Summary
A differenza di ubiquitin-ligasi, sono stati identificati alcuni ligasi E3 SUMO. Questo modificate in vitro sumoilazione protocollo è in grado di identificare il romanzo SUMO E3 ligasi mediante saggio di ricostituzione in vitro .
Abstract
Modifica piccolo ubiquitina-come modificatore (SUMO) è un'importante modificazione post-traduzionale (PTM) che media la trasduzione del segnale principalmente attraverso interazioni proteina-proteina di modulazione. Simile alla modifica di ubiquitina, sumolazione è diretto da una cascata enzimatica sequenziale tra cui enzima E1-attivazione (SAE1/SAE2), enzima di coniugazione E2 (Ubc9) ed E3-ligasi (cioè, pia famiglia, RanBP2 e Pc2). Tuttavia, a differenza di ubiquitinazione, una ligasi E3 non è essenziale per la reazione, ma non fornire la precisione e l'efficacia per la coniugazione di SUMO. Proteine modificate da SUMOylation possono essere identificati dall'analisi in vivo tramite immunoprecipitazione con anticorpi specifici per substrato e immunoblotting con anticorpi specifici per SUMO. Tuttavia, la dimostrazione dell'attività della proteina SUMO E3 ligasi richiede la ricostituzione in vitro di SUMOilazione saggi utilizzando enzimi purificati, substrato e proteine SUMO. Poiché nelle reazioni in vitro , solitamente SAE1/SAE2 e Ubc9, da soli sono sufficienti per la coniugazione di SUMO, valorizzazione di sumoilazione di una putativa ligasi E3 non è sempre facile da rilevare. Qui, descriviamo una modificate in vitro sumoilazione protocollo che identifica costantemente modificati di SUMO utilizzano un sistema in vitro ricostituito. Un protocollo di passo-passo per purificare cataliticamente attiva K-bZIP, una virale SUMO-2/3 E3 ligasi, inoltre è presentato. Le attività di SUMOilazione della K-bZIP purificato sono esposte su p53, una destinazione ben nota di SUMO. Questo protocollo può essere impiegato non solo per il delucidamento romanzo SUMO E3 ligasi, ma anche per rivelare la loro specificità di paralog SUMO.
Introduction
Modifica di SUMO è stato inizialmente identificato come una modificazione post-traduzionale reversibile (PTM) che regola la stabilità della proteina1. Oltre a coniugazione diretta, SUMO può anche essere collegato ad una proteina attraverso l'interazione non-covalente di SUMO interazione motivi (SIMs)2. Simile all'associazione di tyrosyl-fosforilazione di molecole che harboring Src homology 2 (SH2) o phosphotyrosine binding (PTB) domini3,4, modifica di SUMO fornisce una piattaforma di interazione aggiuntiva per selettiva assunzione di5,di proteine effettrici SIM contenenti6. Oltre alla regolazione della trasduzione del segnale, sumoilazione di fattori trascrizionali e molecole di rimodellamento della cromatina servono a modulare l'espressione genica7,8. Gli studi di pattern di SUMOilazione del genoma hanno rivelato che modifica di SUMO è associato con positivo9,10 o negativo10,11,12 trascrizione regolamento, in parte a causa della specificità paralogo di SUMOilazione.
Ci sono tre isoforme principali di SUMO per proteina coniugando presente in cellule di mammiferi; Questi includono SUMO-1 e il SUMO-2 altamente omologa e SUMO-3 (denominato SUMO-2/3)13. SUMO è solitamente coniugata con il residuo di lisina (K) all'interno del motivo di ψKxD/E consenso nella proteina bersaglio. SIM nel SUMO E3 ligasi è responsabile della specificità paralogo14. In contrasto con le vie di ubiquitinazione contenente centinaia di E3 ligasi, ci sono stati solo pochi SUMO E3 ligasi identificati15. Ligasi E3 SUMO sono definiti dalla proprietà, inclusa la capacità di (i) associare Ubc9, (ii) associare frazione SUMO tramite un dominio SIM e (iii) migliorare il trasferimento di SUMO da Ubc9 sul substrato. Ligasi E3 non è assolutamente necessaria per SUMO coniugazione16, ma fornisce il substrato e SUMO-paralogo specificità. Dal solito solo una piccola frazione della proteina totale substrato è SUMO-modificato, la rilevazione di proteine SUMOilate in vivo è sempre una sfida. Pertanto, sono necessari dosaggi accurati e riproducibili per delucidare la precisa funzione di modifica di SUMO.
Lo in vitro test sumoilazione, che valuta la capacità di catalizzare sumoilazione delle proteine substrato Ubc9 purificato, è un saggio ben accettato per lo studio di SUMO modifica17. Tuttavia, attività di ligasi E3 SUMO nella maggior parte dei casi non può essere rilevato o possono essere rilevati solo con mutata ligasi SUMO con alta attività SUMO E3 ligasi e specificità di substrato basso dal protocollo standard a causa della presenza di una quantità abbondante di Ubc918 . Il successo globale di questo dosaggio dipende in gran parte la titolazione attenta di Ubc9 purificata. Il saggio in vitro sumoilazione descritto qui è stato modificato da un sumoilazione standard protocollo (Vedi Tabella materiali). L'osservazione di modificazione di SUMO globale aumentata durante la riattivazione del herpesvirus associato al sarcoma di Kaposi (KSHV) spinti ad identificare la ligasi E3 SUMO virale che può essere responsabile per l'up-regolazione di SUMOilazione. A seguito di uno screening su piccola scala delle proteine d'interazione di virale SUMO E3 ligasi K-bZIP, p53 è stato identificato come un substrato romanzo. In questo protocollo, vi mostriamo nel dettaglio nelle cellule di insetto i passaggi coinvolti nell'espressione e purificazione di selvaggio-tipo K-bZIP, una SUMO E3 ligasi virale con specificità di SUMO-2/3. La capacità del K-bZIP purificata per migliorare la sumoilazione di p53, un ben noto substrato SUMO, è valutata in presenza di ridotte quantità di enzimi E1 ed E2. Utilizzando questa analisi modificata di SUMOilazione, i ricercatori possono attendibilmente definire le capacità di SUMO E3 ligasi SUMOylate romanzo o substrati noti, che è un passo principale nello studio della proteina sumoilazione. Inoltre, questo metodo consente di identificare il romanzo SUMO E3 ligasi con basso ligasi attività ma la specificità di substrato alta.
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Protocol
1. preparazione di costrutti di espressione di Baculovirus
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Purificare il SUMO E3 ligasi K-bZIP di clonazione del cDNA di K-bZIP19 in un vettore di baculovirus duplice espressione (Vedi tabella materiali) con un epitopo-tag N-terminale. Abbiamo avuto successo usando un tag di octapeptide (indicato in tutto il protocollo come vettore-tag-K-bZIP).
Nota: Il modello di DNA per K-bZIP della polimerasi reazione a catena (PCR) clonazione è cDNA inverso trascritto dal RNA isolato dalle cellule di TREx F3H3-K-Rta BCBL-1 seguono doxiciclina trattamento20.- Trasferimento del full-length cDNA di K-bZIP19 nel vettore di espressione dual con CpoI siti di clonazione. CPO Io digerisco il prodotto PCR e 1 µ g del vettore duplice espressione a 37 ° C per 3 h21.
- Separare ed estrarre il DNA digerito dopo elettroforesi su un gel di agarosio 0.8%22. Legare l'inserto (K-bZIP) e vettore di T4 DNA ligasi a 16 ° C per 30 min secondo le istruzioni del produttore (Vedi Tabella materiali).
- Aggiungere 5 µ l di legatura del DNA a 50 µ l competente Escherichia coli cellule "A" (Vedi Tabella materiali) in una provetta da 1,5 mL. Mettere il ghiaccio per 30 min. Quindi, incubare la provetta da 1,5 mL in bagnomaria a 42 ° C per 45 s e mettere immediatamente il tubo sul ghiaccio per 3 min.
- Aggiungere 600 µ l di terreno S.O.C (0,5% (p/v) di Estratto di lievito, tryptone di 2% (p/v), 10 millimetri di NaCl, 2.5 mM KCl, 20mm MgSO4e 4% (p/v) di glucosio) nel tubo e incubare a 37 ° C per 1 h. Quindi, centrifugare la provetta a temperatura ambiente per 3 min a 600 x g.
- Rimuovere il surnatante, risospendere il pellet con il mezzo di Luria-Bertani 60 µ l (LB; tryptone di 1% (p/v), 0,5% (p/v) di lievito estratto e 85 mM NaCl) e la diffusione su piastre di agar LB contenente ampicillina di 100 µ g/mL. Incubare la piastra di agar a 37 ° C per 16 h23,24.
- Selezionare 1 Colonia per inoculare in 5 mL di terreno LB contenente 100 µ g/mL ampicillina e coltura a 37 ° C per 16 h con 250 giri/min agitazione. Quindi, estrarre il plasmide, vector-tag-K-bZIP, da un kit di estrazione del plasmide secondo le istruzioni del produttore (Vedi Tabella materiali).
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Generare il bacmid ricombinante che harboring le bZIP-K-tag di trasformazione del vettore-tag-K-bZIP in competente Escherichia coli cellule "B" (Vedi tabella materiali).
- Mescolare 0,2 µ g vettore-tag-K-bZIP plasmide e 100 µ l competente E. cellule di coli "B" in una provetta da 1,5 mL e mettere il ghiaccio per 30 min. Incubare la provetta nel bagnomaria a 42 ° C per 45 s e mettere immediatamente il tubo sul ghiaccio per 3 min.
- Aggiungere 900 µ l di terreno di S.O.C nel tubo e incubare a 37 ° C per 4 h con rotazione a 50 giri/min. Successivamente, prendere 10 µ l del mezzo, aggiungere un ulteriore 50 µ l di S.O.C medium per diffondere su piastre di agar LB contenente kanamicina di 50 µ g/mL, 7 µ g/mL Gentamicina, tetraciclina di 10 µ g/mL, substrato di galattosidasi 100 µ g/mL e 40 µ g/mL isopropilico β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG ) e incubare le piastre per 48 h a 37 ° C.
- Inoculare una colonia bianca in 5 mL di terreno LB contenente kanamicina di 50 µ g/mL, 7 µ g/mL Gentamicina e la tetraciclina di 10 µ g/mL. Incubare a 37 ° C con 250 giri/min agitazione per 16 h.
- Isolare il bacmid ricombinante del DNA che harboring il tag-K-bZIP, quantificare e risospendere ad una concentrazione di 1 µ g / µ l25.
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Generare ricombinante Baculoviridae esprimendo tag-K-bZIP di transfezione 1 µ g di bacmid ricombinante del DNA contenente tag-K-bZIP in cellule Sf9 in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti.
- Semi 2 x 106 Sf9 celle (Vedi Tabella materiali) in insetto Medium di 2ml grazia fornito con 10% siero bovino fetale (FBS) e gentamicina 1% in ogni bene di una piastra ben 6, quindi incubare a 27 ° C per 1 h.
- Mantenere una cultura di fase log delle cellule Sf9 in insetto Medium di grazia fornito con 10% FBS, gentamicina 1% e 1% detergente C (Vedi Tabella materiali) a 27 ° C in sospensione orbitale a 140 giri/min. Contare le celle utilizzando un emocitometro e colorazione blu di trypan; vitalità cellulare deve superare il 95%. Mantenere le cellule utilizzando un rapporto di subcoltivazione di 1:3 ogni 2-3 giorni (densità minima ~0.5 x 106 cellule/mL).
- Aggiungere 2 µ l bacmid del DNA (1 µ g / µ l) e µ l 98 riduzione media del siero (Vedi Tabella materiali) in una provetta da 2 mL. Quindi, aggiungere 4 µ l di reagente di transfezione (Vedi Tabella materiali) al tubo e mescolare bene. Incubare a temperatura ambiente per 15 min.
- Aggiungere questa miscela di transfezione (104 µ l) in ogni pozzetto e incubare a 27 ° C per 12-16 h.
- Rimuovere i supporti esausti con leggera aspirazione e sostituire con 2 mL di terreno di insetto di Grace fresco fornito con 10% FBS e 1% gentamicina. Le cellule Sf9 aderiscano liberamente alla superficie della placca e non essere disturbate con leggera aspirazione.
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Raccogliere baculovirus ricombinanti dopo trasfezione e amplificare baculovirus per ottenere scorte di alto-titolo (P1) per ulteriori esperimenti.
- 72 h dopo il cambio medio, raschiare il Sf9 celle utilizzando un sollevatore di cella sterile, raccogliere il surnatante da ogni pozzetto individuo in una provetta da 1,5 mL e vortexare per 10 s.
- Centrifugare a 4 ° C per 3 min a 150 g. di x raccogliere surnatante come baculovirus P0 e aliquota in tubi da 1,5 mL (1 mL baculovirus in ogni tubo). Conservare a-80 ° C.
- Cellule di7 Sf9 seme 1 x 10 a insetto Medium di 10ml grazia fornito con 10% FBS e 1% gentamicina in un 10cm di Petri e incubare a 27 ° C per 1 h.
- Per l'amplificazione di Baculoviridae ricombinanti esprimenti tag-K-bZIP, aggiungere 0,5 mL P0 baculovirus alle celle Sf9 seminate e incubare a 27 ° C per 48 h.
- Raccogliere il surnatante baculovirus P1 in un tubo da 15 mL e conservare a 4 ° C per 1 mese.
2. purificazione di K-bZIP
- Mantenere una cultura di fase log delle cellule Sf9 in insetto Medium di grazia fornito con 10% FBS, gentamicina 1% e 1% detergente C a 27 ° C in sospensione orbitale a 140 giri/min, come descritto al punto 1.3.2.
- Il giorno della trasduzione, aggiungere 1 mL di surnatante contenenti baculovirus (P1) in 250 mL di Sf9 cellule con una densità di 2 x 106 cellule/mL.
- Incubare le cellule Sf9 per 72 h a 27 ° C su agitatore orbitale con 140 giri/min agitazione, poi raccogliere mediante centrifugazione a 2.740 x g per 15 min a 4 ° C.
- Rimuovere il surnatante e lisare il pellet cellulare in 10 mL di tampone di lisi (20 mM HEPES pH 7.9, 0.5 M NaCl, 1% detergente un (Vedi Tabella materiali), 2% glicerolo, inibitore della proteasi cocktail) e ruotare a 50 rpm usando un miscelatore di sospensione a 4 ° C per 30 min.
- Lysate a 15.000 x g per 15 min a raccogliere il surnatante delle cellule della centrifuga.
- Per purificare tag-K-bZIP, incubare i lisati cellulari (10 mL) con 50 µ l di anticorpo-etichetta biglie magnetiche in provette di polipropilene 14 mL e ruotarlo a 50 giri/min per 3 ore a 4 ° C, usando un miscelatore di sospensione. Dopo la cattura di proteina, pellet le perline a 800 x centrifugazione g per 30 s a 4 ° C. Rimuovere la maggior parte del surnatante e risospendere le sfere nel volume residuo di circa 1 mL trasferire in una provetta da 1,5 mL per il lavaggio.
- Lavare la proteina catturata inserendo il tubo contenente le perline su un supporto magnetico e rimuovere il supernatante, una volta che i branelli magnetici hanno aderito completamente al lato del tubo.
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Lavare le perle con buffer di lisi quattro volte.
- Aggiungere 1 mL di tampone di lisi in provette da 1,5 mL e invertire i tubi 10 volte. Posizionare la provetta da 1,5 mL su un supporto magnetico e rimuovere il surnatante come descritto in 2.7.
- Ripetere il passaggio precedente altre 3 volte.
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Lavare una volta le perline con tamponato fosfato salino (PBS).
- Aggiungere 1 mL di PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1,5 mM KH2PO4) in provette da 1,5 mL e invertire i tubi 10 volte.
- Mettere la provetta da 1,5 mL su un supporto magnetico e quindi rimuovere il surnatante.
- Eluire la proteina K-tag-bZIP dai branelli magnetici anticorpo-etichetta aggiungendo 100 µ l di 150 octapeptide µ g/mL diluito in PBS in una provetta da 1,5 mL. Ruotare il tubo per 10 min a 50 giri/min di miscelatore di sospensione a temperatura ambiente. Quindi, riposizionare il tubo sul supporto magnetico e raccogliere il surnatante in una provetta pulita da mL 1,5 K-bZIP-contenenti.
- Analizzare 1-5 µ l purificato proteina bZIP-K-tag da SDS-PAGE seguita da macchiatura26blu di Coomassie. Caricare 2 µ g, 1 µ g e 0,5 µ g campioni di albumina di siero bovino (BSA) sullo stesso gel e usarlo per quantificazione con un programma di elaborazione di immagini, come ImageJ. Stimare la concentrazione di K-bZIP in confronto agli standard BSA.
- Il K-bZIP purificata è ora pronto per essere usato per ogni test di SUMOilazione. Diluire il K-bZIP in PBS a una concentrazione finale di 100 ng / µ l e negozio in piccole aliquote a-80 ° C.
3. sumoilazione Assay
- Aggiungere 3 µ l di 100 ng / µ l di purificato tag-K-bZIP nel mix master di ogni in vitro sumoilazione reazione. Componenti in mix master contengono 1 µ l di tampone di proteina, 1 x sumoilazione tampone, proteina di p53 0,5 µ l (0,5 mg/mL), 25 nM di E1 l'enzima d'attivazione (conc. stock: 1 µM), 50 nM di E2 enzima di coniugazione (conc. stock: 10 µM) e 250 nM ogni dei peptidi SUMO (SUMO-1 , SUMO-2 o SUMO-3; Conc. Stock: 5 µM) ad un volume finale di 17 µ l.
- Mescolare delicatamente il contenuto e incubare la reazione a 30 ° C per 3 h. fermare la reazione aggiungendo 20 µ l di tampone di caricamento SDS-PAGE: 2x (100 mM Tris-HCL a pH 6.8, 4% sodio dodecil solfato, blu di bromofenolo 0,2% (w/v), 20% (v/v) glicerolo e 200mm β-mercaptoetanolo) e denaturare i campioni a 95 ° C per 5 min.
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Campioni separati su SDS-PAGE, trasferire le proteine separate sulla membrana PVDF utilizzando un apparato di Trasferimento elettroforetico semi-secco e analizzare mediante Western blot con anticorpi anti-p53.
- Impostare l'apparecchio di gel come descritto al punto 2.11 e caricare 20 µ l di campione nei pozzetti del gel.
- Esegua il gel 10% in una corrente costante a 80 V per circa 120 min (fino a quando la band di tintura raggiunge il fondo del gel). Dopo il completamento dell'elettroforesi, spegnere l'alimentazione.
- Scollegare l'apparecchio di gel e gel di cassette per togliere il gel e galleggiare il gel in tampone di trasferimento semi-secco (48 mM Tris-HCl, glicina di 39 mM, 20% metanolo) per 5 min.
- Prendere un altro contenitore e immergere la membrana PVDF in metanolo per 1 min. Tolga PVDF metanolo, quindi mettere in tampone di trasferimento semi-secco. Agitare delicatamente la membrana per 5 min.
- Rimuovere il coperchio di sicurezza dell'apparato elettroforetico semi-secco.
- Pre-bagnato carta da filtro e preparare un sandwich di gel sull'anodo fondo platino come segue: carta da filtro, membrana PVDF, gel e carta da filtro.
- Coperchio piatto e sicurezza sicuro catodo, quindi eseguire macchia al 15 V corrente costante per 90 min Disabilita l'alimentazione elettrica, disinserire gli apparecchi semi-secco e togliere la membrana PVDF.
- Membrana di PVDF di blocco con tampone bloccante (5% senza grassi del latte nel buffer di TBST (137 mM NaCl2, 20 mM Tris-HCl, 0,1% detergente B (Vedi Tabella materiali), pH 7,6)) a temperatura ambiente per 1 h con 30 giri/min agitando a Agitatore orbitale.
- Ibridare la membrana PVDF con l'anticorpo anti-p53 diluito (1:1, 000) in tampone bloccante per 12-16 ore a 4 ° C con 30 giri/min agitazione utilizzando un miscelatore di sospensione.
- Togliere la membrana PVDF in un contenitore e mettere in TBST. Risciacquare la membrana PVDF con TBST altre due volte.
- Immergere la membrana PVDF in TBST per 30 min con 45 giri agitando a Agitatore orbitale.
- Ibridare la membrana PVDF con anti-coniglio anticorpo coniugato con perossidasi di rafano (HRP) diluito (1:4, 000) in tampone bloccante per 1 h a temperatura ambiente con 30 giri/min agitazione utilizzando un miscelatore di sospensione.
- Lavare la membrana PVDF con TBST 3 volte come descritto nel passaggio 3.4.10.
- Immergere la membrana PVDF in TBST per 30 min con 45 giri agitazione utilizzando un miscelatore di sospensione. Rimuovere TBST e aggiungere PBS per preservare la membrana PVDF a 4 ° C per fino a 12 h.
- Agitare il reagente substrato chemiluminescente avanzata (substrato ECL) 1 e 2 (1:1) (Vedi Tabella materiali). Rimuovere la membrana PVDF da PBS, tamponare brevemente con un tovagliolo di carta o leggeri tergicristallo per assorbire l'umidità in eccesso e immediatamente aggiungere 400 µ l di reagente di ECL alla superficie di ciascuna membrana per 3-5 min. Remove in eccesso ECL reagente tamponando brevemente, ma non consentono la m Embrane a completamente asciutto.
- Esporre la macchia usando un sistema di imaging luminescenza o autoradiografia pellicola27.
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Representative Results
Secondo le informazioni fornite dal costruttore, la quantità di enzima E1 ed E2 nell'analisi della SUMOilazione standard è di 50 nM e 500 nM, rispettivamente. La quantità minima di E2 coniugando enzima Ubc9 che è in grado di SUMOylate p53 in primo luogo è stata determinata mediante un test di SUMOilazione in vitro . In basso come un quinto della quantità di Ubc9 usato nello standard in vitro protocollo di analisi di SUMOilazione ha saputo efficientemente SUMOylate p53 (Figura 1A). Di conseguenza, la metà della quantità di enzima E1 in combinazione con un decimo della quantità di Ubc9 utilizzato nel protocollo standard è stato utilizzato per un altro saggio in vitro sumoilazione. È stata osservata una riduzione significativa di SUMOilazione efficienza rispetto al protocollo standard (Figura 1B).
Così, la capacità di SUMO E3 ligasi K-bZIP di migliorare p53 che sumolazione è stata determinata usando questi modificato in vitro sumoilazione condizioni. Con tag K-bZIP purificato da cellule Sf9 (Figura 2A) è stata impiegata in una reazione di SUMOilazione contenenti minori quantità di enzimi E1 ed E2 Ubc9. In queste condizioni modificate, K-bZIP potrebbero catalizzare efficientemente la sumoilazione di p53 (Figura 2B). Immunoblotting con anticorpo anti-p53 ha confermato gli importi totali simili di p53 in ogni reazione, e anche rilevato SUMO modificato p53.
Figura 1 : Determinazione della minima quantità di enzimi SUMO utilizzati nell'analisi in vitro sumoilazione. (A) p53 che sumolazione è stata valutata in un in vitro sumoilazione test che comprendeva una metà e un quinto la quantità di enzima Ubc9 utilizzato nel protocollo standard. Dopo 3 ore di in vitro sumoilazione reazione, gli enzimi SUMOilate p53 sono stati esaminati mediante Western blot con anticorpi anti-p53. (B) In vitro sumoilazione di p53 è stata ulteriormente analizzata utilizzando la metà della quantità di enzima E1 in combinazione con un decimo della quantità di Ubc9 utilizzato nel protocollo standard. Un Western blot è stato effettuato come descritto come in (A). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Valorizzazione del p53 sumoilazione di SUMO E3 ligasi K-bZIP. (A) purificato baculovirus-espresso la proteina K-bZIP, analizzata da SDS-PAGE seguita con la macchiatura blu di Coomassie. 1 µ g BSA e 10 µ l purificato K-bZIP stavano caricando per comparativa la quantità di proteina. (B) K-bZIP migliorato p53 che sumolazione è stato valutato usando una reazione in vitro sumoilazione con metà della quantità di enzima E1 e un decimo della quantità di Ubc9 raccomandati nel protocollo standard. SUMOilate p53 sono stati studiati mediante Western blot, come descritto in Figura 1A. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Lo in vitro sumoilazione protocollo descritto qui è usata ordinariamente per stabilire lo stato di sumoilazione di identificati Ubc9 substrati. La limitazione principale utilizzando il protocollo standard per studiare la funzione di sumoilazione di SUMO E3 ligasi è l'abbondanza di SUMO E1 attivando ed enzimi di coniugazione E2 Ubc9 che massimizzano la coniugazione di SUMO in sistemi in vitro . Considerando questa sfida, noi crediamo che titolazione della quantità di enzimi SUMO E1 ed E2 al livello che a malapena si può rilevare che la loro attività in sumoilazione è l'unico modo disponibile determinare l'attività catalitica di SUMO E3 ligasi utilizzando questo in vitro Sistema di SUMOilazione. A seguito di questa ipotesi, abbiamo con successo delucidato l'attività della ligasi E3 di K-bZIP e identificato come una romanzo SUMO E3 ligasi con specificità verso SUMO-2/3.
Il passaggio fondamentale all'interno del protocollo è l'incorporazione di quantità inferiori di E1 ed E2. Utilizzando questi importi inferiori, come illustrato nella Figura 2, romanzo SUMO E3 ligasi con attività ligasi basso può essere in grado di essere identificato con la conservazione della loro specificità verso il substrato e SUMO paralogues. Una limitazione importante della tecnica è il requisito per un anticorpo di alta qualità riconoscendo il substrato SUMO, poiché solo una piccolissima parte del substrato può essere SUMO per volta.
Anche se molte proteine mostrano il potenziale per aumentare la sumoilazione dopo sovraespressione in vivo, definendo una SUMO E3 ligasi deve essere dimostrata da un sistema ricostituito in vitro sumoilazione utilizzando enzimi purificati di E1, E2 ed E3. Al contrario di centinaia e forse migliaia di ligasi di ubiquitin E3 identificati, fino ad ora sono stati trovati solo pochi SUMO E3 ligasi. Questo può essere dovuto in parte all'uso del test tradizionale standard in vitro sumoilazione che massimizza l'efficienza di coniugazione di SUMO e di conseguenza, ostacola la funzione di sumoilazione di potenziale SUMO E3 ligasi. Il presente protocollo descrive un'analisi semplice e coerenza per sondare SUMOylation impreziosita da una SUMO E3 ligasi. Il metodo descritto è essenziale per l'identificazione e la caratterizzazione di romanzo SUMO E3 ligasi.
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Disclosures
Gli autori non divulgare nessun potenziali conflitti di interesse.
Acknowledgments
Quest'opera è stata sostenuta da sovvenzioni dal Ministero della scienza e tecnologia (la maggior parte, 105-2320-B-010-007-MY3 a PCC), dall'Istituto di ricerca di salute nazionale (vi-EX105-10215BC a PCC), dal Ministero della scienza e tecnologia (più 105-2314-B-400-019 di HJK) e dell'Istituto di ricerca di salute nazionale (vi MG-105-SP-10, vi MG-106-SP-10 di HJK). Questo lavoro è stato supportato anche parzialmente con National Yang-Ming University sulla pubblicazione del manoscritto di PCC. I finanziatori non avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, raccolta dati e analisi, decisione di pubblicare o riparazione del manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pFastBac | Invitrogen | 10359-016 | dual expression baculovirus vector |
| pCR2.1-TOPO vector | Invitrogen | PCR product vector | |
| competent cell E. coli DH5α | Yeastern Biotech | FYE678-80VL | competent E. coli cells A |
| E. coli DH10Bac | Invitrogen | 10359-016 | competent E. coli cells B |
| FugeneHD | Roche | 04709705001 | transfection reagent |
| Opti-MEM | Gibco | 31985062 | reduced serum media |
| T4 Ligase | NEW England BioLabs | M0202S | |
| CpoI (RsrII) | Thermo Scientific | ER0741 | |
| Bluo-gal | Thermo Scientific | B1690 | galactosidase substrate |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| Grace’s Insect Medium | Gibco | 11605094 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10082147 | |
| Gentamicin | Thermo Fisher | 15750060 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393-25G | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | K0254-20ML | |
| gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| tetracyclin | Sigma-Aldrich | 87128-25G | |
| LB Broth | Merk | 1.10285.0500 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-100G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888-5KG | |
| KCl | Merk | 1.04936.1000 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136-500G | |
| KH2PO4 | J.T.Baker | 3246-01 | |
| sodium dodecyl sulfate | Merk | 1.13760.1000 | |
| β-mercaptoethanol | Bio-Rad | 161-0710 | |
| TRIS (Base) | J.T.Baker | 4109-06 | |
| Non-fat milk | Fonterra | ||
| glycerol | J.T.Baker | 2136-01 | |
| Triton X-100 | Amresco | 0694-1L | detergent A |
| Tween 20 | Amresco | 0777-500ML | detergent B |
| Poloxamer 188 solution | Sigma-Aldrich | P5556-100ML | detergent C |
| Protease Inhibitor Cocktail Tablet | Roche | 04 693 132 001 | |
| 3x Flag peptide | Sigma | F4799 | |
| anti-FLAG m2 Magnetic beads | Sigma-Aldrich | M8823 | antibody-tagged magnetic beads |
| SUMOlink SUMO-1 Kit | Active Motif | 40120 | standard SUMOylation protocol |
| SUMOlink SUMO-2/3 Kit | Active Motif | 40220 | standard SUMOylation protocol |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
| QIAGEN Plasmid Mini Kit | QIAGEN | 12123 | plasmid extraction kit |
| Polypropylene tubes | Falcon | 352059 | |
| Petri Dish | Falcon | 351029 | |
| Cell lifter | Corning | CNG3008 | |
| Loading tip | Sorenson BioScience | 28480 | |
| PVDF | PerkinElmer | NEF1002 | |
| Blotting filter paper | Bio-Rad | 1703932 | |
| Mini slab gel apparatus (Bio-Rad Mini Protean II Cell) | Bio-Rad | 1658001 EDU | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell | Bio-Rad | 1703940 | |
| Pierce ECL Western Blotting | Thermo | 32106 | ECL reagent |
| suspension mixer | Digisystem laboratory instruments Inc. | SM-3000 | |
| orbital shaker | Kansin instruments Co. | OS701 | |
| ImageQuant LAS 4000 biomolecular imager |
GE Healthcare | 28955810 | |
| Sf9 | Thermo Scientific | B82501 | |
| anti-p53 antibody | Cell Signaling | #9282 | |
| anti-rabbit antibody | GE Healthcare | NA934-1ML |
References
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