Summary
כתב יד זה מתאר את היישומים של אלקטרודות פרוטון סלקטיבית, תיקון מחבר חובק למעקה שיטות למדוד את הפעילות של מערכות תחבורה פרוטון. אלה שיטות להתגבר על כמה מגבלות של טכניקות המשמשות בדרך כלל ללימוד פעילות התחבורה פרוטון, כגון רגישות בינונית, רזולוציה זמן ובקרה לא מספיקות כאורחים סביבה תאיים.
Abstract
הובלת יונים דרך קרום התא מבטיחה שליטה בסדר של יון תוכן בתוך ומחוץ לתא שעליו היא הכרחית להישרדות התא. מנגנונים אלה התחבורה הם מתווכת על-ידי הפעילות של חלבונים מוביל מתמחה. באופן ספציפי, pH dynamics דק נשלטים על ידי מערכות ההבלטה קרום פלזמה פרוטונים (H.+), כגון Na+/H+ מחליף (NHE) חלבון המשפחה. למרות המאמצים ללמוד המנגנונים NHE תקנה, ההבנה הנוכחית שלנו של המאפיינים biophysical ומולקולרית של משפחת NHE זה לא מספיק בשל המוגבל של שיטות למדוד ביעילות NHE פעילות . כתב יד זה, השתמשנו H+-אלקטרודות סלקטיבית במהלך כל-תא תיקון הקלטה clamping כדי למדוד את השטף הנוצרות על-ידי NHE H+ . אנחנו הציע גישה זו כדי להתגבר על כמה מגבלות של בדרך כלל השתמשו בשיטות למדידת פעילות NHE, כגון ספיגת רדיואקטיבי permeants ממברנה פלורסנט. מדידה של פעילות NHE באמצעות השיטה המתוארת מאפשר רגישות גבוהה, זמן רזולוציה ובקרה יעיל יותר של ריכוזים H+ תאיים. H+-אלקטרודות סלקטיבית הן מבוססת על העובדה טרנספורטר פעילות יוצרת הדרגתי של יון בסמיכות קרום התא. H+-סלקטיבית אלקטרודה מעבר, הרחק קרום התא בצורה שחוזרת על עצמה, מתנדנדות רשומות שינוי מתח התלויים השטף H+ . בעוד H+-אלקטרודות סלקטיבי משמשים לזיהוי שטף H+ עוזבת התא, השיטה מלחציים תיקון בתצורה שלם-תא משמשת לבקרה ההרכב יון תאיים. יתר על כן, היישום של הטכניקה מלחציים תיקון ענק מאפשר שינוי של ההרכב תאיים של לא רק יונים, אלא גם שומנים. הפעילות מוביל של NHE isoform 3 (NHE3) נמדדה באמצעות גישה טכנית זו ללמוד את הבסיס המולקולרי של תקנה NHE3 על ידי phosphoinositides.
Introduction
תחבורה בין יונים מומסים בגבול על פני קרום פלזמה היא חיונית להישרדותו של התאים ומכאן של אורגניזמים1. תחבורה סלקטיבית של יונים, מומסים בגבול מושגת על ידי מערך של חלבונים טרנספורטר וערוץ מיוחדת. מוטציות בחלבונים אלה לעיתים קרובות לגרום מגוון תנאים קליניים, עיבוד טרנספורטר וערוץ חלבונים מטרות אפשריות עבור טיפול תרופתי1. למרבה הצער, הבנת המנגנונים שבבסיס ערוץ וטרנספורטר ורגולציה לעיתים קרובות מוגבל על ידי הגישות לרשות המחקר שלהם פעילות2,3,4.
באופן ספציפי, מסועי בערך תת מתחלקים לשתי קבוצות גדולות בהתאם אם הם לשנות את הפוטנציאל transmembrane תא במהלך ההובלה של מומסים בגבול: מובילי שינוי יון electrogenic [למשל, נתרן-פוספט 2a טרנספורטר משותף (NaPi2a), נתרן סידן מחליף (NCX), וכו '.] או למעליות יון electroneutral ללא שינוי [כגון: מחליף נתרן-פרוטון (NHE), מוביל שיתוף סודיום-כלוריד, NaPi2c, ועוד.]. הפעילות של שני המעמדות של מובילי נחקרו בהרחבה באמצעות קליטת איזוטופים רדיואקטיביים, צבעי פלורסנט ממברנה-permeant2. שתי הגישות להעריך את הפעילות של מובילי על ידי מדידת שינויים בריכוז בצובר יונים ספציפיים cytoplasmic ולאחר שתי השיטות יש מגבלות, כגון רגישות בינונית ו ברזולוציה זמן לקוי השליטה תאיים חצרו. ואכן, הפעילות של מובילי רבים תלויה cytoplasmic ריכוז היונים נשאו (למשל, NHE3, NCX), צפויים שינויים בריכוזים אלה יון יש תפקיד חשוב בוויסות פעילות המשלח2 , 3 , 5. מדידה מדויקת של מנגנונים אלה בחקיקה מוגבל בשיטות קלאסיות.
כדי להתגבר על מגבלות אלה, שיטות מלחציים תיקון משמשים כדי לחקור את פעילות המשלח2,6. באופן ספציפי, הפניה עצמית אלקטרודות יון סלקטיבית (ISEs)7,8 בשילוב עם התיקון מחבר חובק למעקה המערכת אפשרה לאחרונה את המדידה של electroneutral טרנספורטר פעילות3,4 , 5. ISEs הם מבוססת על העובדה טרנספורטר פעילות יוצרת הדרגתי של יון בסמיכות קרום התא. איסה זזים למעלה כדי ורחוק קרום התא בחוזרות אופנה מתנדנדות רשומות שינוי מתח (µV). מתח ההבדלים יכולים להיות מומרים יון השטף ערכים באמצעות שיטה כיול כי חל החוק הראשון של Fick של דיפוזיה2,9. בעוד ISEs משמשים לזיהוי השטף של יונים זז מתוך תאים, שיטת מלחציים תיקון שני תאים שלמים או תצורות הפוכה משמשת לבקרה ההרכב יון פוטנציאליים, תאיים ממברנה. יתר על כן, היישום של הטכניקה מלחציים תיקון ענק מאפשר שינוי של ההרכב תאיים של לא רק יונים, אלא גם3,של שומנים, חלבונים-5.
לסיכום, צדדיות של השיטה מלחציים תיקון לעומת כי של שיטות אחרות כדי ללמוד פעילות המשלח עשה תיקון מחבר חובק למעקה מתאימים על מנת להתגבר על המגבלות נפוצות של השיטות האחרות. השילוב של הכוללות הפניה עצמית ISEs וטכניקות מלחציים תיקון מציעה את האפשרות ייחודי כדי למדוד את הפעילות של מובילי electroneutral בסביבה ניסיוני פיקוח הדוק, לגלות את הרומן biophysical ומולקולרית המאפיינים של קרום התא תחבורה3,4,5. גישה זו שימש בהצלחה ללמוד את הפעילות של NHE. משפחת יונקים חלבונים NHE מזרז ההחלפה נטו electroneutral חוץ-תאית נתרן (Na+) עבור פרוטון תאיים (H.+)10,11 ניצול של הדרגה Na+ פנימה. ביונקים, משפחת חלבונים NHE כולל חלבונים הקשורים 11 (NHE1-9 ו- NHA1-2) של הזרע ספציפי NHE10,12,13.
NHEs (SLC9a משפחה) נמצאים ubiquitously רוב היצורים החיים של אאוקריוטים פשוטה כדי פרוקריוטים גבוה ומעורבים במגוון של התא חיוני פונקציות10,11, כולל שליטה את ההגנה מליחות תא אאוקריוטים, שמירה על הומאוסטזיס חומצה בסיס וכרך תא, מווסת את ספיגת מלח ומים שונים מיוחדים epithelia10,12,14,15. התפקיד הביולוגי מפתח של NHEs ואת המשמעות של הפונקציות שלהם שנקבע באמצעות מספר מחקרים; עם זאת, מחקרים מעטים חקרו את המאפיינים biophysical ומולקולרית של יונקים NHEs בגלל מגבלות מתודולוגי4. לאחרונה, היישום של הכוללות הפניה עצמית של ISEs במהלך תיקון שלם-תא מחבר חובק למעקה חשפה את הרומן המנגנונים המולקולריים של NHE איזופורמים מוסדר על ידי שינויים ריכוזי יונים, חלבונים, פוספוליפידים3, תאיים 4.
באופן ספציפי, פרוטוקול בתנאי כתב יד זה מתאר את הדרכים ואת הגישות ללמוד את פעילות וויסות של NHE isoform 3 (NHE3), שחקן מרכזי לספיגת נוזלים HCO3– , Cl–, Na+ מברשת קרום הגבול של כליות, מעיים epithelia14,16. תובנה חדשה הבדלים הרגישות של פעילות NHE3 כדי phosphoinositides תאיים (phosphatidylinositide 4, 5-bisphosphate [PI (4.5) P2], phosphatidylinositide 3,4,5-טריפוספט [PI(3,4,5]P3]) הוא דיווח. תא תחבורה חלבונים, כגון ערוצי מובילים, מוסדרים על ידי phosphoinositides17, NHE3 נקשר ישירות P2 PI (4.5) והן P3 PI (3,4,5)18. על סמך הספרות הנוכחי, גם phosphoinositide יכול להיות רלוונטי להסדרת פיזיולוגיים או pathophysiological NHE35,18,19. הממצאים שלנו תומך בתפקידים נפרד PI (4.5) P2, P3 PI (3,4,5) בוויסות פעילות NHE3. הבחנה זו התאפשרה בשל היישום של טכניקות ISE בשילוב עם הקלטה מלחציים תיקון כל תא. טכניקה זו מאפשרת גם שליטה על התוכן הסלולר phosphoinositide ויה זלוף תאיים של phosphoinositides שונים במהלך המדידה של פעילות NHE3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: שני מגברים נדרשים עבור הקלטת הפעילות של מובילי electroneutral על ידי ISE הפניה עצמית בשיתוף עם תיקון מחבר חובק למעקה, מגבר מלחציים תיקון כדי לשמור על התא תצורה של כל תא, (מגבר של impendence גבוהה אלקטרומטר) כדי להקליט הפעילות טרנספורטר באמצעות ISE (ראה טבלה של חומרים). תיקון קלאמפ המגבר מחובר ישירות ללוח הרכישה מסוף. אלקטרומטר קשורה המגבר הדיפרנציאלי מנוצל כדי לסנן ומגבירים את האות. המגבר הדיפרנציאלי מחובר ללוח הרכישה מסוף. Capmeter, תוכנה מלחציים תיקון מפקח על קיבולת תא, שימש מחקרים קודמים20 (ראה טבלה של חומרים). הפתרונות קאמרית זלוף הקלטה נשמרים ב- 37 מעלות צלזיוס.
1. הכנה של מדי סוכר ISEs
- משוך את פיפטות של נימים זכוכית בורוסיליקט הקוטר החיצוני של 1.2 מ מ (ראה טבלה של חומרים) באמצעות פיפטה פולר2 .
- פולנית על פיפטה באמצעות את microforge. הקוטר של קצה פיפטה צריכה להיות 2-3 מיקרומטר.
- מקם את פיפטות בעל צנצנת פיפטות עם קצה פיפטה פונה כלפי מעלה (ראה טבלה של חומרים).
שים לב: בצע שלבים 1.4-1.6 בשכונה fume כימי מאוורר היטב. - לערבב את התערובת siliconization המורכבת טיפה 1 (~ 150 µL) של bis (דלמטלמינו) דימתיל silane ו 10 טיפות של tetrachloride פחמן (ראה טבלה של חומרים).
- שופכים את התערובת siliconization לתוך הצנצנת וסגור המכסה הדוק.
- דגירה את הצנצנת עם התערובת siliconization במשך 24-48 שעות בשכונה fume כימי בטמפרטורת החדר עד התערובת הוא התאדו לגמרי.
- מילוי רקע פיפטה עם שרף יון סלקטיבי המתאים כדי ליצור עמודה של 2-4 מ מ.
הערה: מימן ionophore אני קוקטייל B יכול להיות פעילות NHE לבנייתם הקלטה (ראה טבלה של חומרים). - הקש על קצה פיפטה להפיץ שרף סלקטיבית יון עד הקצה, ולמקם את פיפטה בצורה אנכית בתוך המחזיק צנצנת עם קצה פיפטה למטה.
- מתחת למיקרוסקופ ויבתר הקוקטייל שרף הגיע הסוף של הקצה. אם יש צורך, הפעילו לחץ חיובי כדי לדחוף את השרף עד הסוף.
- מילוי החצי-פיפטה עם הפתרון המתאים (~ 100 μL). . הנה, תשתמש 100 מ מ אשלגן ו- 10 מ מ HEPES ב- pH 7.0 אם משתמש ionophore אני קוקטייל B.
- להתחבר את ISE אלקטרומטר ולמקם את קצה ISE בתוך תמיסת אמבט משמש הקלטה. אפס את אלקטרומטר.
- בדיקת ה+-תגובה סלקטיבית ISE על-ידי שינוי ה-pH של התמיסה אמבט. ה ממוצע+-התגובה ISE סלקטיבית היא ~ 58 mV ליחידה של pH.
- מעת לעת להעריך את ההיענות ISE כיול.
2. הכנת מלחציים תיקון סיליקון עבור הקלטת
הערה: השיטה המתוארת על ידי דונלד Hilgemann במאמרו על ערוץ אחד הקלטה21 מומלץ.
- משוך את פיפטות ענק תיקון של נימים זכוכית בורוסיליקט (2.0 mmOD / 1.5 ממ ת. ז)22,232,פולר פיפטה.
- שימוש microforge רכוב על השלב של מיקרוסקופ הפוכה להגיע עם פיפטה רחב עצה (10-22 μm)23. להמיס חרוז (~ 0.5 מ ל) של זכוכית רכה על החוט פלטינה עבה של microforge.
הערה: פלטינה חוט עבה יחסית נדרש (~0.5 מ"מ) כדי לבדות פיפטות ענק תיקון. - מקם את פיפטה תיקון קרוב חרוז זכוכית רכה, ולהחיל חום מלא עד הקצה מתחילה לסגת. החוט פלטינה יעביר מעט לכיוון centerduring חימום.
- לכבות את האש, דחפו את הטיפ פיפטה חרוז זכוכית מרוככת. החוט קירור תמשוך ולשבור את הטיפ פיפטה.
- להחיל מחדש את החום כדי להחליק את הטיפ פיפטה וליצור טיפ פיפטה לקוטר הרצוי. הקוטר של הקצה תלויה בגודל של התא להיות שתוקנה (8-10 μm במחקר זה).
3. הכנה של תאים
- לחמם מלוחים מאגר פוספט (PBS) ללא Ca2 + , Mg2 +, טריפסין-EDTA פתרון מדיום הגידול ל- 37 מעלות צלזיוס.
- רחץ תאים פעמיים עם PBS. השתמש 1 מ"ל של המאגר לצלחת תא תרבות בקוטר 35 מ מ.
- להוסיף 0.5 מ של טריפסין בתאי לצלחת תא תרבות בקוטר 35 מ מ.
הערה: כאשר התאים מתחילים מצוד, נענעי את הצלחת לצרף מבטל את התאים. - עצרי טריפסין על-ידי הוספת 5 מ ל (כמות לצלחת תא תרבות בקוטר 35 מ מ) של מדיום הגידול מלאה בתוספת 10% סרום שור בעובר.
הערה: זמן התגובה של טריפסין הוא סוג התא התלויים. - המקום התאים על מטרף עם נדנדה כדי למנוע היווצרות גושים.
- השתמש תאים עבור עד 2 שעות לאחר trypsinization.
הערה: הזמן עשויים להשתנות בהתאם לקו תא.
4. הכנת מערכת זלוף אינטרה-פיפטה
- חתך בגודל המתאים של קוורץ אבובים (150 מיקרומטר OD / 75 מיקרומטר ID) כדי להכין את הקו זלוף אינטרה-פיפטה.
- הכנס צד אחד של הצנרת קוורץ טיפ פיפטה µL 200. הדבק את הצנרור קוורץ על הטיפ, לחתוך את הקצה של הקצה עם סכין גילוח חד.
- להתחבר לקו זלוף (קוורץ אבובים דבוק אל קצה) חתיכה קטנה של צינורות סיליקון שישמש מאגר עבור הפתרון זלוף אינטרה-פיפטה.
- להתחבר לאורך צינור סיליקון מזרק כדי ליצור לחץ חיובי.
- הוספה הסוף חינם של הצנרת קוורץ דרך הצינורית פוליאתילן של בעל פיפטה זלוף פורט (ראה טבלה של חומרים).
- להעריך את הקו זלוף עם הפתרון פיפטה.
5. אופן ההכנה של פתרונות
- להכין פתרון פיפטה בכבדות במאגר הקלטה NHE (115 מ מ אשלגן אספרטט (KAsp), 1 מ"מ EGTA, 0.5 מ מ MgCl2, 10 מ מ ג-ATP, 12.5 מ מ HEPES, צינורות 12.5 מ מ, המגבים 12.5 מ מ ו- 12.5 מ מ MES, pH 6.0 מותאם עם חומצה אספרטית).
הערה: להכין את מניות פיפטה פתרון סינון. הוסף Mg-ATP לפני הקלטה. - להכין פתרון אמבט טרי בכל פעם (140 מ"מ NaCl, מ מ 2 CaCl2, 2 מ מ MgCl2ו- pH טריס-HCl 0.1 מ מ 8.2).
6. רישום של פעילות טרנספורטר
- לשמור על חדר ההקלטה ואת כל הפתרונות ב 37 מעלות צלזיוס, כי פעילות טרנספורטר היא תלוית טמפרטורה.
- מקם את התאים אל החדר הקלטה. חכו עד שהם להוריד לחלק התחתון של החדר, אבל אל תתנו להם לצרף אל התא.
- בחר תא המתאים. למדוד את הקוטר של התא עם עינית מיקרומטר. בחר תאים עם קטרים דומה.
הערה: בדרך כלל, תא גדול יהיה השטח התאים ואולי יותר מובילי הביע על קרום פלזמה שלה, וכך גם יש יותר פעילות המשלח. עם זאת, זה לא בהכרח נכון, כמו פעילות טרנספורטר תלוי ספציפית לגבי המעלית ואת סוג התא שנבחנה. - הר על פיפטה microelectrode יון סלקטיבית כדי micromanipulator, מילוי פיפטה מחבר תיקון-חובק למעקה עם הפתרון תאיים, עליך לוודא כי הפתרון מגיע הטיפ של פיפטה2.
הערה: זה עשוי לדרוש הברזים עדין מספר לחסל בועות על חוד פיפטה. - הר של פיפטה מחבר תיקון-חובק למעקה ראש לשלב אלקטרופיזיולוגיה להגדיר22,2,23.
הערה: חשוב לשמור על הבמה ראש על זווית 45 מעלות לציר האופקי, זה מבטיח זווית הכניסה עבור פיפטה מתאים היווצרות של גושפנקה עמיד מאוד. - החל לחץ חיובי קטן (~ 5 ס"מ H2O) על פיפטה תיקון כדי להקטין את הסיכוי של חוסם את הטיפ, ומניחים אותו בתוך תמיסת אמבט.
- . תפסיק לזוז על פיפטה מלחציים תיקון פעם הטיפ הוא קרוב התא.
- לשחרר את הלחץ חיובי בעוד פיפטה נוגע התא והפעילו לחץ שלילי קלה (~ 5 ס"מ H2O) כדי להשיג > 1000 MΩ (גיגה אוהם) חותם על קרום התא עם התיקון פיפטה23.
- למקם את פיפטה תיקון עם התא באותו מישור מוקד כמו ISE ולהזיז את פיפטה תיקון עם התא בסמיכות ISE (~ 5-10 מיקרומטר)2,5 אלא למנוע ומאפשר את התא כדי לפנות את ISE (איור 1 א').
- להבטיח כי החזקת פוטנציאלי הוא 0 mV.
- קרע את החותם עם סדרת ראספים קצר כדי להשיג את תצורת כל תא.
- להזיז את ISE (או פיפטה מלחציים תיקון) לאט משמאל או מעלה-מטה כדי להקליט את הפעילות של המשגר (איור 1B).
- להקליט את פסגות לפחות 5-8 (איור 1C, מ- A ל- B).
- החל גל מרובע לפליטת במהלך ההקלטה לעקוב אחר האיכות של החותם, קיבוליות של קרום התא (איור 1).
- להעריך את שטף H+ (
) מן ההבדל בריכוז H+ חינם בין פני השטח תא הפתרון בתפזורת (ΔH+)
הערה:
, 
H+ , מאגר המקדמים של דיפוזיה בהתאמה, BT הוא ריכוז מאגר הכולל, KD הוא קבוע דיסוציאציה של המאגר, r הוא התא רדיוס, ו 
קובע לשינוי מצב יציב הריכוז של ה מאוגד+ עבור שינוי קטן חינם H+. H+ מציין פרוטון חופשי בתמיסה. עולה בקנה אחד עם מחקרים קודמים, H+ פלקסים מומרים השטף אלקטרופיזיולוגיות יחידות על-ידי חישוב של מקבילות הנוכחי פלקסים (/faraday)3,הרשות הפלסטינית5]. - לנרמל את שטף פרוטון השטח תא זה ניתן לחשב את גודל התא או את קיבול הממברנה.
) מן ההבדל בריכוז H+ חינם בין פני השטח תא הפתרון בתפזורת (ΔH+)
, 
H+ , מאגר המקדמים של דיפוזיה בהתאמה, BT הוא ריכוז מאגר הכולל, KD הוא קבוע דיסוציאציה של המאגר, r הוא התא רדיוס, ו 
קובע לשינוי מצב יציב הריכוז של ה מאוגד+ עבור שינוי קטן חינם H+. H+ מציין פרוטון חופשי בתמיסה. עולה בקנה אחד עם מחקרים קודמים, H+ פלקסים מומרים השטף אלקטרופיזיולוגיות יחידות על-ידי חישוב של מקבילות הנוכחי פלקסים (Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ISE הפניה עצמית במהלך ההקלטה מלחציים תיקון שלם-תא הוחל ללמוד ויסות פעילות NHE3 על ידי phosphoinositides. PS120 תאי פיברובלסט כמו24, שחסרה את הביטוי של קרום פלזמה אנדוגני NHEs, שימשו. NHE3 פראי-סוג (NHE3-wt) או מוטציות NHE3 זה אין איגוד phosphoinositides [טירוזין 501, ארגינין 503, ליזין 505 היו שהוחלפו עם אלנין, R503A/Y501A/K505A (NHE3-YRK)] היו stably לידי תאי פיברובלסט דמוי PS12018.
העקבות מוצגים באיור2. התא היה במוחי תצורה של תאים שלמים באמצעות פיפטה עבור תיקון מחבר חובק למעקה, ISE הוצב מול התא. במצב הזה, ISE הקליט את הריכוז של H חינם+ קרוב קרום התא (איור 1 א'); לאחר מכן, ISE (או פיפטה מלחציים תיקון) היה מיקרומטר רוחבית 50 הועברו באופן ידני ואשר נרשמו ריכוז חינם H+ הפתרון (איור 1B). ההבדלים מתח מוקלטות, המייצגים שתי העמדות של פיפטה תיקון עם התא לפני או הרחק את איסה הם נציג של פעילות NHE3 (איור 1C). זלוף אינטרה-פיפטה של apyrase (ATP-diphosphatase) מקטין את הריכוז תאיים של ATP, לאחר מכן להקטין את תוכן phosphoinositide5. מסכים עם מחקרים שדווחה בעבר5,18,19, התוכן phosphoinositide ירד מתווכת על ידי טיפול apyrase מופחת פעילות NHE3 (~ 50%), אשר הוקלט כמו ירידה ברמת המתח משרעת תנודה (איור 2). ההשפעה של apyrase (ניתן ב- 5 יחידות/ml) על פעילות NHE3 התהפכה לחלוטין על ידי זלוף אינטרה-פיפטה של apyrase בשילוב עם 2 מיקרומטר P3 PI (3,4,5) (איור 2 ו- 3 א). ממצאים אלה נתמכו על ידי הפעילות NHE3 הקליט בתאים PS120 stably לבטא מוטציות NHE3 (NHE3-YRK) הצליחו לקשור phosphatidylinositides18. זלוף של apyrase לבד או בשילוב עם PIP3 לא השפיע על הפעילות של NHE3 NHE3-YRK מוטציות (איור 3B). הפעילות של NHE3 אנדוגני היה גם מעוכבים על ידי טיפול apyrase תאי הכליה (OK) אופוסום3. זלוף אינטרה-פיפטה של PI (3,4,5) P3 להפוך עיכוב של פעילות NHE3 שנגזרות apyrase בתאים בסדר (איור 3C). ממצאים אלה מראים כי ההשפעה של P3 PI (3,4,5) על פעילות NHE3 אינה תא ייחודיים לסוג.
בשלב הבא, אנחנו נועדו לבדוק את ייחודה של PIP3 על ויסות בתיווך apyrase שינויים בפעילות NHE3. אנחנו עשינו את זה על-ידי assaying את ההשפעה על הפחתת apyrase תלויי על פעילות NHE3 לאחר זלוף של phosphoinositides אחרים, כגון P2 PI (4.5) PI (4.5) P2 (ב 10 מיקרומטר) לא השפיע על ירידה בפעילות NHE3 מתווכת על-ידי apyrase (איור 4A). בסופו של דבר, זלוף של המגבר-PNP, אנלוגי הלא-hydrolysable ATP, אינם חוסמים theapyrase תלויי-עיכוב של פעילות NHE3 (איור 4B). ממצאים אלה מראים תפקיד של P3 PI (3,4,5), אבל לא פאי (4.5) P2, בוויסות NHE3 לאחר דלדול ATP. זיהוי תפקידים נפרדים עבור PI (4.5) P2, P3 PI (3,4,5) ב NHE3 תקנה היה אפשרי רק בגלל זלוף המערכת של phosphoinositides במהלך המדידות ISE בשילוב עם מלחציים תיקון שלם-תא הקלטה5. פעולה ספציפית של P3 PI (3,4,5) יותר מאשר PI (4.5) P2 בוויסות פעילות NHE3 יקר, כדי לקבוע אם phosphoinositides תאיים שונים לווסת את הפונקציה של NHE3 באופן שונה.
איור 1 . ייצוג סכמטי של H+ שטף ובחינת המתאם בין פעילות NHE ההבדלים הפוטנציאליים נרשם על ידי microelectrode ה-pH.
ייצוג סכמטי של הגדרת הקלטה. תרשים א של הגדרת הניסוי הראשוני. התא שבידי בתצורה שלם-תא פיפטה מהדק התיקון, הניח לפני איסה. בתנוחה זו, ISE מתעדת את הריכוז של H חינם+ קרוב קרום התא. נולד ב ISE (או פיפטה מלחציים תיקון) הועברו באופן ידני רוחבית ~ 50 מיקרומטר, רושם את הריכוז של H חינם+ הפתרון במצב הזה. ג. ייצוג גרפי של מתח ההבדלים הקליטה באמצעות ISE. תנודות מעמדה (תא מול ISE) ל- B (תא רחוק ISE) הם נציג של פעילות NHE. התוכנה ששימשה רשום את המתח ההבדלים שהוקלט על ידי ISE ועורר לפליטת גל מרובע (20 mV, 0.2 kHz) כדי לנטר את קרום התא קיבוליות ואיכות החותם מלחציים תיקון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 . דוגמה של הקלטה להגדיר לפעילות טרנספורטר NHE3 בתא יחיד PS120 stably לבטא NHE3-wt לפני ואחרי זלוף עם apyrase ו- P3 PI (3,4,5) (PIP3).
לאחר ההקלטה הראשונית, התא הייתה דלה של ATP על ידי זלוף אינטרה-פיפטה של apyrase. פעילות NHE3 בהדרגה ירד והיא שוחזרה על ידי PIP3 אינטרה-פיפטה זלוף. Apyrase תוספת מצוינת באמצעות העמודה האדומה, PIP3 תוספת מצוינת באמצעות הפס הירוק. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 . ההשפעה של דלדול ATP זלוף PIP3 בפעילות טרנספורטר NHE3 בתאים PS120 ו- OK.
ההשפעה של דלדול ATP בתיווך apyrase על פעילות NHE3, את הזמנת את השפעת apyrase על פעילות NHE3 שנגזרות זלוף אינטרה-פיפטה PIP3: א PS120 תאים לביטוי NHE3-wt או B. PS120 תאים לביטוי NHE3-YRK, NHE3 מוטציות אפשרות לבצע איגוד phosphoinositides. ג תאים בסדר להביע NHE3 אנדוגני. החוגים מוצק הצג נתונים ממוצע ניסויים בודדים (ארבעה ניסויים שבוצעו בתנאים זהים). קווי שגיאה מייצגים את האמצעים ± תקן שגיאות (SE). * P 0.05 < לעומת שליטה, ANOVA. $ P < 0.5, apyrase < 0.01 $$P לעומת apyrase + PIP3, ANOVA. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 . ההשפעה של PI (4.5) P2 (PIP2) ו- ANP-PNP זלוף בפעילות NHE3 לאחר דלדול ATP.
ההשפעה של א PIP2 או B. זלוף ANP-PNP אינטרה-פיפטה על צמצום תלויי-apyrase NHE3 פעילות בתאים PS120 לבטא NHE3-wt. החוגים מוצק הצג נתונים ממוצע ניסויים בודדים (ארבעה ניסויים שבוצעו בתנאים זהים). קווי שגיאה לייצג את האמצעים ± SE. * P < 0.05, * * P < 0.01 לעומת שליטה, ANOVA. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
למרות הפונקציות מכריע של שנאים, השיטות הזמינות ללמוד את פעילותם הן יעילות ואף לא מתאימות. מגבלה אחת היא כי השיטות הזמינות למדוד תנועה יון מתווכת על-ידי טרנספורטר פעילות בלי להתחשב תנודות בהרכב יון תאיים במהלך ניסוי4. השיטה הציג מבטיחה שליטה מדויקת של יון חוץ-תאית, תאיים יצירות ומציע כלי רב עוצמה עבור שינוי יון תאיים, חלבון, שומנים בדם יצירות3,4,5.
הצעד החשוב ביותר של פרוטוקול זה הוא הכנת איסה זה יציבים במשך תקופה ארוכה25. מניסיוננו, ISE לא יציבה אינה siliconized היטב (למשל, שרף יון סלקטיבי מחולקת בצדדים פיפטה ISE), אשר ניתן להבחין על הסחף מתמדת ובלתי נשלט בתוך האות ISE. בנוסף, התפלגות שרף ב ISE צריך לפקח באופן הדוק במהלך הניסוי. הפתרון אמבט עשויים לדחוף שרף יון סלקטיבי בתוך ISE הפיפטה יצירת עמודת בפתרון אמבטיה לפני שרף25. במקרה זה, ISE להקליט את ריכוז יון מעמודה זו ולהיות מצבו לשינויים מעברי הצבע יון במהלך הניסוי. התאמת הגיאומטריה של ISE המפתח כדי להשיג תשובה ISE בטווח של 100 ms9 ואת להתגבר על עיכובים אפשריים בתגובות-ISE זמן מושווה שינויים הדרגתיים יון.
המגבלה העיקרית של השיטה הציג הוא ירש את התיקון מחבר חובק למעקה מדידה של פעילות טרנספורטר בתאי אפיתל. בעת ניתוק מתמיכה ומתוחזק ההשעיה, תאי אפיתל מקוטב עלולה לאבד לוקליזציה מקוטב של מובילי על קרום הפסגה או basolateral.
תיקון ששונה מחבר חובק למעקה מדידה אמור לשמש לומדים ערוצי, מסועי ב epithelia מקוטב. בהתחשב בעובדה כי תאים עשוי משוער לתוך גליל מאשר כדור חשוב בשעת שינוי צורה של מעבר הצבע H+ לתוך השטף דרך הנוסחה מסופקים. במקרה זה, יש לשנות את הנוסחה כדי 
שבו λ הוא אורך הגליל, r הוא רדיוס גליל, ad x הוא המרחק רדיאלי האמצע גליל שבמהלכן מעבר הצבע הוא נמדד5. פיתוח עתידי של טכניקה זו עוצמה ללמוד electroneutral מובילי להתמקד על שינוי השיטה כדי למטב את ההקלטה תאים גדל של טפט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים לחשוף.
Acknowledgments
המחברים רוצה להודות אריק Fishback (אוניברסיטת דה מוין, דה מוין, איווה, ארה ב) לסיוע שלו עם ירי ועריכת הוידאו. תאי פיברובלסט דמוי PS120 stably לבטא NHE3-wt או NHE3-YRK נמסרו באדיבות מאת ד ר מארק במושבים. שבהם (ג'ונס הופקינס הספר לרפואה של אוניברסיטת, בולטימור, MD, ארצות הברית).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Patch clamp Amplifier | Molecular Devices | ||
| Dual Channel Differential Electrometer (HiZ-223) | Warner Instruments | 64-1650 | |
| Differential Amplifier (DP-301) | Warner Instruments | 64-0044 | |
| Patch Clamp Software Based on MatLab | MatLab with acquisition toolbox | The capmeter software is recommended | |
| ThermoClamp-1 Temperature Control System | AutoMate Scientific | 03-11-LL | In-line heater |
| Single-Channel Temperature Controller (TC-324C) | Warner Instruments | 64-2400 | |
| Single-Barrel Standard Borosilicate Glass Tubing | World Precision Instruments | 1B120F-3 | Used for ion selective electrodes |
| Micropipette Storage Jar | World Precision Instruments | E212 | |
| Bis(dimethylamino)dimethylsilane | Sigma-Aldrich | 14755-100ML | |
| Carbon tetrachloride | Sigma-Aldrich | 319961-500ML | |
| Hydrogen ionophore I - cocktail B | Sigma-Aldrich | 95293 | |
| Thin Wall Borosilicate Tubing | Sutter Instrument | B200-156-15 | Used for patch clamp pipette |
| Soft glass (Corning 8161 Patch Glass) | Warner Instruments | 64-0815 | |
| Silica Capillary Tubing (150um OD/75um ID) | Molex (Polymicro Technologies) | 106815-0018 | Used for intra-pipette perfusion system |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium aspartate | Sigma-Aldrich | A6558 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M4880 | |
| Mg-ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Apyrase | Sigma-Aldrich | A6535 | |
| Phosphatidylinositol(4,5) bisphosphate diC8 | Echelon Biosciences | P-4508 | |
| Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate diC8 | Echelon Biosciences | P-3908 |
References
- Rives, M. L., Javitch, J. A., Wickenden, A. D. Potentiating SLC transporter activity: Emerging drug discovery opportunities. Biochem Pharmacol. , (2017).
- Kang, T. M., Markin, V. S., Hilgemann, D. W. Ion fluxes in giant excised cardiac membrane patches detected and quantified with ion-selective microelectrodes. J Gen Physiol. 121 (4), 325-347 (2003).
- Babich, V., Vadnagara, K., Di Sole, F. The biophysical and molecular basis of intracellular pH sensing by Na+/H+ exchanger-3. FASEB J. 27 (11), 4646-4658 (2013).
- Fuster, D., Moe, O. W., Hilgemann, D. W. Steady-state function of the ubiquitous mammalian Na/H exchanger (NHE1) in relation to dimer coupling models with 2Na/2H stoichiometry. J Gen Physiol. 132 (4), 465-480 (2008).
- Fuster, D., Moe, O. W., Hilgemann, D. W. Lipid- and mechanosensitivities of sodium/hydrogen exchangers analyzed by electrical methods. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (28), 10482-10487 (2004).
- Forster, I. C., Virkki, L., Bossi, E., Murer, H., Biber, J. Electrogenic kinetics of a mammalian intestinal type IIb Na(+)/P(i) cotransporter. J Membr Biol. 212 (3), 177-190 (2006).
- Smith, P. J., Trimarchi, J. Noninvasive measurement of hydrogen and potassium ion flux from single cells and epithelial structures. Am J Physiol Cell Physiol. 280 (1), C1-C11 (2001).
- Parker, M. D., Musa-Aziz, R., Boron, W. F. The use of extracellular, ion-selective microelectrodes to study the function of heterologously expressed transporters in Xenopus oocytes. Am J Physiol Cell Physiol. 296 (5), C1243 (2009).
- Smith, P. J. S., Sanger, R. H., Messerli, M. A. Electrochemical Methods for Neuroscience. Michael, A. C., Borland, L. M. , CRC Press/Taylor & Francis. 373-406 (2007).
- Orlowski, J., Grinstein, S. Diversity of the mammalian sodium/proton exchanger SLC9 gene family. Pflugers Arch. 447 (5), 549-565 (2004).
- Brett, C. L., Donowitz, M., Rao, R. Evolutionary origins of eukaryotic sodium/proton exchangers. Am J Physiol Cell Physiol. 288 (2), C223-C239 (2005).
- Bobulescu, I. A., Di Sole, F., Moe, O. W. Na+/H+ exchangers: physiology and link to hypertension and organ ischemia. Curr Opin Nephrol Hypertens. 14 (5), 485-494 (2005).
- Donowitz, M., Ming Tse, C., Fuster, D. SLC9/NHE gene family, a plasma membrane and organellar family of Na(+)/H(+) exchangers. Mol Aspects Med. 34 (2-3), 236-251 (2013).
- Zachos, N. C., Tse, M., Donowitz, M. Molecular physiology of intestinal Na+/H+ exchange. Annu Rev Physiol. 67, 411-443 (2005).
- Girardi, A. C., Di Sole, F. Deciphering the mechanisms of the Na+/H+ exchanger-3 regulation in organ dysfunction. Am J Physiol Cell Physiol. 302 (11), C1569-C1587 (2012).
- Bobulescu, I. A., Moe, O. W. Na+/H+ exchangers in renal regulation of acid-base balance. Semin Nephrol. 26 (5), 334-344 (2006).
- Hilgemann, D. W., Feng, S., Nasuhoglu, C. The complex and intriguing lives of PIP2 with ion channels and transporters. Sci STKE. (111), re19 (2001).
- Mohan, S., et al. NHE3 activity is dependent on direct phosphoinositide binding at the N terminus of its intracellular cytosolic region. J Biol Chem. 285 (45), 34566-34578 (2010).
- Alexander, R. T., et al. Membrane surface charge dictates the structure and function of the epithelial Na+/H+ exchanger. EMBO J. 30 (4), 679-691 (2011).
- Wang, T. M., Hilgemann, D. W. Ca-dependent nonsecretory vesicle fusion in a secretory cell. J Gen Physiol. 132 (1), 51-65 (2008).
- Hilgemann, D. W. Single-Channel Recording. Sakmann, B., Neher, E. , Plenum Press. 307-328 (1995).
- Hilgemann, D. W., Lu, C. C. Giant membrane patches: improvements and applications. Methods Enzymol. 293, 267-280 (1998).
- Matsuoka, S., Takeuchi, A. Patch Clamp Techniques. Okada, Y. , Springer. 207-218 (2012).
- Pouyssegur, J., Sardet, C., Franchi, A., L'Allemain, G., Paris, S. A specific mutation abolishing Na+/H+ antiport activity in hamster fibroblasts precludes growth at neutral and acidic pH. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (15), 4833-4837 (1984).
- Ogden, D. Microelectrode Techniques - The Plymouth Workshop Handbook. , The Company of Biologists Ltd. 275-316 (1994).
