Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Применение измерений электрофизиологии для изучения деятельности перевозчиков электро нейтральный

doi: 10.3791/56630 Published: February 3, 2018

Summary

Эта рукопись описывает приложений Протон селективного электрода и патч зажима методы для измерения активности Протон транспортных систем. Эти методы преодолеть некоторые ограничения методов, обычно используется для изучения Протон транспортной деятельности, например умеренной чувствительности, разрешение времени и недостаточно внутриклеточной среды управления.

Abstract

Транспорт ионов через клеточные мембраны обеспечивает точное управление содержанием ионов внутри и вне клетки, что является необходимым условием для выживания клетки. Эти механизмы транспорта опосредованной деятельностью специализированных транспортер белков. В частности, динамика рН тонко контролируется плазматической мембраны Протон (H+) экструзионных систем, например Na+/час+ теплообменником (NHE) белка семьи. Несмотря на активные усилия для изучения механизмов лежащие в основе регулирования NHE нашего нынешнего понимания биофизических и молекулярных свойств NHE семьи недостаточно из-за ограниченности методов эффективной оценки деятельности NHE . В этой рукописи, мы использовали H+-селективный электроды во время поклеточного патч зажимной запись для измерения потока H NHE-индуцированной+ . Мы предложили, что этот подход для преодоления некоторых ограничений обычно используются методы для измерения активности NHE, например поглощение радиоактивных и флуоресцентные мембраны permeants. Измерение активности NHE, с помощью метода описаны обеспечивает высокую чувствительность и разрешение по времени и более эффективного контроля над внутриклеточной концентрации H+ . H+-селективного электрода, основывается на том, что перевозчик деятельность создает ионный градиент в непосредственной близости к клеточной мембраны. H+-селективный электрод до перемещения и подальше от клеточной мембраны в повторяющихся, колебательные моды записывает разница напряжения, что зависит от потока H+ . Хотя H+-селективный электроды используются для обнаружения потока H+ , перемещение из клетки, метод зажима патч в целом ячейки конфигурации используется для управления состав внутриклеточных ионов. Кроме того применение техники зажим гигантских патч позволяет изменения внутриклеточной состава не только ионы, но и липиды. Транспортер активность NHE изоформы 3 (NHE3) был измерен используя этот технический подход для изучения молекулярных основе NHE3 регулирования фосфоинозитидов.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Транспорт ионов и растворенных веществ через мембраны плазмы имеет важное значение для выживания клеток и, следовательно, организмов1. Селективный транспорт ионов и растворенных веществ достигается массив специализированных каналов и транспортер белков. Мутации в эти белки часто приводят в различных клинических условий, предоставление канала и транспортер белки потенциальных целей для медикаментозное лечение1. К сожалению понимания механизмов, лежащих в основе функции канала и транспортер и регулирование часто ограничивается подходы, доступные для изучения их деятельности по2,3,4.

В частности, транспортеры примерно югу делятся на две большие группы, в зависимости от того, ли они изменяют трансмембранный потенциал клеток во время транспортировки растворенных веществ: изменения electrogenic ионных транспортеров [например, -фосфат натрия Совместное транспортер 2a (NaPi2a), обменный натрий кальций (NCX), и т.д.] или не изменяя Электронейтральная ионных транспортеров [например, обменный натрий Протон (NHE), хлоридно Сопредседатель транспортер, NaPi2c, и др.]. Деятельность обоих классов перевозчиков были изучены широко используя поглощение радиоактивных изотопов и Краски люминесцентные, флуоресцентные мембраны permeant2. Оба подхода оценить деятельность перевозчиков путем измерения изменения в массовой концентрации ионов конкретных цитоплазмы, и оба метода имеют ограничения, например умеренной чувствительности и времени резолюции и недостаточный контроль над внутриклеточной окружение. Действительно деятельность многих перевозчиков зависит цитоплазматическая концентрация ионов осуществляется (например, NHE3, NCX), и ожидается, что изменения в концентрации этих ионов играть значительную роль в регулировании деятельности перевозчик2 , 3 , 5. точное измерение этих регулирующих механизмов ограничена с использованием классических методов.

Чтобы преодолеть эти ограничения, патч зажим методы используются для изучения транспортер активность2,6. В частности самовызываемого ионоселективные электроды (МОСЭ)7,8 в сочетании с патч, зажимные системы недавно позволила измерения Электронейтральная транспортер деятельности3,4 , 5. ISEs, основывается на том, что перевозчик деятельность создает ионный градиент в непосредственной близости к клеточной мембраны. Ино, двигаясь вверх и от клеточной мембраны в повторяющихся, колебательные моды записывает разница напряжения (МКВ). Напряжения различия могут быть преобразованы в ионный поток значения с помощью метода калибровки, который применяет первый закон Фика диффузии2,9. Хотя ISEs используются для обнаружения потока ионов, движущихся из клеток, метод зажима патч в обоих поклеточного или наизнанку конфигурации используется для контроля потенциальных и внутриклеточных ионного состава мембраны. Кроме того применение метода зажим гигантских патч позволяет изменения внутриклеточной состава не только ионы, но и липидов и белков в3,5.

Таким образом универсальность метода зажим патч по сравнению с что других методов для изучения деятельности транспортер сделал патч зажима подходит для преодоления общих ограничений этих других методов. Комбинация ссылающиеся сами на себя ISEs и методы зажим патч предлагает уникальную возможность для измерения активности Электронейтральная транспортеров в жестко контролируемой среде экспериментальной и обнаружить роман биофизических и молекулярной свойства клеточной мембраны транспорт3,4,5. Этот подход успешно использовался для изучения деятельности NHE. У млекопитающих NHE белка семьи катализирует Электронейтральная чистого обмена внеклеточного натрия (Na+) для внутриклеточного Протон (H+)10,11 используя уклоном внутрь Na+ . В млекопитающих NHE белка семьи включает в себя 11 родственных белков (NHE1-9 и NHA1-2) и спермы конкретных NHE10,12,13.

NHEs (семейство SLC9a) встречаются повсеместно в большинстве живых организмов от простых прокариот для высших эукариот и участвуют в различных жизненно важных клеток функции10,11, включая управление защиты клетки солености в прокариот, поддержания кислотно щелочного гомеостаза и клетки объем и регулирование поглощения воды и соли в различных специализированных эпителия10,12,14,15. Биологическая роль NHEs и значение их функции были определены через несколько исследований; Однако несколько исследований изучили биофизических и молекулярные свойства млекопитающих NHEs из-за методологических недостатков4. Недавно применение ссылающиеся сами на ISEs во время пережатия поклеточного патч выявил новые молекулярные механизмы NHE изоформ регулируется изменения внутриклеточной концентрации ионов, белков и фосфолипидов в3, 4.

В частности, протокол в этой рукописи излагаются методы и подходы для изучения деятельности и регулирования NHE изоформы 3 (NHE3), одним из основных игроков в поглощении Na+, Cl, HCO3 и жидкости в кисть границы мембрана почек и кишечного эпителия14,16. Новое понимание различия в чувствительности NHE3 активность внутриклеточных фосфоинозитидов (phosphatidylinositide 4,5-Бисфосфат [PI (4,5) P2] и phosphatidylinositide 3,4,5-трифосфата [PI(3,4,5]P3]) сообщается. Клетки транспортных белков, таких как каналы и перевозчиков, регулируются фосфоинозитидов17, и NHE3 прямо связывает PI (4,5) P2 и P3 PI (3,4,5)18. Основываясь на существующей литературы, либо phosphoinositide может быть соответствующие физиологические или патофизиологические регулирования NHE35,18,19. Наши выводы поддерживают отдельные роли для PI (4,5) P2 и P3 PI (3,4,5) в регулирование деятельности NHE3. Это различие стало возможным благодаря применение методов ISE в сочетании с поклеточного патч зажим записи. Этот метод также позволяет контроль клеточного содержания phosphoinositide через внутриклеточные перфузии различных фосфоинозитидов во время измерения NHE3 деятельности.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Примечание: Для записи активности Электронейтральная транспортеров, ссылающейся на себя ISE в сочетании с патч, зажим, зажим усилителя патч для поддержания клеток в целом ячейки конфигурации и высокой impendence усилителя (требуются два усилителя электрометр) для записи активности транспортер через ISE (см. таблицу материалы). Патч зажим усилителя непосредственно подключен к плате приобретение терминала. Электрометр подключен к дифференциальный усилитель, используемых для фильтрации и усилить сигнал. Дифференциальный усилитель подключен к плате приобретение терминала. Capmeter, патч зажим программное обеспечение, которое отслеживает соты, использовалась в предыдущих исследований20 (см. таблицу материалы). Запись камеры и перфузии решения поддерживаются на 37 ° C.

1. Подготовка пипетки ISEs

  1. Вытяните пипетки из боросиликатного стекла капилляров к наружным диаметром 1,2 мм (см. Таблицу материалы) с помощью пипетки съемник2 .
  2. Польский пипетки, используя microforge. Диаметр кончика пипетки должно быть 2-3 мкм.
  3. Место пипетки в банку держатель для пипеток с кончиком пипетки, вверх (см. Таблицу материалы).
    Предупреждение: Выполните действия 1.4-1.6 в хорошо проветриваемом химических зонта.
  4. Смесь siliconization смесь, которая состоит из 1 капля (~ 150 мкл) бис-(диметиламино) диметил силана и 10 капель тетрахлорметана (см. Таблицу материалы).
  5. Залить siliconization смесь в банки и плотно закрыть крышку.
  6. Инкубируйте банку с siliconization смесь для 24-48 ч в химической зонта при комнатной температуре до тех пор, пока смесь полностью испарилась.
  7. Засыпки пипетку с соответствующим ионоселективные смолы для создания столбца примерно 2-4 мм.
    Примечание: Водорода ionophore я коктейль B может быть мелкосемянная записи NHE деятельности (см. Таблицу материалы).
  8. Нажмите кончиком пипетки распространить ионоселективного смолы до кончика и место пипеткой по вертикали в держателе банку с кончиком пипетки вниз.
  9. Checkunder рассечения микроскопа, что смола коктейль достиг конца кончика. При необходимости, приложите положительным давлением, чтобы подтолкнуть смолы до конца.
  10. Засыпки половину дозатор с соответствующим решением (~ 100 мкл). Здесь, использовать 100 мм KCl и 10 мм HEPES при pH 7.0, если используется ionophore я б коктейль.
  11. Подключите к электрометр ISE и поместите кончик ISE в раствор для ванн используется для записи. Нулевой электрометр.
  12. Тест+H-Селективное реагирование ISE, изменив рН раствора ванна. Средняя H+-селективный ISE ответ ~ 58 МВ на единицу рН.
  13. Периодически оцените ISE ответ для калибровки.

2. Подготовка локальной фиксации пипетки для записи

Примечание: Рекомендуется метод, описанный Donald Hilgemann в своей статье одноканальной записи21 .

  1. Вытяните пипетки для гигантских патч из боросиликатного стекла капилляров (2.0 mmOD / 1,5 мм ID) пипетки съемник2,22,23.
  2. Использование microforge монтируется на сцене инвертированным микроскопом сделать широкий пипеткой подсказка (10-22 мкм)23. Расплава шарик (~ 0,5 мл) мягкой стекла на толстый провод платины microforge.
    Примечание: Требуется сравнительно толстый провод платины (~0.5 мм) для изготовления гигантских патч пипетки.
  3. Установите патч пипеткой недалеко от мягкой штапика и полное нагревать до тех пор, пока Совет начинает отступать. Провод платины будет слегка двигаться к centerduring Отопление.
  4. Выключите тепла и вставьте наконечник пипетки в размягченное стеклянная бусина. Охлаждения провод будет убираться и разорвать наконечник пипетки.
  5. Повторное применение тепла для гладких наконечник пипетки и создать наконечник пипетки нужного диаметра. Диаметр кончика зависит размер ячейки быть пропатчен (8-10 мкм в этом исследовании).

3. Подготовка клеток

  1. Разминка Натрий-фосфатный буфер (PBS) без Ca2 + и Mg2 +, раствор трипсина ЭДТА и среднего роста до 37 ° c.
  2. Вымойте клетки дважды с PBS. Использование 1 мл буфера для 35 мм диаметр клетки культуры плиты.
  3. Добавьте 0,5 мл трипсина в клетки для 35 мм диаметр клетки культуры пластины.
    Примечание: Когда клетки начинают облавы, встряхнуть пластину де прикрепить клетки.
  4. Остановите действие трипсина, добавив 5 мл (сумма для 35 мм диаметр клетки культуры плиты) полный рост средних дополнена плода бычьим сывороточным 10%.
    Примечание: Время реакции в трипсин является тип ячейки зависит от.
  5. Место клетки в шейкере с качалки для предотвращения образования сгустков.
  6. Использование ячейки для до 2 ч после trypsinization.
    Примечание: Время может варьироваться в зависимости от линии клеток.

4. Подготовка системы перфузии интра дозатор

  1. Вырезать соответствующий размер трубки кварцевые (150 мкм ОД / 75 мкм ID) подготовить линии перфузии интра пипетки.
  2. Вставьте одну сторону кварцевых труб в 200 мкл наконечник пипетки. Приклейте кварцевых труб на кончик и сократить конце кончика с острым лезвием.
  3. Подключите к небольшой кусочек кремния трубки, которая будет служить резервуар для решения перфузии интра дозатор перфузии линии (кварц трубы приклеены к кончику).
  4. Подключите силиконовой трубки к шприцу для создания положительного давления.
  5. Вставка, свободный конец трубки кварцевые через трубки полиэтиленовые пипеткой держателя перфузии порт (см. Таблицу материалы).
  6. Оцените линии перфузии с пипеткой раствор.

5. Приготовление растворов

  1. Приготовляют раствор сильно буферизации пипетку для записи NHE (115 мм калия аспартата (KAsp), 1 мм EGTA, 0,5 мм MgCl2, 10 мм Mg-АТФ, 12,5 мм HEPES, трубы 12,5 мм, 12,5 мм MOPS и 12,5 мм МЧС, pH 6.0 скорректирована с аспарагиновой кислоты).
    Примечание: Подготовка запасов пипеткой раствор и фильтр. Добавьте мг-АТФ перед записью.
  2. Приготовляют раствор свежих Ванна каждый раз, когда (140 мм NaCl, 2 мм CaCl2, 2 мм MgCl2и 0,1 мм трис-HCl рН 8,2).

6. запись деятельности транспортер

  1. Сохранить запись камеры и все решения при 37 ° C, потому что транспортер деятельность зависит от температуры.
  2. Место клетки в записи камеру. Подождите, пока они падение на дно камеры, но не позволяйте им придают в палату.
  3. Выберите соответствующую ячейку. Измерьте диаметр ячейки с окуляр микрометр. Выберите ячейки с аналогичными диаметров.
    Примечание: Как правило, большая ячейка будет иметь более ячеистая поверхность и возможно более транспортеры выразил на своей плазматической мембраны, таким образом, также имея больше активности транспортер. Однако это не обязательно верно, как транспортер деятельность зависит от конкретных транспортер и тип ячейки под исследование.
  4. Смонтировать ионоселективного микроэлектродные пипетку для микроманипулятор, засыпки патч зажима пипетку с внутриклеточной решение, убедитесь, что решение достигает кончиком пипетки2.
    Примечание: Это может потребоваться несколько нежный краны для устранения пузыри в наконечник пипетки.
  5. Установите патч зажима пипетки на главный этап электрофизиологии, созданы2,,2223.
    Примечание: Важно держать голову сцену на около 45-градусный угол горизонтальной оси, как это гарантирует запись угол для пипетки, которая подходит для формирования высокой устойчивостью печати.
  6. Применять небольшое положительное давление (~ 5 см H2O) для патч пипетку, чтобы уменьшить вероятность блокирования кончик и поместить его в раствор для ванн.
  7. Остановите Перемещение пипетки зажим патч после того, как кончик пера находится близко к клетке.
  8. Облегчить положительным давлением, в то время как Пипетка затрагивает ячейки и применить небольшое отрицательное давление (~ 5 см H2O) для получения > 1000 MΩ (гига ом) печать на клеточную мембрану с патч Пипетка23.
  9. Установите патч пипетку с ячейкой в одной фокальной плоскости как ISE, и переместить патч пипетку с ячейкой в близости к ISE (~ 5-10 мкм)2,5 , но избежать, позволяя ячейку, чтобы связаться с ISE (Рисунок 1A).
  10. Заверить, что проведение потенциальных 0 mV.
  11. Разрыву печать с серии коротких всасывающий для получения поклеточного конфигурации.
  12. Переместите Исэ (или патч зажим пипеткой) медленно влево вправо или вверх вниз для записи активности транспортера (рис. 1B).
  13. Записи по крайней мере 5-8 пиков (Рисунок 1 c, от A до B).
  14. Применить квадратные волны возмущения во время записи для контроля качества печати и мембраны клетки емкости (рис. 1).
  15. Оценить поток H+ (Equation 1) из разница в свободной концентрации H+ поверхности клетки и массовых раствор (ΔH+)
    Equation 2
    Equation 3
    Примечание: Equation 4 и Equation 5 , H+ и буфера коэффициенты диффузии, соответственно, BT является концентрация общего буфера, KD является Константа диссоциации буфера, r — это ячейка, радиус, и Equation 6 определяет изменение устойчивого состояния концентрации связанных H+ для небольшое изменение в свободный час+. H+ указывает бесплатно протона в растворе. В соответствии с предыдущими исследованиями, H+ потоков преобразуются в электрофизиологических поток единиц путем расчета текущей эквиваленты потоков (Equation 1/faraday) в ПА,35].
  16. Нормализовать потока протонов на поверхности клетки, которые можно рассчитать размер ячейки или емкость мембраны.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Самовызываемого ISE во время записи зажим поклеточного патч был применен для изучения регулирование деятельности NHE3 фосфоинозитидов. PS120 фибробластоподобных клеток24, в котором отсутствует выражение эндогенного плазматической мембраны NHEs, были использованы. NHE3 одичал тип (NHE3-wt) или NHE3 мутантов, не связывают фосфоинозитидов [тирозин 501, аргинин 503 и лизин 505 были заменены аланина, Y501A/R503A/K505A (NHE3-YRK)] стабильно были выражены в PS120 фибробластоподобных клеток18.

Следы представлены на рисунке 2. Ячейка была Выборыв поклеточного конфигурации на пипетку для зажима патч, и ISE был помещен в передней камере. В этой позиции ISE записал концентрация свободного H+ близко к клеточной мембраны (рис. 1A); затем Исэ (или патч зажим пипеткой) была вручную переехал боково 50 мкм и записала концентрация свободного H+ в растворе (Рисунок 1B). Записанные напряжения различия, соответствующий две позиции патч пипетку с ячейкой в передней или далеко от ISE, являются представитель NHE3 активности (рис. 1 c). Внутри дозатор перфузии apyrase (АТФ diphosphatase) уменьшает внутриклеточную концентрацию АТФ, впоследствии снижается содержание phosphoinositide5. По согласованию с сообщалось ранее исследования5,18,19снижение phosphoinositide содержание опосредовано apyrase лечения уменьшить NHE3 активности (~ 50%), который был записан как снижение напряжения в амплитуда колебаний (рис. 2). Влияние apyrase (с учетом на 5 единиц/мл) на NHE3 активность было полностью отменено интра дозатор перфузии apyrase в сочетании с 2 мкм PI (3,4,5) P3 (рис. 2 и 3а). Эти выводы были поддержаны NHE3 действия, записанные в PS120 клетках стабильно выражая NHE3 мутантов (NHE3-YRK), которые были не в состоянии связать phosphatidylinositides18. Перфузии apyrase самостоятельно или в сочетании с PIP3 не затрагивают деятельность NHE3 в NHE3-YRK мутантов (рис. 3B). Активность эндогенного NHE3 также тормозится apyrase лечение в опоссума почек (ОК) клетки3. Внутри дозатор перфузии PI (3,4,5) P3 вспять ингибирование активности NHE3, вызванных apyrase в клетках ОК (рис. 3 c). Эти результаты показывают, что влияние PI (3,4,5) P3 на NHE3 активность не является ячейка конкретного типа.

Далее мы стремились проверить специфика PIP3 о регулировании apyrase опосредованной изменения в NHE3 деятельности. Мы сделали это, опробование эффект на снижение apyrase зависимых на NHE3 активность после перфузии других фосфоинозитидов, такие как PI (4,5) P2. PI (4,5) P2 (на 10 мкм) не повлияло снижение NHE3 активности, опосредовано apyrase (рис. 4A). Наконец перфузии AMP-PNP, не hydrolysable аналог СПС, не блокировать theapyrase зависимых ингибирование активности NHE3 (рис. 4В). Эти выводы свидетельствуют о роли Пи (3,4,5) P3, но не PI (4,5) P2, в регуляции NHE3 после истощение АТФ. Идентификация отдельных ролей для PI (4,5) P2 и P3 PI (3,4,5) в NHE3, регулирование было возможно только благодаря межклеточных перфузии фосфоинозитидов во время измерений ISE, в сочетании с поклеточного фиксации записи5. Конкретные действия PI (3,4,5) P3 вместо PI (4,5) P2 в регулирование деятельности NHE3 является ценным для определения, является ли различных внутриклеточных фосфоинозитидов регулировать функции NHE3 по-разному.

Figure 1
Рисунок 1 . Схематическое изображение H+ потока измерения и корреляции между NHE активности и потенциальные различия записаны рН микроэлектродные.
Схематическое представление параметра записи. A. схема начальной экспериментальной установки. Ячейка является проводимых патч зажим пипетку в целом клеточной конфигурации и перед ISE. В этом положении ISE регистрирует концентрацию свободной H+ близко к клеточной мембраны. B. Исэ (или патч зажим пипеткой) вручную переехал боково ~ 50 мкм и регистрирует концентрацию свободной H+ в растворе в этом положении. C. графическое представление напряжения различия записаны с помощью ISE. Колебания от позиции (ячейка напротив ISE) B (ячейка далеко от ISE), представитель NHE деятельности. Программное обеспечение, используемое зарегистрированные напряжения различия записаны ISE и генерируется квадратные волны возмущений (20 МВ, 0.2 кГц) для контроля емкости клеточной мембраны и качество уплотнения зажим патч. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 . Пример записи набор для NHE3 транспортер деятельность в одну ячейку PS120, стабильно выражения NHE3-wt до и после перфузии с apyrase и PI (3,4,5) P3 (PIP3).
После первоначальной регистрации, ячейка была истощены АТФ интра дозатор перфузии apyrase. NHE3 активность постепенно снизилась и был восстановлен PIP3 интра дозатор перфузии. Apyrase дополнение обозначается красной бар, и добавление PIP3 обозначается зеленый бар. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 . Влияние истощение АТФ и PIP3 перфузии на NHE3 транспортер активность в клетках PS120 и ОК.
Эффект apyrase опосредованной истощение АТФ на NHE3 деятельности и резервирования влияние apyrase на NHE3 активность, индуцированных PIP3 интра дозатор перфузии: A. PS120 клеток, выражая NHE3-wt или б. PS120 клетки выражая NHE3-YRK, NHE3 мутантов невозможно подшить фосфоинозитидов. C. ОК клетки, выражая эндогенного NHE3. Закрашенные круги показывают средние данные из отдельных экспериментов (четыре эксперименты, проведенные в одинаковых условиях). Планки погрешностей представляют собой средства ± среднеквадратические ошибки (SE). * P < 0,05 против контроля, ANOVA. $ P < 0.5, apyrase < 0.01 $$P против apyrase + PIP3, ANOVA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4 . Эффект PI (4,5) P2 (PIP2) и АНП-PNP перфузии на NHE3 активность после истощение АТФ.
Влияние а. PIP2 или б. АНП-PNP интра дозатор перфузии на apyrase зависимых снижение NHE3 активности в PS120 клетках, выражая NHE3-массовая твердых круги показывают средние данные из отдельных экспериментов (четыре эксперименты, проведенные в одинаковых условиях). Планки погрешностей представляют средства ± SE. * P < 0,05, ** P < 0.01 против контроля, ANOVA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Несмотря на важнейших функций транспортеров методы, доступные для изучения их деятельности являются неэффективными и неадекватными. Единственным ограничением является, что доступные методы измерения ионного движения опосредовано транспортер деятельности без учета колебания внутриклеточных ионного состава во время эксперимента4. Представленный метод обеспечивает точный контроль над внеклеточные и внутриклеточный ион композиций и предлагает мощный инструмент для изменения внутриклеточный ион, белков и липидов композиции3,4,5.

Наиболее важным шагом в этом протоколе является подготовка ISE, которая является стабильным для длительного периода25. По нашему опыту, нестабильной ISE не является хорошо силиконизированной (например, ионоселективного смолы перераспределяется на сторонах пипеткой ISE), которые могут быть обнаружены путем постоянной и неконтролируемой дрейф в ISE сигнала. Кроме того распределения смолы в ISE должны тщательно контролироваться во время эксперимента. Раствор для ванн может подтолкнуть ионоселективного смолы внутри ISE пипетку, создание столбца раствор для ванн до смолы25. В этом случае ISE запишет концентрация ионов из этого столбца и стать свертывать изменения градиентов ионов во время эксперимента. Регулировка геометрии ISE ключ для получения ответа ISE в диапазоне 100 мс9 и преодолеть возможные задержки в ISE время ответов по сравнению с изменения градиентов ионов.

Основные ограничения метода представленных наследуется от зажима измерения активности транспортер в эпителиальных клетках патч. Когда отделены от поддержки и поддерживается в суспензии, поляризованные эпителиальных клеток может потерять поляризованные локализации перевозчиков на апикальной или базолатеральной мембраны.

Изменение патч зажима измерения должны использоваться при изучении каналов и транспортеров в поляризованную эпителия. Учитывая, что клетки могут приблизительно в цилиндр, а не сфера имеет важное значение при преобразовании H+ градиент в поток через по формуле, содержащейся. В этом случае, должно быть присвоено формула Equation 7 где λ длина цилиндра, r — радиус цилиндра, объявление x является радиальное расстояние от медианы цилиндра, над которой градиент-измеренная5. Будущего развития этой мощной техники для изучения Электронейтральная транспортеров должны сосредоточиться на изменении метода оптимизации записи ячейки, выращенных в монослое.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют никаких конфликтов интересов раскрыть.

Acknowledgments

Авторы хотели бы поблагодарить Эрик Fishback (Университет Де-Мойн, Де-Мойн, Айова, США) за его помощь в съемки и редактирования видео. PS120 фибробластоподобных клеток, стабильно выражения NHE3-wt или NHE3-YRK были любезно предоставлены д-р Марк Донович (университете Джонса Хопкинса Школа медицины, Балтимор, MD, США).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Patch clamp Amplifier Molecular Devices
Dual Channel Differential Electrometer (HiZ-223) Warner Instruments 64-1650
Differential Amplifier (DP-301) Warner Instruments 64-0044
Patch Clamp Software Based on MatLab MatLab with acquisition toolbox The capmeter software is recommended
ThermoClamp-1 Temperature Control System  AutoMate Scientific 03-11-LL In-line heater
Single-Channel Temperature Controller (TC-324C) Warner Instruments 64-2400
Single-Barrel Standard Borosilicate Glass Tubing World Precision Instruments 1B120F-3   Used for ion selective electrodes
Micropipette Storage Jar World Precision Instruments E212
Bis(dimethylamino)dimethylsilane Sigma-Aldrich 14755-100ML
Carbon tetrachloride Sigma-Aldrich 319961-500ML
Hydrogen ionophore I - cocktail B Sigma-Aldrich 95293
Thin Wall Borosilicate Tubing  Sutter Instrument B200-156-15 Used for patch clamp pipette 
Soft glass (Corning 8161 Patch Glass) Warner Instruments 64-0815
Silica Capillary Tubing (150um OD/75um ID) Molex (Polymicro Technologies) 106815-0018 Used for intra-pipette perfusion system
Potassium chloride Sigma-Aldrich P9333
Potassium aspartate  Sigma-Aldrich A6558
EGTA Sigma-Aldrich E3889
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M4880
Mg-ATP Sigma-Aldrich A9187
HEPES Sigma-Aldrich H3375
PIPES Sigma-Aldrich P6757
MOPS Sigma-Aldrich M1254
MES Sigma-Aldrich M3671
Calcium chloride Sigma-Aldrich C5670
Tris Sigma-Aldrich T1503
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich H1758
Apyrase Sigma-Aldrich A6535
Phosphatidylinositol(4,5) bisphosphate diC8 Echelon Biosciences P-4508
Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate diC8 Echelon Biosciences P-3908

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rives, M. L., Javitch, J. A., Wickenden, A. D. Potentiating SLC transporter activity: Emerging drug discovery opportunities. Biochem Pharmacol. (2017).
  2. Kang, T. M., Markin, V. S., Hilgemann, D. W. Ion fluxes in giant excised cardiac membrane patches detected and quantified with ion-selective microelectrodes. J Gen Physiol. 121, (4), 325-347 (2003).
  3. Babich, V., Vadnagara, K., Di Sole, F. The biophysical and molecular basis of intracellular pH sensing by Na+/H+ exchanger-3. FASEB J. 27, (11), 4646-4658 (2013).
  4. Fuster, D., Moe, O. W., Hilgemann, D. W. Steady-state function of the ubiquitous mammalian Na/H exchanger (NHE1) in relation to dimer coupling models with 2Na/2H stoichiometry. J Gen Physiol. 132, (4), 465-480 (2008).
  5. Fuster, D., Moe, O. W., Hilgemann, D. W. Lipid- and mechanosensitivities of sodium/hydrogen exchangers analyzed by electrical methods. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, (28), 10482-10487 (2004).
  6. Forster, I. C., Virkki, L., Bossi, E., Murer, H., Biber, J. Electrogenic kinetics of a mammalian intestinal type IIb Na(+)/P(i) cotransporter. J Membr Biol. 212, (3), 177-190 (2006).
  7. Smith, P. J., Trimarchi, J. Noninvasive measurement of hydrogen and potassium ion flux from single cells and epithelial structures. Am J Physiol Cell Physiol. 280, (1), C1-C11 (2001).
  8. Parker, M. D., Musa-Aziz, R., Boron, W. F. The use of extracellular, ion-selective microelectrodes to study the function of heterologously expressed transporters in Xenopus oocytes. Am J Physiol Cell Physiol. 296, (5), C1243 (2009).
  9. Smith, P. J. S., Sanger, R. H., Messerli, M. A. Electrochemical Methods for Neuroscience. Michael, A. C., Borland, L. M. CRC Press/Taylor & Francis. 373-406 (2007).
  10. Orlowski, J., Grinstein, S. Diversity of the mammalian sodium/proton exchanger SLC9 gene family. Pflugers Arch. 447, (5), 549-565 (2004).
  11. Brett, C. L., Donowitz, M., Rao, R. Evolutionary origins of eukaryotic sodium/proton exchangers. Am J Physiol Cell Physiol. 288, (2), C223-C239 (2005).
  12. Bobulescu, I. A., Di Sole, F., Moe, O. W. Na+/H+ exchangers: physiology and link to hypertension and organ ischemia. Curr Opin Nephrol Hypertens. 14, (5), 485-494 (2005).
  13. Donowitz, M., Ming Tse, C., Fuster, D. SLC9/NHE gene family, a plasma membrane and organellar family of Na(+)/H(+) exchangers. Mol Aspects Med. 34, (2-3), 236-251 (2013).
  14. Zachos, N. C., Tse, M., Donowitz, M. Molecular physiology of intestinal Na+/H+ exchange. Annu Rev Physiol. 67, 411-443 (2005).
  15. Girardi, A. C., Di Sole, F. Deciphering the mechanisms of the Na+/H+ exchanger-3 regulation in organ dysfunction. Am J Physiol Cell Physiol. 302, (11), C1569-C1587 (2012).
  16. Bobulescu, I. A., Moe, O. W. Na+/H+ exchangers in renal regulation of acid-base balance. Semin Nephrol. 26, (5), 334-344 (2006).
  17. Hilgemann, D. W., Feng, S., Nasuhoglu, C. The complex and intriguing lives of PIP2 with ion channels and transporters. Sci STKE. (111), re19 (2001).
  18. Mohan, S., et al. NHE3 activity is dependent on direct phosphoinositide binding at the N terminus of its intracellular cytosolic region. J Biol Chem. 285, (45), 34566-34578 (2010).
  19. Alexander, R. T., et al. Membrane surface charge dictates the structure and function of the epithelial Na+/H+ exchanger. EMBO J. 30, (4), 679-691 (2011).
  20. Wang, T. M., Hilgemann, D. W. Ca-dependent nonsecretory vesicle fusion in a secretory cell. J Gen Physiol. 132, (1), 51-65 (2008).
  21. Hilgemann, D. W. Single-Channel Recording. Sakmann, B., Neher, E. Plenum Press. 307-328 (1995).
  22. Hilgemann, D. W., Lu, C. C. Giant membrane patches: improvements and applications. Methods Enzymol. 293, 267-280 (1998).
  23. Matsuoka, S., Takeuchi, A. Patch Clamp Techniques. Okada, Y. Springer. 207-218 (2012).
  24. Pouyssegur, J., Sardet, C., Franchi, A., L'Allemain, G., Paris, S. A specific mutation abolishing Na+/H+ antiport activity in hamster fibroblasts precludes growth at neutral and acidic pH. Proc Natl Acad Sci U S A. 81, (15), 4833-4837 (1984).
  25. Ogden, D. Microelectrode Techniques - The Plymouth Workshop Handbook. The Company of Biologists Ltd. 275-316 (1994).
Применение измерений электрофизиологии для изучения деятельности перевозчиков электро нейтральный
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Babich, V., Henry, M. K., Di Sole, F. Application of Electrophysiology Measurement to Study the Activity of Electro-Neutral Transporters. J. Vis. Exp. (132), e56630, doi:10.3791/56630 (2018).More

Babich, V., Henry, M. K., Di Sole, F. Application of Electrophysiology Measurement to Study the Activity of Electro-Neutral Transporters. J. Vis. Exp. (132), e56630, doi:10.3791/56630 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter