Summary
Till skillnad från ubiquitin ligases, har några E3 SUMO ligases identifierats. Denna modifierade in vitro- SUMOylation protokoll är kunna identifiera nya SUMO E3 ligases genom beredning in vitro- test.
Abstract
Liten ubiquitin-liknande modifierare (SUMO) ändring är en viktig post-translationella ändring (PTM) som medierar cellsignalering främst genom modulerande protein-protein interaktioner. Liknar ubiquitin modifiering, SUMOylation är regisserad av en sekventiell enzym kaskad inklusive E1-aktiverande enzym (SAE1/SAE2), E2-konjugation enzym (Ubc9) och E3-ligase (dvs, PIAS familj, RanBP2 och Pc2). Dock skiljer sig från ubikvitinering, en E3-ligase är icke-väsentliga för reaktionen men inte ger precision och effekt för SUMO konjugation. Proteiner modifieras av SUMOylation kan identifieras genom in-vivo analys via immunoprecipitation med substrat-specifika antikroppar och immunoblotting med SUMO-specifika antikroppar. Demonstration av protein SUMO E3 ligase aktivitet kräver dock in vitro- beredning av SUMOylation analyser med renade enzymer, substrat och SUMO proteiner. Eftersom i in vitro- reaktioner, oftast SAE1/SAE2 och Ubc9, ensam är tillräcklig för SUMO konjugation, är förbättring av SUMOylation av en förmodad E3-ligase inte alltid lätt att upptäcka. Här beskriver vi en modifierad in vitro- SUMOylation protokoll som konsekvent identifierar SUMO ändring med hjälp av ett in vitro- beredning-system. En steg för steg-protokollet att rena katalytiskt aktiva K-bZIP, en viral SUMO-2/3 E3-ligase, presenteras också. SUMOylation verksamhet den renade K-bZIP visas på p53, ett välkänt mål för SUMO. Detta protokoll kan inte bara användas för att belysa nya SUMO E3 ligases, men också för att avslöja deras SUMO paralog specificitet.
Introduction
SUMO modifiering identifierades inledningsvis som en reversibel posttranslationella modifieringen (PTM) som reglerar protein stabilitet1. Förutom direkta konjugation, kan SUMO också bifogas ett protein genom icke-kovalenta interaktion av SUMO interaktion motiv (SIMs)2. Liknar den bindningen av tyrosyl-fosforylering av molekyler som härbärgerat Src homologi 2 (SH2) eller phosphotyrosine bindande (PTB) domäner3,4, SUMO modifiering ger en ytterligare interaktion plattform för selektiv rekrytering av SIM-innehållande effektor proteiner5,6. Förutom regleringen av signaltransduktion fungerar SUMOylation av transkriptionell faktorer och kromatin remodeling molekyler att modulera gen uttryck7,8. Studier av genome-wide SUMOylation mönster har visat att SUMO modifiering är associerade med antingen positiva9,10 eller negativa10,11,12 transkription förordning, delvis på grund av SUMOylation paralogue specificitet.
Det finns tre stora SUMO isoformer för protein konjugera närvarande i däggdjursceller; Dessa inkluderar SUMO-1, och mycket homologa SUMO-2 och SUMO-3 (kallad SUMO-2/3)13. SUMO är vanligtvis konjugerat till lysin (K) återstoden inom ψKxD/E samförstånd motivet i målproteinet. SIM-kortet i SUMO E3 ligases ansvarar för paralogue specificitet14. I motsats till ubikvitinering vägar som innehåller hundratals E3 ligases, har det bara varit några SUMO E3 ligases identifierade15. SUMO E3 ligases definieras av fastigheter, inklusive deras förmåga att (i) binda Ubc9, (ii) binder SUMO biexponentiellt via en SIM-domän och (iii) förbättra SUMO överföring från Ubc9 på substrat. E3 ligase är inte absolut nödvändigt för SUMO konjugation16, men ger substrat och SUMO-paralogue specificitet. Sedan oftast endast en bråkdel av det totala underlag proteinet är SUMO-modifierat, är detektion av SUMOylated proteiner i vivo alltid en utmaning. Därför behövs exakt och reproducerbar analyser för att klarlägga den exakta funktionen av SUMO modifiering.
I in vitro- SUMOylation-test, som utvärderar renat Ubc9 förmåga att katalysera SUMOylation av substrat proteiner, är en väl accepterade analys för att studera SUMO ändring17. Dock SUMO E3 ligase aktivitet i de flesta fall inte kan upptäckas eller kan endast upptäckas med muterade SUMO ligase med hög SUMO E3 ligase aktivitet och låg substrat specificitet av standardprotokollet på grund av närvaron av en riklig mängd Ubc918 . Den totala framgången för denna analys är till stor del beroende av noggrann titrering av renat Ubc9. In vitro- SUMOylation analysen beskrivs här ändras från en standard SUMOylation protokoll (se Tabell för material). Observation av ökad global SUMO ändring under Kaposis sarkom-associerade herpesvirus (KSHV) reaktivering föranlett oss att identifiera de virala SUMO E3-ligase som kan ansvara för Uppregleringen av SUMOylation. Efter en småskalig genomgång av de samverkande proteinerna av viral SUMO E3 ligase K-bZIP, p53 identifierades som romanen substrat. I detta protokoll visar vi i detalj i insekt celler stegen inblandade i uttryck och rening av vild typ K-bZIP, en viral SUMO E3-ligase med SUMO-2/3 specificitet. Den renade K-bZIP förmåga att förbättra SUMOylation av p53, en välkänd SUMO substrat, utvärderas i närvaro av reducerade mängder E1 och E2 enzymer. Med denna modifierade SUMOylation analys, kan forskare tillförlitligt definiera kapaciteterna av SUMO E3 ligase SUMOylate roman eller kända substrat, vilket är en primär steg i studien av protein SUMOylation. Denna metod hjälper dessutom identifiera nya SUMO E3 ligases med låg ligase aktivitet men hög substrat specificitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning av baculoviridae uttryck konstruktioner
-
Rena SUMO E3 ligase K-bZIP genom kloning av cDNA K-bZIP19 i en vektor med dubbla uttryck i baculoviridae (se tabell för material) med en N-terminal epitop-tagg. Vi har haft framgång med hjälp av en octapeptide-tagg (anges i hela protokollet som vektor-tag-K-bZIP).
Obs: Mallen DNA för K-bZIP polymeras-kedjereaktion (PCR) kloning är cDNA omvänd transkriberas från RNA isoleras från TREx F3H3-K-Rta BCBL-1 celler efter doxycyklin behandling20.- Över de fullängds K-bZIP cDNA19 till dubbla uttryck vektorn med Cpojag kloning platser. CPO Jag smälta PCR-produkten och 1 µg vektorns dubbla uttryck vid 37 ° C för 3 h21.
- Separata och extrahera smält DNA efter elektrofores på en 0,8% agaros gel22. Ligera skäret (K-bZIP) och vektor av T4 DNA-ligase vid 16 ° C i 30 min enligt tillverkarens anvisningar (se Tabell för material).
- Tillsätt 5 µL av ligering DNA till 50 µL behöriga E. coli celler ”A” (se Tabell för material) i en 1,5 mL tub. Sätta på is i 30 min. Sedan, inkubera 1,5 mL röret i 42 ° C vattenbad för 45 s och omedelbart sätta röret på is för 3 min.
- Lägga till 600 µL S.O.C. medium (0,5% (w/v) jästextrakt, 2% (w/v) trypton, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 20 mM MgSO4och 4% (w/v) glukos) in i röret och inkubera vid 37 ° C i 1 h. Sedan Centrifugera röret i rumstemperatur i 3 min vid 600 x g.
- Ta bort supernatanten, återsuspendera pelleten med 60 µL Luria-Bertani medium (LB; 1% (w/v) trypton, 0,5% (w/v) jäst extrakt och 85 mM NaCl) och sprids på LB agarplattor som innehåller 100 µg/mL ampicillin. Inkubera agarplattan vid 37 ° C i 16 h23,24.
- Välj 1 koloni att Inokulera i 5 mL LB medium innehållande 100 µg/mL ampicillin och kultur vid 37 ° C i 16 h med 250 rpm skakar. Extrahera sedan plasmiden, vektor-tag-K-bZIP, av en plasmid utvinning kit enligt tillverkarens anvisningar (se Tabell för material).
-
Generera den rekombinant bacmid härbärgerat den tagg-K-bZIP av omvandlingen av den vektor-tag-K-bZIP till behöriga E. coli celler ”B” (se tabell för material).
- Blanda 0.2 µg vektor-tag-K-bZIP plasmid och 100 µL behöriga E. coli celler ”B” i en 1,5 mL tub och pålagda is för 30 min. Inkubera röret i 42 ° C vattenbad för 45 s och omedelbart sätta röret på is för 3 min.
- Tillsätt 900 µL av S.O.C. medium i röret och inkubera vid 37 ° C i 4 h med rotation 50 rpm. Nästa, ta 10 µL av medium, lägga till en ytterligare 50 µL av S.O.C medium att sprida på LB agarplattor som innehåller 50 µg/mL kanamycin, 7 µg/mL gentamicin, 10 µg/mL tetracyklin, 100 µg/mL galaktosidas substrat och 40 µg/mL isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG ), och inkubera plattorna för 48 timmar vid 37 ° C.
- Inokulera en vit koloni i 5 mL LB medium innehållande 50 µg/mL kanamycin, 7 µg/mL gentamicin och 10 µg/mL tetracyklin. Inkubera vid 37 ° C med 250 rpm skakar för 16 h.
- Isolera den rekombinant bacmid DNA härbärgerat den tagg-K-bZIP, kvantifiera och resuspendera vid en koncentration på 1 µg/µL25.
-
Generera rekombinant baculoviruses uttrycker tagg-K-bZIP av transfecting 1 µg av rekombinant bacmid DNA som innehåller taggen-K-bZIP i Sf9 celler i ett väl 6-bra platta.
- Utsäde 2 x 106 Sf9 celler (se Tabell för material) i 2 mL Graces insekt Medium levereras med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% gentamicin i varje väl 6 väl platta och inkubera vid 27 ° C för 1 h sedan.
- Upprätthålla en logg fas kultur Sf9 celler i Graces insekt Medium levereras med 10% FBS, 1% gentamicin och 1% tvättmedel C (se Tabell för material) vid 27 ° C i orbital suspension på 140 rpm. Räkna celler som använder en hemocytometer och trypan blå färgning; cellernas viabilitet bör överstiga 95%. Upprätthålla celler som använder en inkubationens förhållandet 1:3 varje 2-3 dagar (minimal densitet ~0.5 x 106 celler/mL).
- Lägg till 2 µL bacmid DNA (1 µg/µL) och 98 µL minskade serum media (se Tabell för material) i en 2 mL tub. Lägg sedan till 4 µL transfection reagens (se Tabell för material) till röret och blanda väl. Odla i rumstemperatur i 15 min.
- Lägg denna transfection blandning (104 µL) i varje brunn och inkubera vid 27 ° C under 12-16 h.
- Ta bort utmattad media med mild aspiration, och ersätta med 2 mL färsk Graces insekt Medium levereras med 10% FBS och 1% gentamicin. Sf9 cellerna följer löst platta ytan och kommer inte bli störd med mild aspiration.
-
Samla rekombinant baculoviridae efter transfection och förstärka baculoviridae för att erhålla hög-titer bestånd (P1) för ytterligare experiment.
- 72 h efter byte medium, skrapa Sf9 celler med hjälp av en steril cell lyftare, samla in supernatanten från varje enskild brunn i en 1,5 mL tub och virvel för 10 s.
- Centrifugera vid 4 ° C för 3 min på 150 x g. samla supernatanten som P0 baculoviridae och delprov i 1,5 mL rör (1 mL baculoviridae i varje rör). Förvaras vid-80 ° C.
- Frö 1 x 107 Sf9 celler i 10 mL Graces insekt Medium levereras med 10% FBS och 1% gentamicin i en 10 cm petriskål och inkubera vid 27 ° C i 1 h.
- För förstärkning av rekombinant baculoviruses uttrycker tagg-K-bZIP, tillsätt 0,5 mL P0 baculoviridae till seedade Sf9 celler och inkubera vid 27 ° C för 48 h.
- Samla supernatanten som P1 baculoviridae i en 15 mL tub och förvaras vid 4 ° C i upp till 1 månad.
2. rening av K-bZIP
- Upprätthålla en logg fas kultur Sf9 celler i Graces insekt Medium levereras med 10% FBS, 1% gentamicin och 1% tvättmedel C vid 27 ° C i orbital suspension på 140 rpm som beskrivs i steg 1.3.2.
- På dagen för transduktion, tillsätt 1 mL baculoviridae-innehållande supernatanten (P1) i 250 mL Sf9 celler med en densitet på 2 x 106 celler/mL.
- Inkubera Sf9 celler för 72 h vid 27 ° C i orbitalskak med 140 rpm skakar och sedan samla in genom centrifugering vid 2 740 x g i 15 minuter vid 4 ° C.
- Ta bort supernatanten och lysera cell pellets i 10 mL lyseringsbuffert (20 mM HEPES pH 7,9, 0,5 M NaCl, 1% tvättmedel en (se Tabell för material), 2% glycerol, proteashämmare cocktail) och rotera på 50 varv med en fjädring mixer vid 4 ° C i 30 min.
- Centrifugera cell lysate vid 15 000 x g i 15 min att samla supernatanten.
- För att rena tagg-K-bZIP, inkubera i cell lysates (10 mL) med 50 µL av antikropp-taggade magnetiska pärlor i 14 mL polypropylene rören, och rotera vid 50 rpm för 3 h vid 4 ° C med en fjädring mixer. Efter protein fångst, pellet pärlorna på 800 x g centrifugering i 30 s vid 4 ° C. Ta bort de flesta av supernatanten, återsuspendering pärlorna i den resterande volymen ca 1 ml och överför till en 1,5 mL tub för tvätt.
- Tvätta det fångade proteinet genom att placera röret som innehåller pärlorna på en magnetisk stå och ta bort supernatanten när de magnetiska pärlorna har fullt ut anslutit sig till sidan av röret.
-
Tvätta pärlorna med lyseringsbuffert fyra gånger.
- Tillsätt 1 mL lyseringsbuffert i 1,5 mL rör och Invertera rören 10 gånger. Placera 1,5 mL röret på en magnetisk stå och ta bort supernatanten som beskrivs i 2,7.
- Upprepa föregående steg en annan 3 gånger.
-
Tvätta pärlorna med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) en gång.
- Tillsätt 1 mL PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1,5 mM KH2PO4) i 1,5 mL rör och Invertera rören 10 gånger.
- Pålagt en magnetisk stå 1,5 mL röret och sedan ta bort supernatanten.
- Eluera tagg-K-bZIP protein från antikropp-taggade magnetiska pärlor genom att lägga till 100 µL av 150 µg/mL octapeptide utspädd i PBS i ett 1,5 mL rör. Vrid röret för 10 min vid 50 rpm av suspension mixer i rumstemperatur. Sedan placera röret tillbaka på magnetiska stativet och samla K-bZIP-innehållande supernatanten i en ren 1,5 mL tub.
- Analysera 1-5 µL renat tagg-K-bZIP protein av SDS-PAGE följt av Coomassie blå färgning26. Fyll 2 µg, 1 µg och 0,5 µg prover av bovint serumalbumin (BSA) på samma gel och använda den för kvantifiering med en bild bearbetningsprogram, som ImageJ. Uppskatta den K-bZIP koncentrationen i jämförelse till BSA standarder.
- Den renade K-bZIP är nu redo att användas i varje SUMOylation assay. Späd den K-bZIP i PBS till en slutlig koncentration på 100 ng/µL och förvaras i små delprover vid-80 ° C.
3. SUMOylation Assay
- Tillsätt 3 µL av 100 ng/µL av renat tagg-K-bZIP i huvudmixen av varje in vitro- SUMOylation reaktion. Komponenter i master mix innehåller 1 µL protein buffert, 1 x SUMOylation buffert, 0,5 µL p53 protein (0,5 mg/mL), 25 nM E1 aktivera enzym (konc. lager: 1 µM), 50 nM E2 konjugera enzym (lager konc: 10 µM), och 250 nM varje SUMO peptiderna (SUMO-1 , SUMO-2 eller SUMO-3; beståndet konc: 5 µM) till en slutlig volym av 17 µL.
- Blanda innehållet försiktigt och inkubera reaktionen vid 30 ° C för 3 h. stoppa reaktionen genom att lägga till 20 µL av 2 x SDS-PAGE lastning buffert (100 mM Tris-HCL pH 6.8, 4% sodium dodecyl sulfate, 0,2% (w/v) bromophenol blå, 20% (v/v) glycerol och 200 mM β-merkaptoetanol) och denature proverna vid 95 ° C i 5 min.
-
Separata prover på SDS-PAGE, överföra de separerade proteinerna till PVDF membran med en halvtorr elektroforetiska överföring apparatur och analysera genom Western blot med anti-p53 antikroppen.
- Ställa in gel apparaten som i steg 2.11 och lasta 20 µL prov i gel brunnar.
- Kör 10% gelen i en konstant ström på 80 V för ca 120 min (tills dye bandet når botten av gelen). Efter slutförandet av elektrofores, Stäng av strömförsörjningen.
- Koppla bort gel apparater och gel kassetter att ta ut gelen och flyta gelen till halvtorr överföring buffert (48 mM Tris-HCl, 39 mM glycin, 20% metanol) för 5 min.
- Ta en annan behållare och njuta PVDF membranet i metanol för 1 min. Sedan ta PVDF ur metanol och sätta i halvtorr överföring buffert. Skaka försiktigt membranet i 5 min.
- Ta bort säkerhet omslaget till halvtorr elektroforetiska apparaten.
- Pre våt filterpapper, och göra en gel smörgås på botten platina anoden som följer: filtrerpapper, PVDF membran, gel och filterpapper.
- Säkert katod plattan och säkerhet täcka, sedan köra blot på 15 V konstant ström för 90 min. slå av strömmen, koppla bort halvtorr apparater, och ta av PVDF membranet.
- Blockera PVDF membran med blockerande buffert (5% fettfri mjölk i TBST buffert (137 mM NaCl2, 20 mM Tris-HCl, 0,1% tvättmedel B (se Tabell för material), pH 7,6)) i rumstemperatur i 1 h med 30 rpm skakar av roterande blandare.
- Hybridisera PVDF membranet med anti-p53 antikropp efter utspädning (1:1, 000) i blockerande buffert för 12-16 h vid 4 ° C under 30 rpm skakning med en fjädring mixer.
- Ta av PVDF membranet i en behållare och sätta i TBST. Skölj PVDF membran med TBST två gånger.
- Blötlägg PVDF membranet i TBST i 30 min med 45 rpm skakar av roterande blandare.
- Hybridisera PVDF membranet med anti-kanin-antikropp konjugerat med pepparrotsperoxidas (HRP) efter utspädning (1:4, 000) i blockerande buffert för 1 h i rumstemperatur med 30 rpm skakar använder en suspension mixer.
- Tvätta PVDF membranet med TBST 3 gånger som beskrivs i steg 3.4.10.
- Blötlägg PVDF membranet i TBST i 30 min med 45 rpm skakar använder en suspension mixer. Ta bort TBST och Lägg till PBS för att bevara PVDF membranet vid 4 ° C i upp till 12 h.
- Blanda förstärkt kemiluminiscent substrat (ECL-substrat) reagens 1 och 2 (1:1) (se Tabell för material). Ta bort PVDF membranet från PBS, blot kort med en pappershandduk eller lätta wiper att absorbera fukt, och omedelbart lägga 400 µL ECL reagens på ytan av varje membran för 3-5 min. ta bort överflödig ECL reagens genom kort blotting, men låt inte m embrane till helt torra.
- Exponera blot med luminiscens bildsystem eller autoradiografi filmen27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Enligt den information som tillhandahålls av tillverkaren, mängden standard E1 och E2 enzym i SUMOylation-analysen är 50 nM och 500 nM, respektive. Den minimala mängd E2 konjugera enzymet Ubc9 som kan SUMOylate p53 bestämdes först av ett in vitro- SUMOylation test. Så låg som en femtedel av mängden Ubc9 som används i standarden in vitro- SUMOylation assay protokollet kunde effektivt SUMOylate p53 (figur 1A). Därför användes hälften av mängden E1 enzym i kombination med en tiondel av mängden Ubc9 som används i standardprotokollet för en annan in vitro- SUMOylation analys. En signifikant minskning av SUMOylation effektivitet observerades jämfört med standardprotokoll (figur 1B).
SUMO E3 ligase K-bZIP förmåga att stärka p53 SUMOylation fastställdes med hjälp av dessa ändrade också, in vitro- SUMOylation villkor. Tagged K-bZIP renas från Sf9 celler (figur 2A) var anställd i en SUMOylation reaktion som innehåller lägre mängder av E1 och E2 Ubc9 enzymer. Dessa ändrade villkor, K-bZIP effektivt kunde katalysera SUMOylation p53 (figur 2B). Immunoblotting med anti-p53 antikropp bekräftade liknande totalbeloppen av p53 i varje reaktion och också upptäckta SUMO ändrades p53.
Figur 1 : Bestämning av det minsta stödbeloppet SUMO enzymer som används i SUMOylation in vitro- analys. (A) p53 SUMOylation utvärderades i en in vitro- SUMOylation analysmetod som ingår en halv och en femte mängden Ubc9 enzym som används i standardprotokoll. Efter 3 timmar av in vitro- SUMOylation reaktion, SUMOylated p53 enzymer undersöktes genom Western blot med anti-p53 antikropp. (B) In vitro SUMOylation av p53 analyserades ytterligare genom att använda hälften av E1 enzym i kombination med en tiondel mängden Ubc9 som används i standardprotokoll. En Western blot utfördes som beskrivs i (A). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Förbättring av p53 SUMOylation av SUMO E3 ligase K-bZIP. (A) renat baculoviridae-uttryckta K-bZIP protein, analyseras av SDS-PAGE följt med Coomassie blå färgning. 1 µg BSA och 10 µL renas K-bZIP laddar för jämförande protein kvantiteten. (B) K-bZIP enhanced p53 SUMOylation utvärderades med hjälp av ett in vitro- SUMOylation reaktion med hälften av E1 enzym och en tiondel beloppet av Ubc9 rekommenderar i standardprotokollet. SUMOylated p53 undersöktes genom Western blot som beskrivs i figur 1A. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I in vitro- SUMOylation-protokollet som beskrivs här används rutinmässigt att etablera SUMOylation status identifierade Ubc9 substrat. Den största begränsningen använda standardprotokollet för att studera funktionen SUMOylation av SUMO E3 ligase är överflödet av aktivering av SUMO E1 och E2 konjugera enzymer Ubc9 som maximerar SUMO konjugationen i in vitro- system. Med tanke på denna utmaning tror vi att titrering av SUMO E1 och E2 enzymer till nivån att man knappt kan upptäcka sin verksamhet i SUMOylation finns de bara sätt att bestämma SUMO E3 ligase katalytisk verksamhet använder denna in vitro SUMOylation system. Efter denna hypotes, vi framgångsrikt klarlagd E3 ligase aktiviteten av K-bZIP och identifieras den som en roman SUMO E3-ligase med specificitet mot SUMO-2/3.
Det kritiska steget inom protokollet är införlivandet av lägre mängder av E1 och E2. Hjälp dessa lägre belopp, som visas i figur 2, roman SUMO E3 ligases med låg ligase aktivitet kan kunna identifieras med bevarandet av deras specificitet mot substrat och SUMO paralogues. En stor begränsning av tekniken är kravet på en hög kvalitet antikropp erkänner SUMO substratet, eftersom endast en mycket liten del av substrat kan vara SUMO modified.
Men många proteiner visar potential att öka SUMOylation efter överuttryck i vivo, måste definiera en SUMO E3-ligase påvisas genom en färdigberedd in vitro- SUMOylation system med renade enzymer som E1, E2 och E3. I motsats till hundratals och kanske tusentals ubiquitin E3 ligases identifieras, tills nu har endast några SUMO E3 ligases hittats. Detta kan bero delvis på användningen av traditionell standard in vitro- SUMOylation analysen vilket maximerar SUMO konjugation effektivitet och därmed hindrar potentiella SUMO E3 ligases SUMOylation funktion. Protokolls beskriver en enkel och konsekvent analys för att undersöka SUMOylation förbättras genom en SUMO E3-ligase. Den beskrivna metoden är viktigt för identifiering och karakterisering av nya SUMO E3 ligases.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna avslöja inga potentiella intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av bidrag från ministeriet för vetenskap och teknik (mest, 105-2320-B-010-007-MY3 till PCC), från den nationella Health Research Institute (NHRI-EX105-10215BC till PCC), från ministeriet för vetenskap och teknik (mest 105-2314-B-400-019 till HJK) och från the National Health Research Institute (NHRI MG-105-SP-10, NHRI MG-106-SP-10 till HJK). Detta arbete stöddes också delvis med National Yang-Ming University på manuskriptet publikationen till PCC. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut om att offentliggöra eller reparation av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pFastBac | Invitrogen | 10359-016 | dual expression baculovirus vector |
| pCR2.1-TOPO vector | Invitrogen | PCR product vector | |
| competent cell E. coli DH5α | Yeastern Biotech | FYE678-80VL | competent E. coli cells A |
| E. coli DH10Bac | Invitrogen | 10359-016 | competent E. coli cells B |
| FugeneHD | Roche | 04709705001 | transfection reagent |
| Opti-MEM | Gibco | 31985062 | reduced serum media |
| T4 Ligase | NEW England BioLabs | M0202S | |
| CpoI (RsrII) | Thermo Scientific | ER0741 | |
| Bluo-gal | Thermo Scientific | B1690 | galactosidase substrate |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| Grace’s Insect Medium | Gibco | 11605094 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10082147 | |
| Gentamicin | Thermo Fisher | 15750060 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393-25G | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | K0254-20ML | |
| gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| tetracyclin | Sigma-Aldrich | 87128-25G | |
| LB Broth | Merk | 1.10285.0500 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-100G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888-5KG | |
| KCl | Merk | 1.04936.1000 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136-500G | |
| KH2PO4 | J.T.Baker | 3246-01 | |
| sodium dodecyl sulfate | Merk | 1.13760.1000 | |
| β-mercaptoethanol | Bio-Rad | 161-0710 | |
| TRIS (Base) | J.T.Baker | 4109-06 | |
| Non-fat milk | Fonterra | ||
| glycerol | J.T.Baker | 2136-01 | |
| Triton X-100 | Amresco | 0694-1L | detergent A |
| Tween 20 | Amresco | 0777-500ML | detergent B |
| Poloxamer 188 solution | Sigma-Aldrich | P5556-100ML | detergent C |
| Protease Inhibitor Cocktail Tablet | Roche | 04 693 132 001 | |
| 3x Flag peptide | Sigma | F4799 | |
| anti-FLAG m2 Magnetic beads | Sigma-Aldrich | M8823 | antibody-tagged magnetic beads |
| SUMOlink SUMO-1 Kit | Active Motif | 40120 | standard SUMOylation protocol |
| SUMOlink SUMO-2/3 Kit | Active Motif | 40220 | standard SUMOylation protocol |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
| QIAGEN Plasmid Mini Kit | QIAGEN | 12123 | plasmid extraction kit |
| Polypropylene tubes | Falcon | 352059 | |
| Petri Dish | Falcon | 351029 | |
| Cell lifter | Corning | CNG3008 | |
| Loading tip | Sorenson BioScience | 28480 | |
| PVDF | PerkinElmer | NEF1002 | |
| Blotting filter paper | Bio-Rad | 1703932 | |
| Mini slab gel apparatus (Bio-Rad Mini Protean II Cell) | Bio-Rad | 1658001 EDU | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell | Bio-Rad | 1703940 | |
| Pierce ECL Western Blotting | Thermo | 32106 | ECL reagent |
| suspension mixer | Digisystem laboratory instruments Inc. | SM-3000 | |
| orbital shaker | Kansin instruments Co. | OS701 | |
| ImageQuant LAS 4000 biomolecular imager |
GE Healthcare | 28955810 | |
| Sf9 | Thermo Scientific | B82501 | |
| anti-p53 antibody | Cell Signaling | #9282 | |
| anti-rabbit antibody | GE Healthcare | NA934-1ML |
References
- Bies, J., Markus, J., Wolff, L. Covalent attachment of the SUMO-1 protein to the negative regulatory domain of the c-Myb transcription factor modifies its stability and transactivation capacity. J Biol Chem. 277 (11), 8999-9009 (2002).
- Lin, D. Y., et al. Role of SUMO-interacting motif in Daxx SUMO modification, subnuclear localization, and repression of sumoylated transcription factors. Mol Cell. 24 (3), 341-354 (2006).
- Welsh, M., Jamalpour, M., Zang, G., Akerblom, B. The role of the Src Homology-2 domain containing protein B (SHB) in beta cells. J Mol Endocrinol. 56 (1), 21-31 (2016).
- Huang, W. Q., et al. Structure, function, and pathogenesis of SHP2 in developmental disorders and tumorigenesis. Curr Cancer Drug Targets. 14 (6), 567-588 (2014).
- Perry, J. J., Tainer, J. A., Boddy, M. N. A SIM-ultaneous role for SUMO and ubiquitin. Trends Biochem Sci. 33 (5), 201-208 (2008).
- Sun, H., Leverson, J. D., Hunter, T. Conserved function of RNF4 family proteins in eukaryotes: targeting a ubiquitin ligase to SUMOylated proteins. EMBO J. 26 (18), 4102-4112 (2007).
- Ouyang, J., Shi, Y., Valin, A., Xuan, Y., Gill, G. Direct binding of CoREST1 to SUMO-2/3 contributes to gene-specific repression by the LSD1/CoREST1/HDAC complex. Mol Cell. 34 (2), 145-154 (2009).
- Lyst, M. J., Stancheva, I. A role for SUMO modification in transcriptional repression and activation. Biochem Soc Trans. 35, Pt 6 1389-1392 (2007).
- Liu, H. W., et al. Chromatin modification by SUMO-1 stimulates the promoters of translation machinery genes. Nucleic Acids Res. 40 (20), 10172-10186 (2012).
- Rosonina, E., Duncan, S. M., Manley, J. L. SUMO functions in constitutive transcription and during activation of inducible genes in yeast. Genes Dev. 24 (12), 1242-1252 (2010).
- Chang, P. C., et al. The chromatin modification by SUMO-2/3 but not SUMO-1 prevents the epigenetic activation of key immune-related genes during Kaposi's sarcoma associated herpesvirus reactivation. BMC Genomics. 14, 824 (2013).
- Neyret-Kahn, H., et al. Sumoylation at chromatin governs coordinated repression of a transcriptional program essential for cell growth and proliferation. Genome Res. 23 (10), 1563-1579 (2013).
- Tatham, M. H., et al. Polymeric chains of SUMO-2 and SUMO-3 are conjugated to protein substrates by SAE1/SAE2 and Ubc9. J Biol Chem. 276 (38), 35368-35374 (2001).
- Mattoscio, D., Segre, C. V., Chiocca, S. Viral manipulation of cellular protein conjugation pathways: The SUMO lesson. World J Virol. 2 (2), 79-90 (2013).
- Gareau, J. R., Lima, C. D. The SUMO pathway: emerging mechanisms that shape specificity, conjugation and recognition. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (12), 861-871 (2010).
- Bernier-Villamor, V., Sampson, D. A., Matunis, M. J., Lima, C. D. Structural basis for E2-mediated SUMO conjugation revealed by a complex between ubiquitin-conjugating enzyme Ubc9 and RanGAP1. Cell. 108 (3), 345-356 (2002).
- Knipscheer, P., et al. Ubc9 sumoylation regulates SUMO target discrimination. Mol Cell. 31 (3), 371-382 (2008).
- Vethantham, V., Manley, J. L. In vitro sumoylation of recombinant proteins and subsequent purification for use in enzymatic assays. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (1), 5121 (2009).
- Lin, S. F., Robinson, D. R., Miller, G., Kung, H. J. Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus encodes a bZIP protein with homology to BZLF1 of Epstein-Barr virus. J Virol. 73 (3), 1909-1917 (1999).
- Yang, W. S., Hsu, H. W., Campbell, M., Cheng, C. Y., Chang, P. C. K-bZIP Mediated SUMO-2/3 Specific Modification on the KSHV Genome Negatively Regulates Lytic Gene Expression and Viral Reactivation. PLoS Pathog. 11 (7), 1005051 (2015).
- Connor, C. D., Metcalf, E., Wrighton, C. J., Harris, T. J., Saunders, J. R. RsrII--a novel restriction endonuclease with a heptanucleotide recognition site. Nucleic Acids Res. 12 (17), 6701-6708 (1984).
- Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. Analysis of endonuclease R-EcoRI fragments of DNA from lambdoid bacteriophages and other viruses by agarose-gel electrophoresis. J Virol. 14 (5), 1235-1244 (1974).
- Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D'Ari, R. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth. J Bacteriol. 189 (23), 8746-8749 (2007).
- Gingold, E. B. Bacterial transformation. Methods Mol Biol. 2, 237-240 (1985).
- Brulois, K. F., et al. Construction and manipulation of a new Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus bacterial artificial chromosome clone. J Virol. 86 (18), 9708-9720 (2012).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Ahmed, S., Holt, M., Riedel, D., Jahn, R. Small-scale isolation of synaptic vesicles from mammalian brain. Nat Protoc. 8 (5), 998-1009 (2013).
