Summary
ويصف هذه المخطوطة تطبيقات أقطاب انتقائية بروتون والتصحيح لقط أساليب لقياس نشاط نظم النقل بروتون. هذه الأساليب التغلب على بعض القيود المفروضة على التقنيات المستخدمة عادة لدراسة نشاط النقل بروتون، مثل الحساسية معتدل ووقت القرار ومراقبة الوسط داخل الخلية غير كافية.
Abstract
ويضمن نقل الأيونات خلال أغشية الخلية غرامة مراقبة محتوى أيون داخل وخارج الخلية التي لا غنى عنها لبقاء الخلية. آليات النقل هذه هي توسط أنشطة البروتينات المتخصصة الناقل. على وجه التحديد، ناعما يسيطر ديناميات الأس الهيدروجيني غشاء البلازما بروتون (H+) البثق النظم، مثل Na++ /H مبادل (نة) البروتين الأسرة. وعلى الرغم من الجهود المكثفة دراسة الآليات الكامنة وراء تنظيم نة، فهمنا الحالي للخصائص الفيزيائية-الحيوية والجزيئية للأسرة نة غير كافية بسبب محدودية توافر أساليب لقياس فعالية النشاط نة . في هذه المخطوطة، استخدمنا ح+-أقطاب انتقائية خلال كامل الخلية التصحيح تسجيل لقط لقياس التدفق الناجم عن نة ح+ . واقترحنا هذا النهج للتغلب على بعض القيود التي تفرضها عادة تستخدم أساليب لقياس النشاط نة، مثل الإقبال المشعة والغشاء الفلورسنت بيرمينتس. يمكن قياس نشاط نة باستخدام الأسلوب هو موضح حساسية عالية ووقت القرار ومراقبة أكثر فعالية لتركيزات ح+ داخل الخلايا. ح+-أقطاب انتقائية يتم على أساس حقيقة أن يخلق نشاط الناقل تدرج أيون بالقرب من غشاء الخلية. ح+-القطب الانتقائي نقل تصل إلى وبعيدا من غشاء الخلية بطريقة متكررة ومتذبذبة سجلات فرق جهد اعتماداً على التمويه ح+ . بينما ح+--يتم استخدام أقطاب انتقائية للكشف عن التمويه ح+ تتحرك خارج الخلية، يتم استخدام أسلوب المشبك التصحيح في تكوين كل خلية للتحكم في تكوين أيون داخل الخلايا. وعلاوة على ذلك، يسمح تطبيق أسلوب المشبك التصحيح العملاقة بتعديل تكوين الأيونات ليس فقط ولكن أيضا الدهون داخل الخلايا. تم قياس نشاط الناقل isoform نة 3 (NHE3) باستخدام هذا النهج التقني إلى دراسة الأساس الجزيئي للتنظيم NHE3 قبل فوسفوينوسيتيديس.
Introduction
نقل الأيونات والذوائب عبر غشاء البلازما ضروري لبقاء الخلايا، ومن ثم للكائنات الحية1. النقل الانتقائي من الأيونات والذوائب يتحقق من خلال مجموعة من القنوات المتخصصة والبروتينات الناقل. كثيرا ما تؤدي الطفرات في هذه البروتينات في مجموعة متنوعة من الظروف السريرية، مما يجعل القناة ونقل البروتينات أهدافا محتملة للعلاج الدوائي1. ولسوء الحظ، فهم الآليات الأساسية لوظيفة القناة والناقل والتنظيم غالباً ما تكون محدودة بالنهج المتاحة لدراسة عن النشاط2،،من34.
على وجه التحديد، الناقلين يمكن تقريبا دون تقسيمها إلى مجموعتين كبير تبعاً لما إذا كان أنهم تغيير إمكانيات transmembrane الخلية أثناء نقل الذوائب: الناقلون أيون وآﻻت تغيير [مثلاً -فوسفات الصوديوم 2a الناقل المشارك (NaPi2a)، مبادل الصوديوم-الكالسيوم (نك)، إلخ.] أو الناقلين غير تغيير أيون اليكترونيوترال [مثل مبادل الصوديوم-بروتون (نة)، وكلوريد الصوديوم الناقل المشارك، NaPi2c، إلخ.]. وقد درست أنشطة كل من الفئات من الناقلين على نطاق واسع باستخدام امتصاص نظائر المشعة والأصباغ الفلورية غشاء بيرمينت2. كلا النهجين تقدير نشاط الناقلين بقياس التغيرات في تركيز الجزء الأكبر من أيونات هيولى محددة، وكلا الأسلوبين على قيود، مثل حساسية معتدلة والقرار الوقت وعدم كفاية الرقابة من داخل الخلايا الوسط. وفي الواقع، نشاط العديد من شركات النقل تعتمد على تركيز أيونات يجري بها (مثلاً، NHE3، نك) هيولى، والتغيرات في تركيزات أيون هذه من المتوقع أن تلعب دوراً هاما في تنظيم نقل النشاط2 , 3 , 5-القياس الدقيق لهذه الآليات التنظيمية ويقتصر استخدام الأساليب الكلاسيكية.
للتغلب على هذه القيود، تستخدم أساليب المشبك التصحيح لدراسة نقل النشاط2،6. على وجه التحديد، ذات مرجعية ذاتية أقطاب الأيوني الانتقائي (الجمعية)7،8 جنبا إلى جنب مع التصحيح لقط النظام سمح مؤخرا بقياس اليكترونيوترال نقل النشاط3،4 , 5-الجمعية على أساس حقيقة أن يخلق نشاط الناقل تدرج أيون بالقرب من غشاء الخلية. بورصة اسطنبول نقل ما يصل إلى وبعيدا عن غشاء الخلية في المتكررة، أزياء متذبذبة سجلات فرق جهد (µV). الاختلافات الجهد يمكن تحويلها إلى قيم الجريان أيون باستخدام أسلوب معايرة التي يتم تطبيق أول قانون فيك للانتشار2،9. بينما يتم استخدام الجمعية للكشف عن تدفق الأيونات تتحرك من الخلايا، طريقة المشبك التصحيح في كلا كامل الخلية أو تكوينات من الداخل إلى الخارج يستخدم للتحكم في تكوين غشاء أيون داخل الخلايا والمحتملة. وعلاوة على ذلك، تطبيق تقنية المشبك التصحيح العملاقة يسمح بتعديل تكوين الأيونات ليس فقط ولكن أيضا3،الدهون والبروتينات5داخل الخلايا.
وباختصار، براعة الأسلوب المشبك التصحيح بالمقارنة مع أن نشاط الناقل جعلت من أساليب أخرى لدراسة تصحيح لقط مناسبة للتغلب على القيود الشائعة لهذه الأساليب الأخرى. المزيج من الذاتي الرجوع إلى الجمعية وتقنيات المشبك التصحيح يوفر إمكانية فريدة لقياس نشاط الناقلين اليكترونيوترال في بيئة تجريبية الخاضعة لأحكام الرقابة واكتشاف رواية الفيزيائية-الحيوية والجزيئية خصائص لغشاء الخلية النقل3،،من45. هذا النهج قد استخدمت بنجاح لدراسة نشاط نة. الأسرة البروتين نة الثدييات يحفز تبادل الصوديوم خارج الخلية (نا+) صافي اليكترونيوترال للبروتون داخل الخلايا (ح+)10،11 الاستفادة تدرج نا+ إلى الداخل. في الثدييات، وتضم الأسرة البروتين نة 11 البروتينات ذات الصلة (NHE1-9 و NHA1-2)، وخاصة بالحيوانات المنوية نة10،،من1213.
نيس (عائلة SLC9a) تم العثور على أوبيكويتوسلي في معظم الكائنات الحية من بدائيات النوى بسيطة إلى أعلى حقيقيات النوى ويشاركون في مجموعة متنوعة من الخلية الحيوية وظائف10،11، بما في ذلك السيطرة على الدفاع الملوحة الخلية في بدائيات النوى، الحفاظ على التوازن وخلية حجم حمض-قاعدة، وتنظم امتصاص الماء والملح في مختلف epithelia المتخصصة10،،،من1214،15. الأدوار البيولوجية الرئيسية من نيس وأهمية وظائفهم قد حددت من خلال العديد من الدراسات؛ ومع ذلك، حققت بضعة دراسات الخصائص الفيزيائية-الحيوية والجزيئية للثدييات نيس بسبب القيود المنهجية4. في الآونة الأخيرة، قد كشفت عن تطبيق الذاتي الرجوع إلى الجمعية أثناء تصحيح كامل الخلية لقط الآليات الجزيئية رواية من isoforms نة تخضع لتغييرات في تركيزات الأيونات والبروتينات وشكلها3، داخل الخلايا 4.
على وجه التحديد، يحدد البروتوكول المنصوص عليها في هذه المخطوطة بأساليب ونهج لدراسة النشاط وتنظيم isoform نة 3 (NHE3)، لاعبا رئيسيا في امتصاص Na+، Cl–،– HCO3والسوائل في فرشاة الحدود غشاء ابيثيليا الكلوية والمعوية14،16. نظرة جديدة إلى الاختلافات في حساسية النشاط NHE3 إلى فوسفوينوسيتيديس داخل الخلايا (فوسفاتيديلينوسيتيدي 4، 5-بيسفوسفاتي [P2 PI (4، 5)] وفوسفاتيديلينوسيتيدي 3,4,5-ثلاثي [PI(3,4,5]P3]) يقال. خلية النقل البروتينات، مثل القنوات والناقلين، وينظم فوسفوينوسيتيديس17، و NHE3 مباشرة تربط PI (4، 5) P2 و P3 PI (3,4,5)18. تستند إلى الكتابات الحالية، أما فوسفوينوسيتيدي يمكن أن تكون ذات صلة لتنظيم الفسيولوجية أو الفيزيولوجية المرضية NHE35،،من18إلى19. دعم النتائج التي توصلنا إليها أدوار منفصلة ل PI (4، 5) P2 و P3 PI (3,4,5) في تنظيم النشاط NHE3. وكان هذا التمييز ممكن بسبب تطبيق تقنيات بورصة اسطنبول في تركيبة مع تسجيل المشبك تصحيح كامل الخلية. يسمح هذا الأسلوب أيضا السيطرة على المحتوى فوسفوينوسيتيدي الخلوية عن طريق نضح داخل الخلايا من فوسفوينوسيتيديس مختلفة أثناء قياس النشاط NHE3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: اثنين من مكبرات الصوت مطلوبة لتسجيل نشاط الناقلين اليكترونيوترال ببورصة اسطنبول ذات مرجعية ذاتية بالاقتران مع التصحيح لقط، مكبر للصوت المشبك تصحيح للحفاظ على الخلية الموجودة في تكوين كل خلية و (مكبر للصوت عالية إيمبيندينسي الكترومتر) لتسجيل نشاط الناقل عبر بورصة اسطنبول (انظر الجدول للمواد). مكبر للصوت المشبك التصحيح متصل مباشرة إلى المجلس اقتناء محطة طرفية. الكترومتر متصل بمكبر للصوت التفاضلية المستخدمة لتصفية وتضخيم الإشارات. مكبر للصوت التفاضلية متصلاً بالمجلس اقتناء محطة طرفية. كابميتير، تصحيح المشبك البرمجيات التي تراقب قدرة الخلية، وقد استخدمت في السابق دراسات20 (انظر الجدول للمواد). يتم الاحتفاظ بتسجيل الدائرة ونضح الحلول عند 37 درجة مئوية.
1. إعداد الماصات للجمعية
- سحب الماصات من زجاج البورسليكات الشعيرات الدموية إلى قطر خارجي من 1.2 مم (انظر الجدول للمواد) استخدام ساحبة ماصة2 .
- البولندية ماصة تستخدم في ميكروفورجي. يجب أن يكون قطر طرف ماصة 2-3 ميكرومتر.
- مكان الماصات في حامل جرة الماصات بطرف ماصة مواجهة (انظر الجدول للمواد).
تحذير: الخطوات 1.4-1.6 في غطاء الأبخرة كيميائية جيدة التهوية. - مزيج سيليكونيزيشن المزيج الذي يتألف من قطره 1 (~ 150 ميليلتر) مكررا (ديميثيلامينو) ثنائي ميثيل سيلاني و 10 قطرات من رابع كلوريد الكربون (انظر الجدول للمواد).
- صب الخليط سيليكونيزيشن في الجرة وإغلاق الغطاء محكم.
- احتضان الجرة مع خليط سيليكونيزيشن ح 24-48 في غطاء الأبخرة كيميائية في درجة حرارة الغرفة حتى يتبخر الخليط تماما.
- الردم الماصة مع الراتنج الأيوني الانتقائي المناسبة لإنشاء عمود لما يقرب من 2-4 مم.
ملاحظة: الهيدروجين ionophore أنا ب كوكتيل يمكن تسجيل أوسيدفور نة النشاط (انظر الجدول للمواد). - اضغط غيض ماصة لتوزيع الراتنج الأيوني الانتقائي لهذه المعلومة، ووضع الماصة عمودياً في حامل جرة مع طرف ماصة أسفل.
- شيكوندير مجهر تشريح أن كوكتيل راتنج قد وصلت إلى نهاية الحافة. إذا لزم الأمر، تطبيق الضغط الإيجابي لدفع الراتنج إلى النهاية.
- الردم النصف-الماصة مع الحل المناسب (~ 100 ميكروليتر). هنا، استخدم بوكل 100 و 10 ملم حبيس في درجة الحموضة 7.0 إذا كان استخدام ionophore أنا ب كوكتيل
- الاتصال في بورصة اسطنبول الكترومتر ووضع طرف بورصة اسطنبول في حمام الحل المستخدم لتسجيل. صفر في الكترومتر.
- اختبار ح+-استجابة بورصة اسطنبول انتقائية عن طريق تغيير الرقم الهيدروجيني للحل حمام. ح متوسط+-انتقائية بورصة اسطنبول استجابة ~ 58 أم كل وحدة من الأس الهيدروجيني.
- دورياً بتقييم استجابة بورصة اسطنبول للمعايرة.
2-إعداد المشبك التصحيح الماصات للتسجيل
ملاحظة: ينصح الأسلوب وصف دونالد هيلجيمان في مقالته على "تسجيل" قناة واحدة21 .
- سحب الماصات لتصحيح العملاقة من زجاج البورسليكات الشعيرات الدموية (ممود 2.0/1.5 ملم معرف) على ماصة ساحبة2،،من2223.
- استخدام ميكروفورجي التي شنت على مرحلة المجهر المقلوب جعل نصيحة (10-22 ميكرومتر) ماصة واسعة23. تذوب حبة (~ 0.5 مل) من الزجاج الناعمة على سلك البلاتين سميكة ميكروفورجي.
ملاحظة: مطلوب سلك البلاتين سميكة نسبيا (~0.5 ملم) اختﻻق الماصات التصحيح العملاقة. - ضع ماصة التصحيح قريبة من حبة الزجاج الناعمة، وتطبيق الحرارة كاملة حتى يبدأ التلميح الانحسار. سيتم نقل سلك البلاتين قليلاً نحو سينتيردورينج التدفئة.
- إيقاف الحرارة، ودفع طرف الماصة إلى حبة الزجاج خففت. سوف تتراجع سلك التبريد وكسر طرف ماصة.
- قم بإعادة الحرارة إلى نصيحة ماصة على نحو سلس وإنشاء تلميح ماصة للقطر المطلوب. قطر الطرف يتوقف على حجم الخلية لتكون مصححة (8-10 ميكرومترات في هذه الدراسة).
3-إعداد الخلايا
- الاحماء العازلة الفوسفات المالحة (PBS) دون Ca2 + وملغ2 +والحل يدتا التربسين والمتوسطة النمو إلى في 37 درجة مئوية.
- تغسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني. استخدم 1 مل من المخزن المؤقت للوحة الثقافة الخلية قطرها 35 ملم.
- إضافة 0.5 مل التربسين للخلايا للوحة الثقافة الخلية قطرها 35 ملم.
ملاحظة: عندما تبدأ الخلايا مجمله، ويهز لوحة لإلغاء إرفاق الخلايا. - إيقاف عمل التربسين بإضافة 5 مل (مقدار للوحة الثقافة الخلية قطرها 35 ملم) من متوسط النمو الكامل وتستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين.
ملاحظة: وقت رد الفعل في التربسين نوع من الخلايا التابعة. - وضع الخلايا على شاكر مع هزاز لمنع تشكيل كتل.
- استخدام الخلايا لتصل إلى 2 حاء بعد تريبسينيزيشن.
ملاحظة: قد تختلف الوقت اعتماداً على خط الخلية.
4-إعداد نظام التروية ماصة البينية
- قطع حجم مناسب من الأنابيب الكوارتز (150 ميكرومتر OD/75 معرف ميكرومتر) لإعداد خط التروية الماصة داخل.
- إدراج جانب واحد من الأنابيب الكوارتز في تلميح ماصة 200 ميليلتر. الصق الأنبوب مرو على الحافة، وقطع نهاية الحافة مع شفرة حلاقة حادة.
- قم بتوصيل خط التروية (أنابيب الكوارتز لصقها على الطرف) قطعة صغيرة من السيليكون الأنابيب التي ستكون بمثابة مستودع للحل نضح الماصة داخل.
- قم بتوصيل أنابيب السيليكون حقنه خلق ضغط إيجابي.
- إدراج الموانئ الحرة نهاية الأنبوب الكوارتز من خلال الأنبوب البولي إثيلين حامل ماصة نضح (انظر الجدول للمواد).
- تقييم خط التروية مع الحل ماصة.
5-إعداد الحلول
- تعد حلاً ماصة مخزنة بشكل كبير لتسجيل نة (1 مم عطا، 0.5 مم مجكل2, ملم 10 ملغ-ATP، 12.5 ملم حبيس 115 مم البوتاسيوم اسبارتاتي (الصناعية)، وأنابيب 12.5 ملم والممسحات 12.5 ملم و 12.5 ملم مس، pH 6.0 تعديلها مع حمض الأسبارتيك).
ملاحظة: إعداد ماصة الأسهم الحل والتصفية. إضافة ATP ملغ قبل التسجيل. - إعداد حل حمام جديدة في كل مرة (140 ملم كلوريد الصوديوم، كاكل 2 مم2، 2 مم مجكل2، ومم 0.1 تريس-HCl pH 8.2).
6-تسجيل نشاط الناقل
- الحفاظ على دائرة التسجيل وكافة الحلول في 37 درجة مئوية، لأن نشاط الناقل تعتمد على درجة الحرارة.
- وضع الخلايا في قاعة التسجيل. انتظر حتى أنهم إسقاط إلى أسفل الدائرة ولكن لا تدع لهم إرفاق إلى الدائرة.
- اختر خلية مناسبة. قياس قطر الخلية مع ميكرومتر بصري. اختر الخلايا مع أقطار مشابهة.
ملاحظة: عموما، خلية كبيرة سيكون أكثر الخلوية السطحية وربما أكثر الناقلين عن لها غشاء البلازما، وهكذا أيضا وجود نشاط الناقل أكثر. ومع ذلك، هذا غير صحيح بالضرورة، كما نقل النشاط يعتمد على الناقل محددة ونوع الخلية قيد الدراسة. - جبل ماصة ميكرويليكترودي الأيوني الانتقائي ميكرومانيبولاتور، والردم ماصة لقط التصحيح مع الحل داخل الخلايا، يجب التأكد من أن الحل الذي يصل إلى طرف ماصة2.
ملاحظة: قد يتطلب عدة صنابير لطيف للقضاء على فقاعات في تلميح الماصة. - جبل ماصة لقط التصحيح إلى مرحلة الرأس الكهربية إعداد2،،من2223.
ملاحظة: من المهم إبقاء مرحلة الرأس بزاوية 45 درجة على المحور الأفقي، كما يضمن زاوية دخول الماصة التي مناسبة لتشكيل الختم شديدة المقاومة. - تطبيق ضغط إيجابي صغير (~ 5 سم ح2س) إلى ماصة التصحيح تقليل فرصة لعرقلة التلميح، ووضعه في حمام الحل.
- إيقاف نقل ماصة المشبك التصحيح بمجرد التلميح يقع بالقرب من الخلية.
- تخفيف الضغط الإيجابي بينما ماصة يمس الخلية وتطبيق ضغط سلبي طفيف (~ 5 سم ح2س) للحصول على > 1000 ختم MΩ (جيجا أوم) على غشاء الخلية مع التصحيح "الماصة؛"23.
- ضع ماصة التصحيح مع الخلية في نفس المستوى البؤري كما بورصة اسطنبول، ونقل ماصة التصحيح مع الخلية بالقرب من بورصة اسطنبول (~ 5-10 ميكرون)2،5 ولكن تجنب السماح للخلية إلى الاتصال ببورصة اسطنبول (الشكل 1A).
- أؤكد أن عقد المحتملة 0 أم.
- تمزق الختم مع مجموعة من سوكشنز قصيرة الحصول على تكوين كامل الخلية.
- الانتقال إلى بورصة اسطنبول (أو ماصة المشبك التصحيح) ببطء اليسار أو من أعلى إلى أسفل تسجيل نشاط الناقل (الشكل 1B).
- سجل قمم على الأقل 5-8 (الشكل 1، من أ إلى ب).
- تطبيق مربع موجه اضطرابات أثناء التسجيل لمراقبة نوعية الختم والسعة غشاء الخلية (الشكل 1).
- تقدير تدفق ح+ (
) من الفرق في تركيز ح+ الحرة بين سطح الخلية والحل الأكبر (ΔH+)
ملاحظة:
و 
ح+ والمخزن المؤقت معاملات نشرها على التوالي، بر هو تركيز المخزن المؤقت الإجمالية، كد ثابت تفكك المخزن المؤقت، r هو الخلية دائرة نصف قطرها، و 
يحدد تغيير الحالة المستقرة في تركيز ح منضم+ لتغيير طفيف في ح الحرة+. ح+ يشير إلى بروتون مجاناً في الحل. أن تكون متسقة مع الدراسات السابقة، يتم تحويل الدفقات ح+ إلى وحدات التمويه الكهربية عن طريق حساب مكافئات الحالية للتدفقات (/faraday) في السلطة الفلسطينية3،5]. - تطبيع تدفق بروتون إلى سطح الخلية التي يمكن حسابها من حجم الخلية أو السعة الغشاء.
) من الفرق في تركيز ح+ الحرة بين سطح الخلية والحل الأكبر (ΔH+)
و 
ح+ والمخزن المؤقت معاملات نشرها على التوالي، بر هو تركيز المخزن المؤقت الإجمالية، كد ثابت تفكك المخزن المؤقت، r هو الخلية دائرة نصف قطرها، و 
يحدد تغيير الحالة المستقرة في تركيز ح منضم+ لتغيير طفيف في ح الحرة+. ح+ يشير إلى بروتون مجاناً في الحل. أن تكون متسقة مع الدراسات السابقة، يتم تحويل الدفقات ح+ إلى وحدات التمويه الكهربية عن طريق حساب مكافئات الحالية للتدفقات (Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لدراسة تنظيم النشاط NHE3 تطبقها فوسفوينوسيتيديس بورصة اسطنبول ذات مرجعية ذاتية أثناء تسجيل المشبك تصحيح كامل الخلية. واستخدمت PS120 تنتجها الخلايا الليفية مثل الخلايا24، التي تفتقر إلى التعبير عن غشاء البلازما الذاتية نيس،. NHE3 البرية من نوع (NHE3-wt) أو طفرات NHE3 التي لا فوسفوينوسيتيديس ربط [تيروزين 501، ارجينين 503 و 505 يسين تم استبداله بالأنين، Y501A/R503A/K505A (NHE3-يرك)] أبديت [ستبلى] في PS120 تنتجها الخلايا الليفية مثل الخلايا18.
وترد في الشكل 2الآثار. الخلية هالدين تكوين كامل الخلية قبل ماصة للتصحيح لقط، وبورصة اسطنبول وضعت أمام الخلية. في هذا الموقف، سجلت بورصة اسطنبول تركيز مجاناً ح+ قريبة من غشاء الخلية (الشكل 1A)؛ ثم بورصة اسطنبول (أو ماصة المشبك التصحيح) تم نقلها يدوياً جانبياً 50 ميكرومتر وسجلت تركيز مجاناً ح+ في الحل (الشكل 1B). الاختلافات الجهد مسجل، المقابلة لوظيفتي ماصة التصحيح مع الخلية أمام أو بعيداً عن بورصة اسطنبول، هي الممثل للنشاط NHE3 (الشكل 1). نضح داخل الماصة من أبيراسي (ATP-ديفوسفاتاسي) يقلل من تركيز داخل الخلية ATP، تناقص المحتوى فوسفوينوسيتيدي5في وقت لاحق. باﻻتفاق مع دراسات سبق الإبلاغ عنها5،،من1819، خفض محتوى فوسفوينوسيتيدي انخفاض توسط العلاج أبيراسي نشاط NHE3 (~ 50%)، التي تم تسجيلها كانخفاض في الجهد السعة التذبذب (الشكل 2). انعكس أثر أبيراسي (النظر في 5 وحدات/ml) على النشاط NHE3 تماما من نضح داخل الماصة أبيراسي في تركيبة مع 2 ميكرومتر P3 PI (3,4,5) (الشكل 2 و 3 ألف). ودعمت هذه النتائج بالنشاط NHE3 المسجلة في الخلايا PS120 ستابلي معربا عن طفرات NHE3 (NHE3-يرك) التي كانت غير قادر على ربط فوسفاتيديلينوسيتيديس18. نضح أبيراسي وحدها أو في تركيبة مع PIP3 لا تؤثر على نشاط NHE3 في NHE3-يرك طفرات (الشكل 3B). كان أيضا تثبيط نشاط NHE3 الذاتية بالعلاج أبيراسي في خلايا الكلي (موافق) الابوسوم3. نضح داخل الماصة من P3 PI (3,4,5) عكس تثبيط النشاط NHE3 الناجمة عن أبيراسي في خلايا موافق (الشكل 3). توحي هذه النتائج أن تأثير P3 PI (3,4,5) على نشاط NHE3 لا خلية نوع معين.
المقبل، ونحن تهدف إلى اختبار خصوصية PIP3 في تنظيم أبيراسي بوساطة التغيرات في النشاط NHE3. لقد فعلنا ذلك بفحص أثر على الحد أبيراسي-تعتمد على النشاط NHE3 بعد نضح فوسفوينوسيتيديس أخرى، مثل P2 PI (4، 5). P2 PI (4، 5) (في 10 ميكرون) لا يؤثر انخفاض النشاط NHE3 توسط أبيراسي (الشكل 4 أ). وأخيراً، لم تمنع نضح لامبير-الحزب الوطني التقدمي، بث ATP غير هيدروليسابل، ثيبيراسي-تعتمد على تثبيط النشاط NHE3 (الشكل 4 باء). وتوحي هذه النتائج بدور P3 PI (3,4,5)، ولكن لا P2 PI (4، 5)، في تنظيم NHE3 بعد استنفاد ATP. تحديد أدوار منفصلة بالنسبة PI (4، 5) P2 و P3 PI (3,4,5) في NHE3 التنظيم كان ممكناً فقط بسبب نضح بين الخلايا من فوسفوينوسيتيديس خلال قياسات بورصة اسطنبول جنبا إلى جنب مع المشبك تصحيح كامل الخلية تسجيل5. إجراء محدد P3 PI (3,4,5) بدلاً من P2 PI (4، 5) في تنظيم النشاط NHE3 قيمة لتحديد ما إذا كان فوسفوينوسيتيديس داخل الخلايا مختلفة تنظم وظيفة NHE3 بشكل مختلف.
الشكل 1 . التمثيل التخطيطي من ح+ الجريان القياس والعلاقة بين النشاط نة والاختلافات المحتملة التي سجلتها ميكروليكترودي pH.
التمثيل التخطيطي لإعداد التسجيل. أ الرسم التخطيطي للإعداد التجريبية الأولى. الخلية عقدت في تكوين كل خلية ماصة المشبك التصحيح ووضعت أمام بورصة اسطنبول. في هذا الموقف، يسجل بورصة اسطنبول تركيز مجاناً ح+ قريبة من غشاء الخلية. باء "بورصة اسطنبول" (أو ماصة المشبك التصحيح) يتم نقله يدوياً جانبياً ~ 50 ميكرومتر ويسجل تركيز مجاناً ح+ في الحل في هذا الموقف. جيم التمثيل الرسومي للاختلافات الجهد تسجيلها باستخدام في بورصة اسطنبول. الذبذبات من موقف (خلية أمام بورصة اسطنبول) ب (خلية أبعد ما يكون عن بورصة اسطنبول) تمثل النشاط نة. تسجيل البرمجيات المستخدمة الجهد الاختلافات سجلتها بورصة اسطنبول وإنشاء مربع موجه اضطرابات (20 mV، 0.2 كيلو هرتز) لرصد السعة غشاء الخلية ونوعية الختم المشبك التصحيح. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 . مثال على التسجيل المحددة لنشاط الناقل NHE3 في خلية واحدة PS120 ستابلي معربا عن NHE3 wt قبل وبعد التروية مع أبيراسي و P3 PI (3,4,5) (PIP3).
بعد التسجيل الأولى، كانت تستنفد الخلية من ATP نضح داخل الماصة من أبيراسي. النشاط NHE3 انخفض تدريجيا وأعيدت نضح الماصة داخل PIP3. تتم الإشارة إلى إضافة أبيراسي بشريط أحمر، ويشار إلى إضافة PIP3 بشريط أخضر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 . تأثير استنفاد ATP ونضح PIP3 في NHE3 نقل النشاط في الخلايا PS120 وموافق.
أثر استنفاد ATP بوساطة أبيراسي على النشاط NHE3 والاحتفاظ بتأثير أبيراسي على النشاط NHE3 الناجمة عن PIP3 داخل الماصة التروية: الخلايا PS120 أ إذ تعرب عن NHE3-wt أو باء. PS120 الخلايا وإذ تعرب عن NHE3-يرك، طفرات NHE3 غير قادر على ربط فوسفوينوسيتيديس. جيم الخلايا موافق معربا عن NHE3 الذاتية. وتظهر دوائر صلبة متوسط البيانات من التجارب الفردية (أربع تجارب أجريت في ظروف مماثلة). أشرطة الخطأ تمثل وسائل ± الأخطاء المعيارية (جنوب شرق). * ف < 0.05 مقابل السيطرة، ANOVA. $ ف < 0.5، أبيراسي < 0.01 $$P مقابل أبيراسي + PIP3، ANOVA. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 . أثر P2 PI (4، 5) (PIP2) والشرطة الوطنية اﻷنغولية PNP التروية في النشاط NHE3 بعد استنفاد ATP.
تأثير أ. PIP2 أو باء. نضح الماصة داخل الشرطة الوطنية اﻷنغولية PNP بخفض أبيراسي-تعتمد على النشاط NHE3 في الخلايا PS120 الإعراب عن NHE3-الوزن دوائر صلبة تظهر متوسط البيانات من التجارب الفردية (أربع تجارب أجريت في ظروف مماثلة). تمثل أشرطة الخطأ ± الوسائل ذاتها * P < 0.05، * * ف < 0.01 مقابل السيطرة، ANOVA. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وعلى الرغم من المهام الحاسمة للناقلين، الطرق المتاحة لدراسة نشاطها غير فعالة وغير كافية. قيد واحد أن الأساليب المتاحة قياس حركة أيون توسط نشاط الناقل دون النظر إلى التقلبات في تكوين أيون داخل الخلايا أثناء التجربة4. طريقة عرض يضمن مراقبة دقيقة من التراكيب أيون خارج الخلية وداخل الخلية ويوفر أداة قوية لتعديل الأيونات داخل الخلايا، البروتين والدهن التراكيب3،4،5.
أن أهم خطوة في هذا البروتوكول هو إعداد بورصة اسطنبول أن مستقر ل فترة طويلة25. في تجربتنا، بورصة اسطنبول غير مستقرة لا سيليكونيزيد جيدا (مثلاً، يتم إعادة توزيع الراتنج الأيوني الانتقائي على الجانبين ماصة بورصة اسطنبول)، التي يمكن الكشف عنها بواسطة انجراف ثابتة ولا يمكن السيطرة عليه في إشارة بورصة اسطنبول. بالإضافة إلى ذلك، توزيع الراتنج في بورصة اسطنبول ينبغي أن ترصد عن كثب أثناء التجربة. وقد دفع الحل حمام الراتنج الأيوني الانتقائي داخل الماصة بورصة اسطنبول، إنشاء عمود من حمام الحل قبل الراتنج25. في هذه الحالة، سوف سجل تركيز أيون من هذا العمود بورصة اسطنبول وتصبح nonresponsive للتغييرات في التدرجات أيون أثناء التجربة. ضبط هندسة بورصة اسطنبول هو المفتاح الحصول على استجابة بورصة اسطنبول في المجموعة من 100 مللي ثانية9 والتغلب على التأخيرات المحتملة في بورصة اسطنبول الوقت-الردود مقارنة بالتغيرات في التدرجات أيون.
الحد الرئيسية من طريقة عرض موروث من التصحيح لقط قياس نشاط الناقل في الخلايا الظهارية. عند فصل من الدعم، وأبقى على التعليق، قد تفقد الخلايا الظهارية الاستقطاب التعريب المستقطبة من الناقلين على غشاء قمي أو باسولاتيرال.
ينبغي أن تستخدم تصحيح تعديل لقط القياس عند دراسة القنوات والناقلين في epithelia الاستقطاب. إذ ترى أن الخلايا قد التقريبية إلى اسطوانة بدلاً من مجال المهم عند تحويل التدرج ح+ إلى التمويه عن طريق الصيغة المقدمة. في هذه الحالة، يجب تغيير الصيغة إلى 
حيث λ هو طول الاسطوانة، r هو نصف قطر الاسطوانة، الإعلان العاشر هو المسافة الشعاعية من منتصف الاسطوانة التي التدرج هو قياس5. ينبغي أن تركز التنمية المستقبلية لهذه التقنية القوية لدراسة اليكترونيوترال الناقلين على تعديل الأسلوب الأمثل خلايا التسجيل التي نمت في أحادي الطبقة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب قد لا يوجد تضارب في الكشف عن.
Acknowledgments
المؤلف يود أن يشكر إريك فيشباك (جامعة دي موين، دي موين، آيوا، الولايات المتحدة الأمريكية) لمساعدته مع إطلاق النار وتحرير الفيديو. وقدم الدكتور مارك دونوويتز (جامعة جونز هوبكنز مدرسة الطب، بالتيمور، ماريلاند، الولايات المتحدة الأمريكية) يرجى الخلايا تنتجها الخلايا الليفية مثل PS120 ستابلي يعبر عن وزن NHE3 أو NHE3-يرك.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Patch clamp Amplifier | Molecular Devices | ||
| Dual Channel Differential Electrometer (HiZ-223) | Warner Instruments | 64-1650 | |
| Differential Amplifier (DP-301) | Warner Instruments | 64-0044 | |
| Patch Clamp Software Based on MatLab | MatLab with acquisition toolbox | The capmeter software is recommended | |
| ThermoClamp-1 Temperature Control System | AutoMate Scientific | 03-11-LL | In-line heater |
| Single-Channel Temperature Controller (TC-324C) | Warner Instruments | 64-2400 | |
| Single-Barrel Standard Borosilicate Glass Tubing | World Precision Instruments | 1B120F-3 | Used for ion selective electrodes |
| Micropipette Storage Jar | World Precision Instruments | E212 | |
| Bis(dimethylamino)dimethylsilane | Sigma-Aldrich | 14755-100ML | |
| Carbon tetrachloride | Sigma-Aldrich | 319961-500ML | |
| Hydrogen ionophore I - cocktail B | Sigma-Aldrich | 95293 | |
| Thin Wall Borosilicate Tubing | Sutter Instrument | B200-156-15 | Used for patch clamp pipette |
| Soft glass (Corning 8161 Patch Glass) | Warner Instruments | 64-0815 | |
| Silica Capillary Tubing (150um OD/75um ID) | Molex (Polymicro Technologies) | 106815-0018 | Used for intra-pipette perfusion system |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium aspartate | Sigma-Aldrich | A6558 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M4880 | |
| Mg-ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Apyrase | Sigma-Aldrich | A6535 | |
| Phosphatidylinositol(4,5) bisphosphate diC8 | Echelon Biosciences | P-4508 | |
| Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate diC8 | Echelon Biosciences | P-3908 |
References
- Rives, M. L., Javitch, J. A., Wickenden, A. D. Potentiating SLC transporter activity: Emerging drug discovery opportunities. Biochem Pharmacol. , (2017).
- Kang, T. M., Markin, V. S., Hilgemann, D. W. Ion fluxes in giant excised cardiac membrane patches detected and quantified with ion-selective microelectrodes. J Gen Physiol. 121 (4), 325-347 (2003).
- Babich, V., Vadnagara, K., Di Sole, F. The biophysical and molecular basis of intracellular pH sensing by Na+/H+ exchanger-3. FASEB J. 27 (11), 4646-4658 (2013).
- Fuster, D., Moe, O. W., Hilgemann, D. W. Steady-state function of the ubiquitous mammalian Na/H exchanger (NHE1) in relation to dimer coupling models with 2Na/2H stoichiometry. J Gen Physiol. 132 (4), 465-480 (2008).
- Fuster, D., Moe, O. W., Hilgemann, D. W. Lipid- and mechanosensitivities of sodium/hydrogen exchangers analyzed by electrical methods. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (28), 10482-10487 (2004).
- Forster, I. C., Virkki, L., Bossi, E., Murer, H., Biber, J. Electrogenic kinetics of a mammalian intestinal type IIb Na(+)/P(i) cotransporter. J Membr Biol. 212 (3), 177-190 (2006).
- Smith, P. J., Trimarchi, J. Noninvasive measurement of hydrogen and potassium ion flux from single cells and epithelial structures. Am J Physiol Cell Physiol. 280 (1), C1-C11 (2001).
- Parker, M. D., Musa-Aziz, R., Boron, W. F. The use of extracellular, ion-selective microelectrodes to study the function of heterologously expressed transporters in Xenopus oocytes. Am J Physiol Cell Physiol. 296 (5), C1243 (2009).
- Smith, P. J. S., Sanger, R. H., Messerli, M. A. Electrochemical Methods for Neuroscience. Michael, A. C., Borland, L. M. , CRC Press/Taylor & Francis. 373-406 (2007).
- Orlowski, J., Grinstein, S. Diversity of the mammalian sodium/proton exchanger SLC9 gene family. Pflugers Arch. 447 (5), 549-565 (2004).
- Brett, C. L., Donowitz, M., Rao, R. Evolutionary origins of eukaryotic sodium/proton exchangers. Am J Physiol Cell Physiol. 288 (2), C223-C239 (2005).
- Bobulescu, I. A., Di Sole, F., Moe, O. W. Na+/H+ exchangers: physiology and link to hypertension and organ ischemia. Curr Opin Nephrol Hypertens. 14 (5), 485-494 (2005).
- Donowitz, M., Ming Tse, C., Fuster, D. SLC9/NHE gene family, a plasma membrane and organellar family of Na(+)/H(+) exchangers. Mol Aspects Med. 34 (2-3), 236-251 (2013).
- Zachos, N. C., Tse, M., Donowitz, M. Molecular physiology of intestinal Na+/H+ exchange. Annu Rev Physiol. 67, 411-443 (2005).
- Girardi, A. C., Di Sole, F. Deciphering the mechanisms of the Na+/H+ exchanger-3 regulation in organ dysfunction. Am J Physiol Cell Physiol. 302 (11), C1569-C1587 (2012).
- Bobulescu, I. A., Moe, O. W. Na+/H+ exchangers in renal regulation of acid-base balance. Semin Nephrol. 26 (5), 334-344 (2006).
- Hilgemann, D. W., Feng, S., Nasuhoglu, C. The complex and intriguing lives of PIP2 with ion channels and transporters. Sci STKE. (111), re19 (2001).
- Mohan, S., et al. NHE3 activity is dependent on direct phosphoinositide binding at the N terminus of its intracellular cytosolic region. J Biol Chem. 285 (45), 34566-34578 (2010).
- Alexander, R. T., et al. Membrane surface charge dictates the structure and function of the epithelial Na+/H+ exchanger. EMBO J. 30 (4), 679-691 (2011).
- Wang, T. M., Hilgemann, D. W. Ca-dependent nonsecretory vesicle fusion in a secretory cell. J Gen Physiol. 132 (1), 51-65 (2008).
- Hilgemann, D. W. Single-Channel Recording. Sakmann, B., Neher, E. , Plenum Press. 307-328 (1995).
- Hilgemann, D. W., Lu, C. C. Giant membrane patches: improvements and applications. Methods Enzymol. 293, 267-280 (1998).
- Matsuoka, S., Takeuchi, A. Patch Clamp Techniques. Okada, Y. , Springer. 207-218 (2012).
- Pouyssegur, J., Sardet, C., Franchi, A., L'Allemain, G., Paris, S. A specific mutation abolishing Na+/H+ antiport activity in hamster fibroblasts precludes growth at neutral and acidic pH. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (15), 4833-4837 (1984).
- Ogden, D. Microelectrode Techniques - The Plymouth Workshop Handbook. , The Company of Biologists Ltd. 275-316 (1994).
