Summary
Dette manuskript beskriver programmer af proton-ionselektive elektroder og patch fastspænding metoder til at måle aktivitet af proton transportsystemer. Disse metoder overvinde visse begrænsninger af teknikker, der almindeligvis anvendes til at studere proton transportaktiviteter, som moderat følsomhed, tidsopløsning og utilstrækkelig intracellulære milieu kontrol.
Abstract
Transport af ioner gennem cellemembraner sikrer den fine kontrol af ion indholdet i og uden for den celle, der er uundværlig for celle overlevelse. Disse transportmekanismer er medieret af aktiviteter af specialiserede transportør proteiner. Specifikt, pH dynamics styres fint af plasma membran proton (H+) ekstrudering systemer, som Na+h+ varmeveksler (NHE) protein familie. Trods omfattende bestræbelser på at studere de underliggende NHE forordning mekanismer, er vores nuværende forståelse af familien NHE biofysiske og molekylære egenskaber utilstrækkelig på grund af de begrænsede mængder af metoder til effektivt at måle NHE aktivitet . I dette manuskript, vi anvendte H+-ionselektive elektroder under hele-celle patch fastspænding optagelse for at måle NHE-induceret H+ flux. Vi har foreslået denne metode til at overvinde visse begrænsninger af typisk anvendes metoder til at måle NHE aktivitet, såsom radioaktivt optagelse og fluorescerende membran permeants. Måling af NHE aktivitet ved hjælp af den beskrevne metode giver høj følsomhed og tidsopløsning og mere effektiv kontrol af intracellulære H+ koncentrationer. H+-ionselektive elektroder er baseret på det faktum, at transportvirksomheden aktivitet skaber en ion gradient i umiddelbar nærhed af cellemembranen. En H+-selektiv elektrode bevæger sig op til og væk fra cellemembranen i et monotont, oscillerende mode registrerer en spændingsforskel, der er afhængige af H+ flux. Mens H+-ionselektive elektroder anvendes til at opdage H+ flux bevæger sig ud af cellen, metoden patch klemme i hele-celle-konfigurationen bruges til at styre den intracellulære ion-sammensætning. Desuden kan ansøgningen af kæmpe patch klemme teknik ændring af de intracellulære sammensætning af ioner, men også lipider. Transporter aktivitet af NHE isoform 3 (NHE3) blev målt ved hjælp af denne tekniske tilgang til at studere det molekylære grundlag af NHE3 regulering af phosphoinositides.
Introduction
Transport af ioner og opløste stoffer over plasmamembran er afgørende for overlevelse af celler og dermed af organismer1. Selektiv transport af ioner og opløste stoffer er opnået ved en række specialiserede kanal og transportør proteiner. Mutationer i disse proteiner ofte resultere i en række kliniske tilstande, rendering kanal og transportør proteiner potentielle mål for farmakologisk behandling1. Desværre, forstå de underliggende kanal og transporter funktion og regulering mekanismer er ofte begrænset af tilgange tilgængelige at studere deres aktivitet2,3,4.
Specifikt, transportvirksomheder kan være nogenlunde opdelt i to store grupper afhængig af om de ændre celle transmembrane potentiale under transport af opløste stoffer: ændre electrogenic ion transportvirksomhederne [f.eks., natrium-fosfat Co transporter 2a (NaPi2a), natrium-calcium exchanger (NCX), etc.] eller ikke at ændre electroneutral ion transportvirksomheder [f.eks., natrium-proton exchanger (NHE), natrium-klorid Co transporter, NaPi2c, etc.]. Aktiviteterne i begge klasser af transportvirksomheder er blevet studeret grundigt ved hjælp af optagelsen af radioaktive isotoper og fluorescerende membran-permeant farvestoffer2. Begge tilgange vurdere aktiviteten af transportvirksomheder ved at måle ændringer i bulk koncentrationen af specifikke cytoplasmatisk ioner, og begge metoder har begrænsninger, såsom moderat følsomhed og tidsopløsning og utilstrækkelig kontrol af den intracellulære milieu. Faktisk aktivitet for mange transportvirksomheder er afhængig af cytoplasmatisk koncentrationen af de foretages ioner (f.eks. NHE3, NCX), og ændringer i disse ion koncentrationer forventes at spille en betydelig rolle i reguleringen af transportør aktivitet2 , 3 , 5. præcis måling af disse regulerende mekanismer er begrænset brug af klassiske metoder.
For at overvinde disse begrænsninger, bruges patch klemme metoder til at studere transporter aktivitet2,6. Specifikt, har det selvrefererende ion-selektiv elektroder (ISEs)7,8 kombineret med patch fastspænding system for nylig tilladt måling af electroneutral transporter aktivitet3,4 , 5. ISEs er baseret på det faktum, at transportvirksomheden aktivitet skaber en ion gradient i umiddelbar nærhed af cellemembranen. En ISE bevæger sig op til og fra cellemembranen i en gentagne, registrerer oscillerende mode en spændingsforskel (µV). Spænding forskelle kan konverteres til ion flux værdier ved hjælp af en kalibreringsmetode, der gælder ficks første lov af diffusion2,9. Mens ISEs bruges til at registrere flux af ioner bevæger sig ud af celler, metoden patch klemme i begge hele-celle eller inside-out konfigurationer bruges til at styre membran potentiale og intracellulære ion sammensætning. Desuden kan ansøgningen af kæmpe patch klemme teknik ændring af de intracellulære sammensætning af ioner, men også lipider og proteiner3,5.
I Resumé sammenlignet alsidigheden i patch klemme metode med at transporter aktivitet af andre metoder til at studere har gjort en patch fastspænding egnet til at overvinde de fælles begrænsninger af disse andre metoder. Kombinationen af selvrefererende ISEs og patch klemme teknikker tilbyder den unikke mulighed for at måle aktivitet af electroneutral transportører i et stærkt kontrolleret miljø, eksperimentel og oplev roman biofysiske og molekylær egenskaber for celle membran transport3,4,5. Denne tilgang har held været anvendt til at studere aktiviteten af NHE. Pattedyr NHE protein familie katalyserer electroneutral netto udveksling af ekstracellulært natrium (Na+) til intracellulære proton (H+)10,11 udnytte en indadgående Na+ gradient. I pattedyr omfatter NHE protein familie 11 relaterede proteiner (NHE1-9 og NHA1-2) og en sæd-specifikke NHE10,12,13.
NHEs (SLC9a familie) findes allestedsnærværende i de fleste levende organismer fra simple prokaryoter til højere eukaryoter og er involveret i en række afgørende celle funktioner10,11, herunder kontrollere celle saltholdighed forsvar i prokaryoter, opretholdelse af syre-base homøostase og celle volumen, og regulere absorption af salt og vand i forskellige specialiserede epitheler10,12,14,15. De centrale biologiske roller i NHEs og betydningen af deres funktioner er blevet fastlagt gennem flere undersøgelser; dog har få studier undersøgt den biofysiske og molekylære egenskaber af pattedyr NHEs på grund af metodologiske begrænsninger4. For nylig, anvendelsen af selvrefererende ISEs under hele-celle patch fastspænding har afsløret roman molekylære mekanismer af NHE isoformer reguleret af ændringer i den intracellulære koncentration af ioner, proteiner og fosfolipider3, 4.
Specifikt, protokollen i henhold i dette manuskript skitserer de metoder og tilgange til at studere den aktivitet og regulering af NHE isoform 3 (NHE3), en vigtig aktør i absorptionen af Na+, Cl-, HCO3- og væske i den pensel grænse membranen af renal og tarm epitheler14,16. Nyt indblik i forskelle i følsomhed af NHE3 aktivitet til intracellulære phosphoinositides (phosphatidylinositide 4,5-bisfosfat [PI (4,5) P2] og phosphatidylinositide 3,4,5-triphosphat [PI(3,4,5]P3]) er rapporteret. Celle transport proteiner, som kanaler og transportvirksomheder, der er reguleret af phosphoinositides17, og NHE3 binder direkte både PI (4,5) P2 og PI (3,4,5) P318. Baseret på den aktuelle litteratur, kunne enten phosphoinositide være relevante for den fysiologiske eller patofysiologiske regulering af NHE35,18,19. Vores resultater støtter forskellige roller for PI (4,5) P2 og PI (3,4,5) P3 i reguleringen af NHE3 aktivitet. Denne sondring var muligt på grund af anvendelsen af ISE teknikker i kombination med hele-celle patch klemme optagelse. Denne teknik giver også mulighed for kontrol af phosphoinositide cellular indhold via den intracellulære perfusion af forskellige phosphoinositides under målingen af NHE3 aktivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: To forstærkere er påkrævet for optagelse aktivitet af electroneutral transportører af en selvrefererende ISE sammenholdt med patch fastspænding, en patch klemme forstærker til at opretholde celle i en konfiguration med hele-celle og en høj impendence forstærker ( electrometer) til at registrere transporter aktivitet via ISE (se tabel af materialer). Patch klemme forstærker er direkte forbundet med erhvervelse bestyrelsen terminal. Electrometer er tilsluttet den differential forstærker udnyttet til at filtrere og forstærke signalet. Differential forstærker er forbundet med erhvervelse bord terminal. Capmeter, patch klemme softwaren overvåger celle kapacitet, har været anvendt i tidligere undersøgelser20 (se tabel af materialer). Optagelse kammer og perfusion løsninger er opretholdt ved 37 ° C.
1. forberedelse af pipetter for ISEs
- Trække pipetter fra borsilikatglas kapillærer til en ydre diameter på 1,2 mm (Se Tabel af materialer) ved hjælp af pipetten aftrækker2 .
- Polsk pipette ved hjælp af microforge. Diameteren af pipette tip bør være 2-3 µm.
- Placer pipetter i en krukke holder til pipetter med pipette spidsen vender opad (Se Tabel af materialer).
Forsigtig: Udfør trin 1,4 1,6 i et velventileret kemiske stinkskab. - Bland den siliconization blanding, der består af 1 dråbe (~ 150 µL) bis (dimethylamino) dimethyl silan og 10 dråber af tetrachlormethan (Se Tabel af materialer).
- Hæld siliconization blandingen i glasset og luk låget stramt.
- Inkuber krukke med siliconization blandingen i 24-48 timer i en kemisk stinkskab ved stuetemperatur, indtil blandingen er helt fordampet.
- Opfyldning pipette med passende ion-selektiv harpiks til at skabe en kolonne på ca 2-4 mm.
Bemærk: Brint ionophor jeg cocktail B kan være anvendes optagelse NHE aktivitet (Se Tabel af materialer). - Tryk spidsen af pipetten til at distribuere den ion-selektiv harpiks til spids, og placere pipette lodret i krukke indehaveren med pipette spidsen ned.
- Checkunder dissekere mikroskopet at harpiks cocktail har nået slutningen af spidsen. Hvis det er nødvendigt, Anvend positiv tryk til at skubbe harpiksen til slutningen.
- Opfyldning halv-pipette med den hensigtsmæssige løsning (~ 100 μL). Her bruger 100 mM KCl og 10 mM HEPES ved pH 7,0 hvis bruger ionophor jeg cocktail B.
- Tilslut ISE til electrometer og Placer spidsen af ISE i Bad løsning anvendes til optagelse. Nul for electrometer.
- Teste H+-selektiv ISE svar ved at ændre pH i opløsningen bad. Den gennemsnitlige H+-selektiv ISE svar er ~ 58 mV per enhed af pH.
- Periodisk evaluere ISE svar til kalibrering.
2. forberedelse af Patch klemme pipetter til optagelse
Bemærk: Metoden beskrevet af Donald Hilgemann i sin artikel på Single-kanals optagelse21 anbefales.
- Trække pipetter til kæmpe patch fra borsilikatglas kapillærer (2,0 mmOD / 1,5 mm-ID) på pipette aftrækker2,22,23.
- Brug en microforge monteret på scenen i en inverteret mikroskop til at gøre en bred pipette tip (10-22 μm)23. Smelt en perle (~ 0,5 mL) af bløde glas på den tykke platin tråd af microforge.
Bemærk: En forholdsvis tyk platin wire er nødvendig (~0.5 mm) til at fabrikere kæmpe patch pipetter. - Placer patch pipette tæt på den bløde glas perle, og anvende fuld varme indtil spidsen begynder at aftage. Platin wiren vil bevæge sig en anelse mod den centerduring varme.
- Slukke for varmen, og skubbe pipette tip til blødgjort glas perle. Den kølende ledning vil trække og bryde pipette tip.
- Genanvende varmen til jævn pipette tip og oprette en pipette spidsen af den ønskede diameter. Diameteren af spidsen er afhængig af størrelsen af cellen for at blive lappet (8-10 μm i denne undersøgelse).
3. forberedelse af celler
- Varm op fosfat buffer saltvand (PBS) uden Ca2 + og Mg2 +, trypsin-EDTA-oploesning og vækstmedium til ved 37 ° C.
- Vaske cellerne to gange med PBS. Brug 1 mL af bufferen til 35 mm diameter celle kultur plade.
- Tilføje 0,5 mL trypsin til cellerne for 35 mm diameter celle kultur plade.
Bemærk: Når celler begynder at runde-up, ryste plade Dukanvedhæfte de-cellerne. - Stoppe handlingen trypsin ved tilsætning af 5 mL (beløb for 35 mm diameter celle kultur plade) af komplette vækstmediet suppleret med 10% føtal bovint serum.
Bemærk: Reaktionstid i trypsin er celletype afhængige. - Placer cellerne på en shaker med vuggende for at undgå dannelse af klumper.
- Bruge celler i op til 2 timer efter trypsinization.
Bemærk: Tid kan variere afhængigt af cellelinie.
4. forberedelse af en Intra-Pipette Perfusion System
- Skære en passende størrelse af kvarts rør (150 µm OD / 75 µm ID) til at forberede intra-pipette perfusion linjen.
- Indsætte en side af kvarts rør i en 200 µL pipette tip. Lim kvarts rør på spidsen, og skære enden af spidsen med et skarpt barberblad.
- Tilsluttes et lille stykke silikone slange, der skulle fungere som et reservoir for intra-pipette perfusion løsning perfusion linje (kvarts rør limet på spidsen).
- Tilsluttes en sprøjte til at skabe et positivt pres silikone slanger.
- Indsæt den frie ende af kvarts rør gennem polyethylen rør med pipette indehaveren af perfusion port (Se Tabel af materialer).
- Evaluere perfusion linje med pipette løsning.
5. forberedelse af løsninger
- Udarbejde en stærkt bufferet pipette løsning til optagelse NHE (115 mM kalium aspartat (KAsp), 1 mM EGTA, 0,5 mM MgCl2, 10 mM Mg-ATP, 12,5 mM HEPES, 12,5 mM rør, 12,5 mM MOPPER og 12,5 mM MES, pH 6.0 justeret med asparaginsyre).
Bemærk: Forberede lager pipette løsning og filter. Tilføje Mg-ATP før optagelse. - Forberede et frisk bad løsning hver gang (140 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2og 0,1 mM Tris-HCl pH 8,2).
6. registrering af Transporter aktivitet
- Opretholde optagelse salen og alle løsninger ved 37 ° C, fordi transporter aktivitet er afhængig af temperaturen.
- Placer cellerne i optagelse kammer. Vent, indtil de falder til bunden af salen, men lad dem ikke vedhæfte til salen.
- Vælge en passende celle. Måle diameteren på cellen med den okulær mikrometer. Vælge celler med samme diameter.
Bemærk: Generelt, en stor celle vil have mere cellulære overflade og eventuelt flere transportvirksomheder udtrykt på sin plasma membran, således også med flere transporter aktivitet. Men dette er ikke nødvendigvis korrekt, som transportøren aktivitet afhænger af den specifikke transporter og celletype under undersøgelsen. - Montere ion-selektiv mikroelektrode pipette til at micromanipulator, opfyldning patch-fastspænding pipette med den intracellulære løsning, Sørg for, at løsningen når spidsen af pipetten2.
Bemærk: Det kan kræve flere blid haner til at fjerne boblerne i spidsen af en pipette. - Montere den patch-fastspænding pipette til hoved fase af Elektrofysiologi oprettet2,22,23.
Bemærk: Det er vigtigt at holde hovedet scenen på om en 45-graders vinkel med vandret akse, da dette sikrer en løsning vinkel for den pipette, der er egnet til dannelsen af en meget resistente segl. - Anvende en lille overtryk (~ 5 cm H2O) til patch pipette til at reducere risikoen for at blokere spidsen, og læg det i Bad løsning.
- Stop flytning patch klemme pipette, når spidsen er tæt på cellen.
- Lindre de overtryk, mens pipette rører cellen og anvende lille undertryk (~ 5 cm H2O) at opnå en > 1000 MΩ (en Giga-ohm) seal på cellemembranen med patch afpipetteres23.
- Placer patch pipette med cellen i det samme brændplanet som ISE, og flytte patch pipetten med celle i nærheden af ISE (~ 5-10 µm)2,5 men undgå tillader cellen at kontakte ISE (figur 1A).
- Forsikre, at bedriften potentielle 0 mV.
- Briste segl med serie af korte sugeledninger at få hele-celle konfiguration.
- Flytte ISE (eller patch klemme pipette) langsomt venstre-højre eller op-ned for at registrere aktivitet af transporter (figur 1B).
- Optage mindst 5-8 toppe (figur 1 c, fra A til B).
- Anvende firkantbølge perturbationer under optagelse til at overvåge kvaliteten af segl og cellemembranen kapacitans (figur 1).
- Vurdere H+ flux (
) fra forskellen i gratis H+ koncentration på cellens overflade og bulk løsning (ΔH+)
Bemærk:
og 
er H+ og buffer diffusion koefficienter henholdsvis BT er koncentrationen, samlede buffer, KD er dissociationskonstant af bufferen, r er cellen radius, og 
bestemmer steady-state ændringen i koncentrationen af bundne H+ til en lille ændring i gratis H+. H+ angiver en gratis proton i løsning. For at være i overensstemmelse med tidligere undersøgelser, H+ strømme er konverteret til elektrofysiologiske flux enheder ved at beregne de aktuelle ækvivalenter af strømme (/faraday) i pA3,5]. - Normalisere proton flux til cellens overflade, der kan beregnes ud fra cellestørrelsen eller membran kapacitans.
) fra forskellen i gratis H+ koncentration på cellens overflade og bulk løsning (ΔH+)
og 
er H+ og buffer diffusion koefficienter henholdsvis BT er koncentrationen, samlede buffer, KD er dissociationskonstant af bufferen, r er cellen radius, og 
bestemmer steady-state ændringen i koncentrationen af bundne H+ til en lille ændring i gratis H+. H+ angiver en gratis proton i løsning. For at være i overensstemmelse med tidligere undersøgelser, H+ strømme er konverteret til elektrofysiologiske flux enheder ved at beregne de aktuelle ækvivalenter af strømme (Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En selvrefererende ISE under hele-celle patch klemme optagelse blev anvendt til at undersøge regulering af NHE3 aktivitet af phosphoinositides. PS120 fibroblast-lignende celler24, som mangler udtryk af endogene plasma membran NHEs, blev brugt. NHE3 wild-type (NHE3-wt) eller NHE3 mutanter der ikke binde phosphoinositides [tyrosin 501, arginin 503 og lysin 505 blev erstattet med alanin, Y501A/R503A/K505A (NHE3-YRK)] var stabilt udtrykt i PS120 fibroblast-lignende celler18.
Sporene er præsenteret i figur 2. Cellen var heldin en helhed-celle konfiguration med en pipette til patch fastspænding, og ISE var placeret foran cellen. I denne stilling indspillet ISE koncentrationen af frie H+ tæt på cellemembranen (figur 1A); derefter ISE (eller patch klemme pipette) var manuelt bevæget lateralt 50 µm og indspillet koncentrationen af frie H+ i opløsningen (figur 1B). De indspillede spænding forskelle, svarer til de to positioner i patch pipette med celle foran eller langt fra ISE, er repræsentative for NHE3 aktivitet (figur 1 c). Intra-pipette perfusion af apyrase (ATP-diphosphatase) falder den intracellulære koncentration af ATP, efterfølgende faldende phosphoinositide indhold5. I samarbejde med tidligere rapporteret undersøgelser5,18,19reduceres nedsat phosphoinositide indhold formidlet af apyrase behandling NHE3 aktivitet (~ 50%), der var registreret som et fald i spændingen svingning amplitude (figur 2). Effekten af apyrase (givet på 5 enheder/ml) på NHE3 aktivitet var helt vendt af intra-pipette perfusion af apyrase i kombination med 2 µM PI (3,4,5) P3 (figur 2 og 3A). Disse resultater blev understøttet af NHE3 aktivitet registreres i PS120 celler stabilt udtrykker NHE3 mutanter (NHE3-YRK) der var ude af stand til at binde phosphatidylinositides18. Perfusion af apyrase alene eller i kombination med PIP3 ikke påvirker aktiviteten af NHE3 i NHE3-YRK mutanter (figur 3B). Aktiviteten af endogene NHE3 var også hæmmes af apyrase behandling i opossum nyre (OK) celler3. Intra-pipette perfusion af PI (3,4,5) P3 tilbageført hæmning af NHE3 aktivitet induceret af apyrase i OK celler (figur 3 c). Disse resultater tyder på, at effekten af PI (3,4,5) P3 på NHE3 aktivitet ikke er celle type-specifikke.
Næste, vi havde til formål at teste specificiteten af PIP3 om regulering af apyrase-medieret ændringer i NHE3 aktivitet. Det gjorde vi af boltpistoler effekt på apyrase-afhængige reduktion på NHE3 aktivitet efter perfusion af andre phosphoinositides, såsom PI (4,5) P2. PI (4,5) P2 (på 10 µM) påvirkede ikke nedsat NHE3 aktiviteten medieret af apyrase (figur 4A). Endelig, perfusion af AMP-PNP, en ikke-hydrolyserbar ATP analog, ikke blokerer theapyrase-afhængige hæmning af NHE3 aktivitet (figur 4B). Disse resultater tyder på en rolle af PI (3,4,5) P3, men ikke PI (4,5) P2 i reguleringen af NHE3 efter ATP udtynding. Identifikation af forskellige roller for PI (4,5) P2 og PI (3,4,5) P3 i NHE3 forordning var muligt kun på grund af den intercellulære perfusion af phosphoinositides under ISE målinger kombineret med hele-celle patch klemme optagelse5. En bestemt handling af PI (3,4,5) P3 snarere end PI (4,5) P2 i reguleringen af NHE3 aktivitet er værdifuldt at afgøre, hvorvidt forskellige intracellulære phosphoinositides regulerer funktionen af NHE3 forskelligt.
Figur 1 . Skematisk fremstilling af H+ flux måling og korrelation mellem NHE aktivitet og potentielle forskelle registreret af pH mikroelektrode.
Skematisk fremstilling af indstillingen optagelse. A. Diagram af eksperimentelle fabriksindstillingen. Cellen er afholdt i hele-celle konfiguration af patch klemme pipette og anbringes foran ISE. I denne stilling registrerer ISE koncentrationen af frie H+ tæt på cellemembranen. B. den ISE (eller patch klemme pipette) er manuelt bevæget lateralt ~ 50 µm og registrerer koncentrationen af frie H+ i løsning i denne position. C. grafisk repræsentation af spænding forskelle registreres ved hjælp af ISE. Svingninger fra position en (celle foran ISE) til B (celle langt fra ISE) er repræsentant for NHE aktivitet. Den anvendte software registreret spænding forskelle registreret af ISE og genereret firkantbølge perturbationer (20 mV, 0,2 kHz) for at overvåge cellemembranen kapacitans og kvaliteten af patch klemme segl. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Eksempel på en optagelse indstillet til NHE3 transporter aktivitet i et enkelt PS120 celle stabilt at udtrykke NHE3-wt, før og efter perfusion med apyrase og PI (3,4,5) P3 (PIP3).
Efter den oprindelige optagelse, var cellen forarmet af ATP af intra-pipette perfusion af apyrase. NHE3 aktivitet gradvist faldt og blev restaureret af PIP3 intra-pipette perfusion. Apyrase tilføjelse er angivet med den røde bar, og PIP3 desuden er angivet af den grønne bjælke. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . Effekten af ATP udtynding og PIP3 perfusion på NHE3 transporter aktivitet i PS120 og OK celler.
Effekten af apyrase-medieret ATP udtynding på NHE3 aktivitet og forbeholde effekten af apyrase på NHE3 aktivitet induceret af PIP3 intra-pipette perfusion: A. PS120 celler udtrykker NHE3-wt eller B. PS120 celler udtrykker NHE3-YRK, NHE3 mutanter i stand til at binde phosphoinositides. C. OK celler, der udtrykker endogene NHE3. Udfyldte cirkler viser gennemsnitlige data fra individuelle eksperimenter (fire eksperimenter udført i identiske betingelser). Fejllinjer udgør middel ± standardfejl (SE). * P < 0,05 vs kontrol, ANOVA. $ P < 0.5, $$P < 0,01 apyrase vs apyrase + PIP3, ANOVA. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 . Effekten af PI (4,5) P2 (PIP2) og ANP-PNP perfusion på NHE3 aktivitet efter ATP udtynding.
Effekten af A. PIP2 eller B. ANP-PNP intra-pipette perfusion på den apyrase-afhængige reduktion af NHE3 aktivitet i PS120 celler, der udtrykker NHE3-wt. udfyldte cirkler viser gennemsnitlige data fra individuelle eksperimenter (fire eksperimenter udført i identiske betingelser). Fejllinjer udgør middel ± SE. * P < 0,05, ** P < 0,01 vs kontrol, ANOVA. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Trods de afgørende funktioner af transportvirksomheder er de metoder for at studere deres aktivitet ineffektive og utilstrækkelige. En begrænsning er, at de tilgængelige metoder måle ion bevægelse medieret af transporter aktivitet uden hensyn til udsving i intracellulære ion sammensætning under eksperimentet4. Metoden præsenteres sikrer præcis styring af ekstracellulære og intracellulære ion kompositioner og tilbyder en kraftfuld værktøj til at ændre intracellulære ion, proteiner og lipid kompositioner3,4,5.
Det vigtigste skridt i denne protokol er forberedelsen af en ISE, der er stabil i en lang periode25. Vores erfaring, en ustabil ISE er ikke godt Silikoniseret (f.eks. den ion-selektiv harpiks er omfordelt på ISE pipette sider), som kan påvises ved en konstant og ukontrollabel drift i ISE signal. Derudover bør harpiks distribution i ISE overvåges nøje under eksperimentet. Bad løsning kan skubbe den ion-selektiv harpiks inde ISE pipette, oprettelse af en kolonne af Bad løsning inden resin25. I dette tilfælde vil ISE optage ion koncentration fra denne kolonne og blive nonresponsive til ændringer i ion-gradienter under eksperimentet. Justere geometrien af ISE er nøglen til at opnå en ISE svar i rækken af 100 ms9 og overvinde eventuelle forsinkelser i ISE tid-svar sammenlignet med ændringer i ion forløb.
De store begrænsning af metoden præsenteres er nedarvet fra den lappe fastspænding måling af transporter aktivitet i epitelceller. Når løsrevet fra støtten og vedligeholdes i suspension, kan polariseret epitelceller miste den polariserede lokalisering af transportvirksomheder på den apikale eller basolateral membran.
En modificeret patch fastspænding måling skal bruges, når man studerer kanaler og transportvirksomheder i polariserede epitheler. Overvejer at celler kan tilnærme i en cylinder i stedet for en kugle er vigtigt når omdanne H+ gradient til flux via formel forudsat. I dette tilfælde formlen skal ændres til 
hvor λ er længden af cylinderen, r er radius cylinder ad x er den radiale afstand fra cylinder midtpunktet over som farveforløbet er målt5. Fremtidige udvikling af denne kraftfulde teknik til at studere electroneutral transportvirksomheder bør fokusere på ændring af metoden for at optimere optagelsen celler dyrkes i en éncellelag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at videregive.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Eric Fishback (Des Moines Universitet, Des Moines, Iowa, USA) for hans bistand med optagelse og redigering af video. PS120 fibroblast-lignende celler stabilt udtryk for NHE3-wt eller NHE3-YRK blev venligst leveret af Dr. Mark Donowitz (Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD, USA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Patch clamp Amplifier | Molecular Devices | ||
| Dual Channel Differential Electrometer (HiZ-223) | Warner Instruments | 64-1650 | |
| Differential Amplifier (DP-301) | Warner Instruments | 64-0044 | |
| Patch Clamp Software Based on MatLab | MatLab with acquisition toolbox | The capmeter software is recommended | |
| ThermoClamp-1 Temperature Control System | AutoMate Scientific | 03-11-LL | In-line heater |
| Single-Channel Temperature Controller (TC-324C) | Warner Instruments | 64-2400 | |
| Single-Barrel Standard Borosilicate Glass Tubing | World Precision Instruments | 1B120F-3 | Used for ion selective electrodes |
| Micropipette Storage Jar | World Precision Instruments | E212 | |
| Bis(dimethylamino)dimethylsilane | Sigma-Aldrich | 14755-100ML | |
| Carbon tetrachloride | Sigma-Aldrich | 319961-500ML | |
| Hydrogen ionophore I - cocktail B | Sigma-Aldrich | 95293 | |
| Thin Wall Borosilicate Tubing | Sutter Instrument | B200-156-15 | Used for patch clamp pipette |
| Soft glass (Corning 8161 Patch Glass) | Warner Instruments | 64-0815 | |
| Silica Capillary Tubing (150um OD/75um ID) | Molex (Polymicro Technologies) | 106815-0018 | Used for intra-pipette perfusion system |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium aspartate | Sigma-Aldrich | A6558 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M4880 | |
| Mg-ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Apyrase | Sigma-Aldrich | A6535 | |
| Phosphatidylinositol(4,5) bisphosphate diC8 | Echelon Biosciences | P-4508 | |
| Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate diC8 | Echelon Biosciences | P-3908 |
References
- Rives, M. L., Javitch, J. A., Wickenden, A. D. Potentiating SLC transporter activity: Emerging drug discovery opportunities. Biochem Pharmacol. , (2017).
- Kang, T. M., Markin, V. S., Hilgemann, D. W. Ion fluxes in giant excised cardiac membrane patches detected and quantified with ion-selective microelectrodes. J Gen Physiol. 121 (4), 325-347 (2003).
- Babich, V., Vadnagara, K., Di Sole, F. The biophysical and molecular basis of intracellular pH sensing by Na+/H+ exchanger-3. FASEB J. 27 (11), 4646-4658 (2013).
- Fuster, D., Moe, O. W., Hilgemann, D. W. Steady-state function of the ubiquitous mammalian Na/H exchanger (NHE1) in relation to dimer coupling models with 2Na/2H stoichiometry. J Gen Physiol. 132 (4), 465-480 (2008).
- Fuster, D., Moe, O. W., Hilgemann, D. W. Lipid- and mechanosensitivities of sodium/hydrogen exchangers analyzed by electrical methods. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (28), 10482-10487 (2004).
- Forster, I. C., Virkki, L., Bossi, E., Murer, H., Biber, J. Electrogenic kinetics of a mammalian intestinal type IIb Na(+)/P(i) cotransporter. J Membr Biol. 212 (3), 177-190 (2006).
- Smith, P. J., Trimarchi, J. Noninvasive measurement of hydrogen and potassium ion flux from single cells and epithelial structures. Am J Physiol Cell Physiol. 280 (1), C1-C11 (2001).
- Parker, M. D., Musa-Aziz, R., Boron, W. F. The use of extracellular, ion-selective microelectrodes to study the function of heterologously expressed transporters in Xenopus oocytes. Am J Physiol Cell Physiol. 296 (5), C1243 (2009).
- Smith, P. J. S., Sanger, R. H., Messerli, M. A. Electrochemical Methods for Neuroscience. Michael, A. C., Borland, L. M. , CRC Press/Taylor & Francis. 373-406 (2007).
- Orlowski, J., Grinstein, S. Diversity of the mammalian sodium/proton exchanger SLC9 gene family. Pflugers Arch. 447 (5), 549-565 (2004).
- Brett, C. L., Donowitz, M., Rao, R. Evolutionary origins of eukaryotic sodium/proton exchangers. Am J Physiol Cell Physiol. 288 (2), C223-C239 (2005).
- Bobulescu, I. A., Di Sole, F., Moe, O. W. Na+/H+ exchangers: physiology and link to hypertension and organ ischemia. Curr Opin Nephrol Hypertens. 14 (5), 485-494 (2005).
- Donowitz, M., Ming Tse, C., Fuster, D. SLC9/NHE gene family, a plasma membrane and organellar family of Na(+)/H(+) exchangers. Mol Aspects Med. 34 (2-3), 236-251 (2013).
- Zachos, N. C., Tse, M., Donowitz, M. Molecular physiology of intestinal Na+/H+ exchange. Annu Rev Physiol. 67, 411-443 (2005).
- Girardi, A. C., Di Sole, F. Deciphering the mechanisms of the Na+/H+ exchanger-3 regulation in organ dysfunction. Am J Physiol Cell Physiol. 302 (11), C1569-C1587 (2012).
- Bobulescu, I. A., Moe, O. W. Na+/H+ exchangers in renal regulation of acid-base balance. Semin Nephrol. 26 (5), 334-344 (2006).
- Hilgemann, D. W., Feng, S., Nasuhoglu, C. The complex and intriguing lives of PIP2 with ion channels and transporters. Sci STKE. (111), re19 (2001).
- Mohan, S., et al. NHE3 activity is dependent on direct phosphoinositide binding at the N terminus of its intracellular cytosolic region. J Biol Chem. 285 (45), 34566-34578 (2010).
- Alexander, R. T., et al. Membrane surface charge dictates the structure and function of the epithelial Na+/H+ exchanger. EMBO J. 30 (4), 679-691 (2011).
- Wang, T. M., Hilgemann, D. W. Ca-dependent nonsecretory vesicle fusion in a secretory cell. J Gen Physiol. 132 (1), 51-65 (2008).
- Hilgemann, D. W. Single-Channel Recording. Sakmann, B., Neher, E. , Plenum Press. 307-328 (1995).
- Hilgemann, D. W., Lu, C. C. Giant membrane patches: improvements and applications. Methods Enzymol. 293, 267-280 (1998).
- Matsuoka, S., Takeuchi, A. Patch Clamp Techniques. Okada, Y. , Springer. 207-218 (2012).
- Pouyssegur, J., Sardet, C., Franchi, A., L'Allemain, G., Paris, S. A specific mutation abolishing Na+/H+ antiport activity in hamster fibroblasts precludes growth at neutral and acidic pH. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (15), 4833-4837 (1984).
- Ogden, D. Microelectrode Techniques - The Plymouth Workshop Handbook. , The Company of Biologists Ltd. 275-316 (1994).
