için protokolleri mevcut. Bu iletişim kuralları da ilgili büyüme faktörleri ve tedavi etkileri NPC gelişimi üzerine bir değerlendirme sağlar.

Abstract

İnsan beyin gelişimi işlemleri kesin bir şekilde düzenledi, daha önceki aşamaları yayılması, geçiş ve neurite çıkıntı tarafından ayırt edici ile bir dizi devam eder; ve daha sonraki aşamalarında axon/dendrite çıkıntı ve synapse oluşumu ile karakterize. Nörogelişimsel bozukluklar, sık sık bir veya daha bu süreçlerin, anomalileri beyin oluşumu ve fonksiyon önde gelen alt üst. İnsan İndüklenmiş pluripotent kök hücre (hiPSC) teknolojisinin ortaya çıkmasıyla, araştırmacılar Şimdi sinir hücreleri de dahil olmak üzere hemen her hücre tipi, ayrıştırılan insan hücreleri bir bol kaynağı var. Bu hücreler normal beyin gelişimi ve hastalık patogenezinde eğitim için kullanılabilir. Bir dizi ölümcül nöropsikiyatrik hastalık kullanım modeli için hiPSCs kullanarak Protokolü sinir hücreleri ayrıştırılan veya 3D kültür sistemleri kullanmak organoids olarak adlandırdığı. Bu yöntemler insan hastalık patogenezinde okumak çok değerli kanıtlanmış olsa da bazı dezavantajları vardır. HiPSCs nöronlar içine farklılaşma ve organoids nesil deneyler ve tespit edilebilir değişkenler sayısını etkileyebilir uzun ve pahalı işlemler vardır. Buna ek olarak, sonrası Mitotik neurons ve organoids dendrite çıkıntı ve synaptogenesis, gibi işlemlere, hastalığı ile ilgili çalışma izin verirken yayılması ve göç gibi önceki işlemler çalışma engel. Otizm gibi nörogelişimsel bozukluklar genetik ve öldükten sonra kanıt erken gelişimsel süreçleri hataları gösterir. Sinirsel öncül hücreleri (NPC), son derece proliferatif hücre nüfus, hangi ontogenetik süreçleri ve hastalık başlatma hakkında soru sormak uygun bir model olabilir. Biz şimdi fare ve sıçan kortikal kültürlerinde insan NPCs için geliştirme eğitim öğrenmiş metodolojisi uzatmak. NPC kullanımı hastalığı ile ilgili fenotipleri araştırmak ve ne kadar farklı değişkenleri (örneğin, büyüme faktörleri, uyuşturucu) etkisi gelişimsel süreçleri yayılması, geçiş ve farklılaşma sadece bir kaç gün içinde de dahil olmak üzere tanımlamak için bize izin verir. Sonuçta, bu araç grubu tekrarlanabilir ve yüksek üretilen iş bir şekilde hastalığa özgü mekanizmaları ve nörogelişimsel bozukluklar fenotipleri tanımlamak için kullanılabilir.

Introduction

Kullanımı basit organizmalar ve fare modelleri temel beyin gelişimi hem de hastalık patogenezinde mekanizmaları aydınlatılmamıştır. Tüm bulgular sade organizmalarda doğrudan insan hastalık karmaşık yönlerini ilgilidir çünkü bu gelişmeler rağmen birçok nöropsikiyatrik bozuklukların etiyolojisi zor kalır. Ayrıca, insan beyninin büyük karmaşıklığı kez model insan gelişimi için zor hale getirir ve hayvanlarda bozuklukları. Evrim ve İnsan İndüklenmiş pluripotent kök hücreler (hiPSCs) teknoloji ilerleme ile somatik hücre kök hücre yeniden programlanan ve insan hastalık çalışmaya nöronal hücrelere ayrılır. HiPSCs ve "omic" teknolojileri (genomik, transcriptomics, proteomik, metabolomics) gelişmeler insan beyin gelişimi anlayış bir devrim söz veriyorum. Bu teknolojiler şimdi "hassas tıp" yaklaşımı için ayrı ayrı tarafından nöropsikiyatrik hastalık karakterizasyonu mümkün olun.

HiPSC hastalığı-modelleme alanındaki geçerli elyaf hücreleri belirli nöronal alt türlerinden bir monolayer içine ayırt etmek için ya da beyin geliştirme1,2yönleriyle özetlemek için bir organoid olarak adlandırılan bir 3D kültür sistemi kullanmak için. 3. Bu sistemleri eğitim ve insan gelişimi ve hastalık4,5,6,7benzersiz özelliklerini ortaya çıkarılması son derece değerli olmuştur. Çalışmaya hazır olduklarını önce ancak, nöronal kültür ve organoids kez herhangi bir hafta sonra ay kültür gerektirir. Bu protokoller ve bu kültür sistemleri kez gerçekleştirilen deneyler sayısı ve büyüme faktörleri ya da uyuşturucu) (gibi test edilebilir değişkenlerin sayısını sınırlamak sürdürebilmek için ihtiyaç duyulan kaynakların miktarı zaman alıcı doğası. Ayrıca, birçok çalışma sonrası Mitotik neurons ve organoids kullanan dendrite çıkıntı veya synapse oluşumu gibi daha sonra gelişme meydana süreçleri üzerinde odaklanmıştır. Bu işlemler içinde gelişimsel bozukluğu otizm ve şizofreni gibi patoloji karıştığı olmuştur iken, daha önce daha önce kesin Nöronal Farklılaşma meydana gelen gelişimsel olayları da hastalık patogenezinde8 için önemlidir ,9,10,11,12,13. Nitekim, son genomik çalışmalar yayılması, işlem yapılan ve geçiş oluşur, orta-fetal dönem otizm Patogenez11,14' te özellikle önemli olduğunu gösteriyor. Böylece, çalışma nöral kök ve progenitör hücre popülasyonlarının önceki bu işlemleri daha iyi anlamak için önemlidir. İnsan beyin gelişimi daha iyi düşünülmüş özetlemek kendi 3D doğa ve organize yapısı nedeniyle, Organoid sistemleri, bazı bu önceki olayların eğitim için kullanılan bir progenitör havuzu içermektedirler. Ancak, organoids atası popülasyonda sık sık seyrek ve daha fazla Radyal gliyal hücreler nöral kök veya progenitör hücre5,15gibi. Böylece, açıkların bir aktif proliferatif hücre nüfus erken dönemlerinde çalışmaya yüksek aktarım yöntemi faydalı olacaktır.

Laboratuarda, sinirsel habercisi hiPSC elde edilen hücreleri (NPC), yayılması, hücre göç, gibi nörogelişimsel süreçleri çalışmaya son derece proliferatif nöral kök ve progenitör hücre karışık nüfus kullanan bir iletişim kuralı oluşturduktan ve ilk işlem (neurite) uzantısı. Bu deneyleri laboratuarımıza yıllardır başarıyla açıkların fare ve fare kortikal kültürler16,17,18,19,20eğitim için kullanılan teknik geliştirilmiştir, 21,22,23. Önemlisi, bu da fenotipleri ve düzenleyici sinyaller fare ve fare kültür sistemlerinde tanımlanan etkin vivo içindegösteren değeri bu teknikleri16, , olan mekanizmaları son derece akıllı gösterildi 17,18,19,24. HiPSCs NPCs için ilk farklılaşma sonra bu yöntemler hayati gelişimsel süreçleri birkaç gün içinde çalışma izin. Bu yöntemler pek çok avantajı var: (1) onlar biraz karmaşık ekipman isteyen ve uygulamak çok kolay olan, (2) çok sayıda deneysel çoğaltır tekrarlanabilirlik sonuçları ve (3) hızlı onay için izin zaman, kısa bir süre içinde yürütülen Kültür değişkenleri kaplama matrisler, büyüme faktörlerinin etkileri ve ilaçların etkinliğini gibi hızla ve düşük maliyetle test edilebilir. Ayrıca, farklı gelişim süreçlerinin kritik düzenleyiciler olarak hücre dışı büyüme faktörlerinin rolü köklü avantajlarından yararlanın. NPCs doğrudan nükleer silahların yayılmasına karşı neurite çıkıntı ve hücre göç gibi teşvik etmek ve onlar kontrol koşullar19 ' belirgin değildir hataları tanımlama yeteneği geliştirmek bulduk gelişimsel sinyalleri seçin sinin , 25 , 26 , 27 , 28. aynı şekilde, çeşitli tedavi müdahalelerin etkinliğini test etmek için hassas tıp teknikleri benimsemeye güçlü bir cadde uyuşturucu değerlendirme kolaylığı sağlar. Böylece, bu iletişim kuralı bir yüksek işlem hacmi, tekrarlanabilir ve erken beyin gelişimi, hastalık patogenezinde ve büyüme faktörleri ve uyuşturucu olası yararlı etkilerini nörogelişimsel fenotipleri üzerinde çalışmak için basit metodoloji kolaylaştırır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. güvenlik prosedürleri ve Biyogüvenlik kabini bakım

  1. Biyogüvenlik seviye-2 (BSL-2) güvenlik prosedürleri
    1. BSL-2 malzeme ile çalışma hakkında kurumun yönergeleri izleyin. Kurumun uygulamaları BSL-2 malzemeleri atmayın. Odalar ve BSL-2 malzemeler için kullanılan ekipman gösterir. Önlük ve eldiven dahil olmak üzere tüm kişisel koruyucu ekipman (PPE), giymek.
  2. Biyogüvenlik kabini bakım
    1. BSL-2 düzey malzeme kullanımı için sertifikalı bir biyogüvenlik kabine kullanın.
    2. Biyogüvenlik UV ışığında en az 15 dakikadır kabine açın ve sonra sprey yüzeyler ile % 10 çamaşır suyu çözüm. Çamaşır suyu çözüm 15dk için oturup, kabine silin ve hava akımı kullanmadan önce açmak için izin.
  3. Radyoaktif Tritiated [3H]-timidin (trityum) güvenlik prosedürleri
    Not: Tritium Kategori 5 radyoaktif kaynak, 'en muhtemel tehlikeli olmak ' Bu kategori. Radyoaktivite ile çalışmak için kurumun yönergeleri izleyin. Bazı kurumlar sertifikalar gerekebilir veya trityum işlemek için izin verir.
    1. Eğitim kurumundan nasıl düzgün idare ve trityum elden almak. Uygun kapları, radyoaktif atık kurumun ilkelerine göre atın. PPE Tridium ile çalışırken giyiyorum.

2. iPSCs üzerinden sinirsel indüksiyon

Not: NPCs yapmak, biraz değiştirilmiş sürüm bir piyasada bulunan sinir indüksiyon kit ile birlikte gelen bir protokolü takip etti. Ve bir 50 x 1 x sinirsel indüksiyon orta (NIM) yapmak için kullanılan Neural indüksiyon ek (NIS), Neurobasal (NB) medya kiti oluşur. NIS da % 100 yapmak için kullanılan genişleme orta (bkz. Bölüm 3.1). Malzeme ve ekipman ve referanslar bölümünde43yılında protokolü için bir bağlantı bulunur.

  1. Onlar % 70-80 birleşmesi olunca geçiş iPSCs.
  2. Plaka 300.000 iPSCs 1 de hESC tam içine ekstraselüler matrisi-kaplı jel (ECM-taklit jel) 6-şey plaka içeren besleyici-Alerjik IPSC orta 2 mL ROCK inhibitörü 5 mikron ile taklit. Bölüm 3.2 kaplama wells ECM-taklit jel ile ilgili yönergeler için bkz:.
  3. Bir gün sonra kaldırma IPSC orta + 1 x PBS ile ROCK inhibitörü ve yıkama iPSCs. NIM 2 mL iPSCs için ekleyin.
    Not: NIM 50 mL 50 NIS ve 250 µL (50 adet/mL, 5 μL/mL) penisilin/streptomisin (P/S) x 1 mL 49 mL NB medya ekleyerek yapılır.
  4. Değişim medya sinirsel indüksiyon 2 günde alıyorum tarafından orta ve NIM 2 mL ile değiştirme Konfluent haline hücreleri (yaklaşık 4-5 gün) kadar geçirdi. Hücreleri Konfluent bir kez medya günlük olarak değiştirin.
  5. Geçiş hücreleri NIM ve ECM-taklit jel plaka 7 gün sonra %100 genişleme medya ve 5 mikron ROCK inhibitörü 2 mL içeren 6-şey plaka kaplı. Hücreleri geçiş 0 (P0) olarak kabul edilir bu noktada NPCs. Aşağıda bölüm %3.1 100 genişleme medya yapmak talimatlar için bkz.
  6. Bölüm 3,4 içinde açıklanan yöntemleri kullanarak geçiş hücreleri. Hücreleri P2 ulaştı ve NPC işaretleri ve deneyler (şekil 1) kaplama için leke dissociating önce Konfluent kadar bekleyin.

3. Kültür medya, kaplama ve NPCs bakımından

  1. NPCs (% 100 genişleme medya) bakımı için medyası hazırlama:
    1. 50 mL % 100 genişleme medya DMEM/F12 24.5 mL NB 24.5 mL ile alabilrisiniz
    2. 50 x NIS 1 mL DMEM/F12 + NB çözüm ekleyin. P/S çözüm 250 μL ortamına ekle.
      Not: Medya buzdolabında (4 ° C) olabilir ve 2 hafta için kullanılan. Medya daha küçük hacimli DMEM birimleri ayarlayarak yapılabilir / F12 + NB + NIS 50 mL cilt gelince aynı oranları kullanarak.
  2. ECM-taklit jel hazırlanması kültür plakaları NPC bakım için kaplı.
    1. Aliquot ECM-taklit jel 6 mL çalışma çözeltisi için gerekli ses seviyesinde. Toplu iş toplu ve çok-çok ECM-taklit jel beri seyreltme faktörü analiz sayfası sertifika bakarak aliquot hacmi değişir hesaplayın.
    2. ECM-taklit jel aliquot buz çözme ve 6 mL soğuk DMEM/F12 medya geçiyoruz.
    3. ECM-taklit jel/DMEM/F12 çözüm 1 mL 6 iyi plaka her şey için ekleyin. 6-şey plaka ECM-taklit jel-37 ° C'de 30 dk için çözüm ile kuluçkaya
    4. ECM-taklit jel çözüm kuluçka 30 dakika sonra Aspire edin ve % 100 genişleme ortamı ile değiştirin veya tabak buzdolabında bekletin (4 ° C, 1 hafta kadar) olmadan ECM-taklit jel-çözüm alıyorum.
  3. NPCs bakımından
    1. Plaka NPCs 1.5 milyon hücre yoğunluğu bir ECM-taklit jel kaplı de 2 mL % 100 genişleme medya içeren içine at.
    2. %5 CO2ile nemli bir ortamda 37 ° C'de NPCs kuluçkaya.
    3. ROCK inhibitörü 5 mikron medyaya NPCs P3 veya daha düşük ya da aşırı hücre ölümü önlemek için çözdürülen NPCs ekleyin. Medya ROCK inhibitörü kaldırmak için 24 saat sonra değiştirin.
    4. Geçiş hücreleri Konfluent olduklarında üzerine bağlı olarak her 4-9 gün. Onlar tüm alt çanak yüzeyi kapsayan bir yoğun paketlenmiş monolayer olunca hücreler Konfluent düşünülür.
    5. 6-şey plaka bir kuyu başına 1 ila 1.5 milyon hücre yoğunluğu plaka NPCs (bkz. Bölüm 3,4). Harcanan medya her 48 h kaldırın ve 2 mL % 100 genişleme medya ile değiştirin.
  4. Asansör, ayırmak ve NPCs bakım ve/veya kaplama için deneysel koşullar cips
    1. Orta, yıkama hücreleri bir kez 1 x PBS ile Aspire edin. PBS Aspire edin ve Konfluent NPCs. Incubate 37 ° C'de 10 dakika için de 1 içine 1 x hücre dekolmanı çözeltinin 500 μL ekleyin
    2. Oda sıcaklığında (RT) PBS 500 μL ekleyin ve iyi bir P-1000 pipet hücreleri kaldırılmasını sağlamak için kullanarak yıkayın. Hücreleri + PBS çözüm 15 mL konik tüp içine toplamak. PBS 1 mL ile tekrar tabak yıkama ve tüp sıvı ekleyin.
    3. Hücreleri aşağı 300 x g cips 5 min için spin.
    4. Süpernatant hücre Pelet kaldır ve 1-5 mL Önceden ısıtılmış DMEM/F12 medya hücrelerde yeniden askıya alma. 1 ila 4 milyon hücre/mL ortamının yoğunluğu hücrelere sulandırmak. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri ölçmek.
    5. Hücreleri, özel NPC bakım (Kısım 3.3) ya da (daha fazla bilgi için sonraki bölümlere bakın) yürütülen tek tek tahlil için gerekli sayıda plaka.
    6. Hücre süspansiyon sesi ile kitle iletişim araçları arasında 15-100 μL hücre her şey/yemek için kullanılır böylece ayarlayın. Bu küçük kaplama birim var hatta hücre dağıtım ve büyüme faktörleri, uyuşturucu veya orta yüzeylerde değil seyreltilmiş sağlar.
    7. 37 ° C'de hücreler kuluçkaya Bireysel deneyleri belirli ayrıntılarını görmek veya medya her 48 h NPC bakım için değiştirebilirsiniz.
  5. Medya hazırlık için deneysel koşullar (% 30 genişleme medya)
    1. % 100 genişleme medya % 70 oranında seyreltik (% 30 olarak adlandırdığı genişleme) ekleyerek 1:1 DMEM/F12 + NB çözüm medya deneysel koşullar için yapmak.
    2. % 30 genişleme medya 20 mL 6 mL % 100 genişleme medya ekleyerek ve 7 mL NB ve DMEM/F12 medya 7 mL sulandrarak olun. 5 µL/mL P/S çözeltisi ekleyin.
      Not: %100 ortam P/S içeriyorsa, sonra 5 μL/mL kombine-DMEM için Ekle / F12 + NB (14 mL) = (5 μL/mL) x = P/S 70 μL 100µL yerine.
    3. Kaplama Substratları ve büyüme faktörleri % 30 genişleme medya için istenen konsantrasyonlarda ekleyin.

4. DNA sentezi, S-faz giriş ve NPCs sayıda hücre değerlendirilmesi

  1. DNA sentezi, S-faz giriş ve hücre sayı tahlil için hazırlık
    1. Poli-D-lizin (PDL) 1 mg/mL stok çözeltisi dH2içinde O yapmak ve filtre sterilize. 1:10 0,1 mg/mL PDL çözüm olun ve her şey 24 iyi plaka veya 35 mm çanak 1 mL 300 μL eklemek için dH2O sulandırmak. Dik, 20 dk için kuluçkaya
    2. PDL wells dH2O. aspiratı dH2O 5 min için 3 kez yıkayın ve 300 μL/iyi veya 1 mL/tabak 1 x PBS içinde seyreltilmiş laminin (5 μg/mL) ekleyin. Parafilm ile kuruyucu ve steril, bir biyogüvenlik gecede RT (12-24 h) kabine tutun.
    3. Sonra 12-24 h. Ekle araç, büyüme faktörleri veya istenen konsantrasyonu % 30 NIS sulandrarak önlemek için toplam çözüm daha az % 10 olan cilt olarak faiz ilaçların % 30 genişleme medya (bkz. Kısım 3.5) hazırlamak genişleme orta.
    4. Her yıkama 24-şey plakalı iki kez 1 x PBS (5 dk her), de. 1 x PBS Aspire edin ve medya (olmadan veya uyuşturucu/büyüme faktörleri ile) 450 μL ekleyin. Plaka için en az 15 dk. 37 ° C'de hücreler kaplama önce kuluçkaya.
    5. Her deneme için 2-3 Kuyu veya koşul başına yemekleri ayarlayın.
    6. Plaka NPCs (bkz. Bölüm 3,4):
    7. NPC DNA sentezi tahlil: 100.000 hücreler/24 bir iyi tabak içinde iyi
    8. S-faz giriş: 500.000 hücreler/35 mm çanak
    9. Hücre sayı tahlil: 50.000 hücreleri/24-şey tabak içinde iyi
  2. Sinirsel habercisi hücre DNA sentezi tahlil
    1. 100.000 hücreler/iyi bir 24-şey plaka plaka ve nüsha/durumu değerlendirmek.
    2. Eklemek radyoaktif, tritiated [3H]-timidin her iyi kültür 46 h sonra kültür ortamına (1.5 μCi/mL). Hücreler için 2 h 37 ° C'de kuluçkaya.
      Not: radyoaktif malzemeler kullanılarak, eğitim kurumu, takip radyoaktivite güvenlik protokollerini ve uygun şekilde belirlenen atık kapları radyoaktif malzemelerin dispose alırsınız.
    3. Kaldırmak ve düzgün 2 h. eklemek 300 μL in % 0.25 tripsin-EDTA (0.5 mM) önceden ısındı sonra radyoaktif medya her kuyuya atın ve 37 ° C'de 20 dk için kuluçkaya
    4. Hücre hasat açın (bkz: malzeme ve ekipman bölümü) ve pompa ve pompa basınç altında 200 PSI olduğundan emin olun. Hücre hasat uzayda filtre kağıdı yerleştirin ve kağıt yönlendirmesini işaretlemek için sağ köşedeki gözyaşı.
    5. Hücre hasat toplama tüpler boş bir "boş" tepsisine yerleştirin ve filtre kağıdı nemlendirmek için prewash basın. Toplama tüpler örnek kuyu yerleştirin ve (başlangıç) çalıştırın.
    6. Hücre hasat toplama örnekleri tamamlandığında, tüm örnek kümeleri için yinelemek için kelepçe ve önceden filtre kağıdı kaldırın. Her zaman boş, bir "boş" levha prewash.
    7. Filtre kağıdı bir ışık kaynağı altında kuru ve karşılık gelen şişeleri bir tepsi kurmak. Kağıt pusulaların tüpleri içine dışarı yumruk ve 2 mL sıvı mercek kokteyl her şişe ekleyin. Kapak ve etiket şişeleri.
    8. Sıvı mercek en az 1 h için kokteyl sayar / dakika (acentalar) bir mercek makinede okumadan önce şişeleri kuluçkaya.
  3. NPC S-faz giriş tahlil
    1. Asansör, ayırmak, cips ve hücreleri yeniden askıya alma Bölüm 3,4 adımları için bkz.
    2. Çanak başına 500.000 hücre içine Bölüm 4.1, sadece 1 çanak/koşul bu adım için hazırlanan 35 mm yemekler plaka.
    3. Yemekleri hücreler eşit dağılımı sağlamak için ileri geri her yöne tahrik. 46 h 37 ° C'de hücreler kuluçkaya.
    4. 24 saat sonra durum PDL/Laminin ile kaplı üç 35 mm plakalar hazırlayın. Örneğin, % 30 genişleme medya bir 35 mm çanak ve bir 35 mm çanak % 30 genişleme medya + FGF ise (10 ng/mL) ertesi gün kullanmak için 6 PDL/Laminin plakaları kat.
    5. 2 μL/mL 5 mm EdU kültürler için 2 h 46 h. Incubate sonra ekleyin.
    6. Ayırmak ve (bkz. Bölüm 3,4) hücreleri cips. Hücre Pelet 3 mL % 30 genişleme medya veya % 30 genişleme medya + istenilen büyüme faktörleri/uyuşturucu 3 mL yeniden askıya alma.
    7. Tabak çanak önceden kaplanmış PDL/Laminin yemekleri başına 1 mL. Yemekleri hücreler eşit dağılımı sağlamak için ileri geri her yöne tahrik. Yemek için uygun hücrelere izin vermek 2 h 37 ° C'de kuluçkaya. Basitleştirilmiş zaman çizelgesi için bkz: Şekil 2 .
  4. S-faz giriş analiz
    1. Yemekleri ile buz gibi %4 düzeltmek Paraformaldehyde (1 x PBS PFA) 20 dk için. Sonra 3 kez 1 x PBS ile 5 min için bulaşıkları yıkamak.
    2. 1 mL 1 x PBS % 0.05 ile ekleyin sodyum azid bakteriyel ve mantar büyüme önlemek için. Hücreleri saklanabilir 4 ° C'de 6 aya kadar (parafilm ile mühürlü) yemekleri tutulursa PBS + sodyum azid çözüm, yine de tüm immünolojik antijenleri iyi korunmuş analiz uzun gecikmeler sonra.
    3. Tahlil bir ticari EdU tepki kullanarak hücreleri (üretici Protokolü Bkz:) kit. Hücreleri DAPI veya başka bir nükleer işaretleyici kullanarak leke ve floresan mikroskopi kullanarak görüntü.
    4. EdU pozitif hücrelerinin oranı toplam canlı hücreleri (Toplam hücresini sayı) kör 10 sistematik olarak rasgele alan (10 x) üzerinden değerlendirmek. Ölü hücreleri analizde eklemeyin.
    5. Faz kontrast görüntüler ve floresan resim olumlu EdU boyama belirlemek ve ölü hücreleri tespit için veya canlı (şekil 3) kullanmaktadır.
    6. Bu hücreler vardır canlı olarak (şekil 3A-B), leke içeren tüm hücreleri her ikisi de düzgün sayısı ve hatta hücre zarı faz kontrast ayarlarında ve floresan DAPI nükleer tarafından büyük bir parçalanmamış çekirdek.
    7. Faz parlak olan tüm hücreleri dışlamak, kırık bir düzensiz hücre zarı var ve küçük, yoğun çekirdeği var gibi bu hücreler ölü olduğu gibi görüntüleme DAPI floresan tarafından (şekil 3A-B) görüntülenir. EdU ifade canlı hücreleri kapsayan tüm çekirdeği veya benekli floresan çekirdeğinde (şekil 3 c) Boyama leke parlak floresan EdU içeren hücreleri tespit ederek değerlendirmek.
  5. NPC hücre sayı tahlil
    1. 2 gün sonra kültür, etiket ve 1.5 mL microcentrifuge tüpler ve 0.5 mL microcentrifuge tüpleri hazırlayın. Her 0,5 mL tüp Trypan mavi 5 μL ekleyin.
    2. Her şey bir 24 iyi plaka için orta kaldırın ve kuluçka için 10-15 dk 200 μL 1 x hücre dekolmanı çözümü ve yer ekleyin.
    3. Hücreleri kaldırdı sonra ayrılan süre sonra her şey için 1 x PBS istenilen miktarda ekleyin.
      Not: Genellikle, 2 günde 1 x PBS 300 μL de içeren hücreleri artı 200 μL dekolmanı çözeltinin 500 μL toplam hacmi için ekleyin. Hücreleri daha Konfluent olmak gibi ek kültür kuluçka süresi ile gerektiği şekilde seyreltme birim artırın. Örneğin, gün 4, 1 x PBS ve gün 6 500 μL ekleyin, 1 x PBS 800 μL ekleyin. Toplam birimleri 700 μL ve 1 mL, sırasıyla olacaktır.
    4. P-1000 pipet kullanarak, yukarı ve aşağı her iyi 4 hücreleri kaldırmak için 5 kere için pipet. Plaka tüm hücreleri ayırdıktan emin olmak için mikroskop altında incelemek. Hücreleri 1,5 mL tüpler için transfer.
    5. 1.5 mL tüpler seyreltilmiş hücreleri ile 2-3 kat tersine çevirin. Sonra 50 μL tüp ortasında hücre aliquot al ve Trypan mavi ile 0.5 mL tüpler için eklemek (4.5.1 bakın).
    6. Pipet hücre çözümü 2 3 kez yukarı ve aşağı. Hücreler için hemasitometre ekleyin ve hemen analiz edin. 10 dk hücre ölümü veya Trypan Mavi takım almış hücreler varlığı artırabilir daha uzun bekliyor.
    7. Dikkatli bir şekilde hücre + Trypan mavi karışımı 10 µL Çoğalt sayımları gerçekleştirmek için hemasitometre her tarafına ekleyin. Faz kontrast mikroskop kullanarak hücreleri saymak. Ölü hücreleri veya Trypan Mavi takım almış koyu mavi hücreleri saymaz.
    8. Toplam hücresini sayı, kullanım ortalama almak için cep telefonu numarasını hemasitometre 4 köşesinden sayılır ve aşağıda ki formül uygulamak:
      Cep numarası medya hacmi (mL) x 10,000 x Yani toplam hücresini sayı/iyi =
    9. Aspire edin ve kalan wells yordamı yineleyin. Medya, her gün 4'te 48 h. tekrar tahlil ve 6 sayılır değil hücrelerde değiştirin.

5. NPC Neurite tahlil

  1. Yemekler ve medya Neurite tahlil için hazırlanması
    1. Poli-d-lizin (PDL) 1 mg/mL stok çözeltisi dH2içinde O yapmak ve filtre sterilize. 1:10 0,1 mg/mL PDL çözüm olun ve 1 mL her 35-mm çanak eklemek için dH2O sulandırmak. Dik, 20 dk için kuluçkaya
    2. Bu arada, % 30 genişleme medya (bkz. Kısım 3.5) hazırlamak ve medyaya 5 μg/mL (5 µL/mL) fibronektin çözeltisi (1 mg/mL stok) ekleyin.
    3. Bir kez medya hazırlanır, araçlar, büyüme faktörleri veya uyuşturucu ilgi istenen konsantrasyonları ekleyin.
      Not: Araç, büyüme faktörleri veya uyuşturucu, birimler eklemek en uygunudur < fibronektin ve diğer bileşenleri % 30 genişleme orta sulandrarak önlemek için toplam çözüm yüzde 10'u.
    4. 20 dk sonra 3 kez aşırı PDL kaldırmak için dH2O ile 5 min için PDL bulaşıkları yıkamak. Yemekleri medya eklemeden önce kuru olduğundan emin olun.
    5. Medya (veya uyuşturucu/büyüme faktörleri olmadan) + fibronektin çözüm 1 mL her PDL boyalı çanak yerleştirin.
    6. Yemekleri için en az 30 dk. 37 ° C'de hücreler fibronektin uygun ek PDL için sağlamak için kaplama önce kuluçkaya.
    7. Her deneme için koşul (örneğin, 3 araç içeren yemekleri, 3 uyuşturucu içeren yemekleri) başına 2-3 yemekleri ayarlayın.
  2. NPCs Neurite tahlil için kaplama
    1. Asansör, ayırmak, cips ve hücreleri resuspend Bölüm 3,4 adımları için bkz.
    2. Bölüm 5. 1'hazırlanan yemekler amacına başına plaka 50.000 hücreleri. Yemekleri hücreler eşit dağılımı sağlamak için ileri geri her yöne tahrik.
    3. 48 h 37 ° C'de hücreler kuluçkaya.
  3. Neurites analizi
    1. Hücreler 48 h için kuluçka sonra Aspire orta ve yemekler buz ile soğuk %4 düzeltmek PFA 20 dk için.
    2. 20 dk sonra 3 kez 1 x PBS ile 5 min için bulaşıkları yıkamak. Son yıkama sonra 1 mL 1 x PBS % 0.05 ile ekleyin sodyum azid.
    3. Bulaşık sırası körü körüne faz kontrast mikroskop 32 X analiz. Toplam hücreleri ve neurites ama tekrarlanabilir pozisyonlar rastgele seçilmiş 3, 1 cm satırlardaki hücreleri saymak. Çanak yeterli örnekleme sağlamak için başına 150 hücre en az say.
      Not: Bir neurite olan hücre vücuttan bir uzantısı (işlem) olarak tanımlanır > 2 hücre gövde çapı uzunluğunda. Birden çok işlem içeren hücreleri için en uzun süreç için kriter olarak kabul edilir. Hücreleri olan işlemleri ile < 2 hücre gövde çapı uzunluğunda değildir dahil (şekil 4).
    4. Birlikte toplam hücreleri ve hücre neurites ile toplam sayısı her yemeğin ekleyin. Neurites içeren hücrelerin % hesaplamak. Neurites hücrelerle yüzdesi Çoğalt yemekleri arasında ortalama. Deneysel tekrarlanabilirlik güven kurulan her yemeğin içinde tüm satırları benzer ve ortalamalar yemekleri arasında son derece benzer, standart hata ortalamaya (SEM) ile < % 10.
    5. Alternatif olarak, immunocytochemistry beta-III-tübülin (TUJ1) gibi işaretleri yaparak neurites analiz veya MAP2. Faiz için marker boyama sonra 10 sistematik olarak rasgele görüntüler üzerinde floresan mikroskop 10 X al. Görüntü en az 200 hücreleri. Bu durumda, çanak kenarına çok yakın görüntüler elde etmek. TUJ1 veya MAP2 + neurites ( şekil 10 bir örnek için bkz) içeren hücrelerin yüzdesi analiz.

6. NPC Neurosphere geçiş tahlil

  1. Neurosphere oluşumu
    1. 1 mL % 100 genişleme medya yok kaplama yüzey ile bir 35 mm çanak içine ekleyin. Önce orada olduğundan emin olmak için 2-3 yemekleri NPCs. hazırlama kaplama hücre göç tahlil için yeterli neurospheres yemekleri için en az 15 dk. 37 ° C'de kuluçkaya.
      Not: Bir kaplama substrat yokluğu NPCs neurosphere oluşumu için gerekli olan ortamda, askıda kalmasını sağlar. Kaplama yemekleri neurosphere oluşumunu engeller.
    2. Bölüm 3,4 merdivenlerinde kaldırın, ayırmak ve hücreleri cips için bkz. Hücre Pelet Önceden ısıtılmış %100 2-5 mL resuspend genişleme medya. Plaka 1 milyon NPCs Bölüm 6.1.1 hazırlanan her 35-mm çanak içine.
    3. 48-96 h NPCs toplamak ve formu neurospheres için izin vermek için 37 ° C'de NPCs kuluçkaya. Canlı bir cetvel üzerinde faz kontrast mikroskop kullanarak küre boyutunu değerlendirmek. Çoğu küreler 100 µm (± 20 mikron) yaklaşık bir çapı ulaşmak bekleyin (şekil 5). Daha küçük küreler tamamen dağıtmak ve geçiş tahlil sırasında parçalayın.
  2. Neurosphere geçiş tahlil için tabak hazırlanması
    1. (Bkz. Bölüm 3.2) ECM-taklit jel aliquots 6 mL % 30 genişleme medya geçiyoruz. ECM-taklit gel/30% genişleme medya çözüm hazırlanır sonra Araçlar, büyüme faktörleri veya uyuşturucu ve ilgi alanları istenen konsantrasyonları ekleyin.
      Not: Araç, uyuşturucu ve büyüme faktörü konsantrasyonları hesabına neurospheres Bölüm 6,3 içinde 200 µL eklenmesi için artırılması gerekiyor.
    2. Plaka ECM-taklit 1 mL jel /30% genişleme medya çözüm (± Araçlar, büyüme faktörleri veya uyuşturucu) 6-şey plaka bir kuyunun içine. Deneysel koşul başına 2-3 Kuyu olun. Alternatif olarak, 35 mm yemekleri kullanılabilir. Kaplamalar, en az 30 dk. 37 ° C'de. için kuluçkaya
      Not: ECM-taklit gel/30% genişleme medya çözüm bu tahlil için Aspire değil. Küre üzerine bir emişli ECM-taklit jel kaplama hızlı ve aşırı göç götürecek.
  3. Kaplama Neurospheres
    1. Bölüm 6.1 içinde oluşan neurospheres toplamak ve konik tüp içine koyun. 35 mm yemekleri ile 1 mL 1 x PBS tüm neurospheres emin olmak için toplanan yıkayın. Spin aşağı vasıl 100 x g 5 min için toplanan neurospheres.
    2. Neurospheres Önceden ısıtılmış %30 1-3 mL yeniden askıya alma genişleme medya. Neurospheres 1 fincan toplanan medya 1 mL küreler resuspend için kullanılır. 2 yemekleri toplanır, medya 2 mL küreler resuspend eklenir, vb yavaşça pipet ve küreler kırık değildir sağlamak için yalnızca bir P-1000 kullanın.
    3. Resuspended neurospheres 200 μL ECM-taklit gel/30% Bölüm 6.2 yapılan genişleme çözüm içine plaka. Rock plakaları her yöne eşit neurospheres dağıtmak için. Plakayı 37° c de 48 h için kuluçkaya
    4. ECM-taklit gel/30% genişleme medya çözümü kaldırmak ve hücreleri %4 PFA, yıkama ve 1 x PBS + % 0.05 hücrelerde tutmak düzeltmek sodyum azid.
  4. Neurospheres analizi
    1. Tüm neurospheres 10 X, faz kontrast ayarlarını kullanarak görüntüleri elde etmek. Küreler birbirlerine dokunuyorlar değil emin olun. Ortalama geçiş ImageJ yazılımını kullanarak ölçmek.
    2. Serbest Çizim aracını kullanarak neurosphere dış kontur takip et. Serbest Çizim "düz" çizgi simgesine sağ tıklatarak erişebilirsiniz. El ile bir fare kullanarak izleme.
    3. İzleme alanı hesaplamak için ölçü işlevini kullanın. "Alanı" olarak bir eşleştirmeyi çözümlemek etiket altında bulunan "Ayarla ölçümleri" penceresinde seçili olduğundan emin olun. Şekil 6 dış kontur mavi iz için bkz:.
    4. Küre ve ölçü birimi alanının iç hücre kütlesi takip et. Şekil 6 iç kontur kırmızı iz için bkz:. Ortalama geçiş iç hücre kütlesi toplam neurosphere alanından çıkararak ölçmek.
    5. Hücreler bitişik bir halı (şekil 6) göç yoğun paketlenmiş iç hücre kütlesi sergi ölçü neurospheres.
    6. Hücreleri halı dışında ya da ölçüm için neurosphere dan müstakil eklemeyin. Bkz. şekil 6 örnekler dış halı ölçüm hariç tutulur (beyaz daire içine alınmış) hücre için. En az 20 neurospheres her koşul için analiz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu çalışmaların bir gol NPCs, diğer bir deyişle, bir hücre sayıları artış proliferatif aktivitesini tanımlamaktır. Bu DNA sentezi toplam hücresini nüfusun radyoaktif izleyici tritiated timidin birleşme hücre özleri içine ölçer ve bunların olup tüm hücreleri S-aşamasında nişanlı yansıtan bir yüksek-den geçerek yaklaşım değerlendirme tarafından sağlanır sentezleme 5 dakika veya tüm iki saat için. Ayrıca, bu deneyleri S-faz ve toplam hücresini sayı, tek hücre daha emek yoğun bir tahlil girmek hücreleri oranının belirlenmesi izin. Hücre S-aşamasında, mitoz ve hücre bölünmesi, hücre sayısını artırmak için ortaya çıkması gereken bir adım DNA sentez. Beri bu işlem biraz zaman alabilir, DNA sentezi 48 saat değerlendirildi değişimler hücre sayıları bu zamanda noktada değişiklikler ile ilişkili olmayabilir. Bununla birlikte, bu değişiklikler DNA sentezi, 48 saat içinde hücre sayıları artar gün 4 ve 6, güvenilir bir şekilde tahmin bulundu.

DNA sentezi değerlendirirken, hücreleri bir yoğunluk 100.000 hücre (~ %50 birleşmesi) 24-şey plaka, kaplama ve ölçümler yaparak 48 saat boyunca büyümeye izin verilir. Bu yoğunluk kullanarak hücreleri monolayer çevreleri benzer, ama aynı zamanda çok hızlı bir şekilde medya çok asidik hale gelir bir 48 saat süre içinde büyümek değil sağlar. Çok asittir medya önemli ölçüde etkileyen hücre metabolizması ve böylece, alter nükleer silahların yayılmasına karşı sonuçları. Belirli hücre hatları son derece proliferatif, araştırmacı hücre yoğunluğu, ortam birimi, değiştirmeyi düşünmelisiniz veya medya yüksek asitli koşulları önlemek için frekans değişimi. Koşullar değişirse, hücre hücre iletişim bağımlı değişiklikleri kesinlikle büyüme oranları etkiler çünkü farklı hücre hatları karşılaştırırken tutarlı olması önemlidir. Bu deneyleri basit tasarımı farklı büyüme faktörleri test bize sağlar. Şekil 7' de, fibroblast büyüme faktörü (FGF, 10 ng/mL) eklenmesi için görüldüğü gibi 48 saat ~ 40 oranında DNA sentezi artar. Ayrıca, DNA sentezi tahlil tüm klonlar tekrarlanabilir ve bireylerin FGF stimülasyon sonra DNA sentezinde bir artış gösteriyor. Tablo 1' de aynı birey klonal değişkenlik gösterdiği için temel ve FGF değişkenliği için potansiyel potansiyel yanı sıra farklı etkilenmemiş bireyler arasında DNA sentezi uyarılmış. Bu değişkenlik nedeniyle yanı sıra bağımsız başına birden fazla IPSC klonlar test en az 3-5 NPC satırlarının her farklı IPSC klon türetilmiş değerlendirmek önemlidir. En az 3 deneyler her NPC satırı için gerçekleştirildi.

DNA sentezi tahlil hızla çok sayıda deneysel grupları yüksek üretilen iş bir şekilde değerlendirmek için bize izin verir ve ölçü toplamı DNA sentezi S fazlı süresi (5 dakika ile 2 saat) ne olursa olsun yansıtır. S-aşamasında yapan hücreler oranını tanımlamak için S-faz giriş tahlil istihdam edildi. Bu tahlil için hücreleri monolayer benzeri dynamics yapılmasına izin vermek için daha önce bahsedilen aynı yoğunluğu yetişkin, ama sonra 2 gün sonra ayrışmış ve kısaca tek hücre analizi yapmak için plakalar için bağlı kalmak için izin. Bir monolayer hücrelerde sayım yüksek hücre hücre iletişim ve plaka bölgesel değişkenlik nedeniyle zor olabilir. Bu paradigma hücreleri monolayer model ve sonra bunları tek hücreler olarak analiz için bize izin verir. Ayrıca DNA sentezi assay olarak elde edilen verilerin metodolojik bağımsız bir onay olarak görür. Şekil 8' de görüldüğü gibi FGF (10 ng/mL) stimülasyon 48 saatlik hücre S fazlı ~ 25 oranında girme oranı artar.

Hücre sayıları değerlendirirken, daha düşük bir hücre yoğunluğu söz konusu deneyleri içinde 50.000 hücreleri bir 24 kuyu kaplama ile plaka iyi daha kullanılır. Yine, bu yoğunluğu daha hızlı hücre hatları çok hızlı bir şekilde 6 gün boyunca orta pH çok asidik hale gelir ve sarı döner büyümek değil olduğunu emin olmak için seçildi. Hücre sayıları günde 2, denetim ve FGF (10 ng/mL) grupları arasında önemli ölçüde farklı olabilir değil Şekil 9' da DNA sentezi, 48 h (Şekil 7) 4 ve 6 gün akıllı cep numaraları olarak değişiklikler değişikliklerdir.

NPCs genellikle yüksek yoğunluklu kültürlü iken, neurite tahlil 50.000 hücreleri tek hücre değerlendirmek için bir 35 mm tabak içine kaplama bir yoğunluk yürütülmektedir. Hızlı hücre iskeleti proteinleri ve transkripsiyon faktörleri NPCs NESTIN, SOX2 ve PAX6 gibi karakteristik NPC bile bu düşük yoğunluklu, kültürlerin (şekil 10 A-D). Bu düşük yoğunluklu bir kültür önemli ölçüde bu süre içinde hücre kaderi değiştirmez olduğunu gösterir. Ayrıca, benzer düşük yoğunluklu koşullar fare ve fare kültür sistemleri sonuçta tekrarlanabilir vivo16,17,18,19edildi fenotipleri algılamak için kullanılmıştır, 20,21,22,23. 48 saat sonra kuluçka, NPCs küçük bir kısmı şekil 11A ve B, görüldüğü gibi neurites genişletmeye başlar ve şekil 11Cgrafikte sayılabilir. Neurites, neurites uzunluğu ve neurites/hücre sayısını artıran hücreleri oranda gelişimsel parametrelerini değerlendirmek için ölçülebilir. Doğru neurite çıkıntı hücrelerle yüzdesi değerlendirmek amacıyla, bu hücreleri tek hücre veya kümeleri kaplama önemlidir < 5 hücreleri ve gibi büyük toplamları. Şekil 10 E-Fiçinde görüldüğü gibi aynı zamanda neurites (beyaz ok) taşıyan hücreleri olgunlaşmamış nöronal marker beta-III tübülin (TUJ1) ifade. Yöntemleri de belirtildiği gibi floresan görüntüleri NPCs lekeli TUJ1 elde edilebilir ve daha sonra bu görüntüleri süreçleri nöronal kökeni emin olmak için TUJ1 + neurites oranı için sayılabilir. Bizim laboratuvar analizleri her iki yöntem tarafından istatistiksel olarak benzer sonuçlar vermiştir.

Basit tasarımı ve neurite tahlil hızlı doğası da gelişim ilgili büyüme faktörleri, sitokinler ve peptidler etkilerini test etmek sağlamak. Örneğin, Şekil 11 Bu peptit hipofiz adenilat polipeptid aktive cyclase göstermektedir (PACAP, 3 nM) artar neurite çıkıntı NPCs. PACAP içinde olduğu geniş ifade içinde CNS ve gösterilmiştir önemli bir gelişim faktör beyin gelişiminde önemli bir şey. Bizim laboratuvar ve diğer kemirgen çalışmaları PACAP neurite çıkıntı, geçiş ve yaygın her iki ön ve arka beyin16,22düzenleyen gibi yaygın sahne bağımlı gelişimsel etkileri vardır bulduk, 29,30,31. Ataman ve ark. tarafından son yıllarda yapılan çalışmalarda (2016) kullanarak kültürlü insan fetal beyin hücreleri belirtmek nöronal aktivite PACAP gen ekspresyonu, insan nöronal gelişim32peptidler önem gösteren 9-fold bir artış neden olmaktadır. Gerçekten de, tablo 2 kontrol ve PACAP neurites yüzdesini gösterir (3 nM) arasında çok sayıda satır koşulları etkilenmemiş bireyler türetilmiş. Tablo 2' de görüldüğü gibi orada bazı değişkenlik farklı klonlar aynı birey ve farklı kişilerden elde edilen NPCs türetilmiş hücre hatlarında ifade neurites yüzdesi. Ancak, bu etkilenmemiş bireyler neurite çıkıntı deneyleri tekrarlanabilirlik belirten PACAP, yanıt olarak bir artış bulunur.

Neurite akıbet gibi hücre geçiş önemli bir gelişim sürecinin uygun bağlantı, organizasyon ve kablolama beyin için gerekli değil. Neurospheres NPC geçiş NPCs (şekil 12) arasında hücre-hücre bağlantı kuran bir tipik yüksek yoğunluklu durumda çalışma izin. Gelişimsel olarak ilgili faktörler de geçiş üzerindeki etkileri değerlendirmek için neurospheres üzerinde test edilebilir. Örneğin, şekil 12 gösteren PACAP (10 nM) NPCs geçirilmesi artırır.

Figure 1
Şekil 1: NPCs, geçiş 3. NPCs P3, hızlı (A) pluripotent transkripsiyon faktörü, SOX2 dahil olmak üzere birden çok sahne özgü işaretleri (B) transkripsiyon faktörü için ön NPCs, PAX6, belirli ve NPC hücre iskeleti protein TESTİN. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: S-faz giriş testin şematik. S-faz giriş testin zaman çizelgesi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: S-faz giriş miktarının. (A) faz görüntü gösteren faz-karanlık canlı hücreleri (beyaz ok), faz parlak ölü hücre (beyaz yıldız) ve faz parlak canlı hücre (Yeşil ok). (B) floresan DAPI leke ölü hücre (beyaz yıldız) yoğun çekirdeği ve büyük çekirdekler canlı hücrede (beyaz ve Yeşil oklar) gösterilen. (C) parlak EdU olumlu çekirdek (kırmızı ok) ve benekli EdU olumlu çekirdek (Kızıl Yıldız) gösterilen floresan EdU görüntü. (D) aşama ve floresan birleştirme görüntüleri 3A - 3 C.

Figure 4
Şekil 4: neurites belirlenmesi. Faz kontrastlı görüntüler süreci ile NPCs. (A) A hücrenin > uzunluğu, böylece bir neurite için kriter toplantı 2 hücre gövdelerinde. (B) süreci ile bir hücre < uzunluğu ve bu nedenle değil olarak kabul neurite taşıyan 2 hücre gövdelerinde. (C) ile 2 işlemler daha uzun süreç için neurite kriter değerlendirilir mi-bir hücreyi temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: neurospheres geçiş tahlil için seçerek. (A) faz kontrast görüntü neurospheres 24 h, temsili bir alanın küreler tüm 100 mikron ve böylece, geçiş tahlil için toplanan değildir. (B) faz kontrast görüntü neurospheres 72 h temsilcisi bir alanın. Geçiş tahlil için toplanan olmaya hazır olduklarını belirten 100 mikron ± 20 µm Aralık içinde bütün küreleri vardır.

Figure 6
Şekil 6: geçiş miktarının. (A) faz kontrast görüntü temsilcisi neurosphere. (B) toplam neurosphere alanı ölçmek için izleme mavi anahat görüntülenir. Kırmızı iç hücre alanı ölçmek için kullanılan kontur kitle gösterir. Geçiş toplam neurosphere alan iç hücre yığın alanı olarak tanımlanır. Bu hücreler geçiş kontür dışlanmış olarak Not, beyaz daireler bir bitişik halı olmayan hücreler göster. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 7
Şekil 7: DNA sentezi değerlendirilmesi. FGF-tedavi NPCs. FGF (10 ng/mL) artar DNA sentezi, 48 h karşı Denetim Temsilcisi sonuçlarını (p ≤ 1 x 10-3). (n = 2-4 kuyu/grup/deneme; 3 deneyler). Hata çubukları SEM temsil

Figure 8
Şekil 8: S fazlı girerek hücre oranı. 48 h. Insets yüksek büyütme görüntüler için kontrol ve 10 ng/mL FGF medya floresan EdU işaretleyicisinde lekeli hücre temsil için (A) faz kontrast görüntüler NPC hücre FGF (10 ng/mL) tedavi medya karşı denetimindeki inkübe. Kırmızı oklar, EdU olumlu ve beyaz okları olan hücreler EdU negatif olan hücreleri gösterir gösterir. (B) grafik denetiminin FGF karşı temsilcisi sonuçlarının (10 ng/mL) tedavi NPCs. FGF artar S-faz giriş 48 h (p ≤1 x 10-3). (n = 2-4 yemekleri/grup/deneme; 3 deneyler). Hata çubukları SEM temsil

Figure 9
Şekil 9: 2, 4 ve 6 gün hücreleri numaralandırma. (A) hücre kontrolü ve FGF (10 ng/mL) tedavi medya kontrastlı görüntüler gün 2, 4 ve 6 aşama. (B) grafik temsili sonuçlarının; Not Bu FGF (10 ng/mL) her zaman artmaz hücre sayıları 2 gün ama 4 ve 6 gün artış belirgin (p ≤0.05) vardır. (n = 2-4 kuyu/grup/deneme; 3 deneyler). Hata çubukları SEM temsil

Figure 10
Şekil 10: düşük yoğunluklu koşullarında NPCs karakterizasyonu. (A, C, E) Faz kontrast görüntülerini NPCs düşük yoğunluklu koşullarında. (B) NPCs (yeşil) TESTİN kök/progenitor hücre işaretleri, SOX2 (kırmızı) ve nükleer marker DAPI (mavi) ifade eder. (D) PAX6 (kırmızı), DAPI (mavi). (F) , düşük yoğunluklu, aynı zamanda neurites (beyaz ok) uzanan hücreleri olgunlaşmamış nöron işaret TUJ1 (yeşil) ifade. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 11
Şekil 11: Neurite çıkıntı. (A) faz kontrast görüntü NPCs. Siyah okları neurites hücrelerle üzerine gelin. Peptit PACAP (B) eklenmesi (3 nM) neurites hücrelerle yüzde artırır (p ≤1 x 10-2). Neurite yapılan denetim ve 3 nM PACAP içeren medya (C) miktar. (n = 2-4 yemekleri/grup/deneme; 3 deneyler). Hata çubukları SEM temsil

Figure 12
Şekil 12: Neurosphere geçiş. (A) faz kontrast görüntülerini neurospheres. (B) yanı sıra PACAP (10 nM) neurosphere hücre göç (p ≤10-2) artırır (C) miktar hücre göç. (n = 20 küreler/grup/deney, 3 deneyler). Hata çubukları SEM temsil

Medya
Hasta Klon # CTRL FGF
(10 ng/mL)
Hasta 1 1 21,853 47,538
2 20,336 38,070
Hasta 2 1 7,664 14,060
2 16,573 30,087

Tablo 1: DNA sentezi. İki IPSC klon başına iki etkilenmemiş bireyler üzerinden NPCs (içinde BGBM'leri) DNA sentezi değerleri özetini elde.

Medya
Hasta Klon # CTRL PACAP
(3 nM)
Hasta 1 1 %13,60 %18.10
2 %16,50 %21,10
Hasta 2 1 %8,90 %14.10
2 %14.20 %21,10

Tablo 2: Neurites hücrelerle yüzdesi. Neurites NPC içinde taşıyan hücre yüzdesi özetini iki IPSC klon başına iki etkilenmemiş bireyler üzerinden türetilmiş.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada sunulan protokolleri temel nörogelişimsel işlemler çalışma ve büyüme faktörleri ve sinirsel habercisi hiPSC elde edilen hücreleri kullanarak uyuşturucu testi için hızlı ve basit yöntemleri gösterilmektedir. hiPSC teknoloji nörogelişimsel hastalıkların patogenezinde çalışmanın bizi insan nöronal hücre etkilenen bireylerin yaşamak için eşi görülmemiş erişim sağlayarak devrim yarattı. Gerçekten de, Rett sendromu, Timothy sendromu, Fragile X sendromu, dahil olmak üzere Nörogelişimsel bozukluklarının çok sayıda hiPSC çalışma yapılmıştır ve hastalığa özgü anomalileri dendrites yılında ortaya çıkarılan, şizofreni, synapses ve nöronal 4,33,34,35,36işlev. Bu çalışmaların en öncelikle ölümcül ayrıştırılan odaklı olması, hangi nispeten işlevsel olarak olgunlaşmamış kabul rağmen önceki nörogelişimsel çalışma dışlayan sonrası Mitotik nöronlar yayılması ve göç gibi işler. Bu ikinci işlemler ağır nörogelişimsel bozukluklar patogenezinde karıştığı olmuştur ve arama izni daha fazla çalışma8,9,10,11,12 , 35 , 37 , 38. NPC kullanımı Ayrıca hücrelerinin olgunlaşmamış aksonlar/dendrites (neurites) genişletme olanağı gibi daha olgun süreçler araştırmak için fırsat sağlarken bu önemli önceki olayları incelemek için bize izin verir. Ayrıca, bu deneyleri bazıları da neurite uzunluğu, numarası ve dallanma veya bir hücre tarafından en uzak mesafe gibi diğer parametreleri incelemek için genişletilebilir.

Bazı yeni çalışmalar bir 3-b "Mini beyin sistemi" daha erken gelişimsel olayları incelemek için organoid model sistemleri kullandım1,39,40. Henüz, hatta bu sistemlerinde organoid, proliferatif habercisi hücre nüfus sınırlı ve erken olgunlaşma ve geçiş15,39çalışmaya zor. Sınırlama ek olarak daha önce gelişim olayları, kullanımı çalışmanın ölümcül sinir hücreleri ayrıştırılan veya organoids çoğu zaman alıcı, masraflı ve içinde belgili tanımlık sistem tespit edilebilir değişkenlerin sayısını sınırlar. Bu nöronlar yapma çünkü ve organoids viral indüksiyon iletişim kuralları, özel İnkübatörler ve donanımları, birden çok hafta, zaman ve medyanın büyük miktarlarda gerektirebilir. Buna ek olarak, (ki daha sonra aşağıda açıklanan) DNA sentezi tahlil istisna ile bu iletişim kuralı nörogelişimsel bozukluklar çalışma odasına kolayca uygulanabilir ve kapsamlı bir eğitim, pahalı araçlar ve kaynaklar veya yazılım gerektirmez. Kolay ve nispeten düşük maliyet uyuşturucu ve büyüme faktörleri bu deneyleri ekleme yapmak nörogelişimsel ve nöropsikiyatrik hastalıkların çeşitli potansiyel tedavisi test etmek için bu protokolü yararlı yüksek üretilen iş teknoloji. Büyüme faktörleri Yasası ile hücresel sinyal yolları tanımlanan, Ayrıca, onlar da araçları olarak potansiyel geliştirme sistemleri içinde kusurları işaret için test etmek için kullanılabilir. Son olarak, NPCs proliferatif kendini yenileyerek Vaha'da olduğundan, hücre büyük miktarlarda üretilmektedir ve verimli bir şekilde NPCs iPSCs her zaman yapmak zorunda kalmadan yapılacak izin deneyler cryopreserved.

Başarıyla bu deneyleri istihdam için aşağıdaki kritik adımlar unutmamak gerekir. Bu iletişim kuralı NPCs bakım ve genişleme karşı deneme için farklı koşullar yerleştirir. NPCs indüklenir, özellikle, büyüdü ve sinirsel indüksiyon ek (NIS), içeren ortamda pasajlı bizim deneysel koşullar ek hücreleri bize fırsat geri eklemek için izin bir sınırlayıcı ortamda yerlerde % 70 azaltın iken ve önemli büyüme faktörlerinin etkileri test. İkinci olarak, NPCs geçişini izlemek için önemlidir. Çalışmalarımız, genellikle hücrenin satır sayısı geçit P3 - P8 sınırlandırmış. Pasajlar P3, daha önce bazı satırlar sağlam karakteristik işaretleri ifade yok. Bazı hücre hatları çok tutarlı büyüme oranları veya büyüme faktörleri, yanıtlarını varken daha yüksek pasajlar diğer hücre hatları hücre büyümesini veya yanıt dramatik değişiklikler olabilir. Değil düzenli olarak rapor rağmen biz ve diğerleri daha yüksek pasajlar, proliferatif oranlarında dramatik bu değişiklik yaşadım. Neden bu belirsiz, ancak bu değişiklik bir sınırlı kendini yenileme yeteneği NPCs. yansıtıyor olabilir için neden ve nasıl yayılması gore üzerinde genişletilmiş pasajlar değiştirmek tanımlama geliştirme ve hastalık patogenezinde sağlar, ancak daha fazla araştırma yapılması gerekir. Özellikle başlangıç iPSCs yüksek kalitede değildir Eğer son olarak, bizim kullandığımız ticari sinirsel indüksiyon Protokolü bazen kalitesiz sinir kök hücreleri, yol açabilir (i.e., hücre hücre kolonilerin sınırlarındaki ayırt var karyotip anomalileri). Bazı durumlarda, hücre morfolojisi bozuk ve ifade işaretleri mevcut değil. Bu kültürler kullanmayın. Diğer durumlarda, NPCs deneylerde kullanmadan önce hemen hemen saf NPC nüfus sağlamak için farklı hücre dekolmanı çözüm tedavisi kullanılarak kaldırılabilir düz "geçen madde" hücreleri ile büyümek. Yüksek kaliteli NPCs sahip uygun sonuçlar için kritik: malzeme ve ekipman bölüm nerede yüksek ve düşük kaliteli NPCs görüntülerini bulabilirsiniz sinirsel bir indüksiyon protokolü için bir bağlantı için bkz.

Her sunulan deneyleri için aşağıdaki önemli adımlar, olası hataları ve sorun giderme ipuçlarını unutmamak gerekir. Cep telefonu numarasını, DNA sentezi ve neurite deneyleri için tek hücre ayrışmış ve kümeleri değil, bu kadar DNA sentezi ölçüler, hücre sayımları ve neurite davranış çarpık plaka hücrelere önemlidir. Hücre kümeleri değil kaplama emin olmak için bir küçük hacimli bir P1000, plaka üzerinde bir slayt içeren hücrelerin örnek ve hücre kümeleri mevcut olup olmadığını kontrol edin. Kümeleri belirtilmiştir, yukarı ve aşağı el ile kaplama önce ayrı kümeleri kırmaya hücreleri pipet. DNA sentezi ve hücre sayı tahlil için hücre sayım ve çözümleme enzimler ile kalkar. Bu hücreler tamamen doğru sayar almak için kültür gemiden kaldırdı ve gerekirse, uzun enzim kuluçka dönemleri kullanılabilir görsel olarak onaylamak için önemlidir. Düşük hücre sayısı veya düşük BGBM'leri DNA sentezi tahlil için söz konusu olduğunda, daha yüksek ilk yoğunlukları, radyoaktif tritiated [3H] hücreleri kaplama - timidin çift (4 saatte 2 yerine), veya eklenebilir tritiated [3H] için - timidin konsantrasyon katına olabilir. Neurite tahlil için ilk kaplama yoğunluğu artan hücre hücre iletişim riske atmadan katına olabilir. Dikkat hücreleri dağıtımıyla arasında bir tabak ve çanak her parçası örneklenir öyle ki 1 cm satırları sayma. Neurite yüzde 48 h çok düşükse, tahlil 6 gün veya kaplama yüzey türü kadar uzatılabilir veya konsantrasyon neurites büyük yüzdesi tanıtmak için değiştirilebilir. Ancak, kaplama kez ve biz iletişim kuralında sundu yöntemleri en uygun neurite çıkıntı ve hücre sağlık için çok sayıda farklı yüzeylerde, substrat konsantrasyonu ve kaplama kez test ettikten sonra seçilmiştir unutmamak gerekir. Neurosphere tahlil için daha küçük pipettors (P20, P200) kullanımını kesme ve kırılma daha büyük küre yol açabilir. Böylece, pipetting hafifçe ve bir P1000 veya serolojik pipet ile yapılır zorunludur. Neurospheres peletleme için daha düşük hızlarda (300 x g yerine 100 x g) da neurosphere ayrılma önlemek için tavsiye edilir. Küre kaplama sırasında küre küre iletişim geçiş etkileyebilir gibi alanlarda uygun şekilde ayrı aralıklandırılmış olun. Geçiş çok hızlı veya çok yavaş olduğu durumlarda, kuluçka zamanı azalmıştır veya sırasıyla arttı. Kaplama yüzeylerde de geçiş oranları değiştirmek için değiştirilebilir.

Kullanılan teknikler hızlı, basit ve nörogelişimsel bozukluklar incelenmesi için geçerli olmakla birlikte, bazı sınırlamalar vardır. İlk olarak, çoğu sunulan analizleri (hücre sayı tahlil, neurite tahlil, geçiş tahlil), müfettişler subjektif kararlar gerektirir (örneğin, bir neurite bu? Bu hücre öldü mü?) potansiyel olarak önde gelen araştırmacı önyargı ve daha düşük tekrarlanabilirlik için. Ancak, analizler kör ve ayar katı standartlara bir tahlil içinde verdiğim her karar için yöntemleri, gösterildiği gibi iletken bu önyargıları iyileştirmek. Benzer şekilde, bu deneyleri el ile yapılan ölçümler ve zaman alıcı ve emek yoğun olabilir sayar gerektirir. Ancak, ekipman ve teknik kaynaklar var laboratuvarlarında, bu deneyleri otomatik hücre sayaçları ve otomatik ölçümler41,42-ebilmek davranış programları kullanılarak hızlanmasına. DNA sentezi tahlil söz konusu olduğunda bu yöntemler bizim hücre hasat ve mercek makineye özgü (malzeme ve ekipman bakın); Ancak, diğer kullanılabilir model ve Omnifilter-95 hücre hasat gibi aynı bilgilere erişim için kullanılan yöntemleri vardır. Bazı kurumlar için radyoaktif kaynakların kullanılması mümkün olmayabilir. Bu durumda, floresan timidin analog, EdU, floresan Mikroplaka okuyucu üzerinde analiz gibi kullanarak alternatif bir yöntem DNA sentezi44toplu analizi hakkında bilgi aynı edinimi için izin verir.

Düşük yoğunluklu kültür sistemimiz tek tek hücrelere veya küçük kümeleri, NPCs yoğun dolu doğa gelişmekte olan Nöral tüp içinde farklı bir durum içine NPCs ayırır. Ancak, NPCs sağlıklı ve hızlı uygun işaretleri (şekil 1, şekil 10) vardır. Ayrıca, önceki çalışmalarımız kültürlerin gösterilen fare ve sıçan kortikal vitro kültür bulguları paralel ve in vivo modelleri yardımcı programı ve istimal bu değeri16,17,18 yaklaşım gösterir , 19 , 24. buna ek olarak, bu sistemi hücre olgunlaşma anlamak ve hücre alt nüfus çalışma güçlü bir yaklaşım sağlar. Örneğin, immünhistokimya ne belirli nöronal hücre tipi bir neurite uzanan belirlemek için neurite tahlil yapılabilir. Sonuçta, bazı sınırlamalar rağmen bu benzersiz Protokolü nörogelişimsel bozuklukları eğitim için basit, güçlü ve hızlı yöntemler sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Acknowledgments

Bu eser tıbbi araştırma ve otizm tedavisi (CAUT13APS010; için New Jersey valisi Konseyi tarafından desteklenmiştir CAUT14APL031; CAUT15APL041), Nancy Lurie Aile Vakfı, Mindworks Hayır kurşun güven ve Yahudi cemaati Vakfı büyük MetroWest NJ işaretleri.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PSC Neural Induction Medium:
Protocol Link: https://goo.gl/euub7a 		 ThermoFischer Scientific A1647801 This is a kit that consists of Neurobasal (NB) medium and a 50x Neural Induction Supplement (NIS). The NIS is used to make 1X Neural Induction Medium and 100% Expansion Medium
Advanced DMEM/F12 Medium ThermoFischer Scientific 12634-010 Component of 100% Expansion Medium
Neurobasal Medium ThermoFischer Scientific 21103049 Component of both NIM and 100% Expansion Medium 
hESC-qualified Matrigel Corning 354277 hESC-qualified extracellular matrix-mimic gel (ECM-mimic gel) 
Y-27632 (2HCl), 1 mg Stem Cell Technologies 72302 ROCK inhibitor
6 well plates Corning COR-3506 Polystyrene plates used for NPC maintenance and for Neurosphere Migration Assay 
24 well plates ThermoFischer Scientific 2021-05 Polystyrene plates: Used for NPC DNA Synthesis Assay
35 mm dishes ThermoFischer Scientific 2021-01 Polystyrene plates: Used for NPC S-Phase Entry and Neurite Assay
Natural Mouse Laminin Invitrogen 23017-015 Substrate for coating plates: Used for NPC DNA Synthesis, S-Phase Entry, and Cell Number Assays
Fibronectin Sigma F1141 Substrate for coating plates: Used for Neurite Assay 
Poly-D-Lysine Sigma P0899 Substrate for coating plates
Penicillin/Streptomycin ThermoFischer Scientific 15140122 Antibiotic, component of NIM, 100% Expansion and 30% Expansion Media 
StemPro Accutase Gibco A11105-01 1X Cell Detachment Solution 
2.5% Trypsin (10X) Gibco 15090-046 10X enzymatic solution
0.5 M EDTA ThermoFischer Scientific AM9261 used in trypsin solution for lifting cells for DNA synthesis assay
tritiated [3H]-thymidine PerkinElmer NET027E001 Radioactive tritium, thymidine
Fisherbrand 7 mL HDPE Scintillation Vials Fisherbrand 03-337-1 Vials for liquid scintillation counting
EcoLite(+) MP Biomedicals 0188247501  Liquid scintillation cocktail
LS 6500 multi-purpose liquid scintillation counter Beckman Coulter 8043-30-1194 Liquid Scintillation Counter
Skatron Semi-automactic Cell Harvester Type 11019 Molecular Devices & Skatron Instruments, Inc. Semi-automatic cell harvester
Click-iT EdU Alexa Fluor® 488 Imaging Kit ThermoFisher Scientific C10337 EdU and staining kit for S-Phase Entry Assay
Trypan Blue Solution, 0.4% ThermoFisher Scientific 15250061 Assessing viability of cells
Grade GF/C filter paper GE Healthcare Life Sciences, Whatman 1822-849 Glass fiber filter paper
Human Basic FGF-2 Peprotech 100-18B growth factor
Pituitary Adenylate Cyclase Activating Polypeptide (PACAP-38) BACHEM H-8430 neuropeptide

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  2. Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145 (6), 831-834 (2011).
  3. Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476 (7359), 220-223 (2011).
  4. Marchetto, M. C., et al. A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143 (4), 527-539 (2010).
  5. Bershteyn, M., et al. Human iPSC-Derived Cerebral Organoids Model Cellular Features of Lissencephaly and Reveal Prolonged Mitosis of Outer Radial Glia. Cell Stem Cell. 20 (4), 435-449 (2017).
  6. Giandomenico, S. L., Lancaster, M. A. Probing human brain evolution and development in organoids. Curr Opin Cell Biol. 44, 36-43 (2017).
  7. Vaccarino, F. M., et al. Induced pluripotent stem cells: a new tool to confront the challenge of neuropsychiatric disorders. Neuropharmacology. 60 (7-8), 1355-1363 (2011).
  8. Walsh, T., et al. Rare structural variants disrupt multiple genes in neurodevelopmental pathways in schizophrenia. Science. 320 (5875), 539-543 (2008).
  9. Guilmatre, A., et al. Recurrent rearrangements in synaptic and neurodevelopmental genes and shared biologic pathways in schizophrenia, autism, and mental retardation. Arch Gen Psychiatry. 66 (9), 947-956 (2009).
  10. Pinto, D., et al. Convergence of genes and cellular pathways dysregulated in autism spectrum disorders. Am J Hum Genet. 94 (5), 677-694 (2014).
  11. Parikshak, N. N., et al. Integrative functional genomic analyses implicate specific molecular pathways and circuits in autism. Cell. 155 (5), 1008-1021 (2013).
  12. Birnbaum, R., Jaffe, A. E., Hyde, T. M., Kleinman, J. E., Weinberger, D. R. Prenatal expression patterns of genes associated with neuropsychiatric disorders. Am J Psychiatry. 171 (7), 758-767 (2014).
  13. Voineagu, I., et al. Transcriptomic analysis of autistic brain reveals convergent molecular pathology. Nature. 474 (7351), 380-384 (2011).
  14. Willsey, A. J., et al. Coexpression networks implicate human midfetal deep cortical projection neurons in the pathogenesis of autism. Cell. 155 (5), 997-1007 (2013).
  15. Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
  16. Yan, Y., et al. Pro- and anti-mitogenic actions of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide in developing cerebral cortex: potential mediation by developmental switch of PAC1 receptor mRNA isoforms. J Neurosci. 33 (9), 3865-3878 (2013).
  17. Mairet-Coello, G., et al. p57(KIP2) regulates radial glia and intermediate precursor cell cycle dynamics and lower layer neurogenesis in developing cerebral cortex. Development. 139 (3), 475-487 (2012).
  18. Tury, A., Mairet-Coello, G., DiCicco-Bloom, E. The cyclin-dependent kinase inhibitor p57Kip2 regulates cell cycle exit, differentiation, and migration of embryonic cerebral cortical precursors. Cereb Cortex. 21 (8), 1840-1856 (2011).
  19. Mairet-Coello, G., Tury, A., DiCicco-Bloom, E. Insulin-like growth factor-1 promotes G(1)/S cell cycle progression through bidirectional regulation of cyclins and cyclin-dependent kinase inhibitors via the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt pathway in developing rat cerebral cortex. J Neurosci. 29 (3), 775-788 (2009).
  20. Tury, A., Mairet-Coello, G., DiCicco-Bloom, E. The multiple roles of the cyclin-dependent kinase inhibitory protein p57(KIP2) in cerebral cortical neurogenesis. Dev Neurobiol. 72 (6), 821-842 (2012).
  21. Li, B., DiCicco-Bloom, E. Basic fibroblast growth factor exhibits dual and rapid regulation of cyclin D1 and p27 to stimulate proliferation of rat cerebral cortical precursors. Dev Neurosci. 26 (2-4), 197-207 (2004).
  22. Lu, N., DiCicco-Bloom, E. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide is an autocrine inhibitor of mitosis in cultured cortical precursor cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (7), 3357-3362 (1997).
  23. Zhou, X., Suh, J., Cerretti, D. P., Zhou, R., DiCicco-Bloom, E. Ephrins stimulate neurite outgrowth during early cortical neurogenesis. J Neurosci Res. 66 (6), 1054-1063 (2001).
  24. Falluel-Morel, A., et al. N-acetyl cysteine treatment reduces mercury-induced neurotoxicity in the developing rat hippocampus. J Neurosci Res. 90 (4), 743-750 (2012).
  25. Rossman, I. T., et al. Engrailed2 modulates cerebellar granule neuron precursor proliferation, differentiation and insulin-like growth factor 1 signaling during postnatal development. Mol Autism. 5 (1), 9 (2014).
  26. Tao, Y., Black, I. B., DiCicco-Bloom, E. In vivo neurogenesis is inhibited by neutralizing antibodies to basic fibroblast growth factor. J Neurobiol. 33 (3), 289-296 (1997).
  27. Vaccarino, F. M., Grigorenko, E. L., Smith, K. M., Stevens, H. E. Regulation of cerebral cortical size and neuron number by fibroblast growth factors: implications for autism. J Autism Dev Disord. 39 (3), 511-520 (2009).
  28. Kaplan, D. R., Miller, F. D. Neurotrophin signal transduction in the nervous system. Curr Opin Neurobiol. 10 (3), 381-391 (2000).
  29. Shen, S., Gehlert, D. R., Collier, D. A. PACAP and PAC1 receptor in brain development and behavior. Neuropeptides. 47 (6), 421-430 (2013).
  30. Suh, J., Lu, N., Nicot, A., Tatsuno, I., DiCicco-Bloom, E. PACAP is an anti-mitogenic signal in developing cerebral cortex. Nat Neurosci. 4 (2), 123-124 (2001).
  31. Falluel-Morel, A., et al. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide prevents the effects of ceramides on migration, neurite outgrowth, and cytoskeleton remodeling. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (7), 2637-2642 (2005).
  32. Ataman, B., et al. Evolution of Osteocrin as an activity-regulated factor in the primate brain. Nature. 539 (7628), 242-247 (2016).
  33. Doers, M. E., et al. iPSC-derived forebrain neurons from FXS individuals show defects in initial neurite outgrowth. Stem Cells Dev. 23 (15), 1777-1787 (2014).
  34. Pasca, S. P., et al. Using iPSC-derived neurons to uncover cellular phenotypes associated with Timothy syndrome. Nat Med. 17 (12), 1657-1662 (2011).
  35. Brennand, K., et al. Phenotypic differences in hiPSC NPCs derived from patients with schizophrenia. Mol Psychiatry. 20 (3), 361-368 (2015).
  36. Marchetto, M. C., et al. Altered proliferation and networks in neural cells derived from idiopathic autistic individuals. Mol Psychiatry. , (2016).
  37. Voineagu, I. Gene expression studies in autism: moving from the genome to the transcriptome and beyond. Neurobiol Dis. 45 (1), 69-75 (2012).
  38. Waltereit, R., Banaschewski, T., Meyer-Lindenberg, A., Poustka, L. Interaction of neurodevelopmental pathways and synaptic plasticity in mental retardation, autism spectrum disorder and schizophrenia: implications for psychiatry. World J Biol Psychiatry. 15 (7), 507-516 (2014).
  39. Quadrato, G., Brown, J., Arlotta, P. The promises and challenges of human brain organoids as models of neuropsychiatric disease. Nat Med. 22 (11), 1220-1228 (2016).
  40. Pasca, S. P., Panagiotakos, G., Dolmetsch, R. E. Generating human neurons in vitro and using them to understand neuropsychiatric disease. Annu Rev Neurosci. 37, 479-501 (2014).
  41. Huttunen, T. T., et al. An automated continuous monitoring system: a useful tool for monitoring neuronal differentiation of human embryonic stem cells. Stem Cell Studies. 1 (1), 10 (2011).
  42. Lappalainen, R. S., et al. Similarly derived and cultured hESC lines show variation in their developmental potential towards neuronal cells in long-term culture. Regen Med. 5 (5), 749-762 (2010).
  43. ThermoFisher. GIBCO Induction of Neural Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells Using PSC Neural Induction Medium. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0008031.pdf (2017).
  44. ThermoFisher. Invitrogen Click-iT EdU Microplate Assay. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/mp10214.pdf (2017).

Tags

Gelişim biyolojisi sayı: 133 açıkların gelişim biyolojisi sinirsel öncül hücreleri IPSC beyin hastalığı otizm büyüme faktörleri nükleer silahların yayılmasına karşı neurite çıkıntı hücre göç
Hızlı algılama nörogelişimsel fenotipleri insan sinir habercisi hücrelerdeki (NPCs)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Williams, M., Prem, S., Zhou, X.,… More

Williams, M., Prem, S., Zhou, X., Matteson, P., Yeung, P. L., Lu, C. W., Pang, Z., Brzustowicz, L., Millonig, J. H., Dicicco-Bloom, E. Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells (NPCs). J. Vis. Exp. (133), e56628, doi:10.3791/56628 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter