Summary
Questo manoscritto descrive le applicazioni di elettrodi selettivi protone e patch metodi di bloccaggio per misurare l'attività dei sistemi di trasporto di protoni. Questi metodi di superare alcuni limiti delle tecniche comunemente usate per studiare l'attività di trasporto di protoni, come moderata sensibilità, risoluzione temporale e controllo insufficiente milieu intracellulare.
Abstract
Il trasporto di ioni attraverso le membrane cellulari assicura il controllo preciso del contenuto di ioni all'interno e all'esterno della cellula che è indispensabile per la sopravvivenza delle cellule. Questi meccanismi di trasporto sono mediati dalle attività delle proteine di trasporto specializzate. In particolare, dinamiche di pH sono finemente controllati da sistemi di estrusione del protone (H+) della membrana plasmatica, come Na+/h+ famiglia di proteine dello scambiatore (NHE). Nonostante notevoli sforzi per studiare i meccanismi alla base di regolamento NHE, nostra attuale comprensione delle proprietà biofisiche e molecolare della famiglia NHE è inadeguata a causa della limitata disponibilità di metodi per misurare efficacemente l'attività NHE . In questo manoscritto, abbiamo usato H+-elettrodi selettivi durante intero-cellula patch bloccaggio registrazione per misurare il flusso indotto da NHE H+ . Abbiamo proposto questo approccio per superare alcuni limiti di tipicamente utilizzato metodi per misurare l'attività NHE, quali l'assorbimento radioattivo e membrana fluorescente permeants. La misurazione dell'attività NHE utilizzando il metodo descritto consente ad alta sensibilità e risoluzione temporale e più efficiente controllo delle concentrazioni intracellulari di H+ . H+-elettrodi selettivi si basano sul fatto che il trasportatore attività crea un gradiente di ioni nella prossimità vicina alla membrana cellulare. Un H+-elettrodo selettivo in movimento fino a e distanza dalla membrana cellulare in modo ripetitivo, oscillatorio registra una differenza di tensione che dipende dal flusso di H+ . Mentre H+-elettrodi selettivi sono utilizzati per rilevare il flusso di H+ in movimento fuori dalla cella, il metodo di patch clamp nella configurazione di cellule intere è utilizzato per controllare la composizione intracellulare dello ione. Inoltre, applicazione della tecnica gigante patch clamp consente la modifica della composizione intracellulare di non solo gli ioni, ma anche i lipidi. L'attività di trasportatore di NHE isoforma 3 (NHE3) è stata misurata usando questo approccio tecnico per studiare la base molecolare del regolamento NHE3 fosfoinositidi.
Introduction
Trasporto di ioni e soluti attraverso la membrana plasmatica è essenziale per la sopravvivenza delle cellule e, quindi, di organismi1. Trasporto selettivo di ioni e soluti avviene mediante una matrice di canale specializzato e proteine di trasporto. Le mutazioni in queste proteine provocano spesso una varietà di condizioni cliniche, canale e transporter proteine potenziali bersagli per trattamento farmacologico1di rendering. Purtroppo, la comprensione dei meccanismi alla base funzione canale e transporter e regolamento è spesso limitata dagli approcci disponibili per studiare le loro attività2,3,4.
In particolare, trasportatori possono essere approssimativamente suddivisi in due grandi gruppi a seconda se essi alterano il potenziale transmembrana della cellula durante il trasporto di soluti: i trasportatori dello ione elettrogeniche alterando [ad es., sodio-fosfato co-trasportatore 2a (NaPi2a), scambiatore sodio-calcio (NCX), ecc.] o i trasportatori di ioni elettricamente neutro non alterano [ad es., lo scambiatore sodio-protone (NHE), co-trasportatore sodio-cloruro, NaPi2c, ecc.]. Le attività di entrambe le classi dei trasportatori sono state studiate estesamente utilizzando l'assorbimento degli isotopi radioattivi e coloranti fluorescenti membrana-permeante2. Entrambi gli approcci stimano l'attività dei trasportatori misurando i cambiamenti della concentrazione di massa di ioni specifici citoplasmatici, ed entrambi i metodi hanno dei limiti, come moderata sensibilità e risoluzione temporale e controllo inadeguato di intracellulare milieu. Infatti, l'attività di molti trasportatori è dipenda sulla concentrazione citoplasmatica degli ioni trasportati (ad es., NHE3, NCX), e cambiamenti in queste concentrazioni di ioni sono chiamati a svolgere un ruolo significativo nella regolazione di attività di trasportatore2 , 3 , 5. misurazione precisa di questi meccanismi regolativi è limitato tramite metodi classici.
Per superare queste limitazioni, patch clamp metodi vengono utilizzati per studiare l'attività di trasportatore2,6. In particolare, l'autoreferenziale elettrodi iono-selettivi (ISE)7,8 , combinato con la patch sistema di bloccaggio ha recentemente permesso la misurazione di elettricamente neutro trasportatore attività3,4 , 5. ISEs si basano sul fatto che il trasportatore attività crea un gradiente di ioni nella prossimità vicina alla membrana cellulare. Un ISE salendo a e dalla membrana delle cellule in un ripetitivo, oscillatorio moda registra una differenza di tensione (µV). Differenze di tensione possono essere convertite in valori di flusso dello ione utilizzando un metodo di calibrazione che si applica prima legge di Fick di diffusione2,9. Mentre ISEs sono usati per rilevare il flusso di ioni in movimento su cellule, il metodo di morsetto di patch in entrambi cellule intere o configurazioni di dentro-fuori è usato per controllare la composizione di ioni intracellulari e potenziali di membrana. Inoltre, l'applicazione della tecnica gigante patch clamp consente la modifica della composizione intracellulare di non solo gli ioni, ma anche lipidi e proteine3,5.
In sintesi, la versatilità del metodo patch clamp confrontato con quello di altri metodi per lo studio trasportatore attività ha fatto patch di bloccaggio adatto per superare i limiti comuni di questi altri metodi. La combinazione di autoreferenziali ISEs e tecniche di patch clamp offre la possibilità di misurare l'attività dei trasportatori elettricamente neutro in un ambiente sperimentale controllato e scoprire romanzo molecolare e biofisica Proprietà della membrana cellulare trasporto3,4,5. Questo approccio è stato utilizzato con successo per studiare l'attività della NHE. La famiglia di proteina mammifera NHE catalizza lo scambio netto di elettricamente neutro di sodio extracellulare (Na+) per intracellulare del protone (H+)10,11 utilizzando una pendenza verso l'interno di Na+ . Nei mammiferi, la famiglia di proteine NHE comprende 11 proteine correlate (NHE1-9 e NHA1-2) e un sperma specifiche NHE10,12,13.
Giuseppe (famiglia SLC9a) sono trovati ubiquistmente nella maggior parte dei organismi viventi da semplici procarioti a eucarioti superiori e sono coinvolti in una varietà di cellula vitale funzioni10,11, tra cui il controllo la difesa di salinità delle cellule in procarioti, mantenere il volume delle cellule e l'omeostasi acido-base e che regolano l'assorbimento di acqua e sale in vari epiteli specializzati10,12,14,15. I ruoli biologici chiave di Giuseppe e il significato delle loro funzioni sono stati determinati attraverso diversi studi; Tuttavia, pochi studi hanno studiato le proprietà biofisiche e molecolare di Giuseppe mammiferi a causa di limiti metodologici4. Recentemente, l'applicazione di autoreferenziali ISEs durante il serraggio della intero-cellula patch ha rivelato nuovi meccanismi molecolari delle isoforme NHE regolata da cambiamenti nelle concentrazioni intracellulari di ioni, proteine e fosfolipidi3, 4.
In particolare, il protocollo fornito in questo manoscritto descrive i metodi e approcci per lo studio delle attività e il regolamento di NHE isoforma 3 (NHE3), un attore importante nell'assorbimento di Na+, Cl–, HCO3– e fluido nella spazzola della membrana di confine di epiteli renale ed intestinale14,16. Nuovo approfondimento differenze nella sensibilità di NHE3 attività intracellulare fosfoinositidi (phosphatidylinositide 4,5-bisfosfato [PI (4,5) P2] e phosphatidylinositide 3, 4,5-trifosfato [PI(3,4,5]P3]) è segnalato. Proteine di trasporto delle cellule, quali canali e trasportatori, sono regolati dai fosfoinositidi17e NHE3 si lega direttamente sia PI (4,5) P2 e P3 di PI (3, 4,5)18. Sulla base della letteratura corrente, entrambi phosphoinositide potrebbe essere rilevante per la regolazione fisiologica o patofisiologica di NHE35,18,19. I nostri risultati sostengono ruoli separati per PI (4,5) P2 e P3 di PI (3, 4,5) nella regolazione dell'attività NHE3. Questa distinzione fu possibile grazie all'applicazione di tecniche ISE in combinazione con registrazione di cellule intere patch clamp. Questa tecnica permette anche il controllo del contenuto cellulare phosphoinositide tramite la perfusione intracellulare di fosfoinositidi differenti durante la misurazione dell'attività NHE3.
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Protocol
Nota: Due amplificatori sono necessari per registrare l'attività dei trasportatori elettricamente neutro da un ISE autoreferenziale in combinazione con patch di bloccaggio, un amplificatore di morsetto di patch per mantenere la cella in una configurazione di cellule intere e un'alta impedenza amplificatore ( Elettrometro) per registrare l'attività di trasportatore tramite l'ISE (Vedi tabella materiali). L'amplificatore di patch clamp è collegato direttamente alla scheda di acquisizione terminale. L'elettrometro è collegato all'amplificatore differenziale utilizzato per filtrare e amplificare il segnale. L'amplificatore differenziale è collegato alla scheda di acquisizione terminale. Capmeter, software di morsetto di patch che controlla la capacità della cella, è stato utilizzato in precedenti studi20 (Vedi tabella materiali). Le soluzioni di registrazione camera e perfusione sono mantenute a 37 ° C.
1. preparazione delle pipette per ISEs
- Tirare le pipette da tubi capillari in vetro borosilicato ad un diametro esterno di 1.2 mm (Vedi Tabella materiali) utilizzando la pipetta puller2 .
- Lucidare la pipetta utilizzando il microforge. Il diametro della punta della pipetta deve essere 2-3 µm.
- Posizionare le pipette in un porta vaso per pipette con la punta della pipetta rivolto verso l'alto (Vedi Tabella materiali).
Attenzione: Eseguire procedura 1.4-1.6 in una cappa chimica ben ventilato. - Mescolare la miscela di siliconizzazione che si compone di 1 goccia (~ 150 µ l) di bis (dimetilammino) dimetil Silano e 10 gocce di tetracloruro di carbonio (Vedi Tabella materiali).
- Versare il composto di siliconizzazione nel barattolo e chiudere ermeticamente il coperchio.
- Incubare il vaso con la miscela di siliconizzazione per 24-48 h in una cappa chimica a temperatura ambiente fino a quando il composto è completamente evaporato.
- Recupero informazioni la pipetta con la resina appropriata iono-selettivi per creare una colonna di circa 2-4 mm.
Nota: Ionoforo idrogeno ho B cocktail può essere ataper registrazione NHE attività (Vedi Tabella materiali). - Toccare la punta della pipetta per distribuire la resina iono-selettivi per la punta e posare la pipetta verticalmente nel porta vaso con la punta della pipetta.
- Checkunder il microscopio per dissezione, che il cocktail di resina ha raggiunto la fine della punta. Se necessario, applicare pressione positiva per spingere la resina fino alla fine.
- Recupero informazioni la metà-pipetta con la soluzione appropriata (~ 100 μL). Qui, utilizzare 100 mM KCl e 10 mM HEPES pH 7.0 se utilizza ionoforo ho cocktail B.
- Collegare l'ISE elettrometro e posizionare la punta di ISE nella soluzione vasca utilizzata per la registrazione. Zero l'elettrometro.
- H+di prova-risposta selettiva di ISE modificando il pH della soluzione vasca. H media+-risposta selettiva di ISE è ~ 58 mV per unità di pH.
- Valutare periodicamente la risposta ISE di calibrazione.
2. preparazione del Patch Clamp pipette per la registrazione
Nota: Il metodo descritto da Donald Hilgemann nel suo articolo su registrazione singolo canale21 è consigliato.
- Tirare le pipette per gigante patch dai capillari di vetro borosilicato (mmOD 2.0 / 1.5 mm ID) sulla pipetta estrattore2,22,23.
- Utilizzare un microforge montata sul palco di un microscopio invertito per rendere una pipetta ampia punta (10-22 μm)23. Sciogliere una perlina (~ 0,5 mL) di vetro molle sul filo platino spesso della microforge.
Nota: Un filo di platino relativamente spesso è richiesto (~0.5 mm) per fabbricare gigante patch pipette. - Posizionare la pipetta patch vicino il branello di vetro morbido e applicare calore pieno fino a quando la punta comincia ad attenuarsi. Il legare di platino si sposta leggermente verso il centerduring riscaldamento.
- Spegnete il fuoco e spingere la punta della pipetta il branello di vetro ammorbidito. Il filo di raffreddamento sarà ritrarre e rompere la punta della pipetta.
- Riapplicare il calore per lisciare la punta della pipetta e creare un puntale del diametro desiderato. Il diametro della punta dipende la dimensione della cella per essere patchato (8-10 μm in questo studio).
3. preparazione delle celle
- Riscaldare la soluzione salina tampone fosfato (PBS) senza Ca2 + e Mg2 +, soluzione di tripsina-EDTA e terreno di coltura a 37 ° c.
- Lavare le cellule due volte con PBS. Uso 1 mL di tampone per piastra di coltura cellulare diametro 35 mm.
- Aggiungere 0,5 mL di tripsina alle celle per piastra di coltura cellulare diametro 35 mm.
Nota: Quando le cellule cominciano a round-up, agitare la piastra per-allegare le cellule. - Fermare l'azione della tripsina aggiungendo 5 mL (quantità per piastra di coltura cellulare diametro 35 mm) di medium di crescita completa supplementato con 10% siero bovino fetale.
Nota: Il tempo di reazione in tripsina è cellula-tipo dipendente. - Posizionare le cellule su un agitatore con dondolo per evitare la formazione di grumi.
- Utilizzare le cellule per fino a 2 h dopo trypsinization.
Nota: Il tempo potrebbe variare a seconda della linea cellulare.
4. preparazione di un sistema di perfusione Intra-pipetta
- Tagliare una dimensione appropriata di tubi di quarzo (150 µm OD / 75 µm ID) per preparare la linea di perfusione intra-pipetta.
- Inserire una punta di pipetta 200 µ l di un lato del tubo di quarzo. Incollare il tubo di quarzo sulla punta e tagliare l'estremità della punta con una lama di rasoio affilata.
- Collegare la linea di aspersione (tubi di quarzo incollati alla punta) di un piccolo pezzo di tubo in silicone che sarebbe servito come un serbatoio per la soluzione di perfusione intra-pipetta.
- Collegare il tubo in silicone ad una siringa per creare pressione positiva.
- Inserire l'estremità libera del tubo di quarzo attraverso il tubo di polietilene di Dispensare titolare della perfusione porta (vedere Tabella materiali).
- Valutare la linea di aspersione con la soluzione di pipetta.
5. preparazione delle soluzioni
- Preparare una soluzione di pipetta pesantemente tamponata per la registrazione di NHE (aspartato di potassio 115 mM (KAsp), 1 mM EGTA, 0,5 mM MgCl2, 10 mM Mg-ATP, 12,5 mM HEPES, tubi di 12,5 mM, 12,5 mM MOPS e 12,5 mM MES, pH 6.0 regolato con acido aspartico).
Nota: Preparare la soluzione di riserva pipetta e filtro. Aggiungere Mg-ATP prima della registrazione. - Preparare una soluzione di bagno fresco ogni volta (140 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 2mm MgCl2e 0,1 mM Tris-HCl a pH 8,2).
6. registrazione dell'attività di trasportatore
- Mantenere la camera di registrazione e tutte le soluzioni a 37 ° C, perché l'attività di trasportatore è temperatura-dipendente.
- Posizionare le cellule nella camera di registrazione. Attendere fino a cadere sul fondo della camera, ma non li lascia fissare alla camera di.
- Scegliere una cella appropriata. Misurare il diametro della cella con il micrometro oculare. Scegliere celle con diametri simili.
Nota: In genere, una grande cellula avrà superficie più cellulare e possibilmente più trasportatori espressi sulla sua membrana plasmatica, avendo così anche altre attività di trasportatore. Tuttavia, questo non è necessariamente corretto, come trasportatore attività dipende il trasportatore specifico e il tipo di cella in fase di studio. - Montare la pipetta microelettrodo iono-selettivi per il micromanipolatore, recupero informazioni la pipetta patch di bloccaggio con la soluzione intracellulare, assicurarsi che la soluzione non raggiunge la punta della pipetta2.
Nota: Potrebbe richiedere vari tocchi delicati per eliminare le bolle nella punta della pipetta. - Montare la pipetta patch di bloccaggio alla fase testa di elettrofisiologia impostata2,22,23.
Nota: È importante mantenere sul palco della testa su un angolo di 45 gradi sull'asse orizzontale, come in questo modo, un angolo di ingresso per la pipetta che è adatto per la formazione di una guarnizione ad alta resistenza. - Applicare una piccola pressione positiva (~ 5 cm H2O) per la pipetta di patch per ridurre la possibilità di bloccare la punta e inserire la soluzione del bagno.
- Ferma la pipetta di patch clamp, una volta che la punta è vicino la cella.
- Alleviare la pressione positiva mentre pipetta tocca la cella e applicare una leggera pressione negativa (~ 5 cm H2O) per ottenere un > 1000 sigillo MΩ (un Giga-ohm) sulla membrana cellulare con la patch pipetta23.
- Inserire la pipetta patch con la cella sullo stesso piano focale come l'ISE e spostare la pipetta patch con il cellulare in prossimità di ISE (~ 5-10 µm)2,5 , ma evitare che permette alla cella di contattare l'ISE (Figura 1A).
- Assicurare che l'azienda potenziale è 0 mV.
- Rompere il sigillo con serie di aspirazioni breve per ottenere la configurazione di cellule intere.
- Spostare l'ISE (o patch clamp pipetta) lentamente sinistra-destra oppure su-giù per registrare l'attività del trasportatore (Figura 1B).
- Registrare picchi di almeno 5-8 (Figura 1, da A B).
- Applicare perturbazioni onda quadra durante la registrazione per monitorare la qualità del sigillo e la capacità di membrana delle cellule (Figura 1).
- Stimare il flusso di H+ (
) dalla differenza nella concentrazione di H+ libero tra la superficie della cellula e la soluzione di massa (ΔH+)
Nota:
e 
i coefficenti di diffusione del buffer, rispettivamente e sono H+ BT è la concentrazione del buffer totale, KD è la costante di dissociazione del buffer, r è la cella raggio, e 
determina il cambiamento di stato stazionario della concentrazione di H associato+ per un piccolo cambiamento nel libero H+. H+ indica un protone libero in soluzione. Per essere coerenti con gli studi precedenti, H+ flussi vengono convertiti in unità di flusso elettrofisiologici calcolando gli equivalenti attuali dei flussi (/faraday) in pA3,5]. - Normalizzare il flusso di protoni alla superficie delle cellule che può essere calcolata dalle dimensioni della cella o per la capacità di membrana.
) dalla differenza nella concentrazione di H+ libero tra la superficie della cellula e la soluzione di massa (ΔH+)
e 
i coefficenti di diffusione del buffer, rispettivamente e sono H+ BT è la concentrazione del buffer totale, KD è la costante di dissociazione del buffer, r è la cella raggio, e 
determina il cambiamento di stato stazionario della concentrazione di H associato+ per un piccolo cambiamento nel libero H+. H+ indica un protone libero in soluzione. Per essere coerenti con gli studi precedenti, H+ flussi vengono convertiti in unità di flusso elettrofisiologici calcolando gli equivalenti attuali dei flussi (Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Un ISE autoreferenziale durante la registrazione di morsetto della intero-cellula patch è stata applicata per studiare la regolazione dell'attività NHE3 dai fosfoinositidi. PS120 fibroblasto-come le cellule24, che mancano dell'espressione di membrana plasmatica endogena Giuseppe, sono stati utilizzati. NHE3 wild-type (NHE3-wt) o NHE3 mutanti che non legano fosfoinositidi [tirosina 501, 503 di arginina e lisina 505 sono stati sostituiti con alanina, Y501A/R503A/K505A (NHE3-YRK)] stabile sono stati espressi in PS120 fibroblasto-come le cellule18.
Le tracce sono presentate nella Figura 2. La cella era heldin una configurazione di cellule intere mediante una pipetta per patch di bloccaggio e l'ISE è stato disposto davanti alla cella. In questa posizione, l'ISE ha registrato la concentrazione di libero H+ vicino alla membrana delle cellule (Figura 1A); quindi, l'ISE (o patch clamp pipetta) era manualmente spostato lateralmente 50 µm e registrato la concentrazione di libero H+ nella soluzione (Figura 1B). Le differenze di tensione registrato, corrispondenti a due posizioni della pipetta patch con la cella di fronte o lontano da ISE, sono rappresentante di NHE3 attività (Figura 1). La perfusione intra-pipetta di apyrase (ATP-diphosphatase) diminuisce la concentrazione intracellulare di ATP, successivamente diminuendo il contenuto di phosphoinositide5. In accordo con gli studi precedentemente segnalati5,18,19, il contenuto di phosphoinositide in diminuzione mediato dal trattamento di apyrase ridotto NHE3 attività (~ 50%), che è stata registrata come una diminuzione della tensione di ampiezza di oscillazione (Figura 2). L'effetto di apyrase (dato alle 5 unità/ml) su attività NHE3 era completamente invertita da perfusione intra-pipetta della apyrase in combinazione con 2 µM PI (3, 4,5) P3 (Figura 2 e 3A). Questi risultati sono stati sostenuti dall'attività NHE3 registrata in PS120 cellule che esprimono stabilmente NHE3 mutanti (NHE3-YRK) che erano in grado di associare phosphatidylinositides18. La perfusione di apyrase da solo o in combinazione con PIP3 non ha influenzato l'attività di NHE3 in mutanti NHE3-YRK (Figura 3B). L'attività di NHE3 endogeno inoltre è stata inibita dal trattamento di apyrase in opossum del rene (OK) celle3. La perfusione intra-pipetta di PI (3, 4,5) P3 ha invertito l'inibizione di attività NHE3 indotta da apyrase in cellule OK (Figura 3). Questi risultati suggeriscono che l'effetto di PI (3, 4,5) P3 su NHE3 attività non è specifico del tipo di cella.
Successivamente, abbiamo mirato a testare la specificità di PIP3 sulla regolamentazione cambiamenti apyrase-mediati in NHE3 attività. Abbiamo fatto questo analizzando l'effetto sulla riduzione del apyrase-dipendente su NHE3 attività dopo la perfusione di altri fosfoinositidi, come PI (4,5) P2. PI (4,5) P2 (a 10 µM) non ha influenzato l'attività in diminuzione NHE3 mediata da apyrase (Figura 4A). Infine, la perfusione di AMP-PNP, un analogo di ATP non idrolizzabili, non bloccare l'inibizione di theapyrase-dipendente di attività NHE3 (Figura 4B). Questi risultati suggeriscono un ruolo di PI (3, 4,5) P3, ma non PI (4,5) P2, nella regolazione della NHE3 dopo lo svuotamento di ATP. L'identificazione di ruoli separati per PI (4,5) P2 e P3 di PI (3, 4,5) in NHE3 regolamento era possibile solo a causa dell'aspersione intercellulare di fosfoinositidi durante le misurazioni di ISE combinato con cellule intere toppa morsetto5di registrazione. Un'azione specifica di PI (3, 4,5) P3 anziché PI (4,5) P2 nella regolazione dell'attività NHE3 è utile per determinare se diversi fosfoinositidi intracellulare regolano la funzione del NHE3 diversamente.
Figura 1 . Rappresentazione schematica di H+ flux misura e correlazione tra attività NHE e differenze di potenziale registrate dal microelettrodo pH.
Rappresentazione schematica dell'impostazione della registrazione. A. diagramma dell'impostazione sperimentale iniziale. La cella è tenuta nella configurazione di cellule intere di pipetta patch clamp e posto di fronte a ISE. In questa posizione, l'ISE registra la concentrazione di H gratis+ vicino alla membrana cellulare. B. l'ISE (o patch clamp pipetta) è manualmente spostato lateralmente ~ 50 µm e registra la concentrazione di libero H+ nella soluzione in questa posizione. C. rappresentazione grafica delle differenze di tensione registrato utilizzando l'ISE. Le oscillazioni da posizione (una cella davanti l'ISE) a B (cella lontano l'ISE) sono rappresentativi di attività NHE. Il software utilizzato registrato la tensione differenze registrate da ISE e generato perturbazioni di onda quadra (20 mV, 0,2 kHz) per monitorare la capacità della membrana cellulare e la qualità del sigillo patch clamp. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 . Esempio di una registrazione per NHE3 trasportatore attività impostata in una singola cella di PS120 che esprimono stabilmente NHE3-wt prima e dopo perfusione con apyrase e PI (3, 4,5) P3 (PIP3).
Dopo la registrazione iniziale, la cella è stata vuotata del trifosfato di adenosina di perfusione intra-pipetta della apyrase. NHE3 attività gradualmente diminuito e fu restaurato da perfusione intra-pipetta PIP3. Aggiunta di apyrase è indicato dalla barra rossa, e aggiunta di PIP3 è indicato dalla barra verde. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 . Effetto di deplezione di ATP e di aspersione di PIP3 su NHE3 trasportatore attività in cellule PS120 e OK.
Effetto di deplezione di ATP apyrase-mediata su NHE3 attività e riservando l'effetto del apyrase su NHE3 attività indotta da perfusione intra-pipetta PIP3: r. PS120 cellule esprimenti NHE3-wt o B. PS120 cellule esprimenti NHE3-YRK, NHE3 mutanti in grado di associare fosfoinositidi. C. OK cellule esprimenti NHE3 endogeno. Cerchi pieni mostrano dati medi da singoli esperimenti (quattro esperimenti eseguiti in condizioni identiche). Barre di errore rappresentano gli errori standard ± di mezzi (SE). * P < 0,05 contro controllo, ANOVA. $ P < 0,5, apyrase < 0.01 $$P vs apyrase + PIP3, ANOVA. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 . Effetto di PI (4,5) P2 (PIP2) e ANP-PNP aspersione su NHE3 attività dopo lo svuotamento di ATP.
Effetto di r. PIP2 o B. Aspersione di ANP-PNP intra-pipetta sulla riduzione apyrase-dipendente di attività NHE3 in PS120 cellule che esprimono NHE3-WT cerchi pieni Visualizza dati medi da singoli esperimenti (quattro esperimenti eseguiti in condizioni identiche). Barre di errore rappresentano il ± di mezzi SE. * P < 0,05, * * P < 0.01 vs controllo, ANOVA. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Nonostante le funzioni cruciali dei trasportatori, i metodi disponibili per studiare le loro attività sono inefficace e inadeguata. Una limitazione è che i metodi disponibili misurano il movimento di ioni mediata da trasportatore attività senza considerare le fluttuazioni nella composizione di ioni intracellulari durante l'esperimento4. Il metodo proposto garantisce un controllo preciso delle composizioni di ioni extracellulari ed intracellulari e offre un potente strumento per la modifica di intracellulare dello ione, della proteina e del lipido composizioni3,4,5.
Il passo più importante in questo protocollo è la preparazione di un ISE che è stabile per un lungo periodo25. Nella nostra esperienza, un ISE instabile non è ben siliconato (ad es., la resina iono-selettivi viene ridistribuita ai lati di pipetta ISE), che può essere rilevato da una costante e incontrollabile deriva del segnale di ISE. Inoltre, la distribuzione della resina in ISE deve essere attentamente monitorata durante l'esperimento. La soluzione del bagno può spingere la resina iono-selettivi all'interno della pipetta ISE, creazione di una colonna di soluzione del bagno prima la resina25. In questo caso, l'ISE registrerà la concentrazione di ioni da questa colonna e diventare non rispondono ai cambiamenti nei gradienti ionici durante l'esperimento. Regolazione della geometria di ISE è chiave per ottenere una risposta ISE nella gamma di 100 ms9 e superare possibili ritardi nel tempo ISE-risposte rispetto ai cambiamenti nelle sfumature dello ione.
La limitazione principale del metodo presentato viene ereditata dalla patch misurazione dell'attività di trasportatore in cellule epiteliali di bloccaggio. Quando vengono scollegati dal supporto e mantenute in sospensione, cellule epiteliali polarizzate potrebbero perdere la localizzazione polarizzata dei trasportatori sulla membrana apicale o basolaterale.
Una patch modificata misura di serraggio deve essere utilizzata quando si studia canali e trasportatori in epiteli polarizzati. Considerando che le cellule potrebbero approssimare in un cilindro, piuttosto che una sfera è importante quando trasformando il gradiente di H+ in flusso tramite la formula di. In questo caso, la formula deve essere modificata in 
dove λ è la lunghezza del cilindro, r è il raggio del cilindro, Active x è la distanza radiale dal punto medio cilindro su cui la sfumatura è misurato5. Sviluppo futuro di questa potente tecnica per studiare i trasportatori elettricamente neutro dovrebbe concentrarsi sulla modifica del metodo per ottimizzare la registrazione le cellule coltivate in un monostrato.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse a divulgare.
Acknowledgments
Gli autori vorrei ringraziare Eric Fishback (Università di Des Moines, Des Moines, Iowa, USA) per la sua assistenza con riprese e montaggio video. Il PS120 fibroblasto-come le cellule che esprimono stabilmente NHE3-wt o NHE3-YRK sono state gentilmente concesse dal Dr. Mark Donowitz (Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD, USA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Patch clamp Amplifier | Molecular Devices | ||
| Dual Channel Differential Electrometer (HiZ-223) | Warner Instruments | 64-1650 | |
| Differential Amplifier (DP-301) | Warner Instruments | 64-0044 | |
| Patch Clamp Software Based on MatLab | MatLab with acquisition toolbox | The capmeter software is recommended | |
| ThermoClamp-1 Temperature Control System | AutoMate Scientific | 03-11-LL | In-line heater |
| Single-Channel Temperature Controller (TC-324C) | Warner Instruments | 64-2400 | |
| Single-Barrel Standard Borosilicate Glass Tubing | World Precision Instruments | 1B120F-3 | Used for ion selective electrodes |
| Micropipette Storage Jar | World Precision Instruments | E212 | |
| Bis(dimethylamino)dimethylsilane | Sigma-Aldrich | 14755-100ML | |
| Carbon tetrachloride | Sigma-Aldrich | 319961-500ML | |
| Hydrogen ionophore I - cocktail B | Sigma-Aldrich | 95293 | |
| Thin Wall Borosilicate Tubing | Sutter Instrument | B200-156-15 | Used for patch clamp pipette |
| Soft glass (Corning 8161 Patch Glass) | Warner Instruments | 64-0815 | |
| Silica Capillary Tubing (150um OD/75um ID) | Molex (Polymicro Technologies) | 106815-0018 | Used for intra-pipette perfusion system |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium aspartate | Sigma-Aldrich | A6558 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M4880 | |
| Mg-ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Apyrase | Sigma-Aldrich | A6535 | |
| Phosphatidylinositol(4,5) bisphosphate diC8 | Echelon Biosciences | P-4508 | |
| Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate diC8 | Echelon Biosciences | P-3908 |
References
- Rives, M. L., Javitch, J. A., Wickenden, A. D. Potentiating SLC transporter activity: Emerging drug discovery opportunities. Biochem Pharmacol. , (2017).
- Kang, T. M., Markin, V. S., Hilgemann, D. W. Ion fluxes in giant excised cardiac membrane patches detected and quantified with ion-selective microelectrodes. J Gen Physiol. 121 (4), 325-347 (2003).
- Babich, V., Vadnagara, K., Di Sole, F. The biophysical and molecular basis of intracellular pH sensing by Na+/H+ exchanger-3. FASEB J. 27 (11), 4646-4658 (2013).
- Fuster, D., Moe, O. W., Hilgemann, D. W. Steady-state function of the ubiquitous mammalian Na/H exchanger (NHE1) in relation to dimer coupling models with 2Na/2H stoichiometry. J Gen Physiol. 132 (4), 465-480 (2008).
- Fuster, D., Moe, O. W., Hilgemann, D. W. Lipid- and mechanosensitivities of sodium/hydrogen exchangers analyzed by electrical methods. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (28), 10482-10487 (2004).
- Forster, I. C., Virkki, L., Bossi, E., Murer, H., Biber, J. Electrogenic kinetics of a mammalian intestinal type IIb Na(+)/P(i) cotransporter. J Membr Biol. 212 (3), 177-190 (2006).
- Smith, P. J., Trimarchi, J. Noninvasive measurement of hydrogen and potassium ion flux from single cells and epithelial structures. Am J Physiol Cell Physiol. 280 (1), C1-C11 (2001).
- Parker, M. D., Musa-Aziz, R., Boron, W. F. The use of extracellular, ion-selective microelectrodes to study the function of heterologously expressed transporters in Xenopus oocytes. Am J Physiol Cell Physiol. 296 (5), C1243 (2009).
- Smith, P. J. S., Sanger, R. H., Messerli, M. A. Electrochemical Methods for Neuroscience. Michael, A. C., Borland, L. M. , CRC Press/Taylor & Francis. 373-406 (2007).
- Orlowski, J., Grinstein, S. Diversity of the mammalian sodium/proton exchanger SLC9 gene family. Pflugers Arch. 447 (5), 549-565 (2004).
- Brett, C. L., Donowitz, M., Rao, R. Evolutionary origins of eukaryotic sodium/proton exchangers. Am J Physiol Cell Physiol. 288 (2), C223-C239 (2005).
- Bobulescu, I. A., Di Sole, F., Moe, O. W. Na+/H+ exchangers: physiology and link to hypertension and organ ischemia. Curr Opin Nephrol Hypertens. 14 (5), 485-494 (2005).
- Donowitz, M., Ming Tse, C., Fuster, D. SLC9/NHE gene family, a plasma membrane and organellar family of Na(+)/H(+) exchangers. Mol Aspects Med. 34 (2-3), 236-251 (2013).
- Zachos, N. C., Tse, M., Donowitz, M. Molecular physiology of intestinal Na+/H+ exchange. Annu Rev Physiol. 67, 411-443 (2005).
- Girardi, A. C., Di Sole, F. Deciphering the mechanisms of the Na+/H+ exchanger-3 regulation in organ dysfunction. Am J Physiol Cell Physiol. 302 (11), C1569-C1587 (2012).
- Bobulescu, I. A., Moe, O. W. Na+/H+ exchangers in renal regulation of acid-base balance. Semin Nephrol. 26 (5), 334-344 (2006).
- Hilgemann, D. W., Feng, S., Nasuhoglu, C. The complex and intriguing lives of PIP2 with ion channels and transporters. Sci STKE. (111), re19 (2001).
- Mohan, S., et al. NHE3 activity is dependent on direct phosphoinositide binding at the N terminus of its intracellular cytosolic region. J Biol Chem. 285 (45), 34566-34578 (2010).
- Alexander, R. T., et al. Membrane surface charge dictates the structure and function of the epithelial Na+/H+ exchanger. EMBO J. 30 (4), 679-691 (2011).
- Wang, T. M., Hilgemann, D. W. Ca-dependent nonsecretory vesicle fusion in a secretory cell. J Gen Physiol. 132 (1), 51-65 (2008).
- Hilgemann, D. W. Single-Channel Recording. Sakmann, B., Neher, E. , Plenum Press. 307-328 (1995).
- Hilgemann, D. W., Lu, C. C. Giant membrane patches: improvements and applications. Methods Enzymol. 293, 267-280 (1998).
- Matsuoka, S., Takeuchi, A. Patch Clamp Techniques. Okada, Y. , Springer. 207-218 (2012).
- Pouyssegur, J., Sardet, C., Franchi, A., L'Allemain, G., Paris, S. A specific mutation abolishing Na+/H+ antiport activity in hamster fibroblasts precludes growth at neutral and acidic pH. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (15), 4833-4837 (1984).
- Ogden, D. Microelectrode Techniques - The Plymouth Workshop Handbook. , The Company of Biologists Ltd. 275-316 (1994).
