Summary
Bu el yazması proton taşıma sistemlerinin etkinliğini ölçmek için proton-seçici elektrot ve yöntemleri sıkma yama uygulamaları açıklar. Bu yöntemleri teknikleri proton taşıma etkinlik, ılımlı duyarlılık, zaman çözünürlüğü ve yetersiz hücre içi ortam denetimi gibi çalışma için yaygın olarak kullanılan bazı sınırlamalarının üstesinden gelir.
Abstract
İyonlarının hücre membranlar yoluyla taşıma iyon içeriği içinde ve hücre yaşam için vazgeçilmez bir hücre dışında ayrıntılı denetimini sağlar. Bu taşıma mekanizmaları özel taşıyıcı proteinler faaliyetleri tarafından aracılık. Özellikle, pH dynamics ince Na+gibi plazma zarı proton (H+) ekstrüzyon sistemleri tarafından kontrol edilir/h+ Eşanjör (NHE) protein ailesi. NHE yönetmelik temel mekanizmaları incelemek için kapsamlı çabalarına rağmen geçerli anlayışımız NHE aile biyofiziksel ve moleküler özelliklerinin etkili NHE etkinliği ölçmek için yöntemler sınırlı yer nedeniyle yetersiz . Bu makale, kullandığımız H+-bütün hücreli sırasında seçici elektrot yama NHE kaynaklı H+ akı ölçmek için sıkma kayıt. Biz genellikle bazı sınırlamaları aşmak için bu yaklaşım yöntemleri radyoaktif uptake ve floresan membran permeants gibi NHE etkinliği ölçmek için kullanılan önerdi. Açıklanan yöntemi kullanarak NHE etkinliğini ölçümü yüksek hassasiyet ve zaman çözünürlüğü ve hücre içi H+ konsantrasyonları daha verimli kontrolünü sağlar. H+-seçici elektrotlar vardır yakınında hücre membran bir iyon degrade ışınlama aktivitesi oluşturur gerçeğine dayanır. Bir H+-seçici elektrot kadar hareketli ve hücre zarının bir tekrarlayan, salınım moda uzakları H+ akı üzerinde bağımlı bir gerilim farkı kaydeder. Süre H+-seçici elektrot hareketli hücreden yama kelepçe yöntemi tüm hücreli yapılandırma hücre içi iyon kompozisyon denetlemek için kullanılır H+ akı algılamak için kullanılır. Ayrıca, dev yama klemp tekniği uygulanması sadece da lipidler iyonları hücre içi bileşimi modifikasyonu sağlar. Işınlama aktivitesi NHE izoformu 3 (NHE3), moleküler temelini NHE3 yönetmelik çalışması için bu teknik yaklaşım kullanarak phosphoinositides tarafından ölçüldü.
Introduction
Taşıma iyonları ve solutes plazma zarı arasında hücre ve dolayısıyla, organizmalar1yaşam için önemlidir. Seçici taşıma iyonları ve solutes bir dizi özel kanal ve taşıyıcı proteinler tarafından sağlanır. Bu proteinler mutasyonların kez klinik koşulları, kanal ve taşıyıcı proteinler potansiyel hedefleri farmakolojik tedavi1için işleme çeşitli neden. Ne yazık ki, kanal ve ışınlama işlevi ve yönetmelik temel mekanizmaları anlama kez onların etkinlik2,3,4eğitim kullanılabilir yaklaşımlar tarafından sınırlıdır.
Özellikle, ışınlayıcılar kabaca olup onlar solutes taşıma sırasında hücre transmembran potansiyel alter bağlı olarak iki büyük gruba alt ayrılabilir: değiştirmek aşağıdaki sonuçlara yolaçabilir electrogenic iyon taşıyıcıları [Örneğin, sodyum-fosfat Co ışınlama 2a (NaPi2a), sodyum kalsiyum Eşanjör (NCX), vs.] veya electroneutral iyon değiştirme Işınlayıcılar [Örneğin, sodyum-proton Eşanjör (NHE), Sodyum Klorür co ışınlama odası, NaPi2c, vb.]. Taşıma araçları her iki çeşit faaliyetlerinin yoğun alımını radyoaktif izotoplar kullanılarak incelenmiştir ve floresan membran-permeant2boya. Her iki yaklaşımın belirli sitoplazmik iyonları toplu konsantrasyonu değişiklikleri ölçerek taşıyıcılar aktivitesini tahmin etmek, ve her iki yöntem kısıtlamaları, ılımlı duyarlılık ve zaman çözünürlüğü ve hücre içi yetersiz kontrolü gibi çevre. Gerçekten de, birçok taşıyıcıları etkinliği (Örneğin, NHE3, NCX) taşınan iyonların sitoplazmik konsantrasyon bağımlı olduğunu ve bu iyon konsantrasyonlarının değişimler ışınlama aktivitesi2 düzenlenmesinde önemli bir rol oynaması bekleniyor , 3 , 5. bu düzenleyici mekanizmaları hassas ölçümdür klasik yöntemlerle sınırlı.
Bu sınırlamalar üstesinden gelmek için yama kelepçe yöntemleri ışınlama aktivitesi2,6incelemek için kullanılır. Özellikle, sistem sıkma yama ile kombine self-referencing iyon-seçici elektrot (sorunum)7,8 son zamanlarda electroneutral ışınlama aktivitesi3,4 ölçümü sağladı , 5. sorunum vardır yakınında hücre membran bir iyon degrade ışınlama aktivitesi oluşturur gerçeğine dayanır. Taşımak ve hücre zarının bir tekrarlayan içinde uzak bir İMKB salınım moda bir gerilim farkı (µV) kaydeder. Gerilim farkları Difüzyon2,9Fick'ın ilk hukuk uygulayan bir kalibrasyon yöntemiyle iyon akı değerleri dönüştürülebilir. Sorunum ise dışarı-in hareket iyonları akı algılamak, hücreleri yama kelepçe yöntemi her iki bütün hücredeki veya iç-out yapılandırmaları membran potansiyeli ve hücre içi iyon kompozisyon denetlemek için kullanılır. Ayrıca, dev yama klemp tekniği uygulama sadece da lipidler ve proteinler3,5iyonları hücre içi bileşimi modifikasyonu sağlar.
Özetle, yama kelepçe yöntemi çok yönlülüğü ile çalışmak için diğer yöntemleri yama bu yöntemlerin ortak sınırlamaları aşmak uygun sıkma ışınlama aktivitesi yaptı karşılaştırıldığında. Kendi kendine referans sorunum ve yama kelepçe teknikleri ile birlikte electroneutral taşıyıcılar sıkı şekilde denetlenen bir deneysel ortamda etkinliğini ölçmek için ve roman biyofiziksel ve moleküler keşfetmek için benzersiz imkanı sunuyor Hücre zarı özellikleri3,4,5ulaşım. Bu yaklaşım, etkinliği NHE ile çalışmaya başarıyla kullanılmıştır. Memeli NHE protein ailesi ekstraselüler sodyum (Na+) electroneutral net değişimi için hücre içi proton (H+)10,11 bir içe Na+ degrade kullanan tromboksan. Memelilerde, 11 ilgili proteinler (NHE1-9 ve NHA1-2) ve sperm özgü NHE10,12,13NHE protein ailesi içerir.
NHEs (SLC9a aile) ubiquitously basit prokaryot gelen en canlı organizmalar daha yüksek Ökaryotlar bulunur ve hücre tuzluluk savunmak için kontrol dahil olmak üzere önemli hücre fonksiyonları10,11, çeşitli yer alırlar prokaryot, asit-baz homeostazı ve hücre Cilt Bakımı ve çeşitli özel epiteli10,12,14,15dakika sonra tuz ve su emilimini düzenleyen. NHEs kilit biyolojik rolü ve önemi işlevlerini çeşitli çalışmalar sayesinde tespit edilmiştir; Ancak, birkaç çalışmaları metodolojik sınırlamalar4nedeniyle memeli NHEs biyofiziksel ve moleküler özelliklerini araştırdı. Son zamanlarda, sorunum bütün hücreli yama sıkma sırasında kendi kendine başvuru uygulama değişiklikleri iyonları, proteinler ve fosfolipitler3hücre içi konsantrasyonlarda sahiplenilip NHE izoformlarının roman moleküler mekanizmaları ortaya koymuştur, 4.
Özellikle, bu el yazması gelen doğrulama yöntemleri ve etkinlik düzenlenmesi ve NHE izoformu 3 (NHE3), Na+, Cl-, HCO3- ve sıvı emme önemli bir oyuncu eğitimi için yaklaşımlar önerilmektedir Fırça sınır membran böbrek ve bağırsak epiteli14,16. NHE3 faaliyet duyarlılık farklar için hücre içi phosphoinositides içine yeni bir bakış açısı (phosphatidylinositide 4, 5-bisphosphate [PI (4,5) P2] ve phosphatidylinositide 3,4,5-trifosfat [PI(3,4,5]P3]) bildirdi. Cep taşıma proteinler, kanallar ve ışınlayıcılar, gibi phosphoinositides17tarafından düzenlenir ve NHE3 doğrudan PI (4,5) P2 ve PI (3,4,5) P318bağlar. Geçerli edebiyat bağlı olarak, her iki fosfoinositid NHE35,18,19fizyolojik veya patofizyolojik düzenleme için ilgili olabilir. Cihazla ilgili izlenimlerimizi PI (4,5) P2 ve PI (3,4,5) P3 NHE3 faaliyetinin yönetmelikte ayrı roller destekler. Bu ayrım yüzünden bütün hücreli yama kelepçe kayıt ile birlikte İMKB tekniklerin uygulanması. Bu teknik aynı zamanda fosfoinositid hücresel memnun yolu ile farklı phosphoinositides hücre içi perfüzyon NHE3 etkinlik ölçümü sırasında kontrolünü sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: İki amplifikatörler sıkma, tüm hücreli yapılandırma ve bir yüksek impendence amplifikatör (hücrede korumak için bir yama kelepçe amplifikatör yama ile birlikte electroneutral taşıyıcılar self-referencing İMKB tarafından etkinliği kaydetmek için gerekli olan electrometer İMKB yoluyla ışınlama etkinliklerini kaydetmek için) (tablo malzemeleri görmek). Yama kelepçe amplifikatör satın alma kurulu terminal doğrudan bağlıdır. Electrometer filtre ve sinyali yükseltmek için kullanılan fark amplifikatör bağlıdır. Fark amplifikatör terminal edinme kuruluna bağlı. Capmeter, hücre kapasitesi, izler yama kelepçe yazılım önceki çalışmalar20 dakika içinde kullanılan (tablo malzemeleri görmek). Kayıt odası ve perfüzyon çözümleri 37 ° C'de tutulur
1. hazırlanması Pipetler sorunum için
- Borosilikat cam kılcal üzerinden Pipetler bir dış çap 1.2 mm için çek ( Tablo malzemelerigörmek) pipet çektirme2 kullanarak.
- Microforge kullanarak pipet Lehçe. Pipet ucu çapının 2-3 µm olmalıdır.
- Pipetler bir kavanoz tutucu Pipetler için (bkz: Malzemeler tablo) karşı karşıya pipet ucu yerleştirin.
Dikkat: 1.4-1.6 iyi havalandırılmış kimyasal duman mahallede adımları izleyerek. - BIS (dimetilamino) Dimetil silane ve karbon tetraklorür 10 damla 1 damla (~ 150 µL) oluşan siliconization karışımı karışımı ( Tablo malzemelerigörmek).
- Siliconization karışımı kavanozun içine dökün ve kapağını sıkıca kapatın.
- Karışım tamamen buharlaşıp kadar kavanoz için 24-48 h kimyasal duman başlıklı oda sıcaklığında siliconization karışımı ile kuluçkaya.
- Yaklaşık 2-4 mm bir sütun oluşturmak için uygun iyon-seçici reçine ile pipet tamamlanmıyor.
Not: Hidrojen ionophore ben kokteyl B usedfor kayıt NHE etkinlik olabilir ( Tablo malzemelerigörmek). - Pipet ucu iyon-seçici reçine dağıtmak için ucu dokunun ve pipet pipet ucu kavanoz tutucu dikey olarak yerleştirin.
- Checkunder reçine kokteyl ucunu sonuna ulaştı diseksiyon mikroskop. Gerekirse, reçine sonuna kadar itmek için pozitif basınç uygulayın.
- Backfill yarı-pipet ile uygun bir çözüm (~ 100 μL). Burada, 100 mM KCl ve 10 mM HEPES pH 7,0 ionophore kullanıyorsanız kullanın ben kokteyl B.
- İMKB için electrometer bağlamak ve kayıt için kullanılan banyo çözüm İMKB ucu yerleştirin. Electrometer sıfır.
- H+test-banyo çözüm pH değiştirerek seçici İMKB yanıt. Ortalama H+-seçici İMKB yanıttır ~ 58 mV pH birimi başına.
- Düzenli olarak kalibrasyon İMKB yanıtı değerlendirmek.
2. yama kelepçe hazırlanması için kayıt Pipetler
Not: Donald Hilgemann tarafından yazısında tek kanallı kayıt21 tarihinde açıklanan yöntemi önerilir.
- Pipetler borosilikat cam kılcal gelen dev yama için çek (2.0 mmOD / 1.5 mm kimlik) pipet çektirme2,22,23.
- Kullanım bir microforge geniş pipet ucu (10-22 mikron)23yapmak ters bir mikroskop sahnede monte. Bir boncuk erime (~ 0.5 mL) microforge yumuşak cam kalın Platin tel üzerine.
Not: Nispeten kalın bir platin tel gereklidir (dev yama Pipetler imal etmek ~0.5 mm). - Yumuşak cam boncuk yakın yama pipet getirin ve çekilmek belgili tanımlık uç başlayana kadar tam ısı uygulayın. Platin tel biraz Isıtma centerduring doğru hareket eder.
- Isı kapatın ve pipet ucu yumuşatılmış cam boncuk itin. Soğutma tel geri çekmek ve pipet ucu kesin.
- Pipet ucu düz ve istenilen çap pipet ucu oluşturmak için ısı yeniden uygulayın. Uç çapı bağlı olmak hücre boyutunu (Bu çalışmada 8-10 mikron) yamalı.
3. hücre hazırlanması
- Fosfat tampon serum (PBS) Ca2 + ve Mg2 +, tripsin-EDTA çözüm ve büyüme Orta olarak 37 ° C'de ısıtın
- Hücreleri iki kez PBS ile yıkayın. Arabellek 1 mL 35 mm çap hücre kültür plaka için kullanın.
- Tripsin 0.5 mL 35 mm çap hücre kültür plaka için hücreleri ekleyin.
Not: hücreler yuvarlak-up, de-hücreleri eklemek plaka sallamak başlattığınızda. - Tripsin eylem 5 mL (35 mm çap hücre kültür plaka için tutar) % 10 fetal sığır serum ile desteklenmiş tam büyüme ortamının ekleyerek durdurun.
Not: Tripsin reaksiyon zamanında hücre-türüdür bağımlı. - Hücreleri kümeleri oluşumunu önlemek için sallanan ile bir sallamak yerleştirin.
- Hücreleri trypsinization sonra en fazla 2 saat için kullanın.
Not: Zaman hücre kültürünü bağlı olarak değişebilir.
4. bir Intra-pipet perfüzyon sistemi hazırlanması
- Uygun bir boyut kuvars Boru kesme (150 µm OD / 75 µm kimliği) içi-pipet perfüzyon çizgi hazırlamak için.
- Kuvars hortumunun bir tarafı 200 µL pipet ucu yerleştirin. Kuvars boru ucu üzerine tutkal ve ucu keskin bir ustura ile sonunda kesti.
- Intra-pipet perfüzyon çözüm için bir depo olarak hizmet verecek silikon tüp küçük bir parça için perfüzyon hattı (kuvars boru ucuna kadar yapıştırılmış) bağlayın.
- Silikon tüp artı basınç için bir şırınga bağlayın.
- Kuvars boru polietilen boru perfüzyon pipet sahibinin aracılığıyla ücretsiz sonu port ( Tablo malzemelerigörmek) Ekle.
- Pipet çözüm perfüzyon satırıyla değerlendirin.
5. hazırlık çözümleri
- Bir ağır tamponlu pipet çözüm NHE (115 mM potasyum Aspartat (KAsp), 1 mM EGTA, 0,5 mM MgCl2, 10 mM Mg-ATP, 12,5 mM HEPES, 12,5 mM borular, 12,5 mM BEZLERİ ve 12.5 mM MES, aspartik asit ile ayarlanır pH 6.0) kaydetmek için hazır olun.
Not: stok pipet çözüm ve filtre hazırlayın. MG-ATP kayıt önce ekleyin. - Bir taze banyo çözüm (140 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2ve 0,1 mM Tris-HCl pH 8.2) her zaman hazır olun.
6. kayıt ışınlama aktivitesi
- Işınlama aktivitesi sıcaklık bağımlı olduğundan kayıt odası ve 37 ° C'de tüm çözümleri korumak.
- Hücreleri kayıt odasına koyun. Beklemek-e kadar onlar odası altına bırakın ama izin verme odasına iliştirin.
- Uygun bir hücre seçin. Hücre çapı ile oküler mikrometre ölçmek. Benzer çapları içeren hücreleri seçin.
Not: Genellikle, büyük bir hücre daha hücresel yüzey ve muhtemelen daha fazla taşıyıcı böylece da daha fazla ışınlama aktivitesi having onun plazma membran üzerinde ifade olacaktır. Belirli taşıyıcı ve hücre tipi altında eğitim ışınlama aktivitesi bağlıdır gibi Ancak, bu mutlaka doğru değildir. - İyon-seçici elektrot pipet micromanipulator için mount, backfill yama sıkma pipet ile hücre içi çözüm çözüm2pipet ucu ulaştığından emin olun.
Not: Pipet ucu kabarcıkları ortadan kaldırmak için birkaç nazik musluklar gerektirebilir. - 2,22,23kadar set Elektrofizyoloji baş aşaması için yama sıkma pipet bağlayın.
Not: Bu son derece dayanıklı bir mühür oluşumu için uygundur pipet için bir giriş açısı sağlar gibi bu baş aşamada 45 derecelik bir açı hakkında yatay eksenine tutmak önemlidir. - Küçük bir pozitif basınç uygulayın (~ 5 cm H2O) için belgili tanımlık uç engelleme olasılığını azaltmak ve banyo çözüm içine yerleştirmek için yama pipet.
- Ucu yakın hücre olduğunda yama kelepçe pipet hareket etmeyi kes.
- Pipet hücre dokunur ise pozitif basınç rahatlatmak ve hafif negatif basınç uygulayın (~ 5 cm H2O) elde etmek için bir > 1000 MΩ (Giga-ohm) mühür yama ile hücre zarı üzerinde pipet23.
- Yama pipet hücre ile aynı odak düzlemi İMKB olarak yerleştirin ve yama pipet ile İMKB yakınlığı hücreye taşımak (~ 5-10 µm)2,5 ama kaçının hücre İMKB (şekil 1A) iletişim için izin verir.
- Holding potansiyel 0 temin mV.
- Bütün hücre yapılandırmasını almak için kısa suctions serisi ile mühür rüptürü.
- İMKB (veya yama kelepçe pipet) hareket yavaş yavaş sağa ve sola veya yukarı-aşağı ışınlama (şekil 1B) etkinliklerini kaydetmek için.
- En az 5-8 doruklarına kaydetmek (şekil 1 c, B a).
- Kare dalga rezonans mühür ve hücre zarının kapasite (şekil 1) kalitesini izlemek için kayıt sırasında uygulanır.
- H+ akı tahmin (
) ücretsiz H+ konsantrasyonu hücre yüzeyine ve toplu bir çözüm (ΔH+) arasındaki farkı üzerinden
Not:
ve 
h+ ve Difüzyon katsayıları sırasıyla, tampon BT toplam arabellek konsantrasyon, KD arabelleği ayrılma sabittir, r hücre RADIUS, ve 
ilişkili H+ ücretsiz H+küçük bir değişiklik için konsantrasyon kararlı durum değişikliği belirler. H+ çözümünde ücretsiz bir proton gösterir. Önceki çalışmalar ile tutarlı olacak şekilde H+ Cerayanlar Elektrofizyolojik akı birimlerine Cerayanlar geçerli karşılıkları hesaplayarak dönüştürülür (/faraday) pA3,5]. - Hücre boyutu hesaplanan hücre yüzeyine veya membran kapasitans proton akı normalleştirmek.
) ücretsiz H+ konsantrasyonu hücre yüzeyine ve toplu bir çözüm (ΔH+) arasındaki farkı üzerinden
ve 
h+ ve Difüzyon katsayıları sırasıyla, tampon BT toplam arabellek konsantrasyon, KD arabelleği ayrılma sabittir, r hücre RADIUS, ve 
ilişkili H+ ücretsiz H+küçük bir değişiklik için konsantrasyon kararlı durum değişikliği belirler. H+ çözümünde ücretsiz bir proton gösterir. Önceki çalışmalar ile tutarlı olacak şekilde H+ Cerayanlar Elektrofizyolojik akı birimlerine Cerayanlar geçerli karşılıkları hesaplayarak dönüştürülür (Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bütün hücre yama kelepçe kayıt sırasında self-referencing İMKB NHE3 etkinlik düzenlenmesi çalışmaya phosphoinositides tarafından uygulanmıştır. Endojen plazma zarı NHEs ifade eksikliği, PS120 fibroblast benzeri hücreler24, kullanılmıştır. NHE3 vahşi-türü (NHE3-wt) veya NHE3 mutantlar bunu yapmamalıydın [tirozin 501, arginin 503 ve lizin 505 yerine alanin ile Y501A/R503A/K505A (NHE3-YRK)] bind phosphoinositides stabil PS120 fibroblast benzeri hücreler18' ifade.
İzlerini Şekil 2' de sunulmuştur. Hücre tutuluyor bir bütün-hücre yapılandırma bir pipet için sıkma yama tarafından yapıldı ve İMKB hücrenin önüne yerleştirildi. Bu pozisyonda, İMKB hücre zarı (şekil 1A); yakın ücretsiz H+ konsantrasyonu kaydedildi o zaman, İMKB (veya yama kelepçe pipet) el ile taşınan yanal 50 µm yapıldı ve ücretsiz H+ konsantrasyonu çözüm (şekil 1B) kaydedildi. Yama pipet önünde ya da uzakta İMKB, hücre ile iki pozisyon için karşılık gelen kaydedilen gerilim farkları temsilcisi NHE3 faaliyet (şekil 1 c) vardır. Intra-pipet perfüzyon apyrase (ATP-diphosphatase), daha sonra fosfoinositid içerik5azalan ATP hücre içi konsantrasyonu azalır. Daha önce bildirilen çalışmalar5,18,19ile anlaşma, apyrase tedavi tarafından aracılı azalan fosfoinositid içerik gerilim bir düşüş olarak kaydedildi NHE3 etkinliği (~ %50), azaltılmış salınım genlik (Şekil 2). Apyrase (5 adet/ml verilen) etkisi NHE3 aktivite tamamen apyrase 2 µM ile birlikte içi-pipet perfüzyon tarafından PI (3,4,5) P3 tersine (Şekil 2 ve 3A). Bu bulgular stabil phosphatidylinositides18bağlamak koyamadık NHE3 mutantlar (NHE3-YRK) ifade PS120 hücrelerde kaydedilen NHE3 etkinlik tarafından desteklendi. Apyrase tek başına veya PIP3 birlikte perfüzyon NHE3 aktivitesinde NHE3-YRK mutantlar (şekil 3B) etkilemedi. Endojen NHE3 aktivitesinin de keseli sıçan böbrek (OK) hücreleri3tedavisinde apyrase tarafından inhibe. PI (3,4,5) P3 Intra-pipet perfüzyon apyrase OK hücrelerdeki (şekil 3 c) tarafından indüklenen NHE3 aktivitesinin inhibisyonu ters. Bu bulgular PI (3,4,5) P3 NHE3 etkinliği üzerindeki etkisini hücre türüne özgü değil öneririz.
Daha sonra NHE3 faaliyette apyrase-aracılı değişiklikleri düzenleyen PIP3 özgüllük test amaçladık. Bunu NHE3 faaliyete apyrase bağımlı azaltma PI (4,5) P2 gibi diğer phosphoinositides perfüzyon sonra etkisi raporlaması tarafından yaptık. PI (4,5) P2 (10 µM), apyrase (şekil 4A) aracılı azalan NHE3 aktivite etkilemedi. Son olarak, perfüzyon AMP-PNP, hydrolysable ATP analog, theapyrase bağımlı inhibisyon NHE3 faaliyet (şekil 4B) engellemek değil. Bu bulgular bir rol PI (3,4,5) P3, ama değil PI (4,5) P2, NHE3 yönetmelikle ATP azalması sonra öneririz. Ayrı roller kimliği PI (4,5) P2 ve PI (3,4,5) P3 yönetmelik phosphoinositides hücreler arası Perfüzyon5kayıt bütün hücreli yama kelepçe ile birlikte İMKB ölçümler sırasında sadece nedeniyle mümkün NHE3 içinde. PI (4,5) P2 NHE3 faaliyetinin yönetmelikte yerine PI (3,4,5) P3 belirli bir eylem farklı hücre içi phosphoinositides NHE3 işlevi farklı düzenleyen olup olmadığını belirlemek için değerlidir.
Resim 1 . Şematik gösterim h+ akı ölçüm ve NHE etkinlik ve pH elektrot tarafından kaydedilen olası farklılıklar arasında korelasyon.
Kayıt ayarın şematik gösterimi. A. diyagramı ilk deneysel ayarı. Hücrenin bütün hücreli yapılandırmada yama kelepçe pipet tarafından düzenlenen ve İMKB önüne yerleştirilir. Bu pozisyonda, hücre zarının yakın ücretsiz H+ konsantrasyonu İMKB kaydeder. B. İMKB (veya yama kelepçe pipet) el ile taşınan yanal ~ 50 µm ve bu pozisyonda çözüm ücretsiz H+ konsantrasyonu kaydeder. C. gerilim farkları grafik gösterimi İMKB kullanarak kaydedilen. Konumdan (hücre) İMKB önünde salınımlarını b (hücre İMKB uzak) temsilcisi NHE faaliyet vardır. Kullanılan yazılım farklılıkları İMKB tarafından kaydedilen ve hücre zarının kapasitans ve yama kelepçe mühür kalitesini izlemek için kare dalga rezonans (20 mV, 0.2 kHz) üretilen voltaj kayıtlı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 . Örnek bir kayıt stabil NHE3-wt önce ve sonra apyrase ve PI (3,4,5) P3 ile perfüzyon ifade tek bir PS120 hücrede NHE3 ışınlama aktivitesi için set (PIP3).
İlk kaydettikten sonra hücre ATP apyrase içi-pipet perfüzyon tarafından tüketilmiş. NHE3 etkinliği giderek azalmış ve PIP3 içi-pipet perfüzyon tarafından restore edildi. Apyrase ek kırmızı çubukla belirtilir ve PIP3 yanı sıra yeşil çubukla belirtilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 . ATP azalması ve PIP3 perfüzyon NHE3 ışınlama aktivitesi PS120 ve OK hücrelerdeki üzerinde etkisi.
NHE3 etkinliği ve apyrase etkisi NHE3 faaliyet ayırma ATP azalması apyrase-aracılı etkisi PIP3 içi-pipet perfüzyon tarafından indüklenen: A. PS120 hücreleri ifade NHE3-wt veya d. PS120 ifade NHE3-YRK, NHE3 mutantlar phosphoinositides bağlamak yapamaz hücreleri. C. OK hücreleri endojen NHE3 ifade. Katı daireler bireysel deneyler (aynı koşullarda gerçekleştirilen dört deneyler) ortalama veri göstermek. Hata çubukları anlamına gelir ± standart hataları (SE) temsil eder. * P 0.05 < denetim, ANOVA vs. $ P < 0.5, $$P < 0,01 apyrase apyrase + PIP3, ANOVA vs. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 . PI (4,5) P2 etkisi (PIP2) ve ATP azalması sonra perfüzyon NHE3 faaliyete ANP-PNP.
A ' nın etkisi PIP2 veya d. Apyrase bağımlı azaltma PS120 hücre NHE3-WT katı daireler bireysel deneyler (aynı koşullarda gerçekleştirilen dört deneyler) ortalama veri göstermek ifade NHE3 faaliyete ANP-PNP Intra-pipet perfüzyon. Hata çubukları temsil anlamına gelir ± SE. * P < 0,05, ** P 0,01 < denetim, ANOVA vs. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Işınlayıcılar çok önemli işlevler rağmen faaliyetlerini incelemek kullanılabilir olan yöntemlerden etkisiz ve yetersiz. Kullanılabilir yöntemleri iyon hareketi sırasında deney4hücre içi iyon kompozisyon dalgalanmalar dikkate almadan ışınlama aktivitesi tarafından aracılı ölçmek bir kısıtlamadır. Sunulan yöntem ekstraselüler ve hücre içi iyon bestelerinden hassas kontrol sağlar ve hücre içi iyon, protein ve lipit kompozisyonları3,4,5değiştirmek için güçlü bir araç sunar.
Bu iletişim kuralı konusunda en önemli adım için uzun dönemli25stabil bir İMKB hazırlıktır. Deneyim, kararsız bir İMKB (iyon-seçici reçine İMKB pipet tarafta yeniden dağıtılabilir iyi siliconizedÖrneğin, ), değil hangi tespit tarafından İMKB sinyalinde sürekli ve kontrol edilemeyen bir drift. Ayrıca, işe reçine dağıtım deneme sırasında yakından izlenmelidir. Banyo çözüm banyo çözüm reçine25önce bir sütunu oluşturma İMKB pipet içinde iyon-seçici reçine itebilir. Bu durumda, İMKB bu sütundan iyonu konsantrasyonu kaydetmek ve deneme sırasında iyon gradyanlar içinde değişikliklere yanıt vermeyen haline. İMKB geometrisini ayarlama 100 ms9 aralığındaki bir İMKB yanıt almak ve olası gecikmelere İMKB zaman-yanıtlarında üstesinden gelmek için anahtar değişiklikleri iyon gradyanlar içinde karşılaştırılır.
Sunulan yöntem büyük sınırlandırılması epitel hücrelerdeki ışınlama aktivitesi ölçümü sıkma patch dan devralınır. Destekten ilişkisi kesildi ve süspansiyon tutulan zaman polarize epitel hücreleri taşıyıcılar apikal veya demiri membran üzerinde polarize lokalizasyonu kaybedebilirsiniz.
Ölçüm sıkma değiştirilmiş bir yama kanalları ve Işınlayıcılar polarize epiteli okurken kullanılmalıdır. Hücreleri bir silindir içine yaklaşık yerine bir küre akı sağlanan formül yoluyla H+ degrade dönüşüm önemlidir düşünüyor. Bu durumda, formül değiştirilmesi gerekir 
λ silindir uzunluğu, r silindir RADIUS nerede reklam x üzerinden geçişin olduğu ölçülen5silindir orta nokta Radyal mesafe olduğunu. Electroneutral taşıyıcılar için bu güçlü yüntem gelecekteki gelişimini kayıt hücreleri bir monolayer yetiştirilen en iyi duruma getirmek için yöntemini değiştirme üzerinde odaklanmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.
Acknowledgments
Yazarlar Eric Fishback (Des Moines Üniversitesi, Des Moines, Iowa, ABD) çekim ve düzenleme video ile onun yardım için teşekkür etmek istiyorum. Stabil NHE3-wt veya NHE3-YRK ifade PS120 fibroblast benzeri hücreleri nazikçe Dr Mark Donowitz (Johns Hopkins Üniversitesi Tıp Fakültesi, Baltimore, MD, ABD) tarafından temin edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Patch clamp Amplifier | Molecular Devices | ||
| Dual Channel Differential Electrometer (HiZ-223) | Warner Instruments | 64-1650 | |
| Differential Amplifier (DP-301) | Warner Instruments | 64-0044 | |
| Patch Clamp Software Based on MatLab | MatLab with acquisition toolbox | The capmeter software is recommended | |
| ThermoClamp-1 Temperature Control System | AutoMate Scientific | 03-11-LL | In-line heater |
| Single-Channel Temperature Controller (TC-324C) | Warner Instruments | 64-2400 | |
| Single-Barrel Standard Borosilicate Glass Tubing | World Precision Instruments | 1B120F-3 | Used for ion selective electrodes |
| Micropipette Storage Jar | World Precision Instruments | E212 | |
| Bis(dimethylamino)dimethylsilane | Sigma-Aldrich | 14755-100ML | |
| Carbon tetrachloride | Sigma-Aldrich | 319961-500ML | |
| Hydrogen ionophore I - cocktail B | Sigma-Aldrich | 95293 | |
| Thin Wall Borosilicate Tubing | Sutter Instrument | B200-156-15 | Used for patch clamp pipette |
| Soft glass (Corning 8161 Patch Glass) | Warner Instruments | 64-0815 | |
| Silica Capillary Tubing (150um OD/75um ID) | Molex (Polymicro Technologies) | 106815-0018 | Used for intra-pipette perfusion system |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium aspartate | Sigma-Aldrich | A6558 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M4880 | |
| Mg-ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Apyrase | Sigma-Aldrich | A6535 | |
| Phosphatidylinositol(4,5) bisphosphate diC8 | Echelon Biosciences | P-4508 | |
| Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate diC8 | Echelon Biosciences | P-3908 |
References
- Rives, M. L., Javitch, J. A., Wickenden, A. D. Potentiating SLC transporter activity: Emerging drug discovery opportunities. Biochem Pharmacol. , (2017).
- Kang, T. M., Markin, V. S., Hilgemann, D. W. Ion fluxes in giant excised cardiac membrane patches detected and quantified with ion-selective microelectrodes. J Gen Physiol. 121 (4), 325-347 (2003).
- Babich, V., Vadnagara, K., Di Sole, F. The biophysical and molecular basis of intracellular pH sensing by Na+/H+ exchanger-3. FASEB J. 27 (11), 4646-4658 (2013).
- Fuster, D., Moe, O. W., Hilgemann, D. W. Steady-state function of the ubiquitous mammalian Na/H exchanger (NHE1) in relation to dimer coupling models with 2Na/2H stoichiometry. J Gen Physiol. 132 (4), 465-480 (2008).
- Fuster, D., Moe, O. W., Hilgemann, D. W. Lipid- and mechanosensitivities of sodium/hydrogen exchangers analyzed by electrical methods. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (28), 10482-10487 (2004).
- Forster, I. C., Virkki, L., Bossi, E., Murer, H., Biber, J. Electrogenic kinetics of a mammalian intestinal type IIb Na(+)/P(i) cotransporter. J Membr Biol. 212 (3), 177-190 (2006).
- Smith, P. J., Trimarchi, J. Noninvasive measurement of hydrogen and potassium ion flux from single cells and epithelial structures. Am J Physiol Cell Physiol. 280 (1), C1-C11 (2001).
- Parker, M. D., Musa-Aziz, R., Boron, W. F. The use of extracellular, ion-selective microelectrodes to study the function of heterologously expressed transporters in Xenopus oocytes. Am J Physiol Cell Physiol. 296 (5), C1243 (2009).
- Smith, P. J. S., Sanger, R. H., Messerli, M. A. Electrochemical Methods for Neuroscience. Michael, A. C., Borland, L. M. , CRC Press/Taylor & Francis. 373-406 (2007).
- Orlowski, J., Grinstein, S. Diversity of the mammalian sodium/proton exchanger SLC9 gene family. Pflugers Arch. 447 (5), 549-565 (2004).
- Brett, C. L., Donowitz, M., Rao, R. Evolutionary origins of eukaryotic sodium/proton exchangers. Am J Physiol Cell Physiol. 288 (2), C223-C239 (2005).
- Bobulescu, I. A., Di Sole, F., Moe, O. W. Na+/H+ exchangers: physiology and link to hypertension and organ ischemia. Curr Opin Nephrol Hypertens. 14 (5), 485-494 (2005).
- Donowitz, M., Ming Tse, C., Fuster, D. SLC9/NHE gene family, a plasma membrane and organellar family of Na(+)/H(+) exchangers. Mol Aspects Med. 34 (2-3), 236-251 (2013).
- Zachos, N. C., Tse, M., Donowitz, M. Molecular physiology of intestinal Na+/H+ exchange. Annu Rev Physiol. 67, 411-443 (2005).
- Girardi, A. C., Di Sole, F. Deciphering the mechanisms of the Na+/H+ exchanger-3 regulation in organ dysfunction. Am J Physiol Cell Physiol. 302 (11), C1569-C1587 (2012).
- Bobulescu, I. A., Moe, O. W. Na+/H+ exchangers in renal regulation of acid-base balance. Semin Nephrol. 26 (5), 334-344 (2006).
- Hilgemann, D. W., Feng, S., Nasuhoglu, C. The complex and intriguing lives of PIP2 with ion channels and transporters. Sci STKE. (111), re19 (2001).
- Mohan, S., et al. NHE3 activity is dependent on direct phosphoinositide binding at the N terminus of its intracellular cytosolic region. J Biol Chem. 285 (45), 34566-34578 (2010).
- Alexander, R. T., et al. Membrane surface charge dictates the structure and function of the epithelial Na+/H+ exchanger. EMBO J. 30 (4), 679-691 (2011).
- Wang, T. M., Hilgemann, D. W. Ca-dependent nonsecretory vesicle fusion in a secretory cell. J Gen Physiol. 132 (1), 51-65 (2008).
- Hilgemann, D. W. Single-Channel Recording. Sakmann, B., Neher, E. , Plenum Press. 307-328 (1995).
- Hilgemann, D. W., Lu, C. C. Giant membrane patches: improvements and applications. Methods Enzymol. 293, 267-280 (1998).
- Matsuoka, S., Takeuchi, A. Patch Clamp Techniques. Okada, Y. , Springer. 207-218 (2012).
- Pouyssegur, J., Sardet, C., Franchi, A., L'Allemain, G., Paris, S. A specific mutation abolishing Na+/H+ antiport activity in hamster fibroblasts precludes growth at neutral and acidic pH. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (15), 4833-4837 (1984).
- Ogden, D. Microelectrode Techniques - The Plymouth Workshop Handbook. , The Company of Biologists Ltd. 275-316 (1994).
