Summary
Ubikuitin ligazlar, birkaç E3 SUMO ligazlar tespit edilmiştir. Bu değiştirilmiş vitro SUMOylation Protokolü roman SUMO E3 ligazlar bir vitro sulandırma tahlil tarafından tespit edebilmek.
Abstract
Küçük Ubikuitin benzeri değiştirici (SUMO) değişiklik öncelikle protein-protein etkileşimleri oransal aracılığıyla sinyal iletimi aracılık eder önemli bir translasyonel modifikasyon (PTM) olduğunu. Ubikuitin değişikliklere benzer, SUMOylation enzim (SAE1/SAE2) E1 etkinleştirme, E2-konjugasyon enzim (Ubc9) ve E3-ligaz (Yani, PIA aile, RanBP2 ve Pc2) gibi bir sıralı enzim çağlayan tarafından yönlendirilir. Ama tepki değil ancak, ubiquitination, bir E3 ligaz gerekli olmayan farklıdır SUMO konjugasyon için hassas ve etkinliği sağlamak. SUMOylation tarafından modifiye proteinleri vivo içinde tahlil immunoprecipitation üzerinden substrat özel antikorlar ve immunoblotting SUMO özel antikorlar ile belirlenebilir. Ancak, protein SUMO E3 ligaz faaliyet gösteri arıtılmış enzim, substrat ve SUMO proteinler kullanarak SUMOylation deneyleri in vitro sulandırma gerektirir. Vitro reaksiyonlar genellikle SAE1/SAE2 ve Ubc9, yalnız SUMO konjugasyon için yeterli olduğundan, SUMOylation geliştirme sözde E3 ligaz tarafından her zaman tespit etmek kolay değildir. Burada, bir değiştirilmiş vitro sürekli olarak yeniden düzenlendi vitro sistemini kullanarak SUMO değişiklik tanımlar SUMOylation Protokolü açıklar. Catalytically etkin K-bZIP, viral bir SUMO-2/3 E3 ligaz arındırmak için adım adım bir protokol de sunulmaktadır. Arıtılmış K bZIP SUMOylation faaliyetlerinin p53, SUMO tanınmış bir hedef gösterilir. Bu protokolü yalnızca roman SUMO E3 ligazlar elucidating için aynı zamanda SUMO paralog olmalarından ifşa için istihdam edilebilir değil.
Introduction
SUMO değişiklik başlangıçta protein istikrar1düzenleyen bir tersinir translasyonel modifikasyon (PTM) tespit edilmiştir. Doğrudan fiil ek olarak SUMO Ayrıca bir protein kovalent olmayan etkileşimi aracılığıyla SUMO etkileşim motifleri (SIMs)2tarafından eklenebilir. Src homoloji 2 (SH2) barındıran moleküller tarafından tyrosyl fosforilasyon bağlama veya phosphotyrosine bağlama benzer (PTB) etki alanları3,4, SUMO değişiklik için bir ek etkileşim platformu sağlar seçici İşe Alım SIM içeren efektör proteinler5,6. Ek olarak, düzenleme, sinyal iletimi, SUMOylation molekülleri remodeling Kromatin ve transkripsiyon faktörlerinin gen ifade7,8modüle için hizmet vermektedir. Genom-wide SUMOylation desen çalışmaları SUMO değişiklik olumlu9,10 ya da negatif10,11,12 transkripsiyonu ile ilişkili olduğunu ortaya koymuştur yönetmelik, SUMOylation paralogue özgüllüğü nedeniyle kısmen.
Orada üç büyük SUMO izoformlarının hediye memeli hücrelerinde conjugating protein için; Bu SUMO-1 ve son derece homolog SUMO-2 ve SUMO-3 (SUMO-2/3 adlandırılır)13içerir. SUMO genellikle hedef protein ψKxD/E uzlaşma motifi içinde lizin (K) kalıntı için Birleşik. SUMO E3 ligazlar SIM'de paralogue özgüllük14için sorumludur. E3 ligazlar yüzlerce içeren ubiquitination yolları aksine sadece birkaç SUMO E3 tespit ligazlar15olmuştur. SUMO E3 ligazlar (i) Ubc9 bağlama, bağlama (II) SUMO yan SIM etki alanı ve (III) Ubc9 SUMO transfer substrat üzerine geliştirmek amacıyla yeteneklerini de dahil olmak üzere özellikleri tanımlanır. E3 ligaz SUMO konjugasyon16için kesinlikle gerekli değildir, ancak substrat ve SUMO-paralogue özgüllük sağlar. Beri genellikle Toplam yüzey proteini küçük bir kısmını SUMO-modified, sadece SUMOylated proteinler vivo içinde tespiti her zaman bir meydan okuma olduğunu. Bu nedenle, doğru ve tekrarlanabilir deneyleri SUMO değişiklik hassas işlev aydınlatmak için gereklidir.
Vitro saf Ubc9 SUMOylation substrat proteinlerin katalizler yeteneğini değerlendirir, SUMOylation tahlil SUMO değişiklik17eğitim için iyi kabul edilen bir tahlil olduğunu. Ancak, çoğu durumda SUMO E3 ligaz aktivite tespit edilemez veya sadece mutasyona uğramış SUMO ligaz ile yüksek SUMO E3 ligaz aktivite ve düşük substrat özgüllüğü ile standart iletişim kuralı tarafından Ubc918 bol miktarda varlığı nedeniyle tespit edilebilir . Bu tahlil genel başarısı büyük ölçüde saf Ubc9 dikkatli titrasyon bağlıdır. Burada anlatılan vitro SUMOylation tahlil standart bir SUMOylation değiştirilir ( Tablo malzemelerigörmek) protokol. Kaposi sarkomu ilişkili herpesvirus (KSHV) yeniden etkinleştirme sırasında artan küresel SUMO değişikliği gözlenmesi bize SUMOylation up-yönetmelik için sorumlu olabilir viral SUMO E3 ligaz tanımlamak için istenir. Viral SUMO E3 ligaz K-bZIP etkileşen proteinler küçük ölçekli Gösterimin ardından, p53 roman bir substrat tespit edilmiştir. Bu protokol için ayrıntılı böcek hücreleri ifade ve vahşi-türü K-bZIP, viral bir SUMO E3 ligaz SUMO-2/3 özgüllük ile arınma adımları yer olarak gösteriyoruz. P53, iyi bilinen bir SUMO substrat SUMOylation geliştirmek için saflaştırılmış K bZIP yeteneği E1 ve E2 enzimler azaltılmış miktarda huzurunda değerlendirilir. Bu değiştirilmiş SUMOylation tahlil kullanarak, araştırmacılar güvenilir SUMO E3 ligaz yeteneklerini SUMOylate roman ya da bilinen yüzeylerde, hangi bir protein SUMOylation çalışmanın birincil adımdır tanımlayabilirsiniz. Ayrıca, bu yöntem düşük ligaz aktivite ama yüksek substrat özgüllüğü ile roman SUMO E3 ligazlar tanımlamaya yardım eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. hazırlanması Baculovirus ifade oluşturur
-
Bir çift ifade baculovirus vektör K-bZIP19 cDNA klonlama tarafından SUMO E3 ligaz K-bZIP arındırmak (tablo malzemeleri görmek) bir N-terminal epitope-etiketi ile. (İletişim kuralı olarak vektör-etiket-K-bZIP boyunca gösterilen) octapeptide etiketini kullanarak bir başarı olmuştur.
Not: K-bZIP Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) klonlama DNA cDNA ters gelen Doksisiklin tedavi20takip TREx F3H3-K-Rta BCBL-1 hücrelerden izole RNA transkripsiyonu şablonudur.- Tam uzunlukta K-bZIP cDNA19 ben siteleri klonlama Cpoile çift ifade vektör içine aktarın. CPO PCR ürünü ve çift ifade vektör 3 h2137 ° C'de 1 µg sindirmek.
- Elektroforez bir % 0,8 özel jel22tarihinde takip sindirilir DNA ayıklamak ve ayrı. Ekle (K-bZIP) ligate ve vektör T4 DNA ligaz için üreticinin yönergelerine uygun 30 dk 16 ° C'de tarafından (bkz. Tablo malzeme).
- 5 µL eklemek yetkili E. coli ligasyonu DNA için 50 µL olan bir 1,5 mL tüp içinde "A" (bakınız Tablo reçetesi) hücreleri. 30 dk için buza koy. Sonra bir 42 ° C su banyosunda 45 için 1,5 mL tüp kuluçkaya s ve hemen 3 dakika buzda Tüpü yerleştirmek.
- 600 µL S.O.C. orta (%0,5 (w/v) Maya ekstresi, %2 (w/v) tryptone, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 20 mM MgSO4ve % 4 (w/v) glikoz) tüpün içine ekleyin ve 1 h için 37 ° C'de kuluçkaya. O zaman, tüp 600 x g de 3 dakika oda sıcaklığında santrifüj kapasitesi.
- Süpernatant kaldırmak, pelet 60 µL Luria-Bertani orta ile resuspend (LB; %1 (w/v) tryptone, % 0,5 (w/v) Maya özü ve 85 mM NaCl) ve 100 µg/mL Ampisilin içeren LB agar plakaları yaymak. Agar plaka 16 h23,2437 ° C'de kuluçkaya.
- 5 mL LB orta 100 µg/mL Ampisilin ve kültür için 16 h 37 ° C'de 250 sallayarak d / içeren aşılamak için 1 koloni seçin. Sonra bir plazmid ekstraksiyon kiti üreticinin yönergelerine uygun olarak plazmid, vektör-etiket-K-bZIP, özü ( Tablo malzemelerigörmek).
-
Yetkili E. coli içine vektör-etiket-K-bZIP dönüşüm tarafından etiket-K-bZIP yataklık rekombinant bacmid oluşturmak (bkz. tablo reçetesi) hücreleri "B".
- Mix 0.2 µg vektör-etiket-K-bZIP Plazmid ve 100 µL yetkili E. coli hücreleri "B" bir 1,5 mL tüp ve 30 dakika süreyle koymak üzerinde buz kuluçkaya tüp 42 ° C su banyosunda 45 için s ve hemen 3 dakika buzda Tüpü yerleştirmek.
- S.O.C. orta 900 µL tüpün içine ekleyin ve 50 RPM döndürme için 4 h 37 ° C'de kuluçkaya. Daha sonra orta 10 µL al, S.O.C orta 50 µg/mL sefaloridin, 7 µg/mL gentamisin, 10 µg/mL tetrasiklin, 100 µg/mL galaktozidaz substrat ve 40 µg/mL izopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG içeren LB agar Tabaklarda yaymak için ek bir 50 µL Ekle ) ve tabaklar 37 ° C'de 48 h için kuluçkaya
- 5 mL LB orta 50 µg/mL sefaloridin, 7 µg/mL gentamisin ve 10 µg/mL tetrasiklin içeren bir beyaz kolonisi aşılamak. 250 için 16 h sallayarak rpm ile 37 ° C'de kuluçkaya.
- Rekombinant bacmid etiket-K-bZIP barındıran DNA izole etmek, ölçmek ve 1 µg/µL25bir konsantrasyon yeniden askıya alma.
-
Rekombinant baculoviruses etiket-K-bZIP rekombinant bacmid 6-şey plaka bir iyi Sf9 hücrelere etiket-K-bZIP içeren DNA transfecting 1 µg tarafından ifade oluşturur.
- (Bkz. Tablo reçetesi) tohum 2 x 106 Sf9 hücrelerde 2 mL Grace'in böcek % 10 fetal sığır serum (FBS) ve her %1 gentamisin ile birlikte orta bir 6 iyi tabak o zaman için 1 h 27 ° C'de kuluçkaya.
- Grace'in böcek %10 FBS, % 1 gentamisin ve % 1 deterjan C ile birlikte orta hücrelerde Sf9 günlük faz kültürünü korumak ( Tablo malzemelerigörmek) 140 devirde yörünge süspansiyon 27 ° C'de. Bir hemasitometre ve trypan mavi boyama kullanarak hücreleri saymak; hücre canlılığı % 95 fazla olmamalıdır. (En az yoğunluk ~0.5 x 106 hücre/mL) 2-3 günde bir subcultivation oranı 1:3 kullanarak hücreleri korumak.
- 2 µL bacmid DNA ekleyin (1 µg/µL) ve 98 µL düşük serum medya (bkz. Tablo reçetesi) 2 mL tüp içine. Daha sonra 4 µL transfection reaktif ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek) tüp ve mix iyi. 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.
- Bu transfection karışımı (104 µL) her kuyunun içine ekleyin ve 12-16 saat 27 ° C'de kuluçkaya.
- Nazik aspirasyon ile yorgun medyayı çıkarın ve 2 mL taze Grace'in böcek % 10 FBS ve % 1 gentamisin ile sağlanan orta yerine. Sf9 hücreler gevşek plaka yüzeyine uygun ve nazik aspirasyon ile rahatsız edilmek istemiyorum.
-
Rekombinant baculovirus transfection sonra toplamak ve yüksek-titresi stokları (P1) daha fazla deneyler için elde etmek için baculovirus yükseltmek.
- Orta, scrape Sf9 hücreleri steril hücre lifter kullanarak değiştirdikten sonra 72 h toplamak süpernatant 1,5 mL tüp ve girdap 10 için tek tek her kuyudan s.
- 150 x g., 3 dk 4 ° C'de toplamak süpernatant P0 baculovirus ve aliquot 1,5 mL tüpler (her tüpün içinde 1 mL baculovirus) olarak santrifüj kapasitesi. Mağaza-80 ° C'de
- Tohum 1 x 107 Sf9 10 mL Grace'in böcek orta hücrelerde 10 cm Petri kabına %10 FBS ve % 1 gentamisin ile sağlanan ve 1 h için 27 ° C'de kuluçkaya.
- Rekombinant baculoviruses ifade tag-K-bZIP amplifikasyon, 0.5 mL P0 baculovirus numaralı seribaşı Sf9 hücrelere ekleme ve 48 h 27 ° C'de kuluçkaya.
- Süpernatant P1 baculovirus 15 mL tüp ve store 4 ° c ilâ 1 ay boyunca toplamak gibi.
2. K-bZIP saflaştırılması
- Grace'in böcek 1.3.2. adımda açıklandığı gibi %10 FBS, % 1 gentamisin ve 140 devirde yörünge süspansiyon 27 ° C'de % 1 deterjan C ile birlikte orta hücrelerde Sf9 günlük faz kültürünü korumak.
- İletim günü, yoğunluklu olarak 2 x 106 hücre/mL 250 mL Sf9 hücre içine baculovirus içeren süpernatant (P1) 1 mL ekleyin.
- Sf9 hücreler için bir orbital Çalkalayıcı üzerinde 27 ° C'de 72 h 140 sallayarak d / kuluçkaya sonra Santrifüjü 2,740 x g 4 ° C'de 15 dakika de tarafından toplamak
- Süpernatant kaldırmak ve hücre topakları içinde 10 mL lizis tampon (20 mM HEPES pH 7.9, 0.5 M NaCl, % 1 deterjan (bakınız Tablo malzemeler), % 2 gliserol, proteaz inhibitörü kokteyl) koşullar ve Döndür'ün 50 RPM bir süspansiyon karıştırıcı 4 ° C'de 30 dk için kullanma.
- Santrifüj hücre süpernatant toplamak 15 dak için 15.000 x g de lysate.
- Etiket-K-bZIP arındırmak için hücre lysates (10 mL) ile antikor öğesini manyetik boncuklar 14 mL polipropilen borular içinde 50 µL kuluçkaya ve süspansiyon Mikser kullanarak 4 ° C'de 3 h için 50 RPM döndürün. Protein yakalama, takip cips boncuk 800 g aralıklarla 30 x 4 ° C'de s Boncuk yaklaşık 1 mL kalan hacmi yeniden askıya alma ve 1,5 mL tüp yıkama için transfer süpernatant çoğunu çıkarın.
- Manyetik bir stand üstündeki içeren tüp yerleştirerek yakalanan protein yıkama ve manyetik boncuklar tamamen tüp tarafına yapıştırılır bir kez süpernatant kaldırın.
-
Boncuk lizis arabelleği ile dört kez yıkayın.
- 1 mL lizis arabellek 1,5 mL tüpler içine ekleyin ve tüpler 10 kez tersine çevirin. 1.5 mL tüp manyetik bir stand üzerine yerleştirin ve süpernatant 2.7 içinde konusunda açıklanan şekilde kaldırın.
- Önceki adımı başka bir 3 kez tekrarlayın.
-
Boncuk fosfat tamponlu tuz (PBS) ile bir kez yıkayın.
- 1 mL PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1.5 mM KH2PO4) 1,5 mL tüpler içine ekleyin ve tüpler 10 kez tersine çevirin.
- 1.5 mL tüp manyetik bir mahkemeye ve süpernatant kaldır.
- Antikor öğesini manyetik boncuklar etiket-K-bZIP protein 1.5 mL tüp içine PBS içinde seyreltilmiş 150 µg/mL octapeptide 100 µL ekleyerek elute. Süspansiyon karıştırıcı oda sıcaklığında tarafından 10 dk 50 RPM için tüp döndürün. O zaman, tüp manyetik kürsüye yerleştirin ve K bZIP içeren süpernatant temiz 1.5 mL tüp içinde toplamak.
- 1-5 saf µL etiket-K-bZIP protein SDS-sayfa26boyama Coomassie mavi tarafından takip tarafından analiz. Yük 2 µg, 1 µg ve sığır serum albumin (BSA) aynı 0,5 µg örnekleri jel ve ImageJ gibi bir görüntü işleme programında miktar için kullanabilirsiniz. K-bZIP konsantrasyon kıyasla BSA standartlara uygun tahmin ediyoruz.
- Arıtılmış K bZIP artık her SUMOylation assay olarak kullanılmak üzere hazırdır. K-bZIP PBS içinde 100 ng/µL ve küçük aliquots-80 ° C'de deposunda son bir konsantrasyon sulandırmak
3. SUMOylation tahlil
- 100 ng/µL arıtılmış etiket-K-bZIP 3 µL her vitro SUMOylation reaksiyon ana karışımı içine ekleyin. Ana karışımında bileşenleri içeren 1 µL protein arabellek, 1 SUMOylation arabellek, 0.5 µL p53 proteini (0,5 mg/mL), 25 x enzimi aktive nM E1 (hisse senedi konsantrasyonlu: 1 µM), 50 enzim conjugating nM E2 (hisse senedi konsantrasyonlu: 10 µM) ve 250 her SUMO peptidler (SUMO-1 nM , SUMO-2 veya SUMO-3; hisse senedi konsantrasyonlu: 5 mikron) 17 µL son hacmi için.
- İçeriği hafifçe karıştırın ve 2 SDS-sayfa yükleme arabellek x 20 µL ekleyerek tepki 3 h. durdurmak için 30 ° C'de tepki kuluçkaya (100 mM Tris-HCL pH 6.8, % 4 Sodyum Lauryl Sülfat, %0,2 (w/v) bromophenol mavi, %20 (v/v) gliserol ve 200 mM β-mercaptoethanol) ve 95 ° c 5 min için örnekleri denatüre.
-
SDS-sayfasında, ayrı örnekleri elektroforetik transfer yarı kuru cihazlar kullanarak ayrılmış proteinlerin PVDF membran üzerine aktarmak ve Western blot tarafından anti-p53 antikor kullanarak analiz.
- Jel aparatı adım 2.11 olduğu gibi ayarlayın ve örnek 20 µL jel kuyu yükleyin.
- (Alt jel boya bant ulaşıncaya kadar) % 10 jel yaklaşık 120 dk 80 V geçerli bir sabit çalıştırın. Elektroforez tamamlanmasından sonra güç kaynağını kapatmak.
- Jel aparatı ve jel çekmek için jel kaset kesin ve jel yarı kuru Aktarım arabellek (48 mM Tris-HCl, 39 mM glisin, % 20 metanol) 5 min için içine float.
- Başka bir kabı alın ve PVDF membran metanol için 1 dk içinde ıslatın. Sonra PVDF metanol dışarı almak ve yarı kuru Aktarım arabellek koydu. Yavaşça membran 5 min için tahrik.
- Yarı kuru elektroforetik cihaz Emanet kapağını çıkarın.
- Önceden filtre kağıdı ıslak ve jel alt Platin anot üzerinde aşağıdaki gibi sandviç: filtre kağıdı, PVDF membran, jel ve filtre kağıdı.
- O zaman leke 15 V sabit 90 dk. çevirmek için geçerli güç kaynağını, koşmak güvenli katot plaka ve güvenlik kapağı, yarı kuru cihazlar bağlantısını kesin ve PVDF membran almak.
- Blok PVDF membran ile engelleme arabellek (%5 yağsız süt TBST tampon (137 mM NaCl2, 20 mM Tris-HCl, % 0,1 deterjan B (bakınız Tablo malzemeler), pH 7,6)), oda sıcaklığında 30 tarafından orbital Çalkalayıcı sallayarak devir/dakika ile 1 saat için.
- PVDF membran ile seyreltilmiş anti-p53 antikor (1:1, 000) 12-16 saat 4 ° C'de için engelleme arabellekte bir süspansiyon Mikser kullanarak 30 rpm sallayarak ile melez.
- PVDF membran bir kaba alıp TBST içinde koy. PVDF membran TBST iki kez daha fazla ile yıkayın.
- PVDF membran TBST içinde 45 RPM tarafından orbital Çalkalayıcı sallayarak için 30 dk bekletin.
- PVDF membran seyreltilmiş horseradish peroksidaz ile (HRP) Birleşik Anti-tavşan antikor ile (1:4, 000) 30 bir süspansiyon Mikser kullanarak sallayarak d / oda sıcaklığında 1 h için engelleme arabellekte melezlemek.
- PVDF membran 3.4.10 adımda anlatıldığı gibi TBST 3 kez ile yıkayın.
- PVDF membran TBST içinde 45 rpm ile sallayarak bir süspansiyon Mikser kullanarak için 30 dk bekletin. TBST kaldırın ve PVDF membran en fazla 12 saat için 4 ° C'de korumak için PBS ekleyin.
- Gelişmiş chemiluminescent substrat (ECL substrat) Reaktif 1 ve 2 (1:1) ( Tablo malzemelerigörmek) karıştırın. PVDF membran PBS kaldırmak, kısaca bir kağıt havlu veya aşırı nem emme ve hemen eklemek 400 µL ECL reaktif 3-5 dk. Kaldır aşırı ECL reaktif için her membran yüzeyine kısaca Blot tarafından ışık görev silecek ile leke ama m izin verme embrane için tamamen kuru.
- Bir ışıldama görüntüleme sistemi veya autoradiography film27kullanarak leke ortaya çıkarmak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Üretici tarafından sağlanan bilgilere göre E1 ve E2 enzim SUMOylation tahlil standart miktarı 50 şey nM ve 500 nM, anılan sıraya göre. E2 en az miktarda enzim SUMOylate p53 yapabiliyor Ubc9 conjugating ilk bir vitro SUMOylation tahlil tarafından tespit edilmiştir. Beşte biri Ubc9 standart vitro SUMOylation tahlil protokolü kullanılan miktarı verimli bir şekilde SUMOylate p53 için mümkün olduğu kadar düşük (şekil 1A). Bu nedenle, E1 enzim birlikte miktarı-onda biri standart iletişim kuralında kullanılan Ubc9 miktarı ile yarısını başka bir vitro SUMOylation tahlil için kullanıldı. SUMOylation verimlilik önemli bir azalma ile karşılaştırıldığında standart Protokolü (şekil 1B) gözlenmiştir.
Böylece, SUMO E3 ligaz K-bZIP SUMOylation istimal bunlar belirlendi p53 geliştirmek yeteneği vitro SUMOylation koşulları değiştiren. Tagged K-bZIP Sf9 hücrelerden (Şekil 2A) saf E1 ve E2 Ubc9 enzimler daha düşük miktarlarda içeren bir SUMOylation tepki olarak istihdam edildi. Değiştirilen bu koşullar altında K-bZIP verimli p53 SUMOylation katalizler (Şekil 2B). Immunoblotting anti-p53 antikor ile p53 her tepki benzer toplam miktarda doğruladı ve ayrıca algılanan SUMO p53 değiştirilebilir.
Resim 1 : SUMO enzimler vitro SUMOylation assay olarak kullanılan en az miktarı tayini. (A)p53 SUMOylation yarım ve bir beşinci standart iletişim kuralında kullanılan Ubc9 enzim miktarı dahil bir vitro SUMOylation tahlil içinde değerlendirilmiştir. Vitro SUMOylation tepki 3 saat sonra SUMOylated p53 enzimler tarafından Western incelenmiş leke anti-p53 antikor ile. (B) vitro SUMOylation p53, daha fazla onda biri standart iletişim kuralında kullanılan Ubc9 miktarı ile birlikte yarım miktar E1 enzim kullanarak analiz edildi. Bir Western blot (Aolduğu gibi) açıklandığı gibi gerçekleştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : P53 SUMOylation SUMO E3 ligaz K-bZIP tarafından geliştirme. (A)K-bZIP protein baculovirus ifade tarafından incelendi SDS-sayfa Coomassie mavi boyama ile takip, saf. 1 µg BSA ve 10 µL saf K-bZIP karşılaştırmalı için protein miktarı yükleme. (B) K-bZIP SUMOylation vitro SUMOylation reaksiyon E1 enzim yarı miktarda ve onda Ubc9 tavsiye miktarı standart protokolü kullanarak değerlendirildiğinde p53 gelişmiş. SUMOylated p53 şekil 1içindeAaçıklandığı gibi Western blot tarafından soruşturma. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vitro burada açıklanan SUMOylation Protokolü rutin olarak tanımlanan Ubc9 yüzeylerde SUMOylation durumunu kurmak için kullanılır. SUMO E3 ligaz SUMOylation işlevinin çalışması için standart protokolü kullanarak büyük kısıtlamadır SUMO E1 etkinleştirme ve SUMO konjugasyon vitro sistemlerinde en yüksek düzeye E2 conjugating enzimler Ubc9 bereket. Bu meydan okuma göz önüne alındığında, bu titrasyon düzeye SUMO E1 ve E2 enzim miktarının bir zar zor faaliyetlerini SUMOylation yılında sadece yol bu içinde vitro kullanarak SUMO E3 ligaz katalitik etkinlikleri belirlemek kullanılabilir algılayabilir inanıyoruz SUMOylation sistemi. Bu hipotez, biz başarıyla E3 ligaz etkinliği K-bZIP ile aydınlatılmamıştır ve SUMO-2/3 doğru özgüllük ile bir roman SUMO E3 ligaz tanımlanan.
İletişim kuralına kritik adım daha düşük miktarda E1 ve E2 birleşme olduğunu. Bu daha düşük miktarlar, Şekil 2' de, roman SUMO E3 ligazlar düşük ligaz aktivite ile gösterildiği gibi kullanarak olmalarından substrat ve SUMO paralogues karşı korunması ile tespit edilmesi mümkün olabilir. Bir büyük teknik substrat sadece çok küçük bir oranda değiştiren SUMO olabilir bu yana SUMO substrat tanıma bir yüksek kaliteli antikor gereksinimini kısıtlamasıdır.
Çoğu protein SUMOylation sonra overexpression in vivoartırmak için potansiyel göstermek rağmen SUMO E3 ligaz tanımlama arıtılmış E1, E2, E3 ve enzimler kullanarak Sulandırılan vitro SUMOylation sistem tarafından gösterilmelidir. Ve belki de yüzbinlerce tespit Ubikuitin E3 ligazlar aksine, şimdiye kadar sadece birkaç SUMO E3 ligazlar tespit edilmiştir. Bu kısmen SUMO konjugasyon verimliliği en üst düzeye çıkarır ve sonuç olarak potansiyel SUMO E3 ligazlar SUMOylation işlevini engeller geleneksel standart vitro SUMOylation tahlil kullanımına bağlı olabilir. Mevcut iletişim kuralı bir SUMO E3 ligaz tarafından geliştirilmiş SUMOylation soruşturma için basit ve tutarlı bir tahlil açıklar. Açıklanan yöntemi kimlik ve roman SUMO E3 ligazlar karakterizasyonu için önemlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir potansiyel çıkar çatışmaları ifşa.
Acknowledgments
Bu eser hibe Bakanlığı bilim ve Teknoloji (PCC için çoğu, 105-2320-B-010-007-MY3), Ulusal Sağlık Araştırma Enstitüsü (NHRI-EX105-10215BC için PCC), Bakanlığı bilim ve Teknoloji (en 105-2314-B-400-019 tarafından desteklenmiştir HJK için) ve Ulusal Sağlık Araştırma Enstitüsü (NHRI MG-105-SP-10, NHRI MG-106-SP-10 HJK için). Bu eser de kısmen Ulusal Yang Ming Üniversitesi Tarih PCC yayınına el yazması ile desteklenmiştir. Fon çalışma tasarım, veri toplama ve analizi, yayımlamaya karar veya tazminat makalenin herhangi bir rolü yoktu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pFastBac | Invitrogen | 10359-016 | dual expression baculovirus vector |
| pCR2.1-TOPO vector | Invitrogen | PCR product vector | |
| competent cell E. coli DH5α | Yeastern Biotech | FYE678-80VL | competent E. coli cells A |
| E. coli DH10Bac | Invitrogen | 10359-016 | competent E. coli cells B |
| FugeneHD | Roche | 04709705001 | transfection reagent |
| Opti-MEM | Gibco | 31985062 | reduced serum media |
| T4 Ligase | NEW England BioLabs | M0202S | |
| CpoI (RsrII) | Thermo Scientific | ER0741 | |
| Bluo-gal | Thermo Scientific | B1690 | galactosidase substrate |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| Grace’s Insect Medium | Gibco | 11605094 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10082147 | |
| Gentamicin | Thermo Fisher | 15750060 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393-25G | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | K0254-20ML | |
| gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| tetracyclin | Sigma-Aldrich | 87128-25G | |
| LB Broth | Merk | 1.10285.0500 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-100G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888-5KG | |
| KCl | Merk | 1.04936.1000 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136-500G | |
| KH2PO4 | J.T.Baker | 3246-01 | |
| sodium dodecyl sulfate | Merk | 1.13760.1000 | |
| β-mercaptoethanol | Bio-Rad | 161-0710 | |
| TRIS (Base) | J.T.Baker | 4109-06 | |
| Non-fat milk | Fonterra | ||
| glycerol | J.T.Baker | 2136-01 | |
| Triton X-100 | Amresco | 0694-1L | detergent A |
| Tween 20 | Amresco | 0777-500ML | detergent B |
| Poloxamer 188 solution | Sigma-Aldrich | P5556-100ML | detergent C |
| Protease Inhibitor Cocktail Tablet | Roche | 04 693 132 001 | |
| 3x Flag peptide | Sigma | F4799 | |
| anti-FLAG m2 Magnetic beads | Sigma-Aldrich | M8823 | antibody-tagged magnetic beads |
| SUMOlink SUMO-1 Kit | Active Motif | 40120 | standard SUMOylation protocol |
| SUMOlink SUMO-2/3 Kit | Active Motif | 40220 | standard SUMOylation protocol |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
| QIAGEN Plasmid Mini Kit | QIAGEN | 12123 | plasmid extraction kit |
| Polypropylene tubes | Falcon | 352059 | |
| Petri Dish | Falcon | 351029 | |
| Cell lifter | Corning | CNG3008 | |
| Loading tip | Sorenson BioScience | 28480 | |
| PVDF | PerkinElmer | NEF1002 | |
| Blotting filter paper | Bio-Rad | 1703932 | |
| Mini slab gel apparatus (Bio-Rad Mini Protean II Cell) | Bio-Rad | 1658001 EDU | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell | Bio-Rad | 1703940 | |
| Pierce ECL Western Blotting | Thermo | 32106 | ECL reagent |
| suspension mixer | Digisystem laboratory instruments Inc. | SM-3000 | |
| orbital shaker | Kansin instruments Co. | OS701 | |
| ImageQuant LAS 4000 biomolecular imager |
GE Healthcare | 28955810 | |
| Sf9 | Thermo Scientific | B82501 | |
| anti-p53 antibody | Cell Signaling | #9282 | |
| anti-rabbit antibody | GE Healthcare | NA934-1ML |
References
- Bies, J., Markus, J., Wolff, L. Covalent attachment of the SUMO-1 protein to the negative regulatory domain of the c-Myb transcription factor modifies its stability and transactivation capacity. J Biol Chem. 277 (11), 8999-9009 (2002).
- Lin, D. Y., et al. Role of SUMO-interacting motif in Daxx SUMO modification, subnuclear localization, and repression of sumoylated transcription factors. Mol Cell. 24 (3), 341-354 (2006).
- Welsh, M., Jamalpour, M., Zang, G., Akerblom, B. The role of the Src Homology-2 domain containing protein B (SHB) in beta cells. J Mol Endocrinol. 56 (1), 21-31 (2016).
- Huang, W. Q., et al. Structure, function, and pathogenesis of SHP2 in developmental disorders and tumorigenesis. Curr Cancer Drug Targets. 14 (6), 567-588 (2014).
- Perry, J. J., Tainer, J. A., Boddy, M. N. A SIM-ultaneous role for SUMO and ubiquitin. Trends Biochem Sci. 33 (5), 201-208 (2008).
- Sun, H., Leverson, J. D., Hunter, T. Conserved function of RNF4 family proteins in eukaryotes: targeting a ubiquitin ligase to SUMOylated proteins. EMBO J. 26 (18), 4102-4112 (2007).
- Ouyang, J., Shi, Y., Valin, A., Xuan, Y., Gill, G. Direct binding of CoREST1 to SUMO-2/3 contributes to gene-specific repression by the LSD1/CoREST1/HDAC complex. Mol Cell. 34 (2), 145-154 (2009).
- Lyst, M. J., Stancheva, I. A role for SUMO modification in transcriptional repression and activation. Biochem Soc Trans. 35, Pt 6 1389-1392 (2007).
- Liu, H. W., et al. Chromatin modification by SUMO-1 stimulates the promoters of translation machinery genes. Nucleic Acids Res. 40 (20), 10172-10186 (2012).
- Rosonina, E., Duncan, S. M., Manley, J. L. SUMO functions in constitutive transcription and during activation of inducible genes in yeast. Genes Dev. 24 (12), 1242-1252 (2010).
- Chang, P. C., et al. The chromatin modification by SUMO-2/3 but not SUMO-1 prevents the epigenetic activation of key immune-related genes during Kaposi's sarcoma associated herpesvirus reactivation. BMC Genomics. 14, 824 (2013).
- Neyret-Kahn, H., et al. Sumoylation at chromatin governs coordinated repression of a transcriptional program essential for cell growth and proliferation. Genome Res. 23 (10), 1563-1579 (2013).
- Tatham, M. H., et al. Polymeric chains of SUMO-2 and SUMO-3 are conjugated to protein substrates by SAE1/SAE2 and Ubc9. J Biol Chem. 276 (38), 35368-35374 (2001).
- Mattoscio, D., Segre, C. V., Chiocca, S. Viral manipulation of cellular protein conjugation pathways: The SUMO lesson. World J Virol. 2 (2), 79-90 (2013).
- Gareau, J. R., Lima, C. D. The SUMO pathway: emerging mechanisms that shape specificity, conjugation and recognition. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (12), 861-871 (2010).
- Bernier-Villamor, V., Sampson, D. A., Matunis, M. J., Lima, C. D. Structural basis for E2-mediated SUMO conjugation revealed by a complex between ubiquitin-conjugating enzyme Ubc9 and RanGAP1. Cell. 108 (3), 345-356 (2002).
- Knipscheer, P., et al. Ubc9 sumoylation regulates SUMO target discrimination. Mol Cell. 31 (3), 371-382 (2008).
- Vethantham, V., Manley, J. L. In vitro sumoylation of recombinant proteins and subsequent purification for use in enzymatic assays. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (1), 5121 (2009).
- Lin, S. F., Robinson, D. R., Miller, G., Kung, H. J. Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus encodes a bZIP protein with homology to BZLF1 of Epstein-Barr virus. J Virol. 73 (3), 1909-1917 (1999).
- Yang, W. S., Hsu, H. W., Campbell, M., Cheng, C. Y., Chang, P. C. K-bZIP Mediated SUMO-2/3 Specific Modification on the KSHV Genome Negatively Regulates Lytic Gene Expression and Viral Reactivation. PLoS Pathog. 11 (7), 1005051 (2015).
- Connor, C. D., Metcalf, E., Wrighton, C. J., Harris, T. J., Saunders, J. R. RsrII--a novel restriction endonuclease with a heptanucleotide recognition site. Nucleic Acids Res. 12 (17), 6701-6708 (1984).
- Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. Analysis of endonuclease R-EcoRI fragments of DNA from lambdoid bacteriophages and other viruses by agarose-gel electrophoresis. J Virol. 14 (5), 1235-1244 (1974).
- Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D'Ari, R. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth. J Bacteriol. 189 (23), 8746-8749 (2007).
- Gingold, E. B. Bacterial transformation. Methods Mol Biol. 2, 237-240 (1985).
- Brulois, K. F., et al. Construction and manipulation of a new Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus bacterial artificial chromosome clone. J Virol. 86 (18), 9708-9720 (2012).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Ahmed, S., Holt, M., Riedel, D., Jahn, R. Small-scale isolation of synaptic vesicles from mammalian brain. Nat Protoc. 8 (5), 998-1009 (2013).
