Summary
Dieses Manuskript beschreibt die Anwendungen der Proton-selektive Elektroden und Patch Methoden spannen, die Aktivität der Proton Transportsysteme zu messen. Diese Methoden überwinden einige Einschränkungen von Techniken, Proton Transportaktivität, z. B. mäßige Empfindlichkeit, Zeitauflösung und unzureichende intrazellulären Milieu Kontrolle zu studieren.
Abstract
Der Transport von Ionen durch Zellmembranen sorgt für die Feinsteuerung der Ionengehalt innerhalb und außerhalb der Zelle, die Zelle Überleben unverzichtbar ist. Diese Transportmechanismen werden durch die Aktivitäten von spezialisierten Transporter-Proteinen vermittelt. Insbesondere pH Dynamik sind fein gesteuert Plasmamembran Proton (H+) Extrusionsanlagen, wie Na+/h+ Wärmetauscher (NHE) Proteinfamilie. Trotz umfangreicher Bemühungen, die Mechanismen NHE Verordnung studieren reicht unser gegenwärtige Verständnis der biophysikalischen und molekularen Eigenschaften der NHE Familie wegen der begrenzten Verfügbarkeit von Methoden, um effektiv NHE Aktivität messen . In diesem Manuskript verwendet wir H+-selektive Elektroden während der gesamten Zelle patch klemmenden Aufnahme um NHE-induzierte H+ Flussmittel zu messen. Wir haben vorgeschlagen, dass dieser Ansatz in der Regel einige Einschränkungen der Methoden zur Messung der NHE Aktivität, z. B. radioaktiven Aufnahme und fluoreszierende Membran Permeants. Messung der NHE Aktivität mit der beschriebenen Methode ermöglicht hohe Empfindlichkeit und Auflösung und eine effizientere Kontrolle der intrazellulären Konzentrationen H+ . H+-selektive Elektroden sind dass Transporter Aktivität eine Ionen-Gradienten in der Nähe an der Zellmembran erstellt. Ein H+-selektiven Elektrode bis zu bewegen und entfernt von der Zellmembran in einer sich wiederholenden, oszillierende Mode zeichnet eine Spannungsdifferenz, die H+ Flux abhängig ist. Während H+-selektive Elektroden werden verwendet, um H+ Flux bewegen aus der Zelle, die Patch-Clamp-Methode in der ganz-Zell Konfiguration dient zur Steuerung der intrazellulären Ionen-Zusammensetzung zu erkennen. Darüber hinaus ermöglicht die Anwendung von riesigen Patch-Clamp-Technik Änderung der intrazellulären Zusammensetzung nicht nur Ionen, sondern auch Lipide. Die Transporter-Aktivität der NHE Isoform 3 (NHE3) wurde durch Phosphoinositides gemessen mit diesem technischen Ansatz, um die molekulare Grundlagen der NHE3-Verordnung zu studieren.
Introduction
Transport von Ionen und gelösten Stoffen über die Plasmamembran ist essentiell für das Überleben der Zellen und damit der Organismen1. Selektive Transport von Ionen und gelösten Stoffen wird durch eine Reihe von spezialisierten Kanal und Transporter-Proteinen erreicht. Mutationen in diesen Proteinen führen oft zu einer Vielzahl von klinischen Bedingungen, Kanal und Transporter Proteine potenzielle Ziele für pharmakologische Behandlung1rendern. Leider ist das Verständnis der Mechanismen, die zugrunde liegenden Kanal und Transporter Funktion und Regulation durch die Ansätze zur Verfügung, um ihre Aktivität2,3,4studieren oft begrenzt.
Insbesondere Transporter können werden grob unterteilt in zwei große Gruppen, je nachdem, ob sie die Zelle transmembranen Potenzial beim Transport von gelösten Stoffen verändern: die Veränderung elektrogenes Ion-Transporter [z. B. Natrium-Phosphat Co-Transporter 2a (NaPi2a), Natrium-Calcium-Austauscher (NCX) usw..] oder die nicht verändernde elektroneutraler Ionen-Transporter [z. B. Natrium-Proton Wärmetauscher (NHE), Natrium-Chlorid-Co-Transporter, NaPi2c, etc..]. Die Aktivitäten der beiden Klassen von Transportern wurden untersucht ausgiebig mit Aufnahme von radioaktiven Isotopen und Membran-permeationsfähigen fluoreszierenden Farbstoffen2. Beide Ansätze schätzen die Tätigkeit der Transporter durch die Messung der Masse Konzentrationsänderungen von speziellen zytoplasmatischen Ionen, und beide Methoden haben Einschränkungen, z. B. mäßige Empfindlichkeit und Zeitauflösung und unzureichende Kontrolle über die intrazelluläre Milieu. In der Tat, die Aktivität von vielen Transportern ist abhängig von der zytoplasmatischen Konzentration der Ionen (z. B. NHE3, NCX) durchgeführten, und Veränderungen in diesen Ionen-Konzentrationen werden voraussichtlich eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Transporter Aktivität2 , 3 , 5. präzise Messung dieser regulative Mechanismen beschränkt sich mit klassischen Methoden.
Um diese Einschränkungen zu überwinden, sind Patch-Clamp-Methoden verwendet, um den Transporter Aktivität2,6zu studieren. Insbesondere erlaubt die selbst verweisende ionenselektive Elektroden (ISEs)7,8 in Kombination mit dem Patch Spannsystem vor kurzem die Messung von elektroneutraler Transporter Aktivität3,4 , 5. ISEs sind dass Transporter Aktivität eine Ionen-Gradienten in der Nähe an der Zellmembran erstellt. Ein ISE bewegt sich auf und Weg von der Zellmembran in eine sich wiederholende, zeichnet oszillierende Mode eine Spannungsdifferenz (µV). Spannungsdifferenzen können in Ionen-Fluss Werte mit einer Kalibrierungsmethode, die erste Gesetz des Fick'schen Diffusion2,9gilt umgewandelt werden. Während ISEs verwendet werden zu erkennen, der Fluß der Ionen, die Bewegung von Zellen, Patch-Clamp-Methode in beide ganz-Zelle oder Inside-out-Konfigurationen wird verwendet, um die Membran Potenzial und intrazellulären Ionen-Zusammensetzung zu kontrollieren. Darüber hinaus ermöglicht die Anwendung der riesigen Patch-Clamp-Technik Änderung der intrazellulären Zusammensetzung nicht nur Ionen, sondern auch Lipide und Proteine3,5.
Zusammenfassend lässt sich sagen die Vielseitigkeit der Patch-Clamp-Methode im Vergleich zu, dass andere Methoden zu studieren Transporter Aktivität hat Patch Klemmung geeignet, die allgemeinen Einschränkungen dieser anderen Methoden zu überwinden. Die Kombination von verweisen auf sich selbst ISEs und Patch-Clamp-Technik bietet die einzigartige Möglichkeit, die Aktivität von elektroneutraler Transporter in einem streng kontrollierten experimentellen Umfeld messen und Roman biophysikalische und molekularen entdecken Eigenschaften der Zellmembran transportieren3,4,5. Dieser Ansatz hat erfolgreich eingesetzt, um die Aktivität der NHE zu studieren. Die Säugetier-NHE Proteinfamilie katalysiert die elektroneutraler net Austausch von extrazellulären Natrium (Na+) für intrazelluläre Protonen (H+)10,11 unter Verwendung einer nach innen Na+ Steigung. Bei Säugetieren umfasst die NHE Proteinfamilie 11 verwandte Proteine (NHE1-9 und NHA1-2) und eine Sperma-spezifische NHE10,12,13.
NHEs (SLC9a Familie) sind ubiquitär in den meisten lebenden Organismen aus einfachen Prokaryoten zu höheren Eukaryoten gefunden und engagieren sich in einer Vielzahl von lebenswichtige Zelle Funktionen10,11, einschließlich die Zelle Salzgehalt Verteidigung im controlling Prokaryoten, Aufrechterhaltung des Säure-Basen-Homöostase und Zelle Volumen und reguliert die Aufnahme von Salz und Wasser in verschiedenen spezialisierten Epithelien10,12,14,15. Die biologische Schlüsselrollen NHEs und die Bedeutung ihrer Funktionen wurden durch mehrere Studien festgelegt; jedoch haben einige Studien die biophysikalischen und molekulare Eigenschaften von Säugetieren NHEs Wegen methodischer Einschränkungen4untersucht. Vor kurzem hat die Anwendung von verweisen auf sich selbst ISEs während der gesamten Zelle Patch Klemmung neuartigen molekulare Mechanismen der NHE Isoformen von Änderungen in den intrazellulären Konzentrationen von Ionen, Proteine und Phospholipide3reguliert ergeben, 4.
Insbesondere das Protokoll zur Verfügung gestellt in diesem Manuskript beschreibt die Methoden und Ansätze zur Erforschung der Aktivität und Regulierung der NHE Isoform 3 (NHE3), einer der Hauptakteure bei der Aufnahme von Na+, Cl–, HCO3– und Flüssigkeit in der Bürste Grenze Membran Nieren- und Darm Epithelien14,16. Neue Einblicke in die Unterschiede in der Empfindlichkeit der NHE3 Aktivität, intrazelluläre Phosphoinositides (Phosphatidylinositide 4,5-Bisphosphate [PI (4,5) P2] und Phosphatidylinositide 3,4,5-Triphosphat [PI(3,4,5]P3]) wird berichtet. Zelle-Transport-Proteine, wie Kanäle und Transporter, Phosphoinositides17geregelt sind, und NHE3 bindet direkt PI (4,5) P2 und P3 PI (3,4,5)18. Basierend auf der aktuellen Literatur, könnte entweder Phosphoinositide relevant für die physiologische und pathophysiologische Regulierung des NHE35,18,19. Unsere Befunde stützen separate Rollen für PI (4,5) P2 und P3 PI (3,4,5) bei der Regulierung der NHE3 Aktivität. Diese Unterscheidung war aufgrund der Anwendung der ISE-Techniken in Kombination mit ganzen Zelle Patch Clamp Aufnahme möglich. Diese Technik ermöglicht auch Kontrolle der Phosphoinositide zellulären Inhalte über die intrazelluläre Perfusion der verschiedenen Phosphoinositides während der Messung der NHE3 Tätigkeit.
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Protocol
Hinweis: Zwei Verstärker sind erforderlich für die Aufnahme der Tätigkeit der elektroneutraler Transporter durch eine selbst verweisende ISE in Verbindung mit Patch spannen, einen Patch Clamp Verstärker weiterhin die Zelle in eine ganz-Zell Konfiguration und eine hohe außerdem Verstärker ( Elektrometer) aufzeichnen die Transporter-Aktivität über die ISE (siehe Tabelle der Materialien). Der Patch-Clamp-Verstärker ist direkt mit der Ankaufskommission terminal verbunden. Das Elektrometer mit der Differenzverstärker verwendet, um zu filtern und verstärken das Signal verbunden ist. Der Differenzverstärker ist mit der Ankaufskommission terminal verbunden. Capmeter, Patch Clamp-Software, die Zelle Kapazität überwacht wurde in früheren Studien20 verwendet (siehe Tabelle der Materialien). Kammer und Perfusion Aufzeichnungslösungen werden bei 37 ° c beibehalten.
1. Vorbereitung von Pipetten für ISEs
- Ziehen Sie die Pipetten aus Borosilikatglas Kapillaren zu einem äußeren Durchmesser von 1,2 mm (siehe Tabelle der Materialien) mit der Pipette Abzieher2 .
- Polieren Sie die Pipette mit der Microforge. Der Durchmesser des die Pipettenspitze sollte 2-3 µm.
- Legen Sie die Pipetten in einem Glas-Halter für Pipetten mit der Pipettenspitze nach oben (siehe Tabelle der Materialien).
Achtung: Führen Sie Schritte 1,4-1,6 in einem gut belüfteten chemische Abzug. - Mischen Sie die Silikonisierung Mischung, die aus 1 Tropfen (~ 150 µL) besteht der BIZ (Dimethylamino) Dimethyl Silane und 10 Tropfen der Carbon Titantetrachlorid (siehe Tabelle der Materialien).
- Gießen Sie die Silikonisierung Mischung in das Glas und schließen Sie den Deckel fest.
- Inkubieren Sie das Glas mit der Silikonisierung Mischung für 24-48 h in einem chemischen Abzug bei Raumtemperatur, bis die Mischung vollständig verdunstet ist.
- Die Pipette mit dem entsprechenden ionenselektive Harz Hinterfüllung erstellen Sie eine Spalte von ca. 2-4 mm.
Hinweis: Wasserstoff Ionophore ich cocktail B Geschäftstermine Aufnahme NHE Aktivität werden kann (siehe Tabelle der Materialien). - Tippen Sie auf die Spitze der Pipette, die ionenselektive Harz bis zur Spitze zu verteilen, und legen Sie die Pipette senkrecht in den Glas-Halter mit der Pipettenspitze nach unten.
- Checkunder der sezierenden Mikroskop, dass der Harz-Cocktail am Ende der Spitze erreicht hat. Bei Bedarf positive Druck, das Harz bis zum Ende zu drücken.
- Abgleich der Hälfte-Pipette mit der entsprechenden Lösung (~ 100 μL). Hier verwenden 100 mM KCl und 10 mM HEPES bei pH 7,0, wenn Ionophore ich cocktail B.
- Verbinden Sie die ISE mit dem Elektrometer und setzen Sie die Spitze der ISE in der Bad-Lösung für die Aufzeichnung verwendet. Das Elektrometer auf Null.
- Testen Sie die H+-selektive ISE Reaktion verändern den pH-Wert der Lösung Bad. Die durchschnittliche H+-selektive ISE Antwort ist ~ 58 mV pro Einheit von pH.
- In regelmäßigen Abständen bewerten Sie die ISE-Reaktion auf Kalibrierung.
2. Vorbereitung des Patch Clamp Pipetten für die Aufnahme
Hinweis: Die Methode von Donald Hilgemann in seinem Artikel auf Einkanal-Aufnahme21 beschrieben wird empfohlen.
- Ziehen Sie die Pipetten für riesige Patch aus Borosilikatglas Kapillaren (2.0 MmOD / 1,5 mm ID) auf die Pipette Abzieher2,22,23.
- Verwendung einer Microforge montiert auf der Bühne von einem inversen Mikroskop zu einem breiten Pipette Tipp (10-22 μm)23. Eine Perle zu schmelzen (~ 0,5 mL) von Weichglas auf den dicken Platin Draht von der Microforge.
Hinweis: Eine relativ dicke Platindraht ist erforderlich (~0.5 mm), riesiger Patch Pipetten zu fabrizieren. - Positionieren Sie die Patch-Pipette in der Nähe der weichen Glasperle und gelten Sie volle Hitze, bis die Spitze beginnt zu schwinden. Der Platindraht bewegt sich etwas in Richtung der Centerduring Heizung.
- Schalten Sie die Hitze, und schieben Sie die Pipettenspitze in die weiche Glasperle. Die kühle Draht wird zurückziehen und brechen die Pipettenspitze.
- Erneut die Hitze zu glätten die Pipettenspitze und erstellen eine Pipettenspitze mit dem gewünschten Durchmesser. Der Durchmesser der Spitze ist abhängig von der Größe der Zelle werden gepatcht (8 – 10 μm in dieser Studie).
3. Vorbereitung der Zellen
- Phosphat-Puffer Kochsalzlösung (PBS) ohne Ca2 + und Mg2 +, Trypsin-EDTA-Lösung und Wachstumsmedium, bei 37 ° c erwärmen
- Waschen Sie Zellen zweimal mit PBS. Verwenden Sie 1 mL des Puffers für 35 mm Durchmesser Zellplatte Kultur.
- 0,5 mL Trypsin zu den Zellen für 35 mm Durchmesser Zellplatte Kultur zugeben.
Hinweis: Wenn Zellen beginnen sich zu Round-Up, schütteln Sie die Platte, um die Zellen de befestigen. - Hält die Trypsin-Handlung durch Zugabe von 5 mL (Betrag für 35 mm Durchmesser Zellplatte Kultur) komplette Wachstumsmedium mit 10 % fötalen Rinderserum ergänzt.
Hinweis: Ist die Reaktionszeit in Trypsin-Zelltyp abhängig. - Legen Sie die Zellen auf einem Boston-Shaker mit rockigen um Bildung von Klumpen zu vermeiden.
- Verwenden Sie Zellen für bis zu 2 h nach Trypsinization.
Hinweis: Die Zeit variieren je nach Zelllinie.
4. Erstellung eines Intra-Pipette Perfusion Systems
- Schneiden Sie eine geeignete Größe des Quarz-Schlauch (150 µm OD / 75 µm ID), die Intra-Pipette Perfusion Linie vorzubereiten.
- Ein 200 µL Pipettenspitze stecken Sie einseitig von den Quarz-Schlauch. Kleben Sie die Quarz-Schlauch auf die Spitze und schneiden Sie das Ende der Spitze mit einer scharfen Rasierklinge.
- Schließen Sie die Perfusion Leitung (Quarz-Schlauch an der Spitze geklebt), ein kleines Stück Silikon-Schläuche, die als Reservoir für die Intra-Pipette Perfusion Lösung dienen würde.
- Schließen Sie den Silikon-Schläuche an eine Spritze um Überdruck zu erstellen.
- Legen Sie das freie Ende des Quarz-Schlauch durch das Polyethylen-Rohr von der Pipette Inhaber der Durchblutung port (siehe Tabelle der Materialien).
- Die Perfusion-Linie mit der Pipette Lösung zu bewerten.
5. Vorbereitung der Lösungen
- Bereiten Sie eine stark gepufferten Pipette-Lösung zur Erfassung von NHE (115 mM Kalium Aspartat-(KAsp), 1 mM EGTA, 0,5 mM MgCl2, 10 mM Mg-ATP, 12,5 mM HEPES, 12,5 mM Rohre MOPS 12,5 mM und 12,5 mM MES, pH 6.0 mit Asparaginsäure eingestellt).
Hinweis: Bereiten Sie das Lager Pipette Lösung und Filter. Mg-ATP vor der Aufnahme hinzufügen. - Bereiten Sie eine frisches Bad Lösung jedes Mal (140 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2und 0,1 mM Tris-HCl pH 8,2).
6. Aufnahme von Transporter-Aktivität
- Halten Sie die Aufnahme Kammer und alle Lösungen bei 37 ° C, da Transporter Aktivität temperaturabhängig ist.
- Legen Sie die Zellen in der Aufnahme-Kammer. Warten Sie, bis sie auf den Boden der Kammer fallen aber lass sie nicht anhängen an die Kammer.
- Wählen Sie eine entsprechende Zelle. Messen Sie den Durchmesser der Zelle mit der okulären Mikrometer. Wählen Sie Zellen mit ähnlichen Durchmessern.
Hinweis: In der Regel wird eine große Zelle mehr zellularen Oberfläche und möglicherweise mehr Transporter über die Plasmamembran, also auch mit mehr Transporter Aktivität zum Ausdruck gebracht haben. Dies ist jedoch nicht unbedingt richtig, als Transporter Aktivität hängt von der spezifischen Transporter und Zelltyp unter Studie. - Montieren Sie die ionenselektive Mikroelektrode Pipette an der Mikromanipulator, Hinterfüllung die Patch-Klemmung Pipette mit der intrazellulären Lösung stellen sicher, dass die Lösung die Spitze der Pipette2erreicht.
Hinweis: Es möglicherweise mehrere sanfte Taps, Luftblasen in der Spitze der Pipette zu beseitigen. - Montieren Sie die Patch-Klemmung Pipette auf den Kopf Bühne der Elektrophysiologie eingerichtet,2,22,23.
Hinweis: Es ist wichtig, dass die Kopf Bühne über einen 45-Grad-Winkel auf der horizontalen Achse, da dadurch eine Eintrittswinkel für die Pipette, die für die Bildung einer hochresistenten Dichtung geeignet ist. - Eine kleine positive Druck (~ 5 cm H2O) um die Patch-Pipette zu verringern die Möglichkeit der Sperrung der Spitze, und legen Sie sie in die Bad-Lösung.
- Nicht mehr die Patch-Clamp-Pipette zu bewegen, sobald die Spitze in der Nähe der Zelle ist.
- Entlasten den positiven-Luftdruck während Pipette die Zelle berührt und leichten negativen Druck (~ 5 cm H2O) erhalten eine > 1000 MΩ (ein Giga-Ohm) Siegel auf der Zellmembran mit dem Patch pipette23.
- Legen Sie die Patch-Pipette mit der Zelle in der gleichen Brennebene als die ISE, und bewegen Sie die Patch-Pipette mit der Zelle in der Nähe der ISE (~ 5-10 µm)2,5 aber vermieden werden, dass die Zelle an der ISE (Abbildung 1A).
- Versichern, dass die potenziellen Holding 0 ist mV.
- Bruch der Dichtung mit Serie von kurzen Lenzsauger, die ganz-Zell Konfiguration zu erhalten.
- Verschieben Sie die ISE (oder Patch-Clamp-Pipette) langsam links-rechts oder oben-unten, um die Aktivität des Transporters (Abbildung 1 b) aufzuzeichnen.
- Aufzeichnen von mindestens 5-8-Gipfel (Abbildung 1, von A nach B).
- Gelten Sie Rechtecksignal Störungen während der Aufnahme, die Qualität der Dichtung und die Zellmembran Kapazität (Abbildung 1) zu überwachen.
- Schätzen Sie das Flussmittel H+ (
) aus der Differenz im freien H+ Konzentration der Zelloberfläche und Bulk-Lösung (ΔH+)
Hinweis:
und 
h+ und Puffer Diffusionskoeffizienten bzw. BT ist die Konzentration der gesamten Puffer, KD ist die Dissoziationskonstante des Puffers, R ist die Zelle Radius, und 
bestimmt die Steady-State Änderung in der Konzentration der gebundenen H+ für eine kleine Änderung im freien H+. H+ zeigt eine freie Protonen in Lösung. Um mit früheren Studien, H+ Fluten in elektrophysiologische Flussmittel Einheiten durch die Berechnung der aktuellen Entsprechungen von den Fluten konvertiert (/faraday) in pA-3,-5]. - Den Proton-Flux an der Zelloberfläche, die von der Zellengröße berechnet werden können oder die Membran-Kapazität zu normalisieren.
) aus der Differenz im freien H+ Konzentration der Zelloberfläche und Bulk-Lösung (ΔH+)
und 
h+ und Puffer Diffusionskoeffizienten bzw. BT ist die Konzentration der gesamten Puffer, KD ist die Dissoziationskonstante des Puffers, R ist die Zelle Radius, und 
bestimmt die Steady-State Änderung in der Konzentration der gebundenen H+ für eine kleine Änderung im freien H+. H+ zeigt eine freie Protonen in Lösung. Um mit früheren Studien, H+ Fluten in elektrophysiologische Flussmittel Einheiten durch die Berechnung der aktuellen Entsprechungen von den Fluten konvertiert (Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ein selbst verweisende ISE während der gesamten Zelle Patch Clamp Aufnahme wurde angewandt, um die Regelung der NHE3 Tätigkeit zu studieren von Phosphoinositides. PS120 Fibroblasten-wie Zellen24, die die Expression von endogenen Plasmamembran NHEs fehlt, wurden verwendet. NHE3-Wildtyp (NHE3-wt) oder NHE3-Mutanten, die nicht binden Phosphoinositides [Tyrosin 501, 503 Arginin und Lysin 505 wurden ersetzt mit Alanin, Y501A/R503A/K505A (NHE3-YRK)] wurden in PS120 Fibroblasten-wie Zellen18stabil ausgedrückt.
Die Spuren sind in Abbildung 2dargestellt. Die Zelle war Heldin eine ganz-Zell Konfiguration durch eine Pipette für Patch spannen und die ISE wurde vor der Zelle gelegt. In dieser Position erfasst die ISE die Konzentration der freien H+ in der Nähe der Zellmembran (Abb. 1A); dann die ISE (oder Patch-Clamp-Pipette) manuell verschobenen seitlich 50 µm und war die Konzentration der freien H+ in der Lösung (Abbildung 1 b). Die aufgezeichneten Spannungsdifferenzen, entsprechend den beiden Positionen der Patch Pipette mit der Zelle vor oder weit von der ISE sind Vertreter der NHE3 Aktivität (Abbildung 1). Die Intra-Pipette Perfusion der Apyrase (ATP-Diphosphatase) verringert die intrazelluläre Konzentration von ATP, anschließend Verringerung der Phosphoinositide Inhalt5. Im Einvernehmen mit den bisher gemeldeten Studien5,18,19reduziert die verminderte Phosphoinositide Inhalte vermittelt durch Apyrase Behandlung NHE3 Aktivität (~ 50 %), die als eine Abnahme der Spannung wurde Amplitude der Schwingung (Abbildung 2). Die Wirkung von Apyrase (bei 5 Einheiten/ml angegeben) auf NHE3-Aktivität wurde vollständig durch die Intra-Pipette Perfusion der Apyrase in Kombination mit 2 µM PI (3,4,5) P3 umgekehrt (Abbildung 2 und 3A). Diese Ergebnisse wurden unterstützt durch NHE3 Aktivitäten aufgezeichnet in PS120 Zellen stabil mit dem Ausdruck NHE3 Mutanten (NHE3-YRK), die Phosphatidylinositides18binden konnten. Die Perfusion der Apyrase allein oder in Kombination mit PIP3 hatte keinen Einfluss auf die Tätigkeit der NHE3 in NHE3-YRK Mutanten (Abb. 3 b). Die Aktivität der endogenen NHE3 wurde auch durch Apyrase Behandlung in Opossum Niere (OK) Zellen3gehemmt. Die Intra-Pipette Perfusion der PI (3,4,5) P3 umgekehrt die Hemmung der NHE3 Aktivität induziert durch Apyrase in Ordnung Zellen (Abbildung 3). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Wirkung von PI (3,4,5) P3 auf NHE3 Tätigkeit nicht Zelle typspezifische.
Als nächstes wollten wir die Besonderheit von PIP3 zur Regulierung von Apyrase-vermittelte Änderungen in NHE3 Aktivität zu testen. Wir haben dies durch die Untersuchung der Wirkung auf Apyrase-abhängigen Reduktion auf NHE3 Tätigkeit nach der Perfusion von anderen Phosphoinositides, wie z. B. PI (4,5) P2. PI (4,5) P2 (bei 10 µM) hatte keinen Einfluss auf die verminderte NHE3 Aktivität vermittelt durch Apyrase (Abb. 4A). Schließlich hat die Perfusion der AMP-PNP, ein nicht wasserlöslicher ATP-Analogon, nicht Theapyrase-abhängige Hemmung der NHE3 Aktivität (Abbildung 4 b) blockieren. Diese Ergebnisse weisen auf eine Rolle der PI (3,4,5) P3, aber nicht PI (4,5) P2, bei der Regulation des NHE3 nach ATP-Verarmung. Die Kennung des separaten Rollen für PI (4,5) P2 und P3 PI (3,4,5) in NHE3 nur wegen der interzellulären Perfusion der Phosphoinositides während der ISE Messungen kombiniert mit ganzen Zelle Patch Clamp Aufnahme5Verordnung möglich war. Eine bestimmte Aktion von PI (3,4,5) P3 statt PI (4,5) P2 bei der Regulierung der NHE3 Tätigkeit ist wertvoll, um festzustellen, ob verschiedene intrazelluläre Phosphoinositides die Funktion der NHE3 anders regulieren.
Abbildung 1 . Schematische Darstellung der H+ flux Messung und Korrelation zwischen NHE Aktivität und Potentialdifferenzen, aufgenommen von der pH Mikroelektrode.
Schematische Darstellung der Aufnahmeeinstellung. A. Diagramm der ersten experimentellen Einstellung. Die Zelle ist in der ganz-Zell Konfiguration durch die Patch-Clamp-Pipette gehalten und vor der ISE platziert. In dieser Position zeichnet die ISE die Konzentration der freien H+ in der Nähe der Zellmembran. B. die ISE (oder Patch-Clamp-Pipette) ist manuell verschobenen seitlich ~ 50 µm und die Konzentration der freien H+ in der Lösung in dieser Position zeichnet. C. mit der ISE grafische Darstellung der Spannungsdifferenzen aufgenommen. Die Schwingungen von Position (Zelle vor der ISE) nach B (Zelle weit die ISE) sind Vertreter der NHE Aktivität. Die verwendete Software registriert die Spannung Unterschiede von der ISE aufgezeichnet und erzeugt quadratische Welle Störungen (20 mV, 0,2 kHz) zur Überwachung der Zellmembran Kapazität und Qualität der Patch Clamp Dichtung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 . Beispiel für eine Aufzeichnung für NHE3 Transporter Aktivität inmitten einer Einzelzelle PS120 stabil mit dem Ausdruck ihrer NHE3-wt vor und nach der Perfusion mit Apyrase und PI (3,4,5) P3 (PIP3).
Nach den ersten Aufnahmen war die Zelle von ATP durch die Intra-Pipette Perfusion der Apyrase erschöpft. NHE3 Aktivität schrittweise verringert und von PIP3 Intra-Pipette Perfusion restauriert. Apyrase Ergänzung durch den roten Balken angezeigt wird, und PIP3 Zusatz wird durch den grünen Balken angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 . Wirkung von ATP Erschöpfung und PIP3 Perfusion auf NHE3 Transporter Aktivität in Zellen PS120 und "OK".
Wirkung der Apyrase-vermittelten ATP-Abbau auf NHE3 Aktivität und reservieren Sie die Wirkung von Apyrase auf NHE3 Aktivität induziert durch PIP3 Intra-Pipette Perfusion: A. PS120 Zellen mit dem Ausdruck ihrer NHE3-wt oder B. PS120 Zellen mit dem Ausdruck ihrer NHE3-YRK, NHE3-Mutanten, die nicht in der Lage, Phosphoinositides zu binden. C. "OK" Zellen mit dem Ausdruck ihrer endogenen NHE3. Solide Kreise zeigen Durchschnittsdaten aus einzelnen Experimenten (vier Experimente unter denselben Bedingungen). Fehlerbalken stellen die Mittel ± Standardfehler (SE). * P < 0,05 vs. Kontrolle, ANOVA. $ P < 0,5, $$P < 0,01 Apyrase vs. Apyrase + PIP3, ANOVA. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 . Wirkung von PI (4,5) P2 (PIP2) und ANP-PNP Perfusion auf NHE3 Tätigkeit nach ATP-Verarmung.
Wirkung von A. PIP2 oder B. ANP-PNP Intra-Pipette Perfusion über die Apyrase-abhängige Reduzierung der NHE3 Aktivität in PS120 Zellen mit dem Ausdruck NHE3-WT solide Kreise Durchschnittsdaten aus einzelnen Experimenten (vier Experimente unter denselben Bedingungen zeigen). Fehlerbalken darzustellen Mittel ± SE. * P < 0,05, ** P < 0,01 vs. Kontrolle, ANOVA. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Trotz der wichtigen Funktionen von Transportern sind die Methoden zur Verfügung, um ihre Tätigkeit zu studieren ineffektiv und unzureichend. Eine Einschränkung besteht darin, dass die verfügbaren Methoden Ionenbewegung vermittelt durch Transporter Aktivität ohne Rücksicht auf Schwankungen der intrazellulären Ionen-Zusammensetzung während das Experiment4messen. Die vorgestellte Methode sorgt für präzise Steuerung der extrazellulären und intrazellulären Ionen-Kompositionen und bietet ein leistungsstarkes Tool zum Ändern von intrazellulären Ionen, Protein und Lipid Kompositionen3,4,5.
Der wichtigste Schritt in diesem Protokoll ist die Vorbereitung einer ISE, die für einen langen Zeitraum25stabil ist. Nach unserer Erfahrung ist eine instabile ISE nicht gut silikonisierte (z. B. die ionenselektive Harz wird auf der ISE-Pipette-Seiten verteilt), die durch eine konstante und unkontrollierbare Drift in der ISE-Signal detektiert werden. Darüber hinaus sollten die Harz-Verteilung in der ISE während des Experiments engmaschig überwacht werden. Die Bad-Lösung kann die ionenselektive Harz in die ISE-Pipette, Erstellen einer Spalte Bad-Lösung vor der Harz25drücken. In diesem Fall wird die ISE die Ionenkonzentration aus dieser Spalte aufnehmen und ausweichenden auf Veränderungen in der Ionen-Gradienten während des Experiments. Anpassung der Geometrie der ISE Schlüssel erhalten eine ISE-Antwort im Bereich von 100 ms9 und überwinden mögliche Verzögerungen in ISE Zeitverhalten im Vergleich mit Veränderungen in der Ionen-Gradienten.
Die größte Beschränkung der vorgestellten Methode wird aus dem Beet spannen Messung Transporter Aktivität in Epithelzellen geerbt. Wenn aus der Halterung gelöst und in der Schwebe gehalten, verlieren polarisierte epitheliale Zellen die polarisierte Lokalisierung der Transporter auf der apikalen oder basolateralen Membran.
Ein modifizierte Patch spannen Messung sollte verwendet werden, wenn Kanäle und Transporter im polarisierten Epithelien zu studieren. Wenn man bedenkt, dass Zellen in einen Zylinder annähern könnte, anstatt eine Kugel ist wichtig, wenn die Steigung H+ verwandelt in Flux über die Formel zur Verfügung gestellt. In diesem Fall sollte die Formel geändert werden, um 
wo λ die Länge des Zylinders ist, R ist der Radius des Zylinders, Ad X ist der radiale Abstand vom Zylinder Mittelpunkt der Gradient über die gemessenen5 ist. Künftige Entwicklung dieser leistungsstarke Technik für das Studium elektroneutraler Transporter sollte über die Änderung der Methode zur Optimierung der Aufnahme Zellen gewachsen in einem monomolekularen Film konzentrieren.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenlegen.
Acknowledgments
Die Autoren möchten danke Eric Fishback (Des Moines University, Des Moines, Iowa, USA) für seine Unterstützung bei der Aufnahme und Bearbeitung der Videos. Die PS120 Fibroblasten-ähnliche Zellen stabil mit dem Ausdruck NHE3-wt oder NHE3-YRK wurden freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. Mark Donowitz (Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD, USA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Patch clamp Amplifier | Molecular Devices | ||
| Dual Channel Differential Electrometer (HiZ-223) | Warner Instruments | 64-1650 | |
| Differential Amplifier (DP-301) | Warner Instruments | 64-0044 | |
| Patch Clamp Software Based on MatLab | MatLab with acquisition toolbox | The capmeter software is recommended | |
| ThermoClamp-1 Temperature Control System | AutoMate Scientific | 03-11-LL | In-line heater |
| Single-Channel Temperature Controller (TC-324C) | Warner Instruments | 64-2400 | |
| Single-Barrel Standard Borosilicate Glass Tubing | World Precision Instruments | 1B120F-3 | Used for ion selective electrodes |
| Micropipette Storage Jar | World Precision Instruments | E212 | |
| Bis(dimethylamino)dimethylsilane | Sigma-Aldrich | 14755-100ML | |
| Carbon tetrachloride | Sigma-Aldrich | 319961-500ML | |
| Hydrogen ionophore I - cocktail B | Sigma-Aldrich | 95293 | |
| Thin Wall Borosilicate Tubing | Sutter Instrument | B200-156-15 | Used for patch clamp pipette |
| Soft glass (Corning 8161 Patch Glass) | Warner Instruments | 64-0815 | |
| Silica Capillary Tubing (150um OD/75um ID) | Molex (Polymicro Technologies) | 106815-0018 | Used for intra-pipette perfusion system |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium aspartate | Sigma-Aldrich | A6558 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M4880 | |
| Mg-ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Apyrase | Sigma-Aldrich | A6535 | |
| Phosphatidylinositol(4,5) bisphosphate diC8 | Echelon Biosciences | P-4508 | |
| Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate diC8 | Echelon Biosciences | P-3908 |
References
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