Summary
유비퀴틴 ligases와 달리 몇 E3 스모 ligases가 확인 되었습니다. 이 수정 된 생체 외에서 SUMOylation 프로토콜 생체 외에서 재구성 분석 결과 의해 소설 스모 E3 ligases를 확인 할 수 있다.
Abstract
작은 유비퀴틴-같은 한정자 (스모) 수정 신호 변환 단백질 단백질 상호 작용에 변조를 통해 주로 중재 하는 중요 한 포스트 번역 상 수정 (PTM) 이다. 유비퀴틴 수정 마찬가지로 SUMOylation E1 활성화 효소 (SAE1/SAE2), e 2-활용 효소 (Ubc9), 및 E3-리가 (즉, PIA 가족, RanBP2, 및 Pc2)을 포함 하 여 순차적 효소 캐스케이드 감독 이다. 그러나, 다른 ubiquitination, E3 리가 비 본질적인 반응 하지만 않습니다 스모 활용에 대 한 정밀도 효능을 제공. 단백질 SUMOylation 수정 기판 특정 항 체와 스모 특정 항 체와 immunoblotting vivo에서 immunoprecipitation 통해 분석 하 여 확인할 수 있습니다. 그러나, 단백질 스모 E3 리가 활동의 데모 SUMOylation 분석 실험을 사용 하 여 정제 효소, 기질, 그리고 스모 단백질의 생체 외에서 재구성을 해야 합니다. 때문에 체 외에 반응에서 일반적으로 SAE1/SAE2 및 Ubc9, 혼자 스모 활용에 대 한 충분 한, putative E3 리가 여 SUMOylation의 향상은 항상 검출 하기 쉽지. 여기, 우리는 수정 된 생체 외에서 스모 수정에서 시험관에 재구성 시스템을 사용 하 여 일관 되 게 식별 SUMOylation 프로토콜 설명 합니다. 바이러스 성 스모-2/3 E3 리가 K bZIP 촉매로 활성 정화 단계 프로토콜도 제공 됩니다. 순화 K bZIP의 SUMOylation 활동 p53, 스모의 잘 알려진 대상에 표시 됩니다. 이 프로토콜 없습니다만 사용할 수 있습니다 elucidating 소설 스모 E3 ligases, 뿐만 아니라 그들의 스모 paralog 특이성을 공개.
Introduction
스모 수정 처음 단백질 안정성1을 조절 하는 가역 포스트 번역 상 수정 (PTM)으로 확인 되었습니다. 뿐만 아니라 직접 활용, 스모도 장착할 수 비 공유 상호 작용을 통해 단백질에 스모 상호 작용 주제 (심즈)2. Tyrosyl-Src 상 동 2 (SH2)를 은닉 하는 분자에 의해 인 산화의 바인딩 또는 phosphotyrosine 바인딩 (PTB) 도메인3,4, 스모 수정 제공 위한 추가 상호 플랫폼 선택 포함 하는 SIM effector 단백질5,6모집 신호 변환의 규칙, 이외에 transcriptional 요인과 분자를 개장 하는 chromatin의 SUMOylation 조절 유전자 식7,8을 제공 합니다. 게놈 넓은 SUMOylation 패턴의 연구는 스모 수정은 긍정적인9,10 또는 음수10,11,12 전사와 관련 된 공개 규칙, SUMOylation의 paralogue 특이성 때문에 부분에서.
포유류 세포; 현재 변화 하는 단백질에 대 한 세 가지 주요 스모 isoforms는 스모-1, 그리고 높은 동종 스모 2와 스모-3 (스모-2/3 라고 함)13포함 됩니다. 스모는 대상 단백질에 ψKxD/E 합의 모티브 내 lysine (K) 잔류물에 일반적으로 활용 된다. 스모 E3 ligases에서 시뮬레이션 paralogue 특이성14에 대 한 책임은. E3 ligases의 수백을 포함 하는 ubiquitination 경로, 달리만 있었다 몇 스모 E3 ligases 식별15. 스모 E3 ligases (i) 바인딩 Ubc9, (ii) SIM 도메인 통해 스모 moiety 바인딩 (iii) 기판에 Ubc9에서 스모 전송 향상을 자신의 능력을 포함 하는 속성에 의해 정의 됩니다. E3 리가 스모 활용16, 절대적으로 필요 하지 않습니다 하지만 기판 및 스모 paralogue 특이성을 제공 합니다. 일반적으로 이후 총 기질 단백질의 작은 분수는 스모 수정 SUMOylated 단백질에서 vivo에서 의 탐지 항상 도전 이다. 따라서, 정확 하 고 재현성 분석 스모 수정의 정확한 기능을 명료 하 게 하기 위해 필요 합니다.
생체 외에서 SUMOylation 분석 결과, 기질 단백질의 SUMOylation 촉매 정화 Ubc9의 능력을 평가 하는 스모 수정17공부에 대 한 분석 결과 잘 허용된. 그러나, 대부분의 경우에서 스모 E3 리가 활동 감지 되지 않을 수 또는 검출 될 수 있다 돌연변이 스모 리가와 높은 스모 E3 리가 활동 및 낮은 기질 특이성 표준 프로토콜에 의해 Ubc918 의 풍부한 금액의 존재 때문에 . 순화 Ubc9의 주의 적정이이 분석 결과의 전반적인 성공에 의하여 크게 달려 있다. 생체 외에서 SUMOylation 분석 결과 여기에 설명 된 표준 SUMOylation에서 수정할 프로토콜 ( 재료의 표참조). Kaposi의 육 종 관련 herpesvirus (KSHV) 다시 활성화 하는 동안 증가 글로벌 스모 수정 관찰 SUMOylation의 업 레 귤 레이 션에 대 한 책임이 있을 수 있습니다 바이러스 성 스모 E3 리가 식별 하 라는 메시지가. 다음 바이러스 스모 E3 리가 K bZIP의 상호 작용 단백질의 소규모 상영, p53 소설 기판으로 확인 되었습니다. 이 프로토콜에서 우리 곤충 세포는 표현과 스모-2/3으로 바이러스 스모 E3 리가 K bZIP 야생-타입의 정화에 단계가 자세히 보여줍니다. E1 및 E2 효소의 감소 금액의 p53, 유명한 스모 기판의 SUMOylation를 향상 시키기 위해 정화 K bZIP의 능력 평가 됩니다. 이 수정된 SUMOylation 분석 결과 사용 하 여, 연구원은 안정적으로 정의할 수 스모 E3 리가의 능력 SUMOylate 소설 또는 알려진된 기판 단백질 SUMOylation의 연구에 기본 단계입니다. 또한,이 방법은 낮은 리가 활동 하지만 높은 기질 특이성 소설 스모 E3 ligases를 확인할 수 있습니다.
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Protocol
1입니다. 준비의 잠재 식 구문
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이중 식 잠재 벡터에 K bZIP19 의 cDNA 클로닝 하 여 스모 E3 리가 K bZIP을 정화 (재료의 표 참조)는 N 맨끝 피토 프 태그. 우리는 (벡터-태그-K-bZIP으로 프로토콜에 걸쳐 표시) octapeptide 태그를 사용 하 여 성공을 했다.
참고: K bZIP 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 복제에 대 한 DNA 템플렛은 cDNA 역방향 doxycycline 치료20다음 TREx F3H3-K-Rta BCBL-1 셀에서 격리 하는 RNA에서 복사할.- 전송 길이 K bZIP cDNA19 Cpo와 듀얼 식 벡터에 사이트 복제 나. Cpo 내가 소화 PCR 제품 및 3 h2137 ° C에서 이중 식 벡터의 1 µ g.
- 고220.8 %agarose 젤 전기 이동 법 다음 소화 DNA를 추출 합니다. 삽입 (K-bZIP) 선 및 T4 DNA 리가 제조업체의 지침에 따라 30 분 동안 16 ° C에 의해 벡터 ( 재료의 표참조).
- 5 µ L 추가 50 µ L DNA 결 찰의 유능한 대장균 세포 1.5 mL 튜브에 "A" ( 재료의 표참조). 30 분 동안 얼음에 넣어. 그런 다음, 45 42 ° C 물 욕조에 1.5 mL 튜브를 품 어 s 즉시 3 분 동안 얼음에 튜브를 넣어.
- 튜브에 600 µ L S.O.C. 매체 (0.5% (w/v) 효 모 추출 물, 2% (w/v) tryptone, 10 mM NaCl, 2.5 m m KCl, 20mm MgSO4, 4% (w/v) 포도 당)을 추가 하 고 1 시간 동안 37 ° C에서 품 어. 그런 다음, x 600g에 3 분 동안 실내 온도에 튜브 원심.
- 상쾌한 제거, 60 µ L Luria Bertani 매체와 펠 릿 resuspend (파운드, 1% (w/v) tryptone, 0.5% (w/v) 효 모 추출 물, 및 85 mM NaCl) 및 파운드 한 천 배지 100 µ g/mL 암 피 실린 포함에 확산. 16 h23,2437 ° C에서 한 천 배지를 품 어.
- 1 식민지 250rpm 떨고와 100 µ g/mL 암 피 실린 및 16 h 37 ° C에서 문화를 포함 하는 5 mL 파운드 매체에 접종을 선택 합니다. 다음, 플라스 미드, 벡터-태그-K-bZIP, 제조업체의 지침에 따라 플라스 미드 추출 키트에 의해 추출 ( 재료의 표참조).
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태그-K-bZIP 유능한 대장균 으로 벡터 태그 K bZIP의 변형에 의해 은닉 하는 재조합 bacmid 생성 세포 "B" (재료의 표 참조).
- 0.2 µ g 벡터-태그-K-bZIP 플라스 미드와 100 µ L 유능한 중 1.5 mL 튜브와 30 분 대에 넣어 얼음에 대장균 세포 "B" 품 어 45 42 ° C 물 목욕에서 튜브 s 즉시 3 분 동안 얼음에 튜브를 넣어.
- 튜브에 S.O.C. 매체의 900 µ L을 추가 하 고 회전 50 rpm에서 37 ° C 4 h에서 품 어. 다음, 매체의 10 µ L, 추가 파운드 한 천 배지 50 µ g/mL 대, 7 µ g/mL gentamicin, 10 µ g/mL 항생물질, 100 µ g/mL galactosidase 기판, 및 40 µ g/mL 이소프로필 β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG에 확산 S.O.C 매체의 추가 50 µ L ), 및 48 h 37 ° c.에 대 한 번호판을 품 어
- 5 mL 파운드 매체 50 µ g/mL 대, 7 µ g/mL gentamicin 및 10 µ g/mL 항생물질을 포함 한 백색 식민지 접종 16 h 떨고 250 rpm 37 ° C에서 품 어.
- 재조합 bacmid 태그 K bZIP을 은닉 하는 DNA를 분리 하 고 계량, 1 µ g / µ L25의 농도에 다시 일시 중단.
-
태그-K-bZIP 재조합 bacmid 태그-K-bZIP 6 잘 플레이트 한 우물에서 Sf9 셀에 포함 된 DNA의 transfecting 1 µ g에 의해 표현 하는 재조합 baculoviruses을 생성 합니다.
- 시드 2 x 106 Sf9 셀 ( 재료의 표참조) 2 mL 그레이스의 곤충 매체 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 각각 1 %gentamicin 제공 6 잘 플레이트의 잘 다음 1 h 27 ° C에서 품 어.
- 10 %FBS, 1 %gentamicin, 및 1% 세제 C와 함께 제공 된 그레이스의 곤충 매체에서 Sf9 셀의 로그 단계 문화를 유지 ( 재료의 표참조) 140 rpm에서 궤도에 27 ° C에서. Hemocytometer 고 trypan 푸른 얼룩;를 사용 하 여 셀의 개수 세포 생존 능력 95%를 초과 한다. 매 2-3 일 (최소 밀도 ~0.5 x 106 셀/mL) 1: 3의 subcultivation 비율을 사용 하 여 셀을 유지 합니다.
- 2 µ L bacmid DNA를 추가 (1 µ g / µ L) 98 µ L 2 mL 튜브에 혈 청 미디어 ( 재료의 표참조)을 감소. 그런 다음 추가 4 µ L transfection 시 약 ( 재료의 표참조) 튜브를 잘 믹스. 15 분 동안 실 온에서 품 어.
- 각 음에이 transfection 혼합물 (104 µ L)를 추가 하 고 12-16 h 27 ° C에서 품 어.
- 부드러운 포부와 함께 지쳐 미디어를 제거 하 고 신선한 그레이스의 곤충 매체 10 %FBS 1 %gentamicin와 함께 제공 된의 2 개 mL를 바꿉니다. Sf9 세포는 플레이트 표면에 느슨하게 고착 하 고 부드러운 포부와 방해 하지 않을 것 이다.
-
Transfection 후 재조합 잠재를 수집 하 고 증폭 하는 추가 실험을 위해 높은 titer 주식 (P1)를 얻을 잠재.
- 매체, 멸 균 셀 기중 기를 사용 하 여 긁어는 Sf9 셀을 변경한 후 72 h 1.5 mL 튜브 및 10에 대 한 소용돌이에서 각 개별 우물에서는 상쾌한 수집 s.
- 150 x g. 3 분 4 ° C에서 원심 P0 잠재 및 1.5 mL 튜브 (각 관에 1 mL 잠재) 약 수 수집 상쾌한. -80 ° c.에 게
- 10 mL 그레이스의 곤충 매체에 씨앗 1 x 107 Sf9 세포 10 %FBS 1% gentamicin 10 cm 배양 접시에에서 함께 제공 하 고 1 h 27 ° C에서 품 어.
- 재조합 baculoviruses 표현 태그-K-bZIP의 증폭에 대 한 시드 Sf9 셀을 0.5 mL P0 잠재를 추가 하 고 48 h 27 ° C에서 품 어.
- 최대 1 개월에 대 한 15 mL 튜브에 4 ° C에서 저장소 P1 잠재로 상쾌한을 수집 합니다.
2입니다. K-bZIP의 정화
- 1.3.2 단계에서 설명한 대로 10 %FBS, 1 %gentamicin, 및 1% 세제 C 140 rpm에서 궤도에 27 ° C에서 제공 하는 그레이스의 곤충 매체에 Sf9 셀의 로그 단계 문화를 유지 합니다.
- 변환의 날, 2 x 106 셀/mL의 조밀도 가진 Sf9 셀의 250 mL에 잠재 된 상쾌한 (P1)의 1 mL를 추가 합니다.
- 떨고, 140 rpm 궤도 셰이 커에 27 ° C에서 72 h에 대 한 Sf9 셀을 품 어 다음 4 ° c.에 15 분 동안 2,740 x g에서 원심 분리 하 여 수집
- 상쾌한을 제거 하 고 10 mL 세포의 용 해 버퍼 (20 mM HEPES pH 7.9, 0.5 M NaCl, 1% 세제 ( 재료의 표참조), 2% 글리세롤, 프로 테아 제 억제 물 칵테일) 펠 릿 세포를 lyse 및 4 ° C에서 30 분 동안 정지 믹서를 사용 하 여 50 rpm에 회전.
- 원심 분리기 세포 lysate 15000 x g 15 분은 상쾌한 수집에서.
- 태그-K-bZIP 정화, 항 체 태그 14 mL 폴 리 프로필 렌 튜브, 자석 구슬의 50 µ L로 세포 lysates (10 mL)를 품 어 하 고 정지 믹서를 사용 하 여 4 ℃에서 3 h 50 rpm에 회전 합니다. 30 g 원심 x 800에 구슬 작은 단백질 캡처, 다음 4 ° c.에 s 상쾌한의 대부분을 제거 하 고 다시 약 1 mL의 잔여 볼륨에 비즈를 일시에 1.5 mL 튜브에 전송.
- 마그네틱 스탠드에 구슬 들어 있는 튜브를 배치 하 여 캡처된 단백질을 세척 하 고 일단 자석 구슬은 튜브의 측면을 완벽 하 게 준수는 상쾌한을 제거.
-
세포의 용 해 버퍼와 구슬 4 번 씻어.
- 1.5 mL 튜브에 1 mL 세포의 용 해 버퍼를 추가 하 고 반전 튜브 10 번. 1.5 mL 튜브를 마그네틱 스탠드에 놓고 2.7에서 설명 된 대로 상쾌한을 제거 합니다.
- 또 다른 3 시간 이전 단계를 반복 합니다.
-
버퍼링 하는 인산 염 (PBS)와 구슬 한 번 씻는 다.
- 1.5 mL 튜브에 1 mL PBS (137 m m NaCl, 2.7 m m KCl, 8 m m Na2HPO4, 1.5 m m KH2PO4)를 추가 하 고 반전 튜브 10 번.
- 마그네틱 스탠드에 1.5 mL 튜브를 넣어 하 고는 상쾌한 제거.
- 1.5 mL 튜브에 PBS에 희석 150 µ g/mL octapeptide의 100 µ L을 추가 하 여 항 체 태그 자석 구슬에서 태그-K-bZIP 단백질을 elute. 실 온에서 정지 믹서에 의해 50 rpm에서 10 분 동안 튜브를 회전 합니다. 다음, 튜브 자석 스탠드에 다시 놓고 깨끗 한 1.5 mL 튜브에 K bZIP 포함 된 상쾌한 수집 합니다.
- SDS 페이지 Coomassie 파란 얼룩이26뒤 1-5 µ L 정화 태그-K-bZIP 단백질 분석. 2 µ g, 1 µ g, 로드 및 소 혈 청 알 부 민 (BSA)는 동일에 0.5 µ g 샘플 젤 ImageJ 같은 이미지 처리 프로그램, 정량화에 대 한 그것을 사용 하 여. BSA 기준에 비교 하 여 K-bZIP 농도 견적 한다.
- 순화 K bZIP 이제 각 SUMOylation 분석 결과에서 사용 될 준비가 되어 있습니다. PBS에서 K bZIP 100 ng / µ L-80 ° c.에 작은 aliquots가 게의 최종 농도에 희석
3. SUMOylation 분석 결과
- 각 시험관에서 SUMOylation 반응에서의 마스터 믹스에 정화 태그-K-bZIP의 100 ng / µ L의 3 µ L를 추가 합니다. 마스터 믹스 구성 요소 포함 1 µ L 단백질 버퍼, SUMOylation 버퍼, 0.5 µ L p53 단백질 (0.5 mg/mL), 25 x 1 nM E1 효소를 활성화 (재고 하자마자: 1 µ M), 50 nM e 2의 효소 변화 (재고 하자마자: 10 µ M), 및 250 nM 각 스모 펩 티 드 (스모-1의 스모-2, 또는 스모-3; 재고 하자마자: 5 µ M) 17 µ L의 최종 볼륨을.
- 내용을 부드럽게 혼합 하 고 3 h. SDS 페이지 로딩 버퍼 x 2의 20 µ L을 추가 하 여 반응을 중지에 30 ° C에서 반응을 품 어 (100 mM Tris HCL pH 6.8, 4% 나트륨 라우릴 황산 염, 0.2% (w/v) bromophenol 블루, 20% (v/v) 글리세롤, 및 200 m m β-mercaptoethanol) 및 5 분 동안 95 ° C에서 샘플 변성
-
SDS 페이지에 샘플, PVDF 막에 분리 된 단백질 전기 이동 전송 반 건조 장치를 사용 하 여 전송 하 고 안티-p53 항 체를 사용 하 여 서쪽 오 점 분석 합니다.
- 2.11, 단계에서 젤 장치를 설정 하 고 젤 우물에 20 µ L의 샘플을 로드.
- (때까지 염료 밴드 젤의 하단에 도달) 정 전류 80 V에서 약 120 분 동안에 10% 젤을 실행 합니다. 전기 이동 법의 완성 후 전원 공급 장치를 해제 합니다.
- 젤 기구와 젤, 밖으로 데리고 젤 카세트를 분리 하 고 5 분 동안 세미 드라이 전송 버퍼 (48 mM Tris HCl, 39mm 글리신, 20% 메탄올)에 젤을 떠.
- 다른 컨테이너를가지고 고 1 분 동안 메탄올에 PVDF 막 담가. 그런 다음, 메탄올에 PVDF를 데리고 고 세미 드라이 전송 버퍼에 넣어. 부드럽게 막 5 분 교 반 하십시오.
- 세미 드라이 전기 이동 기구의 안전 덮개를 제거 합니다.
- 사전 필터 종이, 젖은 하단 플래티넘 양극에 젤 샌드위치를 같이 준비: 필터 종이, PVDF 막, 젤, 및 필터.
- 다음 실행 오 점 15 V 정 전류 90 분 설정에 대 한 전원 공급 장치에서 안전한 음극 판과 안전 커버, 세미 건조 장치, 고 PVDF 막 밖으로.
- 블로킹 버퍼 블록 PVDF 막 (TBST 버퍼에 5% 비-지방 우유 (137 m m NaCl2, 20 mM Tris HCl, 0.1% 세제 B ( 재료의 표참조), pH 7.6)) 궤도 셰이 커로 흔들어 30 rpm으로 1 시간에 대 한 실내 온도에.
- 30 rpm 떨고 정지 믹서를 사용 하 여 함께 안티 p53 항 체 희석 (1:1, 000) 4 ° C에서 12-16 h에 대 한 블로킹 버퍼와 PVDF 막 교배.
- 컨테이너에 PVDF 막 꺼내와 TBST에 넣어. 두 번 더 TBST 가진 PVDF 막을 헹 구 십시오.
- 45 rpm 궤도 셰이 커로 흔들어 30 분 동안 TBST에 PVDF 막을 담근 다.
- 30 rpm 떨고 정지 믹서를 사용 하 여 실 온에서 1 h에 대 한 블로킹 버퍼에 반대로 토끼 항 체 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP) 희석과 활용 (1:4, 000)와 PVDF 막 교배.
- 3.4.10 단계에서 설명한 대로 TBST 3 시간 PVDF 막을 씻으십시오.
- 45 rpm 떨고 정지 믹서를 사용 하 여 함께 30 분 동안 TBST에 PVDF 막을 담근 다. TBST를 제거 하 고 PBS PVDF 막 12 h까지 4 ° C에서 유지 하기 위해 추가.
- 믹스 향상 된 chemiluminescent 기판 (ECL 기판) 시 약 1, 2 (1:1) ( 재료의 표참조). PBS에서 PVDF 막 제거, 간단히 종이 타월 또는 과도 일 분을 흡수 즉시 짧게 blotting에 의해 3-5 분 제거 초과 ECL 시 약에 대 한 각 막의 표면에 ECL 시 약의 400 µ L을 추가 하는 빛-의무 퍼 오 점 하지만 m을 허용 하지 마십시오 embrane을 완전히 건조.
- 오 점 발광 이미징 시스템 또는 autoradiography 영화27을 사용 하 여 노출 합니다.
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Representative Results
제조업체에서 제공 하는 정보에 따라 E1 및 E2 효소 SUMOylation 분석 결과에서 표준 금액은 50 nM 및 500 nM, 각각. 최소한의 E2 효소 Ubc9 SUMOylate p53 수 있는 어근 먼저 생체 외에서 SUMOylation 분석 결과 의해 결정 되었다. 낮은 Ubc9는 표준 체 외에서 SUMOylation 분석 결과 프로토콜에 사용 금액의 1 / 5 SUMOylate p53 효율적으로 수 있었다 (그림 1A). 따라서, 표준 프로토콜에 사용 되는 Ubc9의 양의 1/10로 조합에서 E1 효소의 금액의 절반 SUMOylation 분석 결과 체 외에 다른 사용 되었다. SUMOylation 효율의 상당한 감소는 표준 프로토콜 (그림 1B)를 비교 하 여 관찰 되었다.
따라서, 스모 E3 리가 K bZIP의 능력 향상 p53 SUMOylation 이들을 사용 하 여 결정 되었다 생체 외에서 SUMOylation 조건 수정. Sf9 셀 (그림 2A)에서 정화 태그 K bZIP E1 및 E2 Ubc9 효소의 낮은 금액 SUMOylation 반응에서 고용 되었다. 이 수정 된 조건 하에서 K bZIP 효율적으로 p53의 SUMOylation 촉매 수 (그림 2B). Immunoblotting 안티 p53 항 체와 각 반응에서 p53의 비슷한 총 금액을 확인 하 고 또한 검색 된 스모 p53 수정.
그림 1 : 스모 효소는 생체 외에서 SUMOylation 분석 결과에서 사용의 최소한의 결정. (A) p53 SUMOylation 생체 외에서 SUMOylation 분석 결과 표준 프로토콜에 사용 하는 Ubc9 효소의 양을 1/2 및 1 5를 포함 하는에 평가 했다. 3 시간 후 체 외에서 SUMOylation 반응에서 SUMOylated p53 효소는 서쪽에 의해 시험 되었다 안티 p53 항 체와 오 점. (B) 생체 외에서 SUMOylation p53의 표준 프로토콜에 사용 되는 Ubc9의 10 분의 1 금액으로 조합에서 E1 효소의 절반 금액을 사용 하 여 추가 분석 했다. 서쪽 오 점 (A)에서 설명 된 대로 수행 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 스모 E3 리가 K bZIP으로 p53 SUMOylation의 향상. (A) Coomassie 파란 얼룩이 함께 다음 SDS 페이지 분석 잠재 표현 K bZIP 단백질 정화. 1 µ g BSA와 10 µ L K bZIP 정화 단백질 수량 비교에 대 한 로드 했다. (B) K-bZIP 향상 p53 SUMOylation 표준 프로토콜에는 생체 외에서 SUMOylation 반응 E1 효소의 절반 금액 및 10 분의 1 Ubc9 추천의 금액을 사용 하 여 평가 되었다. 그림 1에 설명 된 대로 SUMOylated p53 서쪽 오 점에 의해 조사 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
생체 외에서 SUMOylation 프로토콜 여기에 설명 된 확인 된 Ubc9 기판의 SUMOylation 상태 설정 정기적으로 사용 됩니다. 스모 E3 리가의 SUMOylation 함수를 공부 하는 표준 프로토콜을 사용 하 여 주요 한계는 스모 E1 활성화 및 E2 변화 효소 Ubc9 체 외에 시스템에서 스모 활용을 극대화 하는 풍부한. 이 문제를 고려 하면 우리가 믿는 그 적정 수준에 스모 E1 및 E2 효소의 양을 하나 겨우 SUMOylation에 그들의 활동만 방법을 사용할 수 있는이 시험관 을 사용 하 여 스모 E3 리가 촉매 활동을 결정 하는 검색할 수 있습니다. SUMOylation 시스템입니다. 이 가설에 따라 우리는 성공적으로 해명 K bZIP의 E3 리가 활동 하 고 소설 스모 E3 리가로 스모-2/3으로 특이성에 동일시.
프로토콜 내에서 중요 한 단계는 E1 및 e 2의 낮은 금액의 설립 이다. 같이 그림 2, 소설 스모 E3 ligases 낮은 리가 활동이 낮은 금액을 사용 하 여 기판 및 스모 paralogues 그들의 특이성의 보존으로 식별 될 수 있습니다. 기술의 주요 한계는 기판의 매우 작은 비율만 스모 수정 될 수 있으므로 스모 기질을 인식-고품질 항 체에 대 한 요구 사항입니다.
비록 많은 단백질 overexpression에서 vivo에서후 SUMOylation 증가 가능성을 보여, 스모 E3 리가 정의 시스템에 의해 재구성 된 생체 외에서 SUMOylation 순화 E1, E2 및 E3 효소를 사용 하 여 시연 합니다. 수백, 아마 수천 유비퀴틴 E3 ligases 식별의 반대로 지금까지 몇 스모 E3 ligases 발견 되었습니다. 이 부분에서 전통적인 표준 생체 외에서 SUMOylation 분석 결과 스모 활용 효율성을 극대화 하 고 결과적으로 잠재적인 스모 E3 ligases의 SUMOylation 기능을 방해 하는의 사용에 있을 수 있습니다. 현재 프로토콜 SUMOylation 스모 E3 리가 향상을 간단 하 고 일관 된 분석 결과를 설명 합니다. 설명된 방법 식별 및 소설 스모 E3 ligases의 특성에 대 한 필수적입니다.
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Disclosures
저자는 잠재적인 충돌의 관심을 공개.
Acknowledgments
이 작품에서 과학과 기술 (PCC에 대부분, 105-2320-B-010-007-MY3), 국립 보건 연구소 (NHRI-EX105-10215BC PCC에)에서 과학과 기술 (가장 105-2314-B-400-019에서 교부 금에 의해 지원 되었다 HJK)을 국립 보건 연구소 (NHRI MG-105-SP-10, NHRI MG-106-SP-10 HJK)에서. 이 작품 또한 PCC 원고 게시에 국립 양 밍 대학으로 부분적으로 지원 되었다. Funders 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 결정, 게시 또는 원고의 배상에 아무 역할을 했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pFastBac | Invitrogen | 10359-016 | dual expression baculovirus vector |
| pCR2.1-TOPO vector | Invitrogen | PCR product vector | |
| competent cell E. coli DH5α | Yeastern Biotech | FYE678-80VL | competent E. coli cells A |
| E. coli DH10Bac | Invitrogen | 10359-016 | competent E. coli cells B |
| FugeneHD | Roche | 04709705001 | transfection reagent |
| Opti-MEM | Gibco | 31985062 | reduced serum media |
| T4 Ligase | NEW England BioLabs | M0202S | |
| CpoI (RsrII) | Thermo Scientific | ER0741 | |
| Bluo-gal | Thermo Scientific | B1690 | galactosidase substrate |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| Grace’s Insect Medium | Gibco | 11605094 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10082147 | |
| Gentamicin | Thermo Fisher | 15750060 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393-25G | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | K0254-20ML | |
| gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| tetracyclin | Sigma-Aldrich | 87128-25G | |
| LB Broth | Merk | 1.10285.0500 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-100G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888-5KG | |
| KCl | Merk | 1.04936.1000 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136-500G | |
| KH2PO4 | J.T.Baker | 3246-01 | |
| sodium dodecyl sulfate | Merk | 1.13760.1000 | |
| β-mercaptoethanol | Bio-Rad | 161-0710 | |
| TRIS (Base) | J.T.Baker | 4109-06 | |
| Non-fat milk | Fonterra | ||
| glycerol | J.T.Baker | 2136-01 | |
| Triton X-100 | Amresco | 0694-1L | detergent A |
| Tween 20 | Amresco | 0777-500ML | detergent B |
| Poloxamer 188 solution | Sigma-Aldrich | P5556-100ML | detergent C |
| Protease Inhibitor Cocktail Tablet | Roche | 04 693 132 001 | |
| 3x Flag peptide | Sigma | F4799 | |
| anti-FLAG m2 Magnetic beads | Sigma-Aldrich | M8823 | antibody-tagged magnetic beads |
| SUMOlink SUMO-1 Kit | Active Motif | 40120 | standard SUMOylation protocol |
| SUMOlink SUMO-2/3 Kit | Active Motif | 40220 | standard SUMOylation protocol |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
| QIAGEN Plasmid Mini Kit | QIAGEN | 12123 | plasmid extraction kit |
| Polypropylene tubes | Falcon | 352059 | |
| Petri Dish | Falcon | 351029 | |
| Cell lifter | Corning | CNG3008 | |
| Loading tip | Sorenson BioScience | 28480 | |
| PVDF | PerkinElmer | NEF1002 | |
| Blotting filter paper | Bio-Rad | 1703932 | |
| Mini slab gel apparatus (Bio-Rad Mini Protean II Cell) | Bio-Rad | 1658001 EDU | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell | Bio-Rad | 1703940 | |
| Pierce ECL Western Blotting | Thermo | 32106 | ECL reagent |
| suspension mixer | Digisystem laboratory instruments Inc. | SM-3000 | |
| orbital shaker | Kansin instruments Co. | OS701 | |
| ImageQuant LAS 4000 biomolecular imager |
GE Healthcare | 28955810 | |
| Sf9 | Thermo Scientific | B82501 | |
| anti-p53 antibody | Cell Signaling | #9282 | |
| anti-rabbit antibody | GE Healthcare | NA934-1ML |
References
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