Summary
Detta manuskript beskriver tillämpningar av proton-elektroder och patch fastspänning metoder att mäta aktiviteten av proton transportsystem. Dessa metoder övervinna vissa begränsningar av tekniker som ofta används för att studera proton transport aktivitet, till exempel måttlig känslighet, tidsupplösning och otillräcklig intracellulära milieu kontroll.
Abstract
Transport av joner genom cellmembranen garanterar fina kontroll av ion innehåll inom och utanför cellen som är oumbärlig för cellöverlevnad. Dessa transportmekanismer medieras av verksamheten i specialiserade transporter proteiner. Specifikt, pH dynamics styrs fint av plasmamembranet proton (H+) extrudering system, såsom Na+/h+ värmeväxlare (NHE) protein familj. Trots omfattande insatser för att studera mekanismerna bakom NHE förordning, är vår nuvarande förståelse av familjen NHE biofysiska och molekylära egenskaper otillräcklig på grund av den begränsade tillgången av metoder för att effektivt mäta NHE aktivitet . I detta manuskript, använde vi H+-elektroder under hela-cell patch fastspänning inspelning för att mäta NHE-inducerad H+ flux. Vi föreslog att denna metod att övervinna vissa begränsningar normalt används metoder för att mäta NHE aktivitet, såsom radioaktivt upptag och fluorescerande membran permeanters. Mätning av NHE verksamheten med den beskrivna metoden möjliggör hög känslighet och tidsupplösning och effektivare kontroll av intracellulära H+ koncentrationer. H+-elektroder är baserad på det faktum att transportören aktiviteten skapar en ion lutning i nära närhet till cellmembranet. En H+-selektiv elektrod flyttar upp till och bort från cellmembranet i ett repetitivt, oscillerande mode registrerar en spänningsskillnad som är beroende av H+ flux. Medan H+-elektroder används för att upptäcka H+ flux flytta ut ur cellen, den patch clamp-metoden i hela-cell konfigurationen används för att styra intracellulär jonen sammansättningen. Dessutom tillåter tillämpningen av giant patch clamp tekniken modifiering av intracellulära sammansättning inte bara joner men också lipider. Transportören aktiviteten av NHE isoform 3 (NHE3) mättes med hjälp av denna tekniska metod för att studera den molekylära basen för NHE3 förordning av phosphoinositides.
Introduction
Transport av joner och koncentrationsfördelningen över plasmamembranet är avgörande för överlevnaden av celler och därmed organismer1. Selektiv transport av joner och koncentrationsfördelningen uppnås genom en rad specialiserade kanal och transportören proteiner. Mutationer i dessa proteiner resulterar ofta i en mängd olika kliniska tillstånd, rendering kanal och transporter proteiner potentiella mål för farmakologisk behandling1. Tyvärr, förstå mekanismerna bakom kanal och transportör funktion och förordning begränsas ofta av metoderna som är tillgängliga att studera deras aktivitet2,3,4.
Specifikt, transportörer kan grovt delas in i två stora grupper beroende på huruvida de ändra cellen transmembrana potential under transport av lösta ämnen: ändra electrogenic ion transportörerna [t.ex. -natriumfosfat kotransportör 2a (NaPi2a), natrium-kalcium exchanger (NCX), etc.] eller icke-förändra electroneutral ion transportörerna [t.ex. natrium-proton exchanger (NHE), natriumklorid kotransportör, NaPi2c, etc.]. Verksamheten i båda klasserna av transportörer har studerats flitigt använda upptag av radioaktiva isotoper och fluorescerande membran-diffusionskoefficient färgämnen2. Båda metoderna uppskatta aktiviteten av transportörer genom att mäta förändringar i bulk koncentrationen av specifik Cytoplasmatisk joner, och båda metoderna har begränsningar, såsom måttlig känslighet och tidsupplösning och otillräcklig kontroll av den intracellulära miljö. Faktiskt, aktiviteten av många transportörer är beroende av den cytoplasmiska koncentrationen av transporteras joner (t.ex. NHE3, NCX), och förändringar i dessa jonkoncentrationer förväntas spela en betydande roll i regleringen transporter aktivitet2 , 3 , 5. exakt mätning av dessa förordningar mekanismer är begränsad använder klassiska metoder.
För att övervinna dessa begränsningar, metoderna patch clamp att studera den transportör aktivitet2,6. Specifikt, har självrefererande jonselektiva elektroder (PFD)7,8 i kombination med plåstret fastspänningssystem nyligen tillåtits mätning av electroneutral transportör aktivitet3,4 , 5. ISEs är baserad på det faktum att transportören aktiviteten skapar en ion lutning i nära närhet till cellmembranet. En ISE att flytta till och från cellmembranet i ett repetitivt, registrerar oscillerande mode en spänningsskillnad (µV). Spänning skillnader kan omvandlas till ion flux värden använder en kalibreringsmetod som gäller ficks första lag av diffusion2,9. Medan ISEs används att upptäcka flödet av joner flyttar av celler, den patch clamp-metoden i både hela-cell eller inifrån och ut konfigurationer används för att styra membranet potential och intracellulär jonen sammansättningen. Dessutom tillåter tillämpningen av giant patch clamp tekniken modifiering av intracellulära sammansättning inte bara joner men också lipider och proteiner3,5.
Sammanfattningsvis jämfört mångsidigheten hos den patch clamp metoden med att transportören aktivitet av andra metoder för att studera har gjort patch fastspänning lämplig att övervinna de vanliga begränsningarna av dessa andra metoder. Kombinationen av självrefererande ISEs och patch clamp tekniker erbjuder den unika möjligheten att mäta aktiviteten av electroneutral transportörer i en väl kontrollerad experimentell miljö och upptäcka roman biofysiska och molekylär egenskaper hos cellmembranet transport3,4,5. Detta tillvägagångssätt har använts framgångsrikt att studera aktiviteten av NHE. Proteinfamiljen från däggdjur NHE katalyserar electroneutral netto utbyte av extracellulära natrium (Na+) för intracellulära proton (H+)10,11 utnyttja en inåtgående Na+ lutning. Hos däggdjur innehåller familjen NHE protein 11 relaterade proteiner (NHE1-9 och NHA1-2) och en sperma-specifika NHE10,12,13.
NHEs (SLC9a familj) finns ubiquitously i de flesta levande organismer från enkla prokaryoter till högre Eukaryoter och medverkar i en mängd viktiga cell funktioner10,11, inklusive kontroll av cell salthalt försvar i prokaryoter, syra-bas homeostas och cell volymen behålls och reglerar upptaget av salt och vatten i olika specialiserade epitel10,12,14,15. NHEs viktiga biologiska roller och betydelsen av deras funktioner har bestämts genom flera studier; några studier har dock undersökt däggdjur NHEs biofysiska och molekylära egenskaper på grund av metodologiska begränsningar4. Nyligen, tillämpningen av självrefererande ISEs under hela-cell patch fastspänning har avslöjat nya molekylära mekanismer av NHE isoformer regleras av förändringar i den intracellulära koncentrationen av joner, proteiner och fosfolipider3, 4.
Specifikt, det protokoll som anges i detta manuskript beskriver de metoder och tillvägagångssätt för att studera aktivitet och reglering av NHE isoform 3 (NHE3), en stor aktör i absorptionen av Na+, Cl–, HCO3– och vätska i den pensel gränserna membran av njur- och intestinal epitel14,16. Nya insikter i skillnaderna i känslighet för NHE3 verksamhet till intracellulära phosphoinositides (phosphatidylinositide 4,5-bisphosphate [PI (4,5) P2] och phosphatidylinositide 3,4,5-trifosfat [PI(3,4,5]P3]) rapporteras. Cell transportproteiner, såsom kanaler och transportörer, regleras av phosphoinositides17och NHE3 binder direkt både PI (4,5) P2 och P3 PI (3,4,5)18. Baserat på den aktuella litteraturen, kan antingen fosfoinositid vara relevanta för fysiologiska eller patofysiologiska regleringen av NHE35,18,19. Våra fynd stöder separata roller för PI (4,5) P2 och PI (3,4,5) P3 i regleringen av NHE3 aktivitet. Denna åtskillnad var möjligt på grund av tillämpningen av ISE tekniker i kombination med hela-cell patch clamp inspelning. Denna teknik möjliggör även styrning av fosfoinositid cellulära innehållet via intracellulära perfusionen i olika phosphoinositides under mätningen av NHE3 aktivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Anmärkning: Två förstärkare behövs för att registrera aktiviteten av electroneutral transportörer genom en självrefererande ISE i samband med patch fastspänning, en patch clamp förstärkare att upprätthålla cellen i en konfiguration för hela-cell och en hög impendence förstärkare ( elektrometer) att registrera aktiviteten transportören via av ISE (se tabell för material). Patch clamp förstärkaren är direkt ansluten till förvärvet styrelsen terminal. Elektrometer är ansluten till differential förstärkare används för att filtrera och förstärka signalen. Differential förstärkare är ansluten till förvärvet styrelsen terminal. Capmeter, patch clamp programvara som övervakar cell kapacitet, har använts i tidigare studier20 (se tabell för material). Inspelning kammare och perfusion lösningarna bibehålls vid 37 ° C.
1. beredning av pipetter för kun
- Dra pipetterna från borosilikatglas kapillärer till en yttre diameter 1,2 mm (se Tabell för material) med pipett avdragare2 .
- Polska pipetten med hjälp av microforge. Diametern av pipettspetsen bör vara 2-3 µm.
- Placera pipetterna i en burk hållare för pipetter med pipettspetsen uppåt (se Tabell för material).
FÖRSIKTIGHET: Utför steg 1.4-1.6 i ett välventilerat kemiska dragskåp. - Blanda siliconization blandningen som består av 1 droppe (~ 150 µL) av bis (dimetylamin) dimetyl silane och 10 droppar av koltetraklorid (se Tabell för material).
- Häll siliconization blandningen i burken och Stäng locket ordentligt.
- Inkubera burken med siliconization blandningen för 24-48 h i kemiska dragskåp vid rumstemperatur tills blandningen är helt avdunstat.
- Återfyllning pipetten med lämpliga jonselektiva kådan skapa en kolumn med cirka 2-4 mm.
Obs: Väte jonofor jag cocktail B kan vara för inspelning NHE verksamhet (se Tabell för material). - Tryck på spetsen på pipetten att distribuera jonselektiva kådan till spetsen och placera pipetten vertikalt i burk hållaren med pipettspetsen nedåt.
- Checkunder mikroskopet dissekera att harts cocktail har nått slutet av spetsen. Om det behövs, applicera positivt tryck att driva kådan till slutet.
- Återfyllning halv-pipetten med lämplig lösning (~ 100 μL). Här, använda 100 mM KCl och 10 mM HEPES vid pH 7.0 använder jonofor jag cocktail B.
- Anslut ISE till elektrometer och Placera spetsen på ISE i den bad-lösning som används för inspelning. Noll en elektrometer.
- Testa H+-selektiv ISE svar genom att ändra pH-värdet i Bad lösningen. Den genomsnittliga H+-selektiv ISE svar är ~ 58 mV per enhet av pH.
- Regelbundet utvärdera ISE svaret till kalibrering.
2. beredning av Patch Clamp pipetter för inspelning
Obs: Den metod som beskrivs av Donald Hilgemann i sin artikel på enkanalig inspelning21 rekommenderas.
- Dra pipetterna för giant patch från borosilikatglas kapillärer (2.0 mmOD / 1.5 mm ID) på pipetten avdragare2,22,23.
- Använd en microforge monterade på scenen av en inverterade Mikroskop för att göra en bred pipett tip (10-22 μm)23. Smälta en pärla (~ 0,5 mL) av mjuk glas på tjocka platina kabeln i microforge.
Obs: En relativt tjock platina tråd krävs (~0.5 mm) att fabricera giant patch pipetter. - Placera plåstret pipetten nära den mjuka glaspärlan och tillämpa full värme tills spetsen börjar avta. Platina tråd flyttas något mot den centerduring värme.
- Stäng av värmen och skjut pipettspetsen i den mjuknat glaspärlan. Kylande tråden kommer tillbaka och bryta pipettspetsen.
- Återanvända värmen för att släta pipettspetsen och skapa en pipettspetsen av önskad diameter. Spets diameter är beroende av storleken på cellen till vara lappat (8-10 μm i denna studie).
3. beredning av celler
- Värm upp fosfat buffert saltlösning (PBS) utan Ca2 + och Mg2 +, trypsin-EDTA-lösning och odlingsmedium till vid 37 ° C.
- Tvätta cellerna två gånger med PBS. Använd 1 mL av bufferten för 35 mm diameter cell kultur plattan.
- Tillsätt 0,5 mL av trypsin till cellerna för 35 mm diameter cell kultur plattan.
Obs: När celler börjar runda upp, skaka plattan för att fästa de cellerna. - Stoppa trypsin action genom att tillsätta 5 mL (belopp för 35 mm diameter cell kultur plattan) komplett odlingsmedium kompletteras med 10% fetalt bovint serum.
Obs: Reaktionstiden i trypsin är celltyp beroende. - Placera cellerna på en shaker med gunga för att förhindra bildandet av klumpar.
- Använda celler för upp till 2 h efter trypsinization.
Obs: Tiden kan variera beroende på cellinje.
4. beredning av en Intra-pipett Perfusion System
- Skär lämplig storlek av kvarts slangar (150 µm OD / 75 µm ID) att förbereda intra-pipett perfusion linjen.
- Infoga en sida av kvarts slangen i en 200 µL pipettspetsen. Limma kvarts slangen på spetsen, och skär i slutet av spetsen med ett vasst rakblad.
- Anslut raden perfusion (quartz slangar limmade till spetsen) till en liten bit av silicon slangar som skulle fungera som en reservoar för intra-pipett perfusion lösningen.
- Anslut silicon slangar till en spruta för att skapa övertryck.
- Infoga den fria änden av kvarts slangen genom polyeten röret pipett innehavaren av perfusionen av port (se Tabell för material).
- Utvärdera perfusion raden med pipett lösningen.
5. beredning av lösningar
- Bered en starkt buffrade pipett för inspelning NHE (115 mM kalium aspartat (KAsp), 1 mM EGTA, 0,5 mM MgCl2, 10 mM Mg-ATP, 12,5 mM HEPES, 12,5 mM rör, 12,5 mM moppar och 12,5 mM MES, pH 6,0 justeras med asparaginsyra).
Obs: Förbered lager pipett lösning och filter. Lägg till Mg-ATP innan inspelning. - Bered en fräsch bad varje gång (140 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2och 0,1 mM Tris-HCl pH 8,2).
6. registrering av transportören aktivitet
- Upprätthålla inspelning kammaren och alla lösningar vid 37 ° C, eftersom transportören aktivitet är temperaturberoende.
- Placera cellerna in i inspelningen kammaren. Vänta tills de sjunka till botten av kammaren men låt dem inte bifoga till kammaren.
- Välja en lämplig cell. Mät diametern på cellen med den okulära Mikrometern. Välj celler med liknande diametrar.
Obs: I allmänhet en stor cell har mer cellulära yta och möjligen mer transportörer uttryckt på dess plasmamembran, därmed också få mer transportör aktivitet. Detta är dock inte nödvändigtvis korrekt, som transportör aktivitet beror på specifika transportören och celltypen under studien. - Montera jonselektiva mikroelektrod pipetten till micromanipulator, återfyllning patch-fastspänning pipetten med intracellulära lösningen, se till att lösningen når spetsen av pipett2.
Obs: Det kan krävas flera mjuka kranar för att eliminera bubblorna i spetsen på pipetten. - Montera patch-fastspänning pipetten till huvud scenen av den elektrofysiologi ställa in2,22,23.
Obs: Det är viktigt att hålla huvudet scenen på ungefär en 45 graders vinkel till den vågräta axeln, eftersom detta garanterar inresa vinkel för pipetten som är lämplig för bildandet av en mycket motståndskraftig tätning. - Applicera en liten positiv tryck (~ 5 cm H2O) till patch pipetten att minska risken för blockering spets, och placera den i badet lösning.
- Sluta röra patch clamp pipetten när spetsen är nära cellen.
- Avlasta positiva medan pipett berör cellen och applicera lätt negativt tryck (~ 5 cm H2O) att få en > 1000 MΩ (en Giga-ohm) sigill på cellmembranet med patch Pipettera23.
- Placera plåstret pipetten med cellen i samma fokalplan som av ISE och flytta patch pipetten med cellen i närheten av ISE (~ 5-10 µm)2,5 men undvika att tillåta cellen så kontakta av ISE (figur 1A).
- Säkerställa att anläggningen som är potentiella är 0 mV.
- Brista tätningen med serie kort insug att hämta hela-cell konfigurationen.
- Flytta ISE (eller patch clamp pipett) långsamt vänster höger eller uppåt-nedåt att registrera aktiviteten av transportören (figur 1B).
- Spela in minst 5-8 toppar (figur 1 c, från A till B).
- Tillämpa fyrkantsvåg störningar under inspelningen att övervaka kvaliteten på tätningen och den cellmembran kapacitansen (figur 1).
- Uppskatta den H+ fluxen (
) från skillnaden i gratis H+ koncentration mellan cellens yta och bulk lösningen (ΔH+)
Obs:
och 
är H+ och buffert Diffusionskoefficienterna respektive BT är den totala buffert koncentrationen, KD är konstanten dissociation av bufferten, r är cellen radie, och 
avgör steady state förändringar i koncentrationen av bundna H+ för en liten förändring i gratis H+. H+ indikerar en gratis proton i lösning. För att vara överensstämmer med tidigare studier, H+ flussmedel konverteras till elektrofysiologiska flux enheter genom att beräkna de aktuella motsvarigheterna till flödena (/faraday) pA3,5]. - Normalisera proton flux till cellytan som kan beräknas från Cellstorlek eller den membran kapacitansen.
) från skillnaden i gratis H+ koncentration mellan cellens yta och bulk lösningen (ΔH+)
och 
är H+ och buffert Diffusionskoefficienterna respektive BT är den totala buffert koncentrationen, KD är konstanten dissociation av bufferten, r är cellen radie, och 
avgör steady state förändringar i koncentrationen av bundna H+ för en liten förändring i gratis H+. H+ indikerar en gratis proton i lösning. För att vara överensstämmer med tidigare studier, H+ flussmedel konverteras till elektrofysiologiska flux enheter genom att beräkna de aktuella motsvarigheterna till flödena (Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En självrefererande ISE under hela-cell patch clamp inspelning tillämpades för att studera regleringen av NHE3 aktivitet av phosphoinositides. PS120 fibroblast-liknande celler24, som saknar uttrycket av endogena plasmamembranet NHEs, användes. NHE3 vildtyp (NHE3-wt) eller NHE3 mutanter som inte binda phosphoinositides [tyrosin 501, arginin 503 och lysin 505 var ersatt med alanin, Y501A/R503A/K505A (NHE3-YRK)] uttrycktes stabilt i PS120 fibroblast-liknande celler18.
Spår presenteras i figur 2. Cellen var heldin en hela-cell konfiguration med en pipett för patch fastspänning och av ISE placerades framför cellen. I denna position inspelad av ISE koncentrationen av fria H+ nära cellmembranet (figur 1A); sedan den ISE (eller patch clamp pipett) var manuellt flyttas sidled 50 µm och inspelade koncentrationen av fria H+ i lösningen (figur 1B). Inspelade spänning skillnaderna, motsvarande de två positionerna av patch pipetten med cellen framför eller långt ifrån ISE, är representativa för NHE3 aktivitet (figur 1 c). Intra-pipett perfusionen i apyrase (ATP-diphosphatase) minskar den intracellulära koncentrationen av ATP, därefter minskar fosfoinositid innehåll5. Överens med tidigare rapporterade studier5,18,19reducerad minskad fosfoinositid innehållet medieras av apyrase behandling NHE3 aktivitet (~ 50%), som spelades som en minskning av spänningen svängningen amplitud (figur 2). Effekten av apyrase (ges vid 5 enheter/ml) på NHE3 verksamhet var helt omvända av intra-pipett perfusionen av apyrase i kombination med 2 µM PI (3,4,5) P3 (figur 2 och 3A). Dessa fynd stöttades av den NHE3 aktiviteten registreras i PS120 celler som stabilt uttrycker NHE3 mutanter (NHE3-YRK) som inte kunde binda phosphatidylinositides18. Perfusionen i apyrase ensamt eller i kombination med PIP3 påverkade inte aktiviteten av NHE3 i NHE3-YRK mutanter (figur 3B). Aktiviteten av endogena NHE3 var också hämmas av apyrase behandling i opossum njure (OK) celler3. Intra-pipett perfusionen av PI (3,4,5) P3 omvända hämningen av NHE3 inducerad av apyrase i OK celler (figur 3 c). Dessa fynd tyder på att effekten av PI (3,4,5) P3 på NHE3 verksamhet inte är cell typspecifika.
Nästa, vi ville testa PIP3 specificitet på reglerar apyrase-medierad förändringar i NHE3 verksamhet. Vi gjorde detta genom testmetoder effekten på apyrase-beroende minskning på NHE3 aktivitet efter perfusionen i andra phosphoinositides, såsom PI (4,5) P2. PI (4,5) P2 (vid 10 µM) påverkade inte aktiviteten minskade NHE3 medieras av apyrase (figur 4A). Slutligen perfusionen i AMP-PNP, en icke-hydrolyserbar ATP-analog, blockera inte theapyrase-beroende hämning av NHE3 aktivitet (figur 4B). Dessa fynd antyder en roll för PI (3,4,5) P3, men inte PI (4,5) P2, i regleringen av NHE3 efter ATP utarmning. Identifiering av separata roller för PI (4,5) P2 och PI (3,4,5) P3 i NHE3 förordning var möjligt bara på grund av intercellulära perfusionen i phosphoinositides under ISE mätningar kombinerat med hela-cell patch clamp inspelning5. En särskild åtgärd av PI (3,4,5) P3 i stället för PI (4,5) P2 i regleringen av NHE3 aktivitet är värdefullt att avgöra huruvida olika intracellulära phosphoinositides reglerar funktionen av NHE3 på olika sätt.
Figur 1 . Schematisk framställning av H+ flux mätning och korrelationen mellan NHE aktivitet och potentiella skillnader registreras av den pH mikroelektrod.
Schematisk bild av inställningen för inspelning. A. Diagram över den första experimentella inställningen. Cellen är höll i hela-cell konfigurationen av patch clamp pipetten och placeras framför ISE. I denna position registrerar av ISE koncentrationen av fria H+ nära cellmembranet. B. den ISE (eller patch clamp pipett) är manuellt flyttas sidled ~ 50 µm och registrerar koncentrationen av fria H+ i lösningen i denna position. C. grafisk representation av spänning skillnader registreras med hjälp av ISE. Svängningarna från position en (cell framför ISE) till B (cell långt av ISE) är representativa för NHE aktivitet. Den programvara som används registrerade spänningen skillnader registreras av av ISE och genererade fyrkantsvåg störningar (20 mV, 0.2 kHz) för övervakning av cellmembranet kapacitans och kvalitet av patch clamp tätningen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Exempel på en inspelning inställd för NHE3 transportör aktivitet i en enda PS120 cell stabilt uttrycker NHE3-wt före och efter perfusion med apyrase och PI (3,4,5) P3 (PIP3).
Efter inledande inspelningen, var cellen utarmat av ATP av intra-pipett perfusionen i apyrase. NHE3 verksamhet successivt minskade och restaurerades av PIP3 intra-pipett perfusion. Apyrase tillägg indikeras av den röda stapeln och PIP3 tillägg indikeras av det gröna fältet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . Effekten av ATP utarmning och PIP3 perfusion på NHE3 transportör aktivitet i cellerna PS120 och OK.
Effekten av apyrase-medierad ATP utarmning på NHE3 aktivitet och reservera effekten av apyrase på NHE3 aktivitet induceras av PIP3 intra-pipett perfusion: A. PS120 celler uttrycker NHE3-wt eller B. PS120 celler uttrycker NHE3-YRK, NHE3 mutanter inte binda phosphoinositides. C. OK celler som uttrycker endogena NHE3. Heldragna cirklar visar genomsnittliga data från enskilda experiment (fyra experiment som utförs under identiska förhållanden). Felstaplar representera de medel ± standardfel (SE). * P < 0,05 kontra kontroll, ANOVA. $ P < 0.5, $$P < 0,01 apyrase vs. apyrase + PIP3, ANOVA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 . Effekten av PI (4,5) P2 (PIP2) och ANP-PNP perfusion på NHE3 aktivitet efter ATP utarmning.
Effekten av A. PIP2 eller B. ANP-PNP intra-pipett perfusion på apyrase-beroende driftsinskränkning NHE3 i PS120 celler som uttrycker NHE3-WT heldragna cirklar visar genomsnittliga data från enskilda experiment (fyra experiment som utförs under identiska förhållanden). Felstaplar representera den medel ± SE. * P < 0,05, ** P < 0,01 kontra kontroll, ANOVA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Trots den avgörande funktionen transportörer är metoderna som finns att studera deras verksamhet ineffektiva och otillräckliga. En begränsning är att de tillgängliga metoderna mäter ion rörelse medieras av transportören aktivitet utan att beakta fluktuationer i intracellulär jonen sammansättning under de experiment4. Den presenterade metoden garanterar exakt kontroll av extracellulära och intracellulära ion kompositioner och erbjuder ett kraftfullt verktyg för att ändra intracellulära ion, protein och lipid kompositioner3,4,5.
Det viktigaste steget i detta protokoll är utarbetandet av en ISE som är stabil för en lång tid25. Vår erfarenhet är en instabil ISE inte väl silikoniserat (t.ex. jonselektiva kådan omfördelas på ISE pipett sidorna), vilket kan upptäckas genom en konstant och okontrollerbar drift i ISE signalen. Dessutom bör harts fördelningen i ISE följas noggrant under experimentet. Bad lösningen kan driva jonselektiva harts släpper ISE pipetten, skapa en kolumn med bad lösning innan harts25. I det här fallet av ISE registrerar ion koncentration från denna kolumn och bli nonresponsive till förändringar i ion Övertoningarna under experimentet. Justering av ISE geometri jämförs för att erhålla ett ISE svar i intervallet 100 ms9 och övervinna eventuella förseningar i ISE tid-svaren med förändringar i ion övertoningar.
Den största begränsningen av den presenterade metoden ärvs från plåstret fastspänning mätning av transportören aktivitet i epitelceller. När lossnat från stöd och underhålls i suspension, kan polariserade epitelceller förlora polariserade localizationen av transportörer på apikala eller basolateral membranet.
En modifierad patch fastspänning mätning bör användas när man studerar kanaler och transportörer i polariserade epitel. Med tanke på att celler kan approximera i en cylinder i stället för en sfär är viktigt när du omvandlar H+ gradient in flux via formeln som tillhandahålls. I detta fall formeln bör ändras till 
där λ är längden på cylindern, r är cylinder radien, ad x är det radiella avståndet från cylinder mittpunkten som gradient är uppmätta5. Framtida utvecklingen av denna kraftfulla teknik för att studera electroneutral transportörer bör fokusera på ändra metoden för att optimera inspelning celler odlas i en enskiktslager.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Eric Fishback (Des Moines universitet, Des Moines, Iowa, USA) för hans hjälp med fotografering och redigering videon. PS120 fibroblast-liknande cellerna stabilt uttrycker NHE3-wt eller NHE3-YRK var vänligen tillhandahållen av Dr. Mark Donowitz (Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD, USA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Patch clamp Amplifier | Molecular Devices | ||
| Dual Channel Differential Electrometer (HiZ-223) | Warner Instruments | 64-1650 | |
| Differential Amplifier (DP-301) | Warner Instruments | 64-0044 | |
| Patch Clamp Software Based on MatLab | MatLab with acquisition toolbox | The capmeter software is recommended | |
| ThermoClamp-1 Temperature Control System | AutoMate Scientific | 03-11-LL | In-line heater |
| Single-Channel Temperature Controller (TC-324C) | Warner Instruments | 64-2400 | |
| Single-Barrel Standard Borosilicate Glass Tubing | World Precision Instruments | 1B120F-3 | Used for ion selective electrodes |
| Micropipette Storage Jar | World Precision Instruments | E212 | |
| Bis(dimethylamino)dimethylsilane | Sigma-Aldrich | 14755-100ML | |
| Carbon tetrachloride | Sigma-Aldrich | 319961-500ML | |
| Hydrogen ionophore I - cocktail B | Sigma-Aldrich | 95293 | |
| Thin Wall Borosilicate Tubing | Sutter Instrument | B200-156-15 | Used for patch clamp pipette |
| Soft glass (Corning 8161 Patch Glass) | Warner Instruments | 64-0815 | |
| Silica Capillary Tubing (150um OD/75um ID) | Molex (Polymicro Technologies) | 106815-0018 | Used for intra-pipette perfusion system |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium aspartate | Sigma-Aldrich | A6558 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M4880 | |
| Mg-ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Apyrase | Sigma-Aldrich | A6535 | |
| Phosphatidylinositol(4,5) bisphosphate diC8 | Echelon Biosciences | P-4508 | |
| Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate diC8 | Echelon Biosciences | P-3908 |
References
- Rives, M. L., Javitch, J. A., Wickenden, A. D. Potentiating SLC transporter activity: Emerging drug discovery opportunities. Biochem Pharmacol. , (2017).
- Kang, T. M., Markin, V. S., Hilgemann, D. W. Ion fluxes in giant excised cardiac membrane patches detected and quantified with ion-selective microelectrodes. J Gen Physiol. 121 (4), 325-347 (2003).
- Babich, V., Vadnagara, K., Di Sole, F. The biophysical and molecular basis of intracellular pH sensing by Na+/H+ exchanger-3. FASEB J. 27 (11), 4646-4658 (2013).
- Fuster, D., Moe, O. W., Hilgemann, D. W. Steady-state function of the ubiquitous mammalian Na/H exchanger (NHE1) in relation to dimer coupling models with 2Na/2H stoichiometry. J Gen Physiol. 132 (4), 465-480 (2008).
- Fuster, D., Moe, O. W., Hilgemann, D. W. Lipid- and mechanosensitivities of sodium/hydrogen exchangers analyzed by electrical methods. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (28), 10482-10487 (2004).
- Forster, I. C., Virkki, L., Bossi, E., Murer, H., Biber, J. Electrogenic kinetics of a mammalian intestinal type IIb Na(+)/P(i) cotransporter. J Membr Biol. 212 (3), 177-190 (2006).
- Smith, P. J., Trimarchi, J. Noninvasive measurement of hydrogen and potassium ion flux from single cells and epithelial structures. Am J Physiol Cell Physiol. 280 (1), C1-C11 (2001).
- Parker, M. D., Musa-Aziz, R., Boron, W. F. The use of extracellular, ion-selective microelectrodes to study the function of heterologously expressed transporters in Xenopus oocytes. Am J Physiol Cell Physiol. 296 (5), C1243 (2009).
- Smith, P. J. S., Sanger, R. H., Messerli, M. A. Electrochemical Methods for Neuroscience. Michael, A. C., Borland, L. M. , CRC Press/Taylor & Francis. 373-406 (2007).
- Orlowski, J., Grinstein, S. Diversity of the mammalian sodium/proton exchanger SLC9 gene family. Pflugers Arch. 447 (5), 549-565 (2004).
- Brett, C. L., Donowitz, M., Rao, R. Evolutionary origins of eukaryotic sodium/proton exchangers. Am J Physiol Cell Physiol. 288 (2), C223-C239 (2005).
- Bobulescu, I. A., Di Sole, F., Moe, O. W. Na+/H+ exchangers: physiology and link to hypertension and organ ischemia. Curr Opin Nephrol Hypertens. 14 (5), 485-494 (2005).
- Donowitz, M., Ming Tse, C., Fuster, D. SLC9/NHE gene family, a plasma membrane and organellar family of Na(+)/H(+) exchangers. Mol Aspects Med. 34 (2-3), 236-251 (2013).
- Zachos, N. C., Tse, M., Donowitz, M. Molecular physiology of intestinal Na+/H+ exchange. Annu Rev Physiol. 67, 411-443 (2005).
- Girardi, A. C., Di Sole, F. Deciphering the mechanisms of the Na+/H+ exchanger-3 regulation in organ dysfunction. Am J Physiol Cell Physiol. 302 (11), C1569-C1587 (2012).
- Bobulescu, I. A., Moe, O. W. Na+/H+ exchangers in renal regulation of acid-base balance. Semin Nephrol. 26 (5), 334-344 (2006).
- Hilgemann, D. W., Feng, S., Nasuhoglu, C. The complex and intriguing lives of PIP2 with ion channels and transporters. Sci STKE. (111), re19 (2001).
- Mohan, S., et al. NHE3 activity is dependent on direct phosphoinositide binding at the N terminus of its intracellular cytosolic region. J Biol Chem. 285 (45), 34566-34578 (2010).
- Alexander, R. T., et al. Membrane surface charge dictates the structure and function of the epithelial Na+/H+ exchanger. EMBO J. 30 (4), 679-691 (2011).
- Wang, T. M., Hilgemann, D. W. Ca-dependent nonsecretory vesicle fusion in a secretory cell. J Gen Physiol. 132 (1), 51-65 (2008).
- Hilgemann, D. W. Single-Channel Recording. Sakmann, B., Neher, E. , Plenum Press. 307-328 (1995).
- Hilgemann, D. W., Lu, C. C. Giant membrane patches: improvements and applications. Methods Enzymol. 293, 267-280 (1998).
- Matsuoka, S., Takeuchi, A. Patch Clamp Techniques. Okada, Y. , Springer. 207-218 (2012).
- Pouyssegur, J., Sardet, C., Franchi, A., L'Allemain, G., Paris, S. A specific mutation abolishing Na+/H+ antiport activity in hamster fibroblasts precludes growth at neutral and acidic pH. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (15), 4833-4837 (1984).
- Ogden, D. Microelectrode Techniques - The Plymouth Workshop Handbook. , The Company of Biologists Ltd. 275-316 (1994).
