Summary
Dette manuskriptet beskriver programmer proton-selektiv elektroder og patch clamping metoder å måle aktiviteten til proton transportsystemer. Disse metodene overvinne noen begrensninger teknikker brukes vanligvis til å studere proton transport aktivitet, for eksempel middels følsomhet, tid oppløsning og utilstrekkelig intracellulær miljøet kontroll.
Abstract
Transport av ioner gjennom cellemembraner sikrer god kontroll av ion innhold innenfor og utenfor cellen som er uunnværlig for cellen overlevelse. Disse transportmekanismer er formidlet av aktivitetene til spesialiserte transportkanaler. Spesielt pH dynamics er fint kontrollert av plasma membranen proton (H+) ekstrudering systemer, slik som Na+h+ exchanger (NHE) protein familie. Til tross for omfattende innsats for å studere mekanismene bak NHE regulering, er vår nåværende forståelse av egenskapene Biofysiske og molekylære NHE familien utilstrekkelig på grunn av den begrensede tilgjengeligheten av metoder for å effektivt måle NHE aktivitet . I dette manuskriptet vi brukte H+-selektiv elektroder under hele celle patch klem opptak for å måle NHE-indusert H+ flux. Vi foreslått denne tilnærmingen å overvinne noen begrensninger av vanligvis anvendt metoder for å måle NHE aktivitet, for eksempel radioaktivt opptak og fluorescerende membran permeants. Måling av NHE aktivitet med metoden beskrevet kan høy følsomhet og tid oppløsning og mer effektiv kontroll for intracellulær H+ . H+-selektiv elektrodene er basert på det faktum at transporter aktivitet skaper en ion gradert i nærheten cellemembranen. En H+-selektiv elektrode flytte til og fra cellemembranen i en repeterende, oscillasjon mote registrerer en spenning forskjell som er avhengig av H+ flux. Mens H+-selektiv elektrodene brukes til å oppdage H+ flux flytte ut av cellen, patch klemme metoden i hele celle konfigurasjonen brukes til å kontrollere intracellulær ion sammensetningen. Videre lar programmet av gigantiske oppdateringen klemme teknikken endring av intracellulær sammensetningen av ikke bare ioner, men også lipider. Transporter aktiviteten til NHE isoformen 3 (NHE3) ble målt ved hjelp av denne tekniske tilnærmingen for å studere molekylære grunnlaget for NHE3 regulering av phosphoinositides.
Introduction
Ioner og solutes over plasma membranen er avgjørende for overlevelsen av celler, og dermed organismer1. Selektiv transport av ioner og solutes oppnås ved en rekke spesialiserte kanal og transporter proteiner. Mutasjoner i disse proteinene ofte resultere i en rekke klinisk betingelser gjengivelse kanal og transporter proteiner potensielle mål for farmakologisk behandling1. Dessverre, forstå mekanismene bak kanalen og transporter og regulering er ofte begrenset av tilnærminger tilgjengelig å studere deres aktivitet2,3,4.
Spesielt transportører omtrent sub deles inn i to store grupper avhengig av om de endre cellen transmembrane potensial under transport av solutes: endre electrogenic ion transportører [f.eks natrium-fosfat co transporter 2a (NaPi2a), natrium-kalsium exchanger (NCX), etc.] eller ikke-altering electroneutral ion transportører [f.eks natrium-proton exchanger (NHE), natriumklorid co transporter, NaPi2c, etc.]. Aktivitetene til begge typer transportører har blitt studert grundig med opptak isotopene og fluorescerende membran-permeant fargestoffer2. Begge tilnærminger anslå aktiviteten til transportører ved å måle endringer i bulk konsentrasjonen av bestemte cytoplasmatiske ioner, og begge metodene har begrensninger, som moderat følsomhet og tid oppløsning og manglende kontroll over den intracellulær miljøet. Faktisk, mange transportører aktiviteten er avhengig av cytoplasmatiske konsentrasjonen av de gjennomført ionene (f.eks NHE3, NCX), og endringer i disse ion konsentrasjoner er forventet å spille en betydelig rolle i å regulere transporter aktivitet2 , 3 , 5. nøyaktig måling av disse regulative mekanismene er begrenset ved hjelp av klassisk metoder.
For å overvinne disse begrensningene, brukes oppdateringen klemme metoder å studere transporter aktivitet2,6. Spesielt har de selvrefererende ion-selektive elektroder (ISEs)7,8 kombinert med oppdateringen clamping systemet nylig tillatt måling av electroneutral transporter aktivitet3,4 , 5. ISEs er basert på det faktum at transporter aktivitet skaper en ion gradert i nærheten cellemembranen. En ISE flytte opp til og fra cellemembranen i en repeterende, registrerer oscillasjon mote en spenning forskjell (µV). Spenning forskjeller kan konverteres til ion flux verdier med en kalibrering metode som gjelder Ficks første lov av diffusjon2,9. Mens ISEs brukes å oppdage fluks av ioner flytting ut av celler, patch klemme metoden i både hele celler eller innsiden ut konfigurasjoner brukes til å kontrollere membran potensial og intracellulær ion sammensetningen. Videre lar programmet av gigantiske oppdateringen klemme teknikken endring av intracellulær sammensetningen av ikke bare ioner, men også lipider og proteiner3,5.
I sammendraget sammenlignet allsidighet av metoden oppdateringen klemme med at andre metoder for å studere transporter aktivitet har gjort oppdateringen clamping egnet til å overvinne vanlige begrensningene til disse andre metodene. Kombinasjonen av selvrefererende ISEs og patch klemme teknikker tilbyr en enestående mulighet til å måle aktiviteten til electroneutral transportører i et strengt kontrollert eksperimentelle miljø og oppdage romanen Biofysiske og molekylære Egenskaper for celle membran transport3,4,5. Denne tilnærmingen har blitt brukt til å studere aktiviteten til NHE. Pattedyr NHE protein familien gir electroneutral netto utveksling av ekstracellulære natrium (Na+) for intracellulær proton (H+)10,11 utnytte en innover Na+ -gradering. I pattedyr inkluderer NHE protein familien 11 relaterte proteiner (NHE1-9 og NHA1-2) og en sæd-spesifikke NHE10,12,13.
NHEs (SLC9a familien) finnes overalt i de fleste levende organismer fra simple prokaryoter til høyere eukaryoter og er involvert i en rekke viktige celle funksjoner10,11, herunder kontrollere celle saltholdighet Forsvaret i prokaryoter, opprettholde syre-base homeostase og celle volum og regulere absorpsjon av salt og vann i ulike spesialiserte epithelia10,12,14,15. Biologiske nøkkelroller av NHEs og betydningen av deres funksjoner er funnet gjennom flere studier; imidlertid har få studier undersøkt Biofysiske og molekylære egenskapene for pattedyr NHEs på grunn av metodologiske begrensningene4. Nylig har anvendelsen av selvrefererende ISEs under hele celle oppdateringen clamping avslørt romanen molekylære mekanismer av NHE isoformene regulert av endringer i intracellulær konsentrasjonen av ioner, proteiner og fosfolipider3, 4.
Spesielt protokollen i dette manuskriptet skisserer metoder og tilnærminger for å studere aktiviteten og regulering av NHE isoformen 3 (NHE3), en stor aktør i absorpsjonen av Na+, Cl-, HCO3- og væske i den Brush-grensen membran nyre og intestinal epithelia14,16. Ny innsikt i forskjeller på følsomheten av NHE3 aktivitet intracellulær phosphoinositides (phosphatidylinositide 4,5-bisphosphate [PI (4,5) P2] og phosphatidylinositide 3,4,5-trifosfat [PI(3,4,5]P3]) rapporteres. Celle transport proteiner, som kanaler og transportører, er regulert av phosphoinositides17, og NHE3 binder direkte både PI (4,5) P2 og PI (3,4,5) P318. Basert på gjeldende litteratur, kunne enten phosphoinositide være relevant for fysiologiske eller patofysiologiske regulering av NHE35,18,19. Våre funn støtte egne roller for PI (4,5) P2 og PI (3,4,5) P3 i regulering av NHE3 aktivitet. Dette skillet ble mulig bruk av ISE teknikker i kombinasjon med hele celle oppdateringen klemme opptak. Denne teknikken kan også kontroll over phosphoinositide mobilnettet innholdet via intracellulær perfusjon av ulike phosphoinositides under måling av NHE3 aktivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: To forsterkere kreves for opptak aktiviteten til electroneutral transportører av en selvrefererende ISE i forbindelse med oppdateringen clamping, en patch klemme forsterker å opprettholde cellen i en hel celle konfigurasjon og en høy impendence forsterker ( electrometer) å registrere transporter aktiviteten via ISE (se tabell for materiale). Oppdateringen klemme forsterkeren er direkte koblet til oppkjøpet styret terminal. Electrometer er koblet til differensial forsterker benyttes for å filtrere og forsterke signalet. Differensial forsterkeren er koblet til oppkjøpet styret terminal. Capmeter, patch klemme programvare som overvåker celle kapasitet, har vært brukt i tidligere studier20 (se tabell for materiale). Innspillingen chamber og perfusjon løsningene er opprettholdt på 37 ° C.
1. utarbeidelse av Pipetter for ISEs
- Trekke Pipetter fra Borosilikatglass kapillærene til en ytre diameter på 1,2 mm (se Tabell for materiale) bruker pipette avtrekker2 .
- Polsk pipette ved hjelp av microforge. Diameteren på pipette spissen bør være 2-3 µm.
- Plass Pipetter i en krukke holder for Pipetter pipette spissen vendt opp (se Tabell for materiale).
FORSIKTIG: Utføre trinnene 1.4-1.6 i godt ventilert kjemiske avtrekksvifte. - Bland siliconization blandingen som består av 1 dråpe (~ 150 µL) bis (dimethylamino) dimethyl silane og 10 dråper av karbon tetrachloride (se Tabell for materiale).
- Hell siliconization blandingen i glasset og Lukk lokket tett.
- Inkuber glasset med siliconization blandingen for 24-48 timer i kjemisk avtrekksvifte ved romtemperatur til blandingen er helt fordampet.
- Etterfylle pipette med passende ion-selektiv harpiks opprette en kolonne av ca 2-4 mm.
Merk: Hydrogen ionophore jeg cocktail B kan usedfor opptaksaktiviteten NHE (se Tabell for materiale). - Trykk spissen av pipette å distribuere ion-selektiv harpiks til spissen, og plasser pipette loddrett i glasset holderen med Pipetter spissen ned.
- Checkunder dissecting mikroskopet at harpiks cocktail har nådd slutten av spissen. Eventuelt kan du bruke positive Trykk for å skyve harpiks til slutten.
- Etterfylle halv-pipette med den riktige løsningen (~ 100 μL). Her bruker 100 mM KCl og 10 mM HEPES ved pH 7.0 hvis bruker ionophore jeg cocktail B.
- Koble ISE til electrometer og plassere ISE i Bad løsningen for opptak. Null i electrometer.
- Teste H+-selektiv ISE svar ved å endre pH i Bad løsningen. Den gjennomsnittlige H+-selektiv ISE svaret ~ 58 mV per enhet av pH.
- Regelmessig evaluere ISE responsen til kalibrering.
2. utarbeidelse av oppdateringen klemme Pipetter for innspilling
Merk: Metoden beskrevet av Donald Hilgemann i sin artikkel på én kanal opptak21 anbefales.
- Trekke Pipetter for gigantiske oppdateringen fra Borosilikatglass kapillærene (2.0 mmOD / 1,5 mm ID) på pipette avtrekker2,22,23.
- Bruk en microforge montert på scenen av en invertert mikroskop for å gjøre en bred pipette tips (10-22 μm)23. Smelt en perle (~ 0,5 mL) av myke glass på tykke platina tråden i microforge.
Merk: En relativt tykk platina wire kreves (~0.5 mm) å dikte gigantiske oppdateringen pipetter. - Plasser oppdateringen pipette nær myk glassperle, og gjelder full varme til spissen begynner å falle. Platina ledningen vil flytte litt mot centerduring oppvarming.
- Slå av varmen og presse pipette spissen i myknet glass perlen. Kjøling ledningen vil trekke og bryte pipette spissen.
- Nytt varmen og glatt pipette spissen og opprette en pipette spissen av ønsket diameter. Diameteren på spissen er avhengig av størrelsen på cellen skal lappet (8-10 μm i denne studien).
3. forberedelse av celler
- Varm opp fosfat buffer saltvann (PBS) uten Ca2 + og Mg2 +trypsin-EDTA løsning og vekst medium til på 37 ° C.
- Vask celler to ganger med PBS. Bruk 1 mL av bufferen for 35 mm diameter celle kultur plate.
- Legg til 0,5 mL av trypsin celler for 35 mm diameter celle kultur plate.
Merk: Når celler begynner å oppsummering, riste platen for å knytte de cellene. - Stoppe handlingen trypsin ved å legge til 5 mL (beløp for 35 mm diameter celle kultur plate) komplett oppblomstringen medium med 10% fosterets bovin serum.
Merk: Reaksjonstid i trypsin er celle-type avhengig. - Plasser cellene i en shaker med rock for å unngå dannelse av klumper.
- Bruk celler for opptil 2 timer etter trypsinization.
Merk: Tiden kan variere avhengig av den cellen linjen.
4. forberedelse av et Intra-Pipette perfusjon System
- Kutte en passende størrelse kvarts rør (150 µm OD / 75 µm ID) å forberede intra-pipette perfusjon linjen.
- Ene siden av kvarts slangen inn et 200 µL pipette tips. Fest kvarts slangen onto drikkepengene, og kutte slutten av spissen med en skarp barberblad.
- Koble perfusjon linjen (kvarts rør festet til spissen) til en liten bit av silisium rør som skulle tjene som et reservoar for intra-pipette perfusjon løsningen.
- Koble silisium slangen til en sprøyte opprette positivt trykk.
- Sett inn gratis slutten av kvarts slangen gjennom polyetylen tube pipette innehaver av perfusjonen port (se Tabell for materiale).
- Evaluere perfusjon linjen med Pipetter løsningen.
5. forberedelse av løsninger
- Forberede en tungt bufrede pipette løsning for opptak NHE (115 mM kalium aspartate (KAsp), 1 mM EGTA, 0,5 mM MgCl2, 10 mM Mg-ATP, 12.5 mM HEPES, 12.5 mM rør, 12.5 mM MOPPER og 12.5 mM MES, pH 6.0 justert med aspartic syre).
Merk: Forberede lager pipette løsning og filter. Legge til Mg-ATP før opptak. - Utarbeide en fersk bad løsning hver gang (140 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2og 0,1 mM Tris-HCl pH 8.2).
6. opptak av Transporter aktivitet
- Opprettholde opptak kammeret og alle løsninger på 37 ° C, fordi transporter er temperaturen-avhengige.
- Plasser cellene i innspillingen kammeret. Vent til de slippe til bunnen av kammeret, men ikke la dem legge til kammeret.
- Velg en passende celle. Måle diameteren på cellen med den okulær mikrometer. Velg celler med samme diameter.
Merk: Vanligvis en stor celle har mer mobilnettet overflaten og muligens flere transportører uttrykt sin plasma membran, dermed også har mer transporter aktivitet. Men er dette ikke nødvendigvis riktig, som transporter aktivitet avhenger av den bestemte transporter og hvilken celle under studien. - Montere ion-selektiv microelectrode Pipetter til micromanipulator, etterfylle patch-klemanordning pipette med intracellulære løsningen, pass på at løsningen når spissen av pipette2.
Merk: Det kan kreve flere mild kraner å eliminere bobler i spissen av pipette. - Montere det patch-klemanordning Pipetter til hodet stadium av elektrofysiologi satt opp2,22,23.
Merk: Det er viktig å holde hodet scenen på om en 45-graders vinkel til den vannrette aksen, så dette sikrer en oppføring vinkel for pipette som passer for dannelsen av en svært motstandsdyktig forsegling. - Bruk en liten positivt trykk (~ 5 cm H2O) til oppdateringen pipette å redusere sjansen for å blokkere spissen, og plasser den i badekar løsningen.
- Stopp flytting oppdateringen klemme pipette når spissen er nær cellen.
- Lindre positiv trykket mens pipette berører cellen og bruke liten negative trykket (~ 5 cm H2O) å få en > 1000 MΩ (en Giga-ohm) forseglingen på cellemembranen med oppdateringen Pipetter23.
- Plasser oppdateringen pipette med cellen i samme fokalplanet som ISE, og flytte oppdateringen pipette med cellen i nærheten ise (~ 5-10 µm)2,5 men unngå at cellen kontakte ISE (figur 1A).
- Sikre at beholdning potensielle er 0 mV.
- Ruptur segl serie med kort suctions å få hele celle konfigurasjonen.
- Flytte ISE (eller oppdateringen klemme pipette) sakte venstre høyre eller opp og ned å registrere aktiviteten av transporter (figur 1B).
- Registrere minst 5-8 topper (figur 1 c, fra A til B).
- Bruke firkantbølge forstyrrelser under innspillingen å overvåke kvaliteten segl og cellemembranen kapasitans (figur 1).
- Beregne H+ fluks (
) fra forskjellen i gratis H+ konsentrasjon celleoverflaten og bulk løsning (ΔH+)
Merk:
og 
er H+ og buffer diffusjon koeffisienter, BT er den totale buffer konsentrasjonen, KD er dissosiasjon konstant bufferen, r er cellen RADIUS, og 
bestemmer stabil endringen i konsentrasjonen av bundet H+ for en liten endring i gratis H+. H+ angir et gratis proton i løsningen. For å være i tråd med tidligere studier, H+ flukser konverteres til elektrofysiologiske flux enheter ved å beregne gjeldende ekvivalenter av flukser (/faraday) i pA3,5]. - Normalisere proton fluks celleoverflaten som kan beregnes fra cellestørrelsen eller membran kapasitans.
) fra forskjellen i gratis H+ konsentrasjon celleoverflaten og bulk løsning (ΔH+)
og 
er H+ og buffer diffusjon koeffisienter, BT er den totale buffer konsentrasjonen, KD er dissosiasjon konstant bufferen, r er cellen RADIUS, og 
bestemmer stabil endringen i konsentrasjonen av bundet H+ for en liten endring i gratis H+. H+ angir et gratis proton i løsningen. For å være i tråd med tidligere studier, H+ flukser konverteres til elektrofysiologiske flux enheter ved å beregne gjeldende ekvivalenter av flukser (Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En selvrefererende ISE hele celle oppdateringen klemme innspillingen ble brukt for å studere regulering av NHE3 aktivitet av phosphoinositides. PS120 fibroblast-lignende celler24, mangler uttrykket av endogene plasma membran NHEs, ble brukt. NHE3 vill-type (NHE3-wt) eller NHE3 mutanter som ikke binde phosphoinositides [tyrosin 501, arginine 503 og lysin 505 ble erstattet med alanin, Y501A/R503A/K505A (NHE3-YRK)] var stabilt uttrykt i PS120 fibroblast-lignende celler18.
Spor presenteres i figur 2. Cellen var heldin en hel celle konfigurasjon av en pipette for oppdateringen fastklemming av ISE ble plassert foran cellen. I denne posisjonen registrert ISE konsentrasjonen av gratis H+ nær cellemembranen (figur 1A); deretter ISE (eller oppdateringen klemme pipette) var manuelt flyttet lateralt 50 µm og registrert konsentrasjonen av gratis H+ i løsningen (figur 1B). Innspilte spenning forskjellene, tilsvarer to posisjonene til oppdateringen pipette med cellen foran eller langt fra ISE, er representant for NHE3 aktivitet (figur 1 c). Intra-pipette perfusjon av apyrase (ATP-diphosphatase) reduserer intracellulær konsentrasjonen av ATP, deretter redusere phosphoinositide innhold5. Med tidligere rapportert studier5,18,19redusert redusert phosphoinositide innholdet formidlet av apyrase behandling NHE3 aktivitet (~ 50%), som ble innspilt som en nedgang i spenning svingning amplituden (figur 2). Effekten av apyrase (gitt på 5 enheter/ml) på NHE3 aktivitet ble fullstendig tilbakeført av intra-pipette perfusjon av apyrase i kombinasjon med 2 µM PI (3,4,5) P3 (figur 2 og 3A). Disse funnene ble støttet av NHE3 aktivitet i PS120 celler uttrykke stabilt NHE3 mutanter (NHE3-YRK) som ikke binde phosphatidylinositides18. Perfusjon av apyrase alene eller i kombinasjon med PIP3 påvirke ikke aktiviteten til NHE3 i NHE3-YRK mutanter (figur 3B). Aktiviteten av endogene NHE3 var også hemmet av apyrase behandling i opossum nyre (OK) celler3. Intra-pipette perfusjon av PI (3,4,5) P3 reversert hemming av NHE3 aktivitet av apyrase i OK celler (Figur 3 c). Disse funnene tyder på at effekten av PI (3,4,5) P3 på NHE3 aktivitet ikke er celle type-spesifikk.
Neste, vi som mål å teste spesifisiteten av PIP3 om å regulere apyrase-mediert endringer i NHE3 aktivitet. Vi gjorde dette ved assaying effekten på apyrase-avhengige reduksjon på NHE3 aktivitet etter perfusjon av andre phosphoinositides, for eksempel PI (4,5) P2. PI (4,5) P2 (på 10 µM) påvirke ikke redusert NHE3 aktiviteten formidlet av apyrase (figur 4A). Endelig blokkere perfusjon av AMP-PNP, en ikke-hydrolysable ATP analog, ikke theapyrase-avhengige hemming av NHE3 aktivitet (figur 4B). Disse funnene tyder på en rolle av PI (3,4,5) P3, men ikke PI (4,5) P2, i regulering av NHE3 etter ATP uttømming. Identifikasjon av egne roller for PI (4,5) P2 og PI (3,4,5) P3 i NHE3 skulle mulig bare på grunn av den intercellulære perfusjonen av phosphoinositides under ISE målinger kombinert med hele celle oppdateringen klemme opptak5. En bestemt handling av PI (3,4,5) P3 i stedet for PI (4,5) P2 i regulering av NHE3 aktivitet er verdifullt å avgjøre om forskjellige intracellulær phosphoinositides regulerer funksjonen til NHE3 annerledes.
Figur 1 . Skjematisk fremstilling av H+ flux måling og sammenheng mellom NHE aktivitet og potensial forskjeller av pH-microelectrode.
Skjematisk fremstilling av innstillingen opptak. A. Diagram av den opprinnelige eksperimentelle innstillingen. Cellen er holdt i hele celle konfigurasjonen av oppdateringen klemme pipette og plassert foran ISE. I denne posisjonen registrerer ISE konsentrasjonen av gratis H+ nær cellemembranen. B. The ISE (eller oppdateringen klemme pipette) er manuelt flyttet lateralt ~ 50 µm og registrerer konsentrasjonen av gratis H+ i løsningen i denne posisjonen. C. grafisk fremstilling av spenning forskjeller spilt inn med ISE. Oscillations fra posisjon en (celle foran ISE) b (celle langt fra ISE) er NHE aktivitet. Programvaren brukes registrert spenningen forskjellene av ISE og generert firkantbølge forstyrrelser (20 mV, 0,2 kHz) for å overvåke cellemembranen kapasitans og kvalitet av oppdateringen klemme segl. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 . Eksempel på et opptak satt NHE3 transporter aktivitet i en enkelt PS120 celle stabilt uttrykke NHE3-wt før og etter perfusjon med apyrase og PI (3,4,5) P3 (PIP3).
Etter denne første var cellen oppbrukt ATP av intra-pipette perfusjon av apyrase. NHE3 aktivitet gradvis redusert og ble restaurert av PIP3 intra-pipette perfusjon. Apyrase tillegg angis av den røde linjen, og PIP3 tillegg angis av den grønne linjen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 . Effekten av ATP uttømming og PIP3 perfusjon NHE3 transporter aktivitet i PS120 og OK celler.
Effekten av apyrase-mediert ATP uttømming på NHE3 aktivitet og reservere effekten av apyrase på NHE3 aktivitet indusert av PIP3 intra-pipette perfusjonsmåler: A. PS120 celler uttrykke NHE3-wt eller B. PS120 celler uttrykke NHE3-YRK, NHE3 mutanter kan ikke binde phosphoinositides. C. OK celler uttrykke endogene NHE3. Solid sirkler viser gjennomsnittlig data fra personlige eksperimenter (fire eksperimenter utført i like). Feilfelt representerer betyr ± standardfeil (SE). * P < 0,05 vs kontroll, ANOVA. $ P < 0,5, $$P < 0,01 apyrase vs apyrase + PIP3, ANOVA. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 . Effekten av PI (4,5) P2 (PIP2) og ANP-PNP perfusjon NHE3 aktivitet etter ATP uttømming.
Effekten av A. PIP2 eller B. ANP-PNP intra-pipette perfusjon på apyrase-avhengige reduksjon av NHE3 aktivitet i PS120 celler uttrykke NHE3-wt. Solid sirkler viser gjennomsnittlig data fra personlige eksperimenter (fire eksperimenter utført i like). Feilfelt representerer den betyr ± SE. * P < 0,05, ** P < 0,01 vs kontroll, ANOVA. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Til tross for de avgjørende funksjonene av transportører er metodene tilgjengelig å studere deres aktivitet ineffektive og utilstrekkelig. En begrensning er at de tilgjengelige metodene måle ion bevegelse formidlet av transporter aktivitet uten å vurdere svingninger i intracellulær ion komposisjon under eksperimentet4. Presentert metoden sikrer presis kontroll over ekstracellulære og intracellulære ion komposisjoner og tilbyr et kraftig verktøy for å endre intracellulær ion, protein og lipid komposisjoner3,4,5.
Viktigste i denne protokollen er utarbeidelsen av en ISE som er stabil for en lang periode25. I vår erfaring, en ustabil ISE er ikke godt silikoniserte (f.eks ion-selektiv harpiks fordeles på ISE pipette sidene) som kan registreres i en konstant og ukontrollerbar drift i ISE signalet. I tillegg bør harpiks distribusjon i ISE nøye overvåket under eksperimentet. Bad løsningen kan presse ion-selektiv harpiks inne ISE pipette, opprette en kolonne med bad løsning før harpiks25. I dette tilfellet vil ISE registrere konsentrasjonen fra denne kolonnen og bli selv endringer i ion graderingene under eksperimentet. Justere geometri i ISE er nøkkelen til å få en ISE reaksjon mellom 100 ms9 og overvinne forsinkelser i ISE tid-svar sammenlignet med endringer i ion graderinger.
Stor begrensning av metoden presentert arves fra oppdateringen clamping måling av transporter aktivitet i epitelceller. Når løsrevet fra støtte og vedlikeholdes i suspensjon, kanskje polariserte epitelceller miste den polariserte lokaliseringen av transportører på apikale eller basolateral membranen.
En modifisert patch clamping måling bør brukes når studere kanaler og transportører i polarisert epithelia. Vurderer at cellene kan omtrentlig til en sylinder snarere enn en kule er viktig når transformere H+ gradient til flux via formelen gitt. I dette tilfellet formelen skal endres til 
hvor λ er lengden på sylinderen, r er radius sylinder, annonse x er den radielle avstanden fra sylinder midtpunktet som forløpningen er målt5. Fremtidig utvikling av denne kraftig teknikk for å studere electroneutral transportører bør fokusere på å endre metoden for å optimalisere opptak celler dyrket i en monolayer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konflikter av interesse å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne takke Eric Fishback (Des Moines University, Des Moines, Iowa, USA) for hans hjelp med skyting og redigering av video. PS120 fibroblast-lignende cellene stabilt uttrykke NHE3-wt eller NHE3-YRK fotograferingen av Dr. Mark Donowitz (Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD, USA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Patch clamp Amplifier | Molecular Devices | ||
| Dual Channel Differential Electrometer (HiZ-223) | Warner Instruments | 64-1650 | |
| Differential Amplifier (DP-301) | Warner Instruments | 64-0044 | |
| Patch Clamp Software Based on MatLab | MatLab with acquisition toolbox | The capmeter software is recommended | |
| ThermoClamp-1 Temperature Control System | AutoMate Scientific | 03-11-LL | In-line heater |
| Single-Channel Temperature Controller (TC-324C) | Warner Instruments | 64-2400 | |
| Single-Barrel Standard Borosilicate Glass Tubing | World Precision Instruments | 1B120F-3 | Used for ion selective electrodes |
| Micropipette Storage Jar | World Precision Instruments | E212 | |
| Bis(dimethylamino)dimethylsilane | Sigma-Aldrich | 14755-100ML | |
| Carbon tetrachloride | Sigma-Aldrich | 319961-500ML | |
| Hydrogen ionophore I - cocktail B | Sigma-Aldrich | 95293 | |
| Thin Wall Borosilicate Tubing | Sutter Instrument | B200-156-15 | Used for patch clamp pipette |
| Soft glass (Corning 8161 Patch Glass) | Warner Instruments | 64-0815 | |
| Silica Capillary Tubing (150um OD/75um ID) | Molex (Polymicro Technologies) | 106815-0018 | Used for intra-pipette perfusion system |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium aspartate | Sigma-Aldrich | A6558 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M4880 | |
| Mg-ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Apyrase | Sigma-Aldrich | A6535 | |
| Phosphatidylinositol(4,5) bisphosphate diC8 | Echelon Biosciences | P-4508 | |
| Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate diC8 | Echelon Biosciences | P-3908 |
References
- Rives, M. L., Javitch, J. A., Wickenden, A. D. Potentiating SLC transporter activity: Emerging drug discovery opportunities. Biochem Pharmacol. , (2017).
- Kang, T. M., Markin, V. S., Hilgemann, D. W. Ion fluxes in giant excised cardiac membrane patches detected and quantified with ion-selective microelectrodes. J Gen Physiol. 121 (4), 325-347 (2003).
- Babich, V., Vadnagara, K., Di Sole, F. The biophysical and molecular basis of intracellular pH sensing by Na+/H+ exchanger-3. FASEB J. 27 (11), 4646-4658 (2013).
- Fuster, D., Moe, O. W., Hilgemann, D. W. Steady-state function of the ubiquitous mammalian Na/H exchanger (NHE1) in relation to dimer coupling models with 2Na/2H stoichiometry. J Gen Physiol. 132 (4), 465-480 (2008).
- Fuster, D., Moe, O. W., Hilgemann, D. W. Lipid- and mechanosensitivities of sodium/hydrogen exchangers analyzed by electrical methods. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (28), 10482-10487 (2004).
- Forster, I. C., Virkki, L., Bossi, E., Murer, H., Biber, J. Electrogenic kinetics of a mammalian intestinal type IIb Na(+)/P(i) cotransporter. J Membr Biol. 212 (3), 177-190 (2006).
- Smith, P. J., Trimarchi, J. Noninvasive measurement of hydrogen and potassium ion flux from single cells and epithelial structures. Am J Physiol Cell Physiol. 280 (1), C1-C11 (2001).
- Parker, M. D., Musa-Aziz, R., Boron, W. F. The use of extracellular, ion-selective microelectrodes to study the function of heterologously expressed transporters in Xenopus oocytes. Am J Physiol Cell Physiol. 296 (5), C1243 (2009).
- Smith, P. J. S., Sanger, R. H., Messerli, M. A. Electrochemical Methods for Neuroscience. Michael, A. C., Borland, L. M. , CRC Press/Taylor & Francis. 373-406 (2007).
- Orlowski, J., Grinstein, S. Diversity of the mammalian sodium/proton exchanger SLC9 gene family. Pflugers Arch. 447 (5), 549-565 (2004).
- Brett, C. L., Donowitz, M., Rao, R. Evolutionary origins of eukaryotic sodium/proton exchangers. Am J Physiol Cell Physiol. 288 (2), C223-C239 (2005).
- Bobulescu, I. A., Di Sole, F., Moe, O. W. Na+/H+ exchangers: physiology and link to hypertension and organ ischemia. Curr Opin Nephrol Hypertens. 14 (5), 485-494 (2005).
- Donowitz, M., Ming Tse, C., Fuster, D. SLC9/NHE gene family, a plasma membrane and organellar family of Na(+)/H(+) exchangers. Mol Aspects Med. 34 (2-3), 236-251 (2013).
- Zachos, N. C., Tse, M., Donowitz, M. Molecular physiology of intestinal Na+/H+ exchange. Annu Rev Physiol. 67, 411-443 (2005).
- Girardi, A. C., Di Sole, F. Deciphering the mechanisms of the Na+/H+ exchanger-3 regulation in organ dysfunction. Am J Physiol Cell Physiol. 302 (11), C1569-C1587 (2012).
- Bobulescu, I. A., Moe, O. W. Na+/H+ exchangers in renal regulation of acid-base balance. Semin Nephrol. 26 (5), 334-344 (2006).
- Hilgemann, D. W., Feng, S., Nasuhoglu, C. The complex and intriguing lives of PIP2 with ion channels and transporters. Sci STKE. (111), re19 (2001).
- Mohan, S., et al. NHE3 activity is dependent on direct phosphoinositide binding at the N terminus of its intracellular cytosolic region. J Biol Chem. 285 (45), 34566-34578 (2010).
- Alexander, R. T., et al. Membrane surface charge dictates the structure and function of the epithelial Na+/H+ exchanger. EMBO J. 30 (4), 679-691 (2011).
- Wang, T. M., Hilgemann, D. W. Ca-dependent nonsecretory vesicle fusion in a secretory cell. J Gen Physiol. 132 (1), 51-65 (2008).
- Hilgemann, D. W. Single-Channel Recording. Sakmann, B., Neher, E. , Plenum Press. 307-328 (1995).
- Hilgemann, D. W., Lu, C. C. Giant membrane patches: improvements and applications. Methods Enzymol. 293, 267-280 (1998).
- Matsuoka, S., Takeuchi, A. Patch Clamp Techniques. Okada, Y. , Springer. 207-218 (2012).
- Pouyssegur, J., Sardet, C., Franchi, A., L'Allemain, G., Paris, S. A specific mutation abolishing Na+/H+ antiport activity in hamster fibroblasts precludes growth at neutral and acidic pH. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (15), 4833-4837 (1984).
- Ogden, D. Microelectrode Techniques - The Plymouth Workshop Handbook. , The Company of Biologists Ltd. 275-316 (1994).
