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Biology

इन विट्रो SUMOylation परख सूमो E3 Ligase गतिविधि का अध्ययन करने के लिए

Published: January 29, 2018 doi: 10.3791/56629
Automatic Translation
1, 2, 2,3,4,5, 1,6
1Institute of Microbiology and Immunology, National Yang-Ming University, 2UC Davis Cancer Center, University of California, Davis, 3Department of Biochemistry and Molecular Medicine, University of California, Davis, 4Institute for Translational Medicine, College of Medical Science and Technology, Taipei Medical University, 5Division of Molecular and Genomic Medicine, National Health Research Institutes, 6Center for Infectious Disease and Cancer Research, Kaohsiung Medical University

Summary

ubiquitin ligases के विपरीत, कुछ E3 सूमो ligases पहचान की गई है । इन विट्रो SUMOylation प्रोटोकॉल में संशोधित एक इन विट्रो पुनर्गठन परख द्वारा उपंयास सूमो E3 ligases की पहचान करने में सक्षम है ।

Abstract

छोटे ubiquitin की तरह संशोधक (सुमो) संशोधन एक महत्वपूर्ण पद अनुवाद संशोधन (PTM) है कि मुख्य रूप से प्रोटीन प्रोटीन बातचीत संग्राहक के माध्यम से संकेत transduction मध्यस्थता है । ubiquitin संशोधन करने के लिए इसी तरह, SUMOylation E1-सक्रिय एंजाइम (SAE1/SAE2), E2-विकार एंजाइम (Ubc9), और E3-ligase (यानी, PIAS परिवार, RanBP2, और Pc2) सहित एक अनुक्रमिक एंजाइम झरना द्वारा निर्देशित है । हालांकि, ubiquitination से अलग है, एक E3 ligase गैर प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक है, लेकिन सटीक और प्रभावकारिता प्रदान करता है सूमो विकार के लिए । SUMOylation द्वारा संशोधित प्रोटीन सब्सट्रेट विशेष एंटीबॉडी और सूमो-विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ immunoblotting के साथ immunoprecipitation के माध्यम से vivo परख में द्वारा पहचाना जा सकता है । हालांकि, प्रोटीन सूमो E3 ligase गतिविधि के प्रदर्शन में इन विट्रो SUMOylation परख के पुनर्गठन की आवश्यकता है शुद्ध एंजाइमों, सब्सट्रेट, और सूमो प्रोटीन का उपयोग कर । के बाद से इन विट्रो में प्रतिक्रियाओं, आमतौर पर SAE1/SAE2 और Ubc9, अकेले सूमो विकार के लिए पर्याप्त हैं, SUMOylation के एक ख्यात E3 ligase द्वारा वृद्धि हमेशा पता लगाने के लिए आसान नहीं है । यहां, हम इन विट्रो SUMOylation प्रोटोकॉल में एक संशोधित वर्णन है कि लगातार सूमो संशोधन एक में इन विट्रो प्रणाली का उपयोग कर पहचानता है । उत्प्रेरक सक्रिय K-bZIP, एक वायरल सूमो-2/3 E3 ligase को शुद्ध करने के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल भी प्रस्तुत किया जाता है । bZIP की शुद्धि के SUMOylation कार्यकलाप p53 पर दिखाए जाते हैं, जो सुमो का सुपरिचित लक्ष्य है. इस प्रोटोकॉल elucidating उपंयास सूमो E3 ligases के लिए ही कार्यरत नहीं हो सकता है, लेकिन यह भी उनके सूमो paralog विशिष्टता खुलासा करने के लिए ।

Introduction

सूमो संशोधन शुरू में एक प्रतिवर्ती बाद अनुवाद संशोधन (PTM) है कि प्रोटीन स्थिरता को विनियमित के रूप में पहचाना गया था1। प्रत्यक्ष विकार के अलावा, सूमो भी सूमो इंटरेक्शन रूपांकनों (SIMs) द्वारा गैर आबंध बातचीत के माध्यम से एक प्रोटीन से जुड़ा जा सकता है2। tyrosyl के बंधन के समान-फास्फारिलीकरण Src समरूपता 2 (SH2) या phosphotyrosine बाइंडिंग (PTB) डोमेन3,4, सूमो संशोधन के लिए एक अतिरिक्त संपर्क मंच प्रदान करता है के लिए चयनित सिम युक्त प्रभाव वाले प्रोटीन की भर्ती5,6. संकेत transduction के विनियमन के अलावा, transcriptional कारकों और क्रोमेटिन remodeling अणुओं के SUMOylation जीन अभिव्यक्ति7,8का नियमन करने की सेवा । जीनोम-वाइड SUMOylation पैटर्न के अध्ययनों से पता चला है कि सूमो संशोधन या तो सकारात्मक9,10 या नकारात्मक10,11,12 प्रतिलेखन के साथ जुड़ा हुआ है विनियमन, SUMOylation की paralogue विशिष्टता के कारण भाग में ।

स्तनधारी कोशिकाओं में मौजूद प्रोटीन conjugating के लिए तीन प्रमुख सूमो isoforms हैं; इनमें सूमो-1, और अत्यधिक मुताबिक़ सूमो-2 और सूमो-3 शामिल है (सूमो-2/13के रूप में संदर्भित । सूमो आमतौर पर संयुग्मित है lysine (कश्मीर) ψKxD/ई के भीतर अवशेष लक्ष्य प्रोटीन में आम सहमति आकृति । सूमो E3 ligases में सिम paralogue विशिष्टता14के लिए जिंमेदार है । ubiquitination e3 ligases के सैकड़ों युक्त रास्ते के विपरीत, वहां केवल कुछ सूमो E3 ligases15की पहचान की गई है । सूमो E3 ligases उनके (मैं) बांध Ubc9, (ii) एक सिम डोमेन के माध्यम से बांध सूमो moiety की क्षमता सहित संपत्तियों द्वारा परिभाषित कर रहे हैं, और (iii) सब्सट्रेट पर Ubc9 से सूमो हस्तांतरण को बढ़ाने । E3 ligase बिल्कुल सूमो विकार के लिए आवश्यक नहीं है16, लेकिन सब्सट्रेट और सूमो-paralogue विशिष्टता प्रदान करता है । के बाद से आमतौर पर केवल कुल सब्सट्रेट प्रोटीन का एक छोटा सा अंश सूमो संशोधित है, vivo में SUMOylated प्रोटीन का पता लगाने हमेशा एक चुनौती है. इसलिए, सटीक और प्रतिलिपि परख के लिए सूमो संशोधन के सटीक समारोह स्पष्ट की जरूरत है ।

इन विट्रो SUMOylation परख, जो सब्सट्रेट प्रोटीन के उत्प्रेरित SUMOylation को शुद्ध Ubc9 की क्षमता का मूल्यांकन करता है, एक अच्छी तरह से स्वीकार किए जाते है सूमो संशोधन17के अध्ययन के लिए परख है । हालांकि, ज्यादातर मामलों में सूमो e3 ligase गतिविधि का पता लगाया जा सकता है या केवल उच्च सूमो E3 ligase गतिविधि और कम सब्सट्रेट विशिष्टता के साथ मानक प्रोटोकॉल के एक प्रचुर मात्रा में Ubc9 की उपस्थिति की वजह से की पहचान की गई सूमो ligase के साथ पता लगाया जा सकता18 . इस परख की समग्र सफलता काफी हद तक शुद्ध Ubc9 के सावधान अनुमापन पर निर्भर करता है । इन विट्रो SUMOylation परख यहां वर्णित एक मानक SUMOylation प्रोटोकॉल से संशोधित किया गया है ( सामग्री की तालिकादेखें) । है Kaposi सार्कोमा के दौरान वृद्धि हुई वैश्विक सूमो संशोधन के प्रेक्षण-एसोसिएटेड gerpevirusnoy (KSHV) पुनर्सक्रियण हमें प्रेरित करने के लिए वायरल सूमो E3 ligase की पहचान है कि अप के लिए जिंमेदार हो सकता है SUMOylation के विनियमन । वायरल सूमो E3 ligase K-bZIP के बातचीत प्रोटीन के एक छोटे पैमाने पर स्क्रीनिंग के बाद, p53 एक उपंयास सब्सट्रेट के रूप में पहचाना गया था । इस प्रोटोकॉल में, हम कीट कोशिकाओं में विस्तार से दिखाने के कदम अभिव्यक्ति और वंय-प्रकार कश्मीर के शुद्धि में शामिल-bZIP, एक वायरल सूमो E3 सूमो के साथ ligase-2/ शुद्ध K-bZIP की क्षमता p53, एक प्रसिद्ध सूमो सब्सट्रेट के SUMOylation को बढ़ाने के लिए, E1 और E2 एंजाइमों की कम मात्रा की उपस्थिति में मूल्यांकन किया जाता है । इस संशोधित SUMOylation परख का उपयोग करना, शोधकर्ताओं ने मज़बूती से सूमो E3 ligase की क्षमताओं को परिभाषित कर सकते है SUMOylate उपंयास या जाना जाता है सब्सट्रेट, जो प्रोटीन SUMOylation के अध्ययन में एक प्राथमिक कदम है । इसके अलावा, इस विधि कम ligase गतिविधि लेकिन उच्च सब्सट्रेट विशिष्टता के साथ उपंयास सूमो E3 ligases की पहचान में मदद करता है ।

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Protocol

1. Baculovirus अभिव्यक्ति का निर्माण की तैयारी

  1. एक दोहरी अभिव्यक्ति baculovirus वेक्टर में k-bZIP19 के सीडीएनए क्लोनिंग द्वारा सूमो E3 ligase k-bZIP (सामग्री की तालिका देखें) एक N-टर्मिनल epitope-टैग के साथ । हम एक octapeptide टैग का उपयोग सफलता मिली है (सदिश के रूप में प्रोटोकॉल भर में संकेत-टैग-K-bZIP) ।
    नोट: डीएनए के लिए टेंपलेट k-bZIP पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) क्लोनिंग सीडीएनए रिवर्स आरएनए से पृथक TREx F3H3-K-आरटीए BCBL-1 कोशिकाओं doxycycline उपचार के बाद से प्रतिलिखित है20।
    1. पूर्ण लंबाई K-bZIP सीडीएनए19 दोहरी अभिव्यक्ति वेक्टर में सूत्रके साथ स्थानांतरण मैं साइटों क्लोनिंग । सूत्र मैं 3 h के लिए पीसीआर उत्पाद और 1 µ जी दोहरी अभिव्यक्ति वेक्टर के ३७ ° c पर पचाने के लिए21।
    2. अलग और एक ०.८% agarose जेल22पर ट्रो निंनलिखित पचा डीएनए निकालने । Ligate (K-bZIP) और वेक्टर-टी-4 डीएनए ligase द्वारा 30 मिनट के लिए 16 ° c में निर्माता के निर्देशों के अनुसार ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
    3. जोड़ें 5 µ बंधाव डीएनए के एल ५० µ एल सक्षम ई. कोलाई कोशिकाओं "एक" ( सामग्री की तालिकादेखें) एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में । 30 मिनट के लिए बर्फ पर रखो । फिर, ४५ s के लिए एक ४२ ° c पानी स्नान में १.५ मिलीलीटर ट्यूब मशीन और तुरंत 3 मिनट के लिए बर्फ पर ट्यूब डाल दिया ।
    4. जोड़ें ६०० µ एल S.O.C. मध्यम (०.५% (डब्ल्यू/2% (डब्ल्यू/वी) tryptone, 10 मिमी NaCl, २.५ मिमी KCl, 20 मिमी MgSO4, और 4% (डब्ल्यू/वी) ग्लूकोज) में ट्यूब और मशीन के लिए ३७ ° c 1 h. फिर, कमरे के तापमान पर ६०० x g पर 3 मिनट के लिए ट्यूब केंद्रापसारक
    5. निकालें supernatant, ६० µ एल Luria-Bertani मध्यम (पौंड; 1% (डब्ल्यू/वी) tryptone, ०.५% (डब्ल्यू/वी) खमीर निकालने, और ८५ mM NaCl) और पौंड आगर पर प्रसार के साथ गोली reसस्पेंड १०० µ g/एमएल एम्पीसिलीन युक्त प्लेटें । 16 ज23,24के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर आगर प्लेट मशीन ।
    6. २५० rpm मिलाते के साथ 16 एच के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर १०० µ जी/एमएल एम्पीसिलीन और संस्कृति युक्त 5 मिलीलीटर पौंड में लगाना करने के लिए 1 कॉलोनी का चयन करें । फिर, प्लाज्मिड, वेक्टर टैग-K-bZIP, एक प्लाज्मिड निष्कर्षण किट द्वारा निर्माता के निर्देशों के अनुसार निकालने ( सामग्री की तालिकादेखें).
  2. उत्पंन संयोजक टैग बंदरगाह bacmid-k-वेक्टर के परिवर्तन से bZIP-टैग-k-सक्षम ई. कोलाई कोशिकाओं में bZIP "बी" (सामग्री की तालिका देखें) ।
    1. Mix ०.२ µ छ वेक्टर-तग-K-bZIP प्लाज्मिड र १०० µ l सक्षम ई. कोलाई कोशिकाओं "बी" एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में और 30 मिनट के लिए बर्फ पर डाल दिया ४२ ° c पानी स्नान के लिए ४५ एस के लिए और तुरंत 3 मिनट के लिए बर्फ पर ट्यूब डाल ।
    2. ट्यूब में S.O.C. माध्यम के ९०० µ एल जोड़ें और ५० rpm पर रोटेशन के साथ 4 एच के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन । इसके बाद, मध् यम के 10 µ l को एक अतिरिक् त ५० µ l में डालें । O. C मध्यम ५० µ g/ml कनमीसिन, 7 µ g/एमएल gentamicin, 10 µ g/एमएल टेट्रासाइक्लिन, १०० µ g/ml galactosidase सब्सट्रेट, और ४० µ g/ml isopropyl-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG ), और ३७ डिग्री सेल्सियस पर ४८ घंटे के लिए प्लेटें मशीन ।
    3. लगाना एक सफेद कॉलोनी में 5 मिलीलीटर पौंड मध्यम से युक्त ५० µ जी/एमएल कनमीसिन, 7 µ जी/एमएल gentamicin, और 10 µ जी/ 16 घंटे के लिए मिलाते २५० rpm के साथ ३७ ° c पर मशीन ।
    4. संयोजक bacmid डीएनए को अलग टैग-K-bZIP, यों, और 1 µ g/µ l25की एकाग्रता पर पुनः निलंबित ।
  3. उत्पंन संयोजक baculoviruses व्यक्त टैग-k-bZIP द्वारा transfecting 1 µ जी के संयोजक bacmid डीएनए युक्त टैग-k-bZIP में Sf9 कोशिकाओं में एक अच्छी तरह से एक 6-वेल प्लेट की ।
    1. बीज 2 x 106 Sf9 कोशिकाओं ( सामग्री की तालिकादेखें) में 2 मिलीलीटर अनुग्रह के कीट मध्यम 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और एक अच्छी तरह से एक 6 अच्छी प्लेट के प्रत्येक कुआं में 1% gentamicin के साथ आपूर्ति की है, तो 1 एच के लिए 27 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी ।
    2. अनुग्रह कीट में Sf9 कोशिकाओं के एक लॉग चरण संस्कृति बनाए रखने 10% FBS, 1% gentamicin, और 1% डिटर्जेंट सी ( सामग्री की तालिकादेखें) १४० rpm पर कक्षीय निलंबन में 27 डिग्री सेल्सियस में) के साथ आपूर्ति की । एक hemocytometer और trypan नीले दाग का उपयोग कर कोशिकाओं गिनती; कोशिका व्यवहार्यता ९५% से अधिक होनी चाहिए । 1:3 हर 2-3 दिन (ंयूनतम घनत्व ~ ०.५ x 106 कोशिकाओं/एमएल) के एक उपकृषि अनुपात का उपयोग कर कोशिकाओं को बनाए रखने ।
    3. जोड़ें 2 µ l bacmid डीएनए (1 µ g/µ l) और ९८ µ l कम सीरम मीडिया ( सामग्री की तालिकादेखें) में एक 2 मिलीलीटर ट्यूब । फिर, 4 µ एल अभिकर्मक रिएजेंट जोड़ें ( सामग्री की तालिकादेखें) ट्यूब करने के लिए और अच्छी तरह से मिश्रण. 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन ।
    4. इस अभिकर्मक मिश्रण जोड़ें (१०४ µ एल) में एक अच्छी तरह से, और 12-16 एच के लिए 27 डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।
    5. कोमल आकांक्षा के साथ समाप्त मीडिया निकालें, और ताजा अनुग्रह के कीट मध्यम 10% FBS और 1% gentamicin के साथ आपूर्ति की 2 मिलीलीटर के साथ बदलें । Sf9 कोशिकाएँ शिथिल होकर थाली की सतह का पालन करती हैं और कोमल आकांक्षा से परेशान नहीं होंगी.
  4. आगे के प्रयोगों के लिए उच्च titer स्टॉक्स (P1) प्राप्त करने के लिए baculovirus अभिकर्मक और बढ़ाना के बाद संयोजक baculovirus लीजिए ।
    1. ७२ एच मध्यम बदलने के बाद, Sf9 एक बाँझ कोशिका भारोत्तोलक का उपयोग कर कोशिकाओं परिमार्जन, प्रत्येक व्यक्ति अच्छी तरह से एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब और भंवर में 10 एस के लिए supernatant इकट्ठा.
    2. १५० x जी में 3 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर केंद्रापसारक P0 baculovirus और १.५ मिलीलीटर ट्यूबों में aliquot के रूप में supernatant लीजिए (प्रत्येक ट्यूब में 1 मिलीलीटर baculovirus) । पर स्टोर-८० ° c ।
    3. बीज 1 x 107 Sf9 कोशिकाओं में 10 मिलीलीटर अनुग्रह के कीट मध्यम 10% FBS और 1% gentamicin में 10 सेमी पेट्री डिश और 1 एच के लिए 27 डिग्री सेल्सियस पर मशीन के साथ आपूर्ति की ।
    4. संयोजक baculoviruses व्यक्त टैग-K-bZIP के प्रवर्धन के लिए, ४८ एच के लिए ०.५ मिलीलीटर P0 baculovirus को वरीयता प्राप्त Sf9 कोशिकाओं और 27 डिग्री सेल्सियस पर मशीन जोड़ें ।
    5. एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में P1 baculovirus के रूप में supernatant लीजिए और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करने के लिए 1 महीने ।

2. K-bZIP का शुद्धिकरण

  1. अनुग्रह कीट मध्यम में Sf9 कोशिकाओं के एक लॉग चरण संस्कृति को बनाए रखने के 10% FBS, 1% gentamicin, और 1% डिटर्जेंट सी पर १४० rpm में कक्षीय निलंबन में 27 डिग्री सेल्सियस पर के रूप में वर्णित कदम 1.3.2 ।
  2. transduction के दिन, 2 x 106 कोशिकाओं/एमएल के घनत्व के साथ Sf9 कोशिकाओं के २५० मिलीलीटर में baculovirus-युक्त supernatant (P1) के 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
  3. ७२ के लिए Sf9 कोशिकाओं की मशीन 27 डिग्री सेल्सियस पर १४० rpm मिलाते के साथ एक कक्षीय शेखर पर, तो 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए २,७४० x जी में केंद्रापसारक द्वारा इकट्ठा ।
  4. 10 मिलीलीटर lysis बफर में supernatant और लाइसे सेल छर्रों निकालें (20 मिमी HEPES पीएच ७.९, ०.५ मीटर NaCl, 1% डिटर्जेंट ए ( सामग्री की तालिकादेखें), 2% ग्लिसरॉल, चिढ़ाना अवरोधक कॉकटेल) और 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक निलंबन मिक्सर का उपयोग कर ५० rpm पर घुमाएं ।
  5. 15 मिनट के लिए supernatant इकट्ठा करने के लिए १५,००० x g पर सेल lysate केंद्रापसारक ।
  6. टैग शुद्ध करने के लिए-K-bZIP, एंटीबॉडी के ५० µ एल के साथ सेल lysates (10 मिलीलीटर)-14 मिलीलीटर में चुंबकीय मोती टैग, और 3 ज के लिए ५० rpm पर घुमाएं 4 डिग्री सेल्सियस एक निलंबन मिक्सर का उपयोग । प्रोटीन पर कब्जा करने के बाद, 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस के लिए ८०० x g केंद्रापसारक पर मोती गोली । supernatant के अधिकांश निकालें, फिर से के बारे में 1 मिलीलीटर की अवशिष्ट मात्रा में मोतियों को निलंबित, और धोने के लिए एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब को हस्तांतरण ।
  7. एक चुंबकीय स्टैंड पर मोतियों से युक्त ट्यूब रखकर छीना हुआ प्रोटीन धोएं, और एक बार चुंबकीय मोतियों को पूरी तरह से ट्यूब की तरफ से पालने वाले supernatant को हटा दें ।
  8. lysis बफर के साथ चार बार मोतियों को धो लें ।
    1. १.५ मिलीलीटर ट्यूबों में 1 मिलीलीटर lysis बफर जोड़ें, और ट्यूब पलटना 10 बार । एक चुंबकीय स्टैंड पर १.५ एमएल ट्यूब प्लेस और २.७ में वर्णित के रूप में supernatant निकालें ।
    2. पिछले चरण को एक और 3 बार दोहराएं ।
  9. एक बार फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) के साथ मोतियों को धो लें ।
    1. 1 मिलीलीटर पंजाबियों (१३७ मिमी NaCl, २.७ मिमी KCl, 8 मिमी Na2HPO4, १.५ मिमी KH2PO4) में १.५ मिलीलीटर ट्यूब, और पलटन ट्यूबों 10 बार जोड़ें ।
    2. एक चुंबकीय स्टैंड पर १.५ मिलीलीटर ट्यूब रखो और फिर supernatant निकालें ।
  10. Elute टैग-K-bZIP प्रोटीन से एंटीबॉडी-टैग की गईं चुंबकीय मोतियों को जोड़कर १०० µ एल के १५० µ g/एमएल octapeptide में पंजाब में पतला एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब । कमरे के तापमान पर निलंबन मिक्सर द्वारा ५० rpm पर 10 मिनट के लिए ट्यूब घुमाएँ । फिर, ट्यूब वापस चुंबकीय स्टैंड पर जगह और K-bZIP-युक्त supernatant एक साफ १.५ मिलीलीटर ट्यूब में इकट्ठा ।
  11. विश्लेषण 1-5 µ l शुद्ध टैग-K-bZIP प्रोटीन द्वारा एसडीएस-पृष्ठ के बाद Coomassie नीला दाग26. लोड 2 µ जी, 1 µ जी, और ०.५ एक ही जेल पर गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) के µ जी के नमूने और ठहराव की तरह एक छवि प्रसंस्करण कार्यक्रम के साथ ImageJ के लिए इसका इस्तेमाल करते हैं । BSA मानकों की तुलना करके K-bZIP एकाग्रता का अनुमान लगाएं ।
  12. शुद्ध कश्मीर bZIP अब प्रत्येक SUMOylation परख में इस्तेमाल किया जा करने के लिए तैयार है । -८० डिग्री सेल्सियस पर छोटे aliquots में १०० एनजी/µ एल और स्टोर के एक अंतिम एकाग्रता के लिए पंजाब में कश्मीर bZIP पतला ।

3. SUMOylation परख

  1. शुद्ध टैग के १०० एनजी/µ एल के 3 µ एल जोड़ें-K-bZIP प्रत्येक इन विट्रो SUMOylation प्रतिक्रिया के मास्टर मिश्रण में । मास्टर मिक्स में अवयव 1 µ एल प्रोटीन बफर, 1x SUMOylation बफर होते हैं, ०.५ µ एल p53 प्रोटीन (०.५ मिलीग्राम/एमएल), E1 के 25 एनएम एंजाइम को सक्रिय करने (स्टॉक: 1 µ m), ५० एनएम के E2 conjugating एंजाइम (स्टॉक: 10 µ m), और २५० एनएम प्रत्येक सूमो पेप्टाइड्स (सुमो-1 , सुमो-2, या सूमो-3; स्टॉक: 5 µ एम) के एक अंतिम खंड के लिए 17 µ l
  2. सामग्री धीरे मिश्रण और 3 एच के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया मशीन । 2x एसडीएस के 20 µ एल जोड़कर प्रतिक्रिया रोकें-पृष्ठ लोड हो रहा बफर (१०० mm Tris-HCL pH ६.८, 4% सोडियम dodecyl सल्फेट, ०.२% (डब्ल्यू/वी) bromophenol नीला, 20% (v/v) ग्लिसरॉल, और २०० mm β-mercaptoethanol) और 5 मिनट के लिए ९५ डिग्री सेल्सियस पर नमूने स्वभाव ।
  3. एसडीएस पर अलग नमूने-पृष्ठ, एक अर्द्ध शुष्क electrophoretic स्थानांतरण तंत्र का उपयोग करके PVDF झिल्ली पर अलग प्रोटीन हस्तांतरण, और विरोधी p53 एंटीबॉडी का उपयोग पश्चिमी दाग से विश्लेषण ।
    1. जेल उपकरण के रूप में चरण २.११ में सेट करें, और जेल कुओं में नमूना के 20 µ एल लोड ।
    2. चलाने के बारे में १२० मिनट के लिए ८० V पर एक निरंतर वर्तमान में 10% जेल (जब तक डाई बैंड जेल के नीचे पहुंचता है) । ट्रो के पूरा होने के बाद बिजली सप्लाई बंद कर दें ।
    3. जेल तंत्र और जेल कैसेट्स को बाहर निकालने के लिए जेल, और 5 मिनट के लिए अर्ध-शुष्क स्थानांतरण बफर (४८ mm Tris-HCl, ३९ mm glycine, 20% मेथनॉल) में जेल फ्लोट ।
    4. एक और कंटेनर ले लो और 1 मिनट के लिए मेथनॉल में PVDF झिल्ली सोख । फिर, मेथनॉल से बाहर PVDF ले और अर्द्ध शुष्क हस्तांतरण बफर में डाल दिया । धीरे 5 मिनट के लिए झिल्ली आंदोलन ।
    5. अर्द्ध शुष्क electrophoretic तंत्र के सुरक्षा आवरण को हटा दें ।
    6. पूर्व गीला फिल्टर कागज, और नीचे प्लेटिनम anode पर एक जेल सैंडविच इस प्रकार के रूप में तैयार: फिल्टर कागज, PVDF झिल्ली, जेल, और फिल्टर कागज ।
    7. सुरक्षित कैथोड प्लेट और सुरक्षा कवर, तो 15 वी निरंतर वर्तमान में ९० मिनट के लिए दाग चलाते हैं । बिजली की आपूर्ति बंद, अर्द्ध शुष्क तंत्र काटना, और PVDF झिल्ली बाहर ले ।
    8. अवरुद्ध बफर के साथ PVDF झिल्ली ब्लॉक (5% TBST बफर में गैर वसा दूध (१३७ mM NaCl2, 20 मिमी Tris-एचसीएल, ०.१% डिटर्जेंट बी (देखें सामग्री की तालिका), पीएच ७.६)) 1 एच के लिए कमरे के तापमान पर 30 के साथ कक्षीय शेखर से मिलाते हुए rpm ।
    9. संकरण विरोधी के साथ PVDF झिल्ली p53 एंटीबॉडी पतला (1:1000) 12-16 के लिए बफर अवरुद्ध में 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 एक निलंबन मिक्सर का उपयोग कर मिलाते हुए rpm के साथ ।
    10. बाहर एक कंटेनर में PVDF झिल्ली ले लो और TBST में डाल दिया । TBST के साथ PVDF झिल्ली कुल्ला दो बार अधिक ।
    11. ४५ के साथ 30 मिनट के लिए TBST में PVDF झिल्ली भिगोना कक्षीय शेखर द्वारा मिलाते rpm ।
    12. संकरण विरोधी के साथ PVDF झिल्ली खरगोश एंटीबॉडी संयुग्मित के साथ सहिजन peroxidase (एचआरपी) पतला (1:4000) के लिए बफर अवरुद्ध में 1 एच के साथ कमरे के तापमान पर 30 rpm एक निलंबन मिक्सर का उपयोग मिलाते हुए ।
    13. चरण 3.4.10 में बताए गए अनुसार PVDF झिल्ली को TBST के साथ 3 बार धोएं ।
    14. ४५ एक निलंबन मिक्सर का उपयोग कर मिलाते हुए rpm के साथ 30 मिनट के लिए TBST में PVDF झिल्ली सोख । TBST निकालें और 12 ज तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर PVDF झिल्ली को संरक्षित करने के लिए पंजाबियों जोड़ें ।
    15. मिश्रण बढ़ाया chemiluminescent सब्सट्रेट (ECL सब्सट्रेट) एजेंट 1 और 2 (1:1) ( सामग्री की तालिकादेखें). पंजाबियों से PVDF झिल्ली निकालो, दाग एक कागज तौलिया या प्रकाश शुल्क वाइपर के साथ संक्षेप में अतिरिक्त नमी को अवशोषित करने के लिए, और तुरंत 3-5 मिनट के लिए प्रत्येक झिल्ली की सतह के लिए ECL रिएजेंट के ४०० µ एल जोड़ें । संक्षिप्त सोख्ता द्वारा अतिरिक्त ECL रिएजेंट निकालें, लेकिन m की अनुमति न दें embrane को पूरी तरह सुखा लें ।
    16. एक luminescence इमेजिंग प्रणाली या autoradiography फिल्म27का उपयोग दाग बेनकाब ।

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Representative Results

निर्माता द्वारा उपलब्ध कराई गई जानकारी के अनुसार, SUMOylation परख में E1 और E2 एंजाइम की मानक मात्रा क्रमशः ५० एनएम और ५०० एनएम है । E2 conjugating एंजाइम Ubc9 है कि SUMOylate p53 करने में सक्षम है की ंयूनतम राशि पहले एक इन विट्रो SUMOylation परख द्वारा निर्धारित किया गया था । के रूप में कम के रूप में एक Ubc9 की राशि के पांचवें इन विट्रो SUMOylation परख प्रोटोकॉल में मानक में इस्तेमाल किया कुशलता से SUMOylate p53 (चित्रा 1ए) में सक्षम था । इसलिए, मानक प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया Ubc9 की राशि के एक दसवें के साथ संयोजन में E1 एंजाइम की राशि का आधा एक दूसरे के लिए इस्तेमाल किया गया था इन विट्रो SUMOylation परख । SUMOylation दक्षता की एक महत्वपूर्ण कमी मानक प्रोटोकॉल (चित्रा 1बी) के साथ तुलना के रूप में मनाया गया ।

इस प्रकार, सूमो E3 ligase K-bZIP की क्षमता p53 SUMOylation को बढ़ाने के लिए इन विट्रो SUMOylation स्थितियों में इन संशोधित का उपयोग निर्धारित किया गया था । टैग की गईं K-bZIP Sf9 कोशिकाओं से शुद्ध (चित्रा 2ए) E1 और E2 Ubc9 एंजाइमों की कम मात्रा वाले एक SUMOylation प्रतिक्रिया में कार्यरत था. इन संशोधित शर्तों के तहत, K-bZIP p53 (चित्रा 2बी) के SUMOylation को कुशलतापूर्वक उत्प्रेरित सकता है । विरोधी के साथ Immunoblotting-p53 एंटीबॉडी प्रत्येक प्रतिक्रिया में p53 की इसी तरह की कुल मात्रा की पुष्टि की है, और भी सुमो संशोधित p53 का पता लगाया ।

Figure 1
चित्र 1 : सूमो एंजाइमों में इस्तेमाल की ंयूनतम राशि का निर्धारण इन विट्रो SUMOylation परख में । (क) p53 SUMOylation एक इन विट्रो SUMOylation परख है कि एक आधा और एक पांचवें Ubc9 मानक प्रोटोकॉल में प्रयुक्त एंजाइम की मात्रा शामिल में मूल्यांकन किया गया था । इन विट्रो SUMOylation प्रतिक्रिया के 3 घंटे के बाद, SUMOylated p53 एंजाइमों विरोधी p53 एंटीबॉडी के साथ पश्चिमी दाग द्वारा जांच की गई । (ख) इन विट्रो SUMOylation of p53 और मानक प्रोटोकॉल में प्रयुक्त Ubc9 की मात्रा एक दसवें के साथ संयोजन में E1 एंजाइम की आधी राशि का उपयोग करके विश्लेषण किया गया था । (a) के रूप में वर्णित एक पश्चिमी दाग प्रदर्शन किया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : सूमो E3 ligase K-bZIP द्वारा p53 SUMOylation की बढोतरी । (क) शुद्ध baculovirus-व्यक्त कश्मीर bZIP प्रोटीन, एसडीएस द्वारा विश्लेषण-Coomassie नीले दाग के साथ पीछा पृष्ठ । 1 µ g BSA और 10 µ l शुद्ध K-bZIP तुलनात्मक प्रोटीन मात्रा के लिए लोड कर रहे थे । (ख) K-bZIP एन्हांस्ड p53 SUMOylation एक इन विट्रो SUMOylation प्रतिक्रिया का उपयोग करके मूल्यांकित किया गया था E1 एंजाइम की आधी राशि और एक दसवें Ubc9 की राशि के साथ मानक प्रोटोकॉल में अनुशंसा करते हैं. SUMOylated p53 पश्चिमी दाग के रूप में चित्रा 1एमें वर्णित द्वारा जांच की गई । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

इन विट्रो SUMOylation प्रोटोकॉल यहां वर्णित नियमित रूप से पहचान Ubc9 सब्सट्रेट की SUMOylation स्थिति स्थापित करने के लिए प्रयोग किया जाता है । प्रमुख मानक प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए सूमो E3 ligase के SUMOylation समारोह का अध्ययन सीमा सूमो E1 सक्रिय करने और E2 conjugating एंजाइमों Ubc9 कि में सूमो विकार को अधिकतम की बहुतायत है इन विट्रो सिस्टम । इस चुनौती को ध्यान में रखते हुए, हमें विश्वास है कि अनुमापन के स्तर के लिए सूमो E1 और E2 एंजाइमों की राशि का है कि एक मुश्किल से SUMOylation में अपनी गतिविधि का पता लगा सकते है एकमात्र तरीका सूमो E3 ligase उत्प्रेरक गतिविधियों का निर्धारण करने के लिए उपलब्ध है इस में इन विट्रो SUMOylation व्यवस्था. इस परिकल्पना के बाद, हम सफलतापूर्वक K-bZIP के E3 ligase गतिविधि का आविर्भाव और एक उपंयास सूमो E3 ligase के प्रति विशिष्टता के साथ एक के रूप में पहचान की सूमो-2/

प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम E1 और E2 की कम मात्रा का शामिल है । इन कम मात्रा का उपयोग करना, जैसा कि चित्र 2में दिखाया गया है, कम ligase गतिविधि के साथ उपंयास सूमो E3 ligases सब्सट्रेट और सूमो paralogues के प्रति उनकी विशिष्टता के संरक्षण के साथ पहचान करने में सक्षम हो सकता है । तकनीक की एक प्रमुख सीमा एक उच्च गुणवत्ता सूमो सब्सट्रेट पहचानने एंटीबॉडी के लिए आवश्यकता है, के बाद से ही सब्सट्रेट के एक बहुत छोटे अनुपात सूमो संशोधित किया जा सकता है ।

हालांकि कई प्रोटीन की क्षमता vivo मेंव्यक्त करने के बाद SUMOylation बढ़ाने के लिए दिखाने के लिए, एक सूमो E3 ligase परिभाषित एक इन विट्रो SUMOylation प्रणाली शुद्ध E1, E2, और e3 एंजाइमों का उपयोग करके का प्रदर्शन किया जाना चाहिए । के रूप में सैकड़ों और शायद ubiquitin E3 ligases की पहचान की हजारों का विरोध किया, अब तक केवल कुछ सूमो E3 ligases पाया गया है । इस भाग में इन विट्रो SUMOylation परख जो सूमो विकार दक्षता अधिकतम और फलस्वरूप संभावित सूमो E3 ligases के SUMOylation समारोह में बाधाएं में पारंपरिक मानक का उपयोग करने के लिए कारण हो सकता है । वर्तमान प्रोटोकॉल एक सरल और सुसंगत परख का वर्णन करने के लिए जांच SUMOylation एक सूमो E3 ligase द्वारा बढ़ाया । वर्णित विधि की पहचान और उपंयास सूमो E3 ligases के लक्षण वर्णन के लिए आवश्यक है ।

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Disclosures

लेखकों के हित के कोई संभावित संघर्ष का खुलासा ।

Acknowledgments

इस कार्य को विज्ञान एवं प्रौद्योगिकी मंत्रालय (सर्वाधिक, 105-2320-बी-010-007-MY3 को पीसीसी) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया, राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान (NHRI-EX105-10215BC से पीसीसी), विज्ञान एवं प्रौद्योगिकी मंत्रालय से (सर्वाधिक 105-2314-बी-400-019 HJK करने के लिए) और राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान (NHRI मिलीग्राम-१०५-एसपी-10, NHRI मिलीग्राम-१०६-sp-10 से HJK) । यह काम भी राष्ट्रीय यांग-मिंग विश्वविद्यालय के साथ पांडुलिपि प्रकाशन पर पीसीसी के लिए आंशिक रूप से समर्थन किया गया था । funders अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने का निर्णय, या पांडुलिपि के मरंमत में कोई भूमिका नहीं थी ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pFastBac Invitrogen 10359-016 dual expression baculovirus vector
pCR2.1-TOPO vector Invitrogen PCR product vector
competent cell  E. coli DH5α Yeastern Biotech FYE678-80VL competent E. coli cells A
E. coli DH10Bac Invitrogen 10359-016 competent E. coli cells B
FugeneHD Roche 04709705001 transfection reagent
Opti-MEM Gibco 31985062 reduced serum media
T4 Ligase NEW England BioLabs M0202S
CpoI (RsrII) Thermo Scientific ER0741
Bluo-gal Thermo Scientific B1690 galactosidase substrate
IPTG Sigma-Aldrich I6758-1G
Grace’s Insect Medium Gibco 11605094
Fetal Bovine Serum Gibco 10082147
Gentamicin Thermo Fisher 15750060
Ampicillin Sigma-Aldrich A9393-25G
Kanamycin Sigma-Aldrich K0254-20ML
gentamicin Gibco 15710-064
tetracyclin Sigma-Aldrich 87128-25G
LB Broth Merk 1.10285.0500
HEPES Sigma-Aldrich H4034-100G
NaCl Sigma-Aldrich S9888-5KG
KCl Merk 1.04936.1000
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S5136-500G
KH2PO4 J.T.Baker 3246-01
sodium dodecyl sulfate Merk 1.13760.1000
β-mercaptoethanol Bio-Rad 161-0710
TRIS (Base) J.T.Baker 4109-06
Non-fat milk Fonterra
glycerol J.T.Baker 2136-01
Triton X-100 Amresco 0694-1L detergent A
Tween 20 Amresco 0777-500ML detergent B
Poloxamer 188 solution Sigma-Aldrich P5556-100ML detergent C
Protease Inhibitor Cocktail Tablet Roche 04 693 132 001
3x Flag peptide Sigma F4799
anti-FLAG m2 Magnetic beads Sigma-Aldrich M8823 antibody-tagged magnetic beads
SUMOlink SUMO-1 Kit Active Motif 40120 standard SUMOylation protocol 
SUMOlink SUMO-2/3 Kit Active Motif 40220 standard SUMOylation protocol 
QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN 28704
QIAGEN Plasmid Mini Kit QIAGEN 12123 plasmid extraction kit
Polypropylene tubes Falcon 352059
Petri Dish Falcon 351029
Cell lifter Corning CNG3008
Loading tip Sorenson BioScience 28480
PVDF PerkinElmer NEF1002
Blotting filter paper Bio-Rad 1703932
Mini slab gel apparatus (Bio-Rad Mini Protean II Cell) Bio-Rad 1658001 EDU
Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell Bio-Rad 1703940
Pierce ECL Western Blotting Thermo 32106 ECL reagent
suspension mixer Digisystem laboratory instruments  Inc. SM-3000
orbital shaker Kansin instruments Co. OS701
ImageQuant LAS 4000
biomolecular imager		 GE Healthcare 28955810
Sf9 Thermo Scientific B82501
anti-p53 antibody Cell Signaling #9282
anti-rabbit antibody GE Healthcare NA934-1ML

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References

  1. Bies, J., Markus, J., Wolff, L. Covalent attachment of the SUMO-1 protein to the negative regulatory domain of the c-Myb transcription factor modifies its stability and transactivation capacity. J Biol Chem. 277 (11), 8999-9009 (2002).
  2. Lin, D. Y., et al. Role of SUMO-interacting motif in Daxx SUMO modification, subnuclear localization, and repression of sumoylated transcription factors. Mol Cell. 24 (3), 341-354 (2006).
  3. Welsh, M., Jamalpour, M., Zang, G., Akerblom, B. The role of the Src Homology-2 domain containing protein B (SHB) in beta cells. J Mol Endocrinol. 56 (1), 21-31 (2016).
  4. Huang, W. Q., et al. Structure, function, and pathogenesis of SHP2 in developmental disorders and tumorigenesis. Curr Cancer Drug Targets. 14 (6), 567-588 (2014).
  5. Perry, J. J., Tainer, J. A., Boddy, M. N. A SIM-ultaneous role for SUMO and ubiquitin. Trends Biochem Sci. 33 (5), 201-208 (2008).
  6. Sun, H., Leverson, J. D., Hunter, T. Conserved function of RNF4 family proteins in eukaryotes: targeting a ubiquitin ligase to SUMOylated proteins. EMBO J. 26 (18), 4102-4112 (2007).
  7. Ouyang, J., Shi, Y., Valin, A., Xuan, Y., Gill, G. Direct binding of CoREST1 to SUMO-2/3 contributes to gene-specific repression by the LSD1/CoREST1/HDAC complex. Mol Cell. 34 (2), 145-154 (2009).
  8. Lyst, M. J., Stancheva, I. A role for SUMO modification in transcriptional repression and activation. Biochem Soc Trans. 35, Pt 6 1389-1392 (2007).
  9. Liu, H. W., et al. Chromatin modification by SUMO-1 stimulates the promoters of translation machinery genes. Nucleic Acids Res. 40 (20), 10172-10186 (2012).
  10. Rosonina, E., Duncan, S. M., Manley, J. L. SUMO functions in constitutive transcription and during activation of inducible genes in yeast. Genes Dev. 24 (12), 1242-1252 (2010).
  11. Chang, P. C., et al. The chromatin modification by SUMO-2/3 but not SUMO-1 prevents the epigenetic activation of key immune-related genes during Kaposi's sarcoma associated herpesvirus reactivation. BMC Genomics. 14, 824 (2013).
  12. Neyret-Kahn, H., et al. Sumoylation at chromatin governs coordinated repression of a transcriptional program essential for cell growth and proliferation. Genome Res. 23 (10), 1563-1579 (2013).
  13. Tatham, M. H., et al. Polymeric chains of SUMO-2 and SUMO-3 are conjugated to protein substrates by SAE1/SAE2 and Ubc9. J Biol Chem. 276 (38), 35368-35374 (2001).
  14. Mattoscio, D., Segre, C. V., Chiocca, S. Viral manipulation of cellular protein conjugation pathways: The SUMO lesson. World J Virol. 2 (2), 79-90 (2013).
  15. Gareau, J. R., Lima, C. D. The SUMO pathway: emerging mechanisms that shape specificity, conjugation and recognition. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (12), 861-871 (2010).
  16. Bernier-Villamor, V., Sampson, D. A., Matunis, M. J., Lima, C. D. Structural basis for E2-mediated SUMO conjugation revealed by a complex between ubiquitin-conjugating enzyme Ubc9 and RanGAP1. Cell. 108 (3), 345-356 (2002).
  17. Knipscheer, P., et al. Ubc9 sumoylation regulates SUMO target discrimination. Mol Cell. 31 (3), 371-382 (2008).
  18. Vethantham, V., Manley, J. L. In vitro sumoylation of recombinant proteins and subsequent purification for use in enzymatic assays. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (1), 5121 (2009).
  19. Lin, S. F., Robinson, D. R., Miller, G., Kung, H. J. Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus encodes a bZIP protein with homology to BZLF1 of Epstein-Barr virus. J Virol. 73 (3), 1909-1917 (1999).
  20. Yang, W. S., Hsu, H. W., Campbell, M., Cheng, C. Y., Chang, P. C. K-bZIP Mediated SUMO-2/3 Specific Modification on the KSHV Genome Negatively Regulates Lytic Gene Expression and Viral Reactivation. PLoS Pathog. 11 (7), 1005051 (2015).
  21. Connor, C. D., Metcalf, E., Wrighton, C. J., Harris, T. J., Saunders, J. R. RsrII--a novel restriction endonuclease with a heptanucleotide recognition site. Nucleic Acids Res. 12 (17), 6701-6708 (1984).
  22. Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. Analysis of endonuclease R-EcoRI fragments of DNA from lambdoid bacteriophages and other viruses by agarose-gel electrophoresis. J Virol. 14 (5), 1235-1244 (1974).
  23. Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D'Ari, R. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth. J Bacteriol. 189 (23), 8746-8749 (2007).
  24. Gingold, E. B. Bacterial transformation. Methods Mol Biol. 2, 237-240 (1985).
  25. Brulois, K. F., et al. Construction and manipulation of a new Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus bacterial artificial chromosome clone. J Virol. 86 (18), 9708-9720 (2012).
  26. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  27. Ahmed, S., Holt, M., Riedel, D., Jahn, R. Small-scale isolation of synaptic vesicles from mammalian brain. Nat Protoc. 8 (5), 998-1009 (2013).

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आणविक जीवविज्ञान मुद्दा १३१ इन विट्रो SUMOylation K-bZIP सुमो E3 ligase p53 पद-शोधों में संशोधन Ubc9
इन <em>विट्रो</em> SUMOylation परख सूमो E3 Ligase गतिविधि का अध्ययन करने के लिए
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Yang, W. S., Campbell, M., Kung, H.… More

Yang, W. S., Campbell, M., Kung, H. J., Chang, P. C. In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity. J. Vis. Exp. (131), e56629, doi:10.3791/56629 (2018).

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