Summary
A diferencia de ligasas de ubiquitina ligasas E3 SUMO algunos han sido identificados. Este modificado en vitro protocolo de sumoilación es capaz de identificar nuevos SUMO E3 ligasas por un ensayo de reconstitución en vitro .
Abstract
Modificación de pequeños ubiquitin-like modifier (SUMO) es una importante modificación poste-de translación (PTM) que media el transduction de la señal sobre todo a través de la modulación de las interacciones proteína-proteína. Similar a la modificación de la ubiquitina, la sumoilación está dirigida por una cascada secuencial de enzimas como enzima activadora de E1 (SAE1/SAE2), enzima E2-Conjugación (Ubc9) y E3 ligasa (es decir, Pia familia, RanBP2 y Pc2). Sin embargo, a diferencia de la ubiquitinación, una ligasa E3 es no esencial para la reacción pero no proporcionan precisión y eficacia para verbal de SUMO. Las proteínas modificadas por sumoilación pueden identificarse por ensayo en vivo mediante inmunoprecipitación con anticuerpos específicos de sustrato y el immunoblotting con anticuerpos específicos para SUMO. Sin embargo, la demostración de la actividad de la proteína SUMO E3 ligasa requiere reconstitución en vitro de sumoilación ensayos con enzimas purificadas, sustrato y proteínas SUMO. Ya que en las reacciones en vitro , generalmente SAE1/SAE2 y Ubc9, solo son suficientes para Conjugación de SUMO, realce de la sumoilación por una supuesta ligasa E3 no siempre es fácil de detectar. Aquí, describimos una modificada en vitro la sumoilación protocolo que identifica sistemáticamente modificación SUMO usando un sistema en vitro reconstituido. También se presenta un protocolo paso a paso para purificar catalítico activo K-bZIP, una ligasa E3 de SUMO-2/3 viral. Las actividades de la sumoilación de la purificada bZIP de K aparecen en p53, un conocido destino de SUMO. Este protocolo puede no sólo utilizarse para dilucidar las ligasas SUMO E3 novela, sino también para revelar su especificidad paralog SUMO.
Introduction
Modificación de SUMO fue identificado inicialmente como una modificación poste-de translación reversible (PTM) que regula la estabilidad de la proteína1. Además de conjugación directa, SUMO puede también acoplarse a una proteína a través de la interacción no covalente por SUMO interacción motivos (SIMs)2. Similar a la Unión de Tirosil-fosforilación de moléculas que de homología Src 2 (SH2) o phosphotyrosine atar (PTB) dominios3,4, modificación SUMO proporciona una plataforma de interacción adicional para selectivo contratación de SIM que contiene proteínas de efector5,6. Además de regulación de la transducción de la señal, la sumoilación de factores transcripcionales y cromatina remodelación moléculas sirven para modular la gene expresión7,8. Estudios de patrones de sumoilación de genoma han revelado que la modificación SUMO es asociada a positivo9,10 o negativo10,11,12 transcripción Reglamento, en parte debido a la especificidad del paralogue de sumoilación.
Hay tres isoformas principales de SUMO para la proteína conjugando presente en células de mamíferos; Estos incluyen SUMO-1 y la altamente homólogo SUMO-2 y SUMO-3 (denominado SUMO-2/3)13. SUMO se conjuga generalmente a los residuos de lisina (K) en el motivo de consenso ψKxD/E en la proteína diana. La SIM en SUMO E3 ligasas es responsable de la especificidad de paralogue14. En contraste con vías de ubiquitinación que contiene cientos de ligasas E3, sólo ha habido unos SUMO E3 ligasas identificados15. Ligasas de SUMO E3 se definen por propiedades, incluyendo su capacidad para (i) atar Ubc9, (ii) parte de SUMO se unen a través de un dominio SIM y (iii) mejorar la transferencia SUMO de Ubc9 sobre substrato. Ligasa E3 no es absolutamente necesario para SUMO verbal16, pero proporciona sustrato y SUMO paralogue especificidad. Puesto que generalmente sólo una pequeña fracción de la proteína total del sustrato es modificado de SUMO, detección de proteínas sumoiladas en vivo es siempre un reto. Por lo tanto, se necesitan análisis precisos y reproducibles para aclarar la función precisa de modificación de SUMO.
El en vitro la sumoilación ensayo, que evalúa la capacidad de Ubc9 purificada para catalizar la sumoilación de proteínas sustrato, es un ensayo bien-aceptado para el estudio de modificación SUMO17. Sin embargo, SUMO E3 ligasa actividad en la mayoría de los casos no puede ser detectada o solamente se pueden detectar con ligasa SUMO transformada con alta SUMO E3 ligasa actividad y especificidad de sustrato bajo el protocolo estándar debido a la presencia de una abundante cantidad de Ubc918 . El éxito de este ensayo depende en gran medida la valoración cuidadosa de Ubc9 purificada. El ensayo de la sumoilación en vitro descrito aquí se modifica una sumoilación estándar protocolo (véase Tabla de materiales). La observación de mayor modificación SUMO global durante la reactivación del herpesvirus asociado a sarcoma de Kaposi (KSHV) nos llevó a identificar la ligasa E3 SUMO viral que puede ser responsable de la para arriba-regulación de la sumoilación. Tras una proyección en pequeña escala de las proteínas obran recíprocamente de viral SUMO E3 ligasa K bZIP, p53 fue identificado como un sustrato nuevo. En este protocolo, se muestra detalladamente en células de los insectos los pasos involucrados en la expresión y purificación de tipo K-bZIP, una ligasa E3 SUMO viral con especificidad de SUMO-2/3. Se evalúa la capacidad de la K-bZIP purificado para mejorar la sumoilación de p53, un conocido sustrato SUMO, en presencia de cantidades reducidas de enzimas E1 y E2. Usando este análisis modificado de sumoilación, los investigadores pueden confiablemente definir las capacidades del SUMO E3 ligasa SUMOylate novela o sustratos conocidos, que es un paso primordial en el estudio de la sumoilación de la proteína. Además, este método ayuda a identificar nuevos ligasas SUMO E3 con actividad ligasa baja pero la especificidad de sustrato alta.
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Protocol
1. preparación de expresión de Baculovirus construye
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Purificar el SUMO E3 ligasa bZIP K mediante la clonación de cDNA de bZIP K19 en un vector del baculovirus de expresión dual (véase tabla de materiales) con un N-terminal del epítopo-tag. Hemos tenido éxito utilizando una etiqueta octapéptido (indicado en el protocolo como vector-etiqueta-K-bZIP).
Nota: La plantilla de ADN para la clonación de la reacción en cadena (PCR) K-bZIP polimerasa es inversa del cDNA transcrito de RNA aislado de células de TREx F3H3-K-Rta BCBL-1 después de la doxiciclina tratamiento20.- Transferir el cuerpo entero K bZIP cDNA19 en el vector de expresión dual con Cpoque sitios de clonación. CPO Digiero el producto PCR y 1 μg del vector de expresión dual a 37 ° C para 3 h21.
- Separar y extraer el ADN digerido después de electroforesis en una de gel de agarosa 0,8%22. Ligar el inserto (K-bZIP) y vector de T4 ADN ligasa a 16 ° C durante 30 minutos según las instrucciones del fabricante (véase Tabla de materiales).
- Añadir 5 μl de ligadura de ADN a 50 μl competentes de e. coli las células "A" (véase Tabla de materiales) en un tubo de 1,5 mL. Poner en hielo durante 30 minutos. Luego, incubar el tubo de 1,5 mL en un baño de agua de 42 ° C por 45 s y poner inmediatamente el tubo en hielo por 3 minutos.
- Añadir 600 μl de medio de novedosa (Extracto de levadura 0.5% (p/v), 2% (w/v) triptona, NaCl 10 mM, 2,5 mM KCl, 20 mM MgSO4y glucosa 4% (p/v)) en el tubo e incubar a 37 ° C durante 1 h. Luego, centrifugar el tubo a temperatura ambiente durante 3 minutos a 600 x g.
- Quite el sobrenadante, Resuspender el precipitado con 60 μL de medio Luria-Bertani (LB; 1% (p/v) triptona, 0.5% (p/v) de levadura extracto y el 85 mM NaCl) y en placas de agar LB con ampicilina 100 de μg/mL. Incubar la placa de agar a 37 ° C por 16 h23,24.
- Seleccione 1 Colonia para inocular en medio LB de 5 mL conteniendo 100 μg/mL ampicilina y cultivo a 37 ° C por 16 h con agitación de 250 rpm. Luego, extrae el plásmido, vector-etiqueta-K-bZIP, por un kit de extracción de plásmidos según las instrucciones del fabricante (véase Tabla de materiales).
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Generar la bacmid recombinante albergando la etiqueta-K-bZIP por transformación del vector-etiqueta-K-bZIP en competentes de e. coli las células "B" (véase tabla de materiales).
- 0,2 μg plásmido de vector-etiqueta-K-bZIP y 100 μl de la mezcla competente E. las células "B" de coli en un tubo de 1,5 mL y puesto en hielo durante 30 minutos incuban el tubo en baño de agua de 42 ° C por 45 s y poner inmediatamente el tubo en hielo por 3 minutos.
- Agregar 900 μl de medio de la novedosa en el tubo e incubar a 37 ° C durante 4 h con rotación a 50 rpm. A continuación, tomar 10 μl del medio, agregar un adicional 50 μl de medio S.O.C difusión en placas de agar LB con kanamicina 50 de μg/mL, 7 gentamicina μg/mL, 10 tetraciclina μg/mL, sustrato de galactosidasa de 100 μg/mL y 40 μg/mL isopropílico β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG ) e incubar las placas durante 48 h a 37 ° C.
- Inocular una colonia blanca en medio LB de 5 mL que contienen 50 kanamicina μg/mL, 7 gentamicina μg/mL y 10 μg/mL tetraciclina. Incubar a 37 ° C con agitación por 16 h de 250 rpm.
- Aislar la bacmid recombinante ADN que la etiqueta-K-bZIP, cuantificar y vuelva a suspender en una concentración de 1 μg/μl25.
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Generar el baculovirus recombinante expresando etiqueta-K-bZIP por transferencia 1 μg de bacmid recombinante ADN que contiene la etiqueta-K-bZIP en células Sf9 en un pozo de una placa de 6 pozos.
- Semilla 2 x 106 Sf9 células (véase Tabla de materiales) en insecto medio 2 mL Grace suministrado con 10% suero bovino fetal (FBS) y gentamicina 1% en cada pozo de una placa bien 6, luego incuban a 27 ° C durante 1 hora.
- Mantener una cultura de la fase de registro de células Sf9 en medio de insecto de gracia suministrado con 10% FBS, gentamicina 1% y detergente al 1% C (véase Tabla de materiales) a 27 ° C en suspensión orbital a 140 rpm. Contar las células usando un hemocitómetro y tinción trypan blue. viabilidad celular debe superar 95%. Mantener las células mediante una relación de subcultivation de 1:3 cada 2-3 días (mínima densidad ~0.5 x 106 células/mL).
- Añadir 2 μl bacmid ADN (1 μg/μl) y 98 μl reduce medios suero (véase Tabla de materiales) en un tubo de 2 mL. A continuación, añadir 4 μL de reactivo de transfección (véase Tabla de materiales) para el tubo y mezcla bien. Incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos.
- Agregar esta mezcla de transfección (104 μL) en cada pocillo e incubar a 27 ° C durante 12-16 h.
- Agotado los medios de comunicación con la aspiración suave de quitar y reemplazar con 2 mL de medio de insecto de gracia fresca suministrada con FBS y 1% gentamicina al 10%. Las células Sf9 adhieran libremente a la superficie de la placa y no será perturbadas con aspiración suave.
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Recoger el baculovirus recombinante después de transfección y amplificación de baculovirus para obtener las existencias del alto-título (P1) para experimentos adicionales.
- 72 h después de cambiar de medio, raspe el Sf9 células usando un levantador de células estériles, recoger el sobrenadante de cada pozo individual en un tubo de 1,5 mL y agitar por 10 s.
- Centrifugar a 4 ° C por 3 min a 150 x g. recoger sobrenadante como P0 baculovirus y Alicuotar en tubos de 1,5 mL (baculovirus de 1 mL en cada tubo). Tienda a-80 ° C.
- Semilla 1 x 107 Sf9 células en insecto medio 10 mL Grace suministran con FBS y 1% gentamicina al 10% en una placa de Petri de 10 cm e incuban a 27 ° C durante 1 hora.
- Para la amplificación de baculovirus recombinante expresando su etiqueta-K-bZIP, añada 0,5 mL P0 baculovirus a las células Sf9 sembradas e incubar a 27 ° C durante 48 h.
- Recoger sobrenadante como baculovirus P1 en un tubo de 15 mL y conservar a 4 ° C durante 1 mes.
2. purificación de K-bZIP
- Mantener una cultura de la fase de registro de células Sf9 en medio de insecto de gracia suministrado con 10% FBS, gentamicina 1% y detergente al 1% C a 27 ° C en suspensión orbital a 140 rpm como se describe en el paso 1.3.2.
- En el día de la transducción de señales, añadir 1 mL del sobrenadante que contiene el baculovirus (P1) en 250 mL de células Sf9 con una densidad de 2 x 106 células/mL.
- Incube las células Sf9 por 72 h a 27 º C en un agitador orbital con 140 rpm de agitación, luego recoge por centrifugación a 2.740 x g durante 15 min a 4 ° C.
- Eliminar el sobrenadante y lyse Pellet celular en 10 mL de tampón de lisis (20 mM HEPES pH 7.9, 0,5 M de NaCl, 1% detergente un (véase Tabla de materiales), 2% glicerol, inhibidor de la proteasa cóctel) y gira a 50 rpm con un mezclador de suspensión a 4 ° C durante 30 minutos.
- Célula de centrífuga lisada a 15.000 x g durante 15 min a recoger el sobrenadante.
- Para purificar el tag-K-bZIP, incubar los lysates de la célula (10 mL) con 50 μl de anticuerpo etiquetado granos magnéticos en tubos de polipropileno de 14 mL y gira a 50 rpm durante 3 h a 4 ° C utilizando una mezcladora de suspensión. Tras la captura de la proteína, pellets los granos en 800 x centrifugado g 30 s a 4 ° C. Eliminar la mayor parte del sobrenadante, resuspender los granos en el volumen residual de aproximadamente 1 mL y transferir a un tubo de 1,5 mL para lavado.
- Lavar la proteína capturada colocando el tubo que contiene los granos en un soporte magnético y eliminar el sobrenadante una vez que los granos magnéticos se han adherido completamente al lado del tubo.
-
Lavar los granos con tampón de lisis cuatro veces.
- Añadir 1 mL de tampón de lisis en tubos de 1,5 mL e invertir los tubos 10 veces. Coloque el tubo de 1,5 mL en un soporte magnético y eliminar el sobrenadante como se describe en 2.7.
- Repita el paso anterior otras 3 veces.
-
Lavar los granos con tampón fosfato salino (PBS) una vez.
- Añadir 1 mL de PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1,5 mM KH2PO4) en tubos de 1,5 mL e invertir los tubos 10 veces.
- Poner el tubo de 1,5 mL en un soporte magnético y retire el sobrenadante.
- Eluir la etiqueta-K-bZIP proteína de los granos magnéticos etiquetados anticuerpo añadiendo 100 μl de 150 octapéptido μg/mL diluido en PBS en un tubo de 1,5 mL. Gire el tubo durante 10 minutos a 50 rpm mezcladora de suspensión a temperatura ambiente. A continuación, coloque el tubo en el soporte magnético y recoger el sobrenadante en un tubo limpio de 1.5 mL que contiene K-bZIP.
- Análisis de 1-5 μl purificada etiqueta-K-bZIP proteínas por SDS-PAGE seguido por el azul de Coomassie tinción26. Carga 2 μg, 1 μg, y 0,5 μg muestras de albúmina de suero bovino (BSA) en el mismo gel y usan para la cuantificación con un programa de procesamiento de imagen, como el ImageJ. Calcular la concentración de K-bZIP en comparación a los estándares de BSA.
- El K-bZIP purificada está ahora listo para ser utilizado en cada ensayo la sumoilación. Diluir el bZIP K en PBS hasta una concentración final de 100 ng/μl y tienda en pequeñas alícuotas a-80 ° C.
3. la sumoilación ensayo
- Agregar 3 μl de 100 ng/μl de etiqueta-K-bZIP purificado en la mezcla principal de cada uno en vitro la sumoilación reacción. Componentes en la mezcla principal contienen 1 μl de tampón de proteínas, 1 x de buffer de la sumoilación, proteína de p53 de 0,5 μl (0,5 mg/mL), 25 nM de E1 activar enzima (stock Conc.: 1 μm), 50 nM de E2 conjugar la enzima (Conc. stock: 10 μm) y 250 nM de los péptidos SUMO (SUMO-1 , 2 de SUMO y SUMO-3; concentrado acción: 5 μm) a un volumen final de 17 μl.
- Mezclar suavemente el contenido e incubar la reacción a 30 ° C para 3 h. detener la reacción añadiendo 20 μl de 2 x de buffer de carga SDS-PAGE (100 mM Tris-HCL de pH 6.8, dodecil sulfato de sodio de 4%, azul de bromofenol 0,2% (p/v), glicerol al 20% (v/v) y 200 mM β-mercaptoetanol) y desnaturalizar las muestras a 95 ° C durante 5 minutos.
-
Muestras separadas por SDS-PAGE, transferir las proteínas separadas en una membrana de PVDF utilizando un aparato de transferencia electroforética semiseco y análisis por Western blot utilizando anticuerpos anti-p53.
- Configurar el aparato del gel como en el paso 2.11 y cargar 20 μl de muestra en los pocillos del gel.
- Correr el gel 10% en una constante actual a 80 V durante unos 120 minutos (hasta que la banda de tinte alcanza la parte inferior del gel). Después de la terminación de la electroforesis, apague la fuente de alimentación.
- Desconecte el aparato de gel y gel de cassettes para sacar el gel y flotar el gel en tampón de transferencia semiseco (48 mM Tris-HCl, 39 mM glicina, 20% metanol) durante 5 minutos.
- Toma otro recipiente y sumérgete en la membrana PVDF en metanol durante 1 minuto. Luego, sacar PVDF de metanol y poner en tampón de transferencia semiseco. Frote suavemente la membrana por 5 min.
- Retire la cubierta de seguridad del aparato electroforética semiseco.
- Humedezca previamente el papel de filtro y preparar un sándwich de gel en el ánodo de platino de fondo como sigue: papel de filtro, membrana PVDF, gel y papel de filtro.
- Cubierta de placa y seguridad seguro cátodo, entonces escurr blot en corriente para 90 min vuelta constante de 15 V la fuente de alimentación, desconecte aparatos semisecos y sacar la membrana PVDF.
- Membrana de PVDF de bloque con solución amortiguadora de bloqueo (5% leche descremada en buffer TBST (137 mM NaCl2, 20 mM Tris-HCl, 0.1% detergente B (véase Tabla de materiales), pH 7,6)) a temperatura ambiente durante 1 h con 30 rpm agitación por Agitador orbital.
- Hibridar la membrana PVDF con anti-p53 anticuerpo diluido (1:1, 000) en solución amortiguadora de bloqueo para 12-16 h a 4 ° C con 30 rpm agitación usando una mezcladora de suspensión.
- Saque la membrana PVDF en un recipiente y poner en TBST. Enjuagar la membrana PVDF con TBST dos veces más.
- Poner en remojo la membrana PVDF en TBST durante 30 minutos con 45 rpm agitación por Agitador orbital.
- Hibridar la membrana PVDF con anticuerpo anti-conejo conjugado con peroxidasa de rábano (HRP) diluido (1:4, 000) en solución amortiguadora de bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente con 30 rpm agitación usando una mezcladora de suspensión.
- Lavar la membrana PVDF con TBST 3 veces como se describe en el paso 3.4.10.
- Poner en remojo la membrana PVDF en TBST durante 30 minutos con 45 rpm agitación usando una mezcladora de suspensión. Retirar TBST y añadir PBS para preservar la membrana PVDF a 4 ° C por hasta 12 h.
- Mezclar el reactivo Substrato quimioluminiscente mejorada (ECL éste) 1 y 2 (1:1) (véase Tabla de materiales). Quitar la membrana PVDF del PBS, blot brevemente con una toalla de papel o un limpiador ligero para absorber el exceso de humedad y añadir 400 μL de reactivo de ECL para la superficie de cada membrana para 3-5 min quitar exceso ECL reactivo frotando brevemente, pero no permita que el m superficial a completamente secos.
- Exponga la mancha blanca /negra usando un sistema de proyección de imagen de luminiscencia o autorradiografía película27.
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Representative Results
Según la información proporcionada por el fabricante, la cantidad de enzima E1 y E2 en el ensayo de sumoilación es de 50 nM y 500 nM, respectivamente. Primero se determinó la cantidad mínima de E2 conjugando enzimas Ubc9 que es capaz de SUMOylate p53 por un análisis de la sumoilación en vitro . Tan bajo como un quinto de la cantidad de Ubc9 utilizado en el estándar en vitro la sumoilación protocolo eficiente SUMOylate p53 (figura 1A). Por lo tanto, la mitad de la cantidad de enzima E1 en combinación con un décimo de la cantidad de Ubc9 utilizado en el protocolo estándar fue utilizado para otro ensayo en vitro la sumoilación. Se observó una reducción significativa de la eficiencia de la sumoilación en comparación con el protocolo estándar (figura 1B).
Así, la capacidad de SUMO E3 ligasa K bZIP para aumentar p53 que sumoilación se determinó utilizando estos modificado en vitro la sumoilación condiciones. Tagged K-bZIP purificado de células Sf9 (figura 2A) fue empleada en una reacción de la sumoilación que contienen cantidades menores de enzimas E1 y E2 Ubc9. Bajo estas condiciones modificadas, bZIP K podría catalizar eficientemente la sumoilación de la p53 (figura 2B). Immunoblotting con anticuerpo anti-p53 confirmó el total de las cantidades similar de p53 en cada reacción, y también SUMO detectado modificado p53.
Figura 1 : Determinación de la cantidad mínima de enzimas SUMO usadas en el ensayo en vitro la sumoilación. (A) p53 que sumoilación se evaluó en un ensayo en vitro la sumoilación que incluyó una mitad y un quinto la cantidad de enzimas Ubc9 utilizados en protocolo estándar. Después de 3 horas en vitro la sumoilación reacción, enzimas de sumoiladas p53 fueron examinadas por Western blot con anticuerpos anti-p53. (B) In vitro la sumoilación de p53 más se analizó utilizando la mitad de la cantidad de enzima E1 en combinación con una décima parte la cantidad de Ubc9 utilizado en el protocolo estándar. Se realizó un Western blot como se describe en (A). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Mejora de la sumoilación de p53 por SUMO E3 ligasa bZIP K. (A) purificado proteína K bZIP expresada en baculovirus, analizada por SDS-PAGE seguido con tinción azul de Coomassie. 1 μg BSA y 10 μl purificaron bZIP K se carga comparada la cantidad de proteína. (B) K-bZIP mejorado p53 que sumoilación se evaluó mediante una reacción de la sumoilación en vitro con mitad de la cantidad de enzima E1 y un décimo de la cantidad de Ubc9 recomienda en el protocolo estándar. Sumoiladas p53 fueron investigados por Western blot como se describe en la figura 1A. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El en vitro la sumoilación protocolo descrito aquí se utiliza rutinariamente para establecer la situación de la sumoilación de sustratos Ubc9 identificados. La limitación principal utilizando el protocolo estándar para el estudio de la función de SUMO E3 ligasa de sumoilación es la abundancia de activación de SUMO E1 y E2 Conjugación enzimas Ubc9 que maximicen la conjugación de SUMO en sistemas in vitro . Teniendo en cuenta este reto, creemos la titulación de la cantidad de enzimas SUMO E1 y E2 al nivel que uno apenas puede detectar que su actividad en la sumoilación es el solo camino disponible determinar actividades catalíticas de SUMO E3 ligase usando este in vitro Sistema de sumoilación. Siguiendo esta hipótesis, con éxito dilucidar la actividad ligasa E3 K bZIP y había identificado como una novela ligasa E3 SUMO con especificidad hacia SUMO-2/3.
El paso crítico en el protocolo es la incorporación de cantidades menores de E1 y E2. Usando estas cantidades inferiores, como se muestra en la figura 2, novela SUMO E3 ligasas con actividad ligasa baja puede ser capaces de identificarse con la preservación de su especificidad hacia el sustrato y defendieron SUMO. Una limitación importante de la técnica es el requisito para un anticuerpo de alta calidad reconociendo el sustrato SUMO, ya que sólo una proporción muy pequeña del sustrato puede ser SUMO modificado.
Aunque muchas proteínas muestran el potencial de aumentar la sumoilación después sobreexpresión en vivo, definiendo una ligasa E3 SUMO debe demostrarse mediante un sistema de sumoilación reconstituido en vitro usando purificadas enzimas E1, E2 y E3. A diferencia de los cientos y quizás miles de ligasas de ubiquitina E3 identificados, hasta ahora se han encontrado sólo unos pocos SUMO E3 ligasas. Esto puede ser debido en parte a la utilización del tradicional estándar en vitro la sumoilación ensayo que maximiza la eficiencia verbal de SUMO y en consecuencia dificulta la función de la sumoilación de potencial SUMO E3 ligasas. El presente Protocolo describe un ensayo simple y consistente para sonda sumoilación realzada por una ligasa E3 SUMO. El método descrito es esencial para la identificación y caracterización de nuevos SUMO E3 ligasas.
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Disclosures
Los autores no divulgar conflictos de interés.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Ministerio de ciencia y tecnología (la mayoría, 105-2320-B-010-007-MY3 para PCC), del Instituto Nacional de investigación de salud (INDH-EX105 10215BC para PCC), del Ministerio de ciencia y tecnología (más 105-2314-B-400-019 a HJK) y del Instituto de investigación nacional de salud (INDH MG-105-SP-10, INDH MG-106-SP-10 HJK). Este trabajo también fue financiado en parte con la Universidad Nacional de Yang Ming en la publicación del manuscrito al PCC. Los fundadores no tenían ningún papel en el diseño del estudio, recopilación de datos y análisis, publicación o reparación del manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pFastBac | Invitrogen | 10359-016 | dual expression baculovirus vector |
| pCR2.1-TOPO vector | Invitrogen | PCR product vector | |
| competent cell E. coli DH5α | Yeastern Biotech | FYE678-80VL | competent E. coli cells A |
| E. coli DH10Bac | Invitrogen | 10359-016 | competent E. coli cells B |
| FugeneHD | Roche | 04709705001 | transfection reagent |
| Opti-MEM | Gibco | 31985062 | reduced serum media |
| T4 Ligase | NEW England BioLabs | M0202S | |
| CpoI (RsrII) | Thermo Scientific | ER0741 | |
| Bluo-gal | Thermo Scientific | B1690 | galactosidase substrate |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| Grace’s Insect Medium | Gibco | 11605094 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10082147 | |
| Gentamicin | Thermo Fisher | 15750060 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393-25G | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | K0254-20ML | |
| gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| tetracyclin | Sigma-Aldrich | 87128-25G | |
| LB Broth | Merk | 1.10285.0500 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-100G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888-5KG | |
| KCl | Merk | 1.04936.1000 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136-500G | |
| KH2PO4 | J.T.Baker | 3246-01 | |
| sodium dodecyl sulfate | Merk | 1.13760.1000 | |
| β-mercaptoethanol | Bio-Rad | 161-0710 | |
| TRIS (Base) | J.T.Baker | 4109-06 | |
| Non-fat milk | Fonterra | ||
| glycerol | J.T.Baker | 2136-01 | |
| Triton X-100 | Amresco | 0694-1L | detergent A |
| Tween 20 | Amresco | 0777-500ML | detergent B |
| Poloxamer 188 solution | Sigma-Aldrich | P5556-100ML | detergent C |
| Protease Inhibitor Cocktail Tablet | Roche | 04 693 132 001 | |
| 3x Flag peptide | Sigma | F4799 | |
| anti-FLAG m2 Magnetic beads | Sigma-Aldrich | M8823 | antibody-tagged magnetic beads |
| SUMOlink SUMO-1 Kit | Active Motif | 40120 | standard SUMOylation protocol |
| SUMOlink SUMO-2/3 Kit | Active Motif | 40220 | standard SUMOylation protocol |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
| QIAGEN Plasmid Mini Kit | QIAGEN | 12123 | plasmid extraction kit |
| Polypropylene tubes | Falcon | 352059 | |
| Petri Dish | Falcon | 351029 | |
| Cell lifter | Corning | CNG3008 | |
| Loading tip | Sorenson BioScience | 28480 | |
| PVDF | PerkinElmer | NEF1002 | |
| Blotting filter paper | Bio-Rad | 1703932 | |
| Mini slab gel apparatus (Bio-Rad Mini Protean II Cell) | Bio-Rad | 1658001 EDU | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell | Bio-Rad | 1703940 | |
| Pierce ECL Western Blotting | Thermo | 32106 | ECL reagent |
| suspension mixer | Digisystem laboratory instruments Inc. | SM-3000 | |
| orbital shaker | Kansin instruments Co. | OS701 | |
| ImageQuant LAS 4000 biomolecular imager |
GE Healthcare | 28955810 | |
| Sf9 | Thermo Scientific | B82501 | |
| anti-p53 antibody | Cell Signaling | #9282 | |
| anti-rabbit antibody | GE Healthcare | NA934-1ML |
References
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