Summary
Presentamos un método eficaz y reproducible para aislar las células progenitoras neurales de tejido cerebral embrionario y postnatal de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) de la histona 3 lisina 79 dimetilación (H3K79me2) - una marca de histona situada dentro de la cultura el dominio globular de la histona 3.
Abstract
Desarrollo del cerebro es un proceso complejo, que es controlado en forma temporo-espacial por gradientes de morfógenos y diferentes programas transcripcionales. Además, modificaciones epigenéticas de la cromatina, como la metilación de las histonas, tienen un papel importante para establecer y mantener destinos celulares específicas dentro de este proceso. La gran mayoría de la metilación de las histonas se produce en la cola de la histona flexible, que es accesible a los modificadores de las histonas, los borradores y proteínas de histona lector. En cambio, metilación de H3K79 se encuentra en el dominio globular de la histona 3 y está implicada en diversas funciones del desarrollo. H3K79 metilación evolutionarily se conserva y puede encontrarse en una amplia gama de especies de Homo sapiens a Saccharomyces cerevisiae. La modificación se produce en diferentes poblaciones celulares dentro de los organismos, incluyendo progenitores neuronales. La ubicación de la metilación de H3K79 en el dominio globular de la histona 3 hace difícil evaluar. Aquí se presentan métodos para aislar y progenitor cortical cultura (CPCs) con células de tejido embrionario cerebro cortical (E11.5-E14.5) o progenitores de neuronas granulares cerebelosas (CGNPs) del tejido postnatal (P5-P7) y eficientemente immunoprecipitate H3K79me2 para PCR cuantitativa (qPCR) y secuenciación del genoma.
Introduction
Las funciones sensoriales, motores y cognitivas del cerebro son altamente complejas y susceptibles a los cambios físicos y ambientales. El cerebro consta de tres partes generales el hind-, mediados de y prosencéfalo, que están profundamente conectados. En el prosencéfalo, el telencéfalo puede dividirse en un telencéfalo dorsal (DT) y un telencéfalo ventral (VT). El DT de los ratones consiste en seis capas corticales que se forman entre E11.5 y E18.5 en una manera de "inside-out"1. El VT incluye las eminencias ganglionares en desarrollo, que posteriormente forman los ganglios basales2,3. Varios tipos celulares se pueden clasificar en mamífero sistema nervioso central tales como neuronas, astrocitos y oligodendrocitos4, que se convierten en una forma temporo-espacial5. En primer lugar, las células progenitoras neurales (PNJ) dan lugar a diferentes tipos de neuronas, interneuronas en las VT y las neuronas de proyección en el despegue y más tarde en las células gliales (p. ej., astrocitos6). Durante el desarrollo cortical, la capa más superficial (capa I), que contiene las células de Cajal-Retzius, está formado en primer lugar. Luego, entre E12.5 y E14.5, NPCs generan capas más profundas neuronales (VI, V) mientras que entre 14,5 y 16,5, progenitores dan lugar a las neuronas de la capa superior (IV-II)7,8. Identidad neuronal está especificado por diferentes programas transcripcionales temporo-espacial inducida por morfógeno y además por programas epigenéticos2.
El cerebelo, que está implicado en la coordinación motora, se encuentra en el cerebelo y se desarrolla entre E10 y P20 en ratones9. Contiene la corteza cerebelosa y los núcleos cerebelosos10. La corteza cerebelosa adultos consta de tres capas, la capa molecular externa, la capa de células de Purkinje y la capa granular más interna que contiene las neuronas granulares10. Las células del gránulo cerebeloso son las neuronas más pequeñas y representan alrededor del 80% de todas las neuronas en el cerebro vertebrados11. Se desarrollan a partir de precursores en la zona germinal externa y migran a través de la capa de células de Purkinje a su destino12. Como en el telencéfalo, el desarrollo del cerebelo está regulado por varios importantes morfógenos, que tienen funciones específicas de tiempo y espacio dependiente e iniciar define programas transcripcionales10.
El desarrollo de capas corticales y cerebelosas es controlado por la expresión transcripcional de morfógenos específicos y, por tanto, el estado de la cromatina de la DNA. En una visión simplificada, Estados de la cromatina pueden dividirse en eucromatina como transcripcionalmente activo y heterocromatina regiones transcripcionalmente silencioso. Como la unidad básica de la cromatina nucleosoma contiene dos copias de cada histona núcleo H2A, H2B, H3 y H4, rodeado de 147 pares de bases de ADN13. Las histonas son modificadas altamente postraduccional por metilación, acetilación, fosforilación, ubiquitinación, la sumoilación, ADP-ribosylation, desaminación y prolina isomerización14,15. La metilación de lisina de las histonas se considera que la modificación de las histonas más estable que controla la transcripción, replicación, recombinación16, daño de la DNA respuesta17e impresión genómica18. Lisinas pueden ser mono-, di- o tri-metilados19 y aparecer en las colas de las histonas accesible, sino también en el dominio globular de las histonas20. Metilaciones específicas en H3K4 y H3K36 se asocian principalmente a eucromatina, metilaciones específicas en H3K9 H3K27 y H4K20 se encuentran principalmente en regiones heterochromatic, aunque todos los residuos se encuentran a la cola de las histonas14, 19,21. Metilación de H3K79 se encuentra en el dominio globular de las histonas y se ha asociado con la actividad transcripcional, sino también con las regiones genomic transcripcionalmente inerte22. La modificación evolutionarily se conserva ya que se ha observado en levaduras, timo de ternero, pollo y humana23. H3K79 mono, di y trimetilación (H3K79me1, me2 y me3) son catalizadas por la histona metiltransferasas DOT1L24,25 y la Nuclear conjunto dominio-que contienen la proteína 2 (Nsd2)26. DOT1L está implicado en la proliferación y reparación del ADN celular reprogramación27. Pérdida de Dot1l en ratones conduce a una muerte prenatal alrededor de la etapa de desarrollo E10.528,29. Durante el desarrollo del corazón y en la diferenciación de myocardiocyte, DOT1L es esencial para gene expresión Reglamento30. En el sistema nervioso central, función DOT1L podría estar implicada en el tubo neural desarrollo31, está implicado en la supresión de Tbr1-expresión durante el desarrollo de cerebro anterior32y puede funcionar en la regulación de la tensión ER de genes de respuesta33. Contexto-dependiente de la activación o represión acción de H3K79me, especialmente con en vivo situaciones como el desarrollo del sistema nervioso central, es hasta la fecha sólo parcialmente entendida32. Puesto que la metilación del H3K79 se encuentra en el dominio globular de la histona 3, es sterically menos accesible en comparación con modificaciones de la histona flexible cola23. Para entender la función de la metilación de H3K79, se necesitan métodos de análisis fiables y reproducibles para determinar su ubicación y entorno genómico. En este trabajo métodos, presentamos métodos de aislamiento de diferentes progenitores neuronales (CPCs de la corteza) y CGNPs para el cerebelo, eficaz tratamiento del inhibidor de DOT1L y un método de ChIP para analizar H3K79 metilación mediante qPCR o secuenciación en tiempo diferente puntos durante el desarrollo cortical y cerebeloso. Para tener una visión general del protocolo y sus posibilidades, vea la figura 1.
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Protocol
Comités de bienestar animal de la Universidad de Freiburg y las autoridades locales aprobaron todos los experimentos con animales (G12/13, 11 G16) mencionados en el siguiente protocolo.
1. preparaciones
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Preparativos para el aislamiento de CPCs
- Configurar tiempo de apareamiento para obtener embriones en diferentes etapas de desarrollo de la corteza (entre E11.5 y E14.5). Utilizar ratones de la cepa NMRI (Instituto de investigación médica Naval) que son al menos 8 semanas de edad. Después de aparearse, considere un tapón vaginal positivo E0.5.
- Para tener suficiente material, utilizar una camada de ratones NMRI para un ChIP de H3K79me2 de cortezas de E12.5 o E14.5. Para más adelante etapas embrionarias, utilice una camada para más análisis de ChIP (promedio de tamaño de camada NMRI: 10 embriones).
- Preenfriar Hank´s balanceado sal solución (HBSS) y solución salina con tampón fosfato (PBS) a 4 ° C (almacenamiento a largo plazo en RT).
- Equilibrar los 4 ° C almacenado tripsina-EDTA (0.05% p/v) a 37 ° C.
- Medio de preparar células corticales (CCM): Suplementar el medio de las neuronas (véase Tabla de materiales) con concentraciones finales de 2% (v/v) B-27 suplemento, 5 μg/mL Apo-transferrina, glutatión de 1 μg/mL, 0,5 mM L-glutamina, dismutasa del superóxido de 0,8 μg/mL y 1% (v/v) Mezcla antibiótica de penicilina-estreptomicina-neomicina. Almacenar a 4 ° C. Para el experimento, equilibrar el medio a 37 ° C.
- Descongelar el suero fetal de ternero (FCS), alícuota que (50 mL cada uno) y alcancen una alícuota a 37 ° C (almacenamiento a largo plazo a-20 ° C).
- Preparar las acciones de la DNasa 1 (10 mg/mL) en H2O para el cultivo celular. Almacenar en alícuotas a-20 ° C.
- Si es necesario, disolver los inhibidores específicos de la DOT1L zona franca-5676 o SGC0946 en DMSO a una concentración stock de 100 mM. Una concentración final de 1-5 μm se aplican a las células en el día 0 y vuelva a aplicar el inhibidor cada dos días.
- Para el cultivo de la CPC, la capa celular placas (pozo 12 o 6 bien) con poli-L-ornitina bromhidrato (1 mg/mL en 150 mM ácido bórico de pH 8,4) durante al menos 1 h a temperatura ambiente y luego con laminina (1 mg/mL) en medio de la CCM a 37 ° C durante la noche.
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Preparativos para el aislamiento de CGNP
- Organizar un adecuado apareamiento de ratones para generar animales P5-P7 para el aislamiento del cerebelo (3-5 animales por ChIP y condición).
- Preparar HBSS glucosa mediante la adición de 6 mg/mL glucosa al buffer HBSS.
- Preparar el medio de cultivo de células CGNP (CGM) mediante la adición de 1% (v/v) N2 suplemento, 1% (v/v) penicilina-estreptomicina-neomicina, 25 mM KCl y 10% FCS a DMEM-F12. Para el cultivo de CGNP prepare medio CGM sin FCS pero incluyendo erizo sonic de 0,6 μg/mL (SHH) (CGM-SHH) y equilibrar a 37 ° C cuando sea necesario.
- Capa de placas 6-pozo de la célula con 100 μg/mL poly-D-lisina para 1-2 h a temperatura ambiente para la eliminación de células de la glia. Luego lavar dos veces con ddH estéril2O y deje que se seque las placas. Almacenar las placas para una semana máximo a 4 ° C.
- Para el cultivo de CGNPs capa celular bien 6 placas con poli-L-ornitina (0,1 mg/mL) a 4 ° C durante la noche. Luego lavar dos veces con H2O para el cultivo celular y deje que se seque las placas.
Nota: Las placas pueden guardarse durante una semana máximo a 4 ° C. - Preparar tripsina 0,025% (p/v) en glucosa HBSS y equilibre a 37 ° C cuando sea necesario.
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Preparaciones para el ChIP de H3K79me2
- Preparar la PFA (1% en PBS, pH 8) recién antes de cromatina de reticulación. Para preparar PFA calentar 50 mL de PBS en el microondas a máxima 65 ° C. En constante agitación añadir 0,5 mg PFA al PBS. Luego agregar 50 μl 10 M NaOH y espere hasta que se disuelva la PFA. Luego, añadir 42,5 μl HCl (37% v/v) para obtener un pH de 8. Verificar el pH otra vez y luego dejar la solución al 1% PFA llegar a RT
- Preparar acciones de Rnasa (1 mg/mL) y proteinasa K (20 μg/μl) por separado en ddH estéril2O. almacenar las alícuotas a-20 ° C.
- Preparar los siguientes buffers y reactivos: que contiene 0,02% de PBS Tween, tampón de lisis, glicina, buffer de dilución, ChIP tampón 1, buffer ChIP 2, buffer ChIP 3 y buffer TE y almacenar a 4 ° C. Preparar el tampón de elución recién cada vez.
- Preparar que contiene 0,02% de PBS Tween. Tienda en más de una semana a 4 ° C.
- Preparar el tampón de lisis utilizando 50 mM Tris pH 8.0, 10 mM EDTA, 1% (p/v) sodio dodecil sulfato (SDS) y 1 x inhibidor de la proteasa.
- Preparar 2,5 M glicina.
- Preparar el tampón de dilución con 20 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% (v/v) Tritón X-100, 0.25% (p/v) de SDS y 1 x inhibidor de la proteasa.
- Preparación de buffer ChIP 1 con 20 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% (v/v) Tritón X-100 y 0.2% (p/v) de SDS.
- Preparar el tampón de ChIP 2 con 20 mM Tris, pH 8.0, 500 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% (v/v) Triton X-100 y 0.2% (p/v) de SDS.
- Preparación de buffer ChIP 3 usando 20 mM Tris, pH 8.0, 250 mM LiCl, 2 mM EDTA, 1% NP-40 (v/v) y 1% (p/v) de SDS.
- Preparar el tampón TE utilizando 20 mM Tris pH 8.0 y 2 mM EDTA.
- Preparar el tampón de elución fresco contiene 1% (p/v) de SDS, 100 mM NaHCO3.
2. nervios del Progenitor aislamiento de tejido cerebral
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Aislamiento y cultivo opcional de CPCs
- Eutanasia de los animales embarazados por dislocación cervical y transferir los embriones a HBSS helada.
- Quitar el cráneo con tijeras y aislar el cerebro, luego quitar las meninges, en su caso, con pinzas pequeñas y cortezas aislante (entero, DT o VT) de ambos hemisferios mediante la eliminación de todas las otras partes cerebrales en el ámbito binocular utilizando pinzas pequeñas y, si es necesarios, pequeñas tijeras. Almacenar las cortezas aisladas en tampón HBSS de 5 mL a 4 ° C en un tubo de 15 mL.
- Centrifugar el material de cerebro aislado durante 5 minutos a 1.000 x g a 4 ° C.
- Lavar las cortezas con 5 mL helado HBSS y homogeneizarlas con una pipeta de 1 mL por pipeteo arriba y abajo. Si es necesario, cortar la punta de la pipeta.
- Centrifugue la muestra homogeneizada durante 5 minutos a 1.000 x g a 4 ° C. Retire la HBSS.
- Añadir 3 mL de tripsina e incubar la muestra durante 5 min a 37 ° C.
- Añadir 1 mL de FCS, 5 mL CCM y 30 μl de DNasa 1 a la muestra y homogeneizar la muestra con una pipeta de vidrio de 5 mL por Pipetear cuidadosamente hacia arriba y hacia abajo.
- Centrifugar las células aisladas durante 5 minutos a 1000 x g a 4 ° C. Deseche el sobrenadante, agregar 5 mL CCM y homogeneizar la muestra una vez más.
- Diluir una alícuota de la muestra y cuenta con una cámara de conteo Neubauer. Se espera un promedio de 4.5 x 106 células por embrión. Para el cultivo de las CPCs aislados continúe con el paso 2.1.10. Para ChIP, inmediatamente proceder con el paso 3.
- Para el cultivo, placa CPCs en poly-L-ornitina (0,1 mg/mL) y laminina (1 mg/mL) cubierto platos con una densidad entre 8 x 104 y 2.5 x 105 células/cm2 en medio de la CCM e incubar a 37 ° C, 5% CO2y 100% de humedad relativa.
- Como los CPCs comienzan a diferenciarse en neuronas en cultivo celular (después de aproximadamente 4 días), considerar la disección fecha del día en vitro 0 (día 0). Para más condiciones de cultivo, cambiar la mitad del medio cada cuarto día con medio fresco de CCM.
- Aplicar 1-5 μm de SGC0946 o EPZ5676 disuelto en DMSO en el día 0 (4-5 h después de aislamiento de células) y actualice cada segundo día. Uso de DMSO como tratamiento control. Comprobar la eficiencia del tratamiento del inhibidor mediante métodos estándar immunoblot, si es necesario.
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Aislamiento y cultivo opcional de CGNPs
- Eutanasia a P5-7 animales por decapitación con unas tijeras. Quitar la piel del cuero cabelludo, abrir el cráneo y quitar el cerebro utilizando pinzas y tijeras pequeñas. Aislar el cerebelo y traslado a glucosa HBSS helada. Retire todas las meninges y los vasos sanguíneos y transferir el cerebelo en tubos de 15 mL con glucosa HBSS frío.
- Lavar el cerebelo tres veces con 10 mL glucosa HBSS helada (recogerlos por centrifugación a 650 x g durante 5 min a 4 ° C) y homogeneizar cerebelo posteriormente transfiriendo suavemente hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de 1 mL (máximo 2 - 3 veces) a 0.5-1 mm3 los fragmentos.
- Añadir 5 mL de tripsina de 0.025% en HBSS glucosa e incubar el tejido bajo agitación constante en un baño de agua de 37 ° C durante 15 minutos parada la digestión agregando 5 mL de CGM y recoger el tejido por centrifugación a 650 x g durante 5 min a 4 ° C.
- Quite el sobrenadante y triturate el tejido con una punta de la pipeta de 1 mL en 1 mL CGM y transferirlo a un nuevo tubo de 15 mL.
Nota: Es importante evitar burbujas de aire.- Añadir 5 mL CGM e incubar la mezcla por 2 min en hielo para colocar restos de tejido. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de 15 mL. Añadir 2 mL CGM el tejido residual y repita el procedimiento de trituración.
- Piscina los sobrenadantes (sin restos de tejido, aproximadamente 10 mL en total) y centrifugar a 650 x g durante 5 min a 4 ° C para recoger las células cerebelosas. Resuspender el precipitado en 10 mL CGM.
- Ya que los astrocitos se adhieren más rápido y más fuerte a poly-D-lisina que CGNPs, las células en 100 μg/mL poly-D-Lisina 6-pozo-placas cubiertas de la placa (hasta 4 mL por pozo) e incubar por 20 min a 37 ° C para eliminar los astrocitos.
- Agitar la placa y recoger el sobrenadante. Luego centrifugar a 650 x g durante 5 min a 4 ° C en un tubo de 15 mL. Resuspender el precipitado en 10 mL CGM y contar las células con una cámara de recuento de Neubauer.
Nota: CGNPs son redondos, pequeños y muestran un halo cuando reflejada mediante microscopía de contraste de fase. - Si necesario, semilla las células en 37 ° C previamente calentado CGM en placas de poly-L-ornitina-cubierto (3 x 106 células por pocillo 6) e incuban a 37 ° C, 5% CO2 y 100% de humedad relativa.
Nota: Si no se realiza la siembra, continúe con el paso 3.1.- Después de 6-12 h, el intercambio del medio a CGM-SHH. Tratar el aislado CGNPs 6 h (o al cambiar a CGM-SHH) después de aislamiento con inhibidor de la DOT1L y DMSO control y renovarla cada dos días (Comparar con 2.1.12). Comprobar la eficiencia del tratamiento del inhibidor mediante métodos de immunoblot estándar si es necesario. Para ChIP, continúe con el paso 3.3.
Nota: Dejando CGM en las placas (y con eso FBS) dará lugar a la diferenciación de las CGNPs en neuronas granulares cerebelosas (CGNs).
- Después de 6-12 h, el intercambio del medio a CGM-SHH. Tratar el aislado CGNPs 6 h (o al cambiar a CGM-SHH) después de aislamiento con inhibidor de la DOT1L y DMSO control y renovarla cada dos días (Comparar con 2.1.12). Comprobar la eficiencia del tratamiento del inhibidor mediante métodos de immunoblot estándar si es necesario. Para ChIP, continúe con el paso 3.3.
3. fijación de las células y la esquila de la cromatina
Nota: Realice los pasos 3.1 y 3.2 Si no se cultivan células, si son continúe con el paso 3.3.
- Recoger las células por centrifugación durante 4 min a 1.000 x g y agregar 1,3 mL de PBS. Transferir la muestra a un tubo de 1,5 mL. Centrifugar durante 4 min a 1.000 x g a 4° C. Lave la muestra dos veces con 1,3 mL de PBS.
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Paso crítico: Añadir 350 μL 1% PFA a la muestra e incubar durante 5 minutos a 22 ° C. Para detener la reacción, añadir 18.4 glicina μl y 1 mL PBS. Centrifugue la muestra durante 5 min a 1.000 x g a 4 ° C.
- Lave la muestra dos veces con PBS helado. Recoger las células fijas por centrifugación durante 5 minutos a 1.000 x g y 4 ° C. Mantener las muestras en hielo de ahora en adelante.
Nota: El tiempo de fijación debe ser exactamente 5 min para obtener resultados óptimos. Un número diferente de células puede requerir adaptaciones de tiempo.
- Lave la muestra dos veces con PBS helado. Recoger las células fijas por centrifugación durante 5 minutos a 1.000 x g y 4 ° C. Mantener las muestras en hielo de ahora en adelante.
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Paso crítico: CGNPs cultivadas (o CPC), agregar 1 mL 1% PFA directamente a los pozos de la placa de la célula cultura. Después de una incubación de 5 minutos a 22 ° C, agregar una cantidad apropiada de glicina y PBS y cosechar las células con un raspador celular.
- Las células de transferencia en tubos de 1.5 mL y centrifugar la muestra durante 5 min a 1.000 x g a 4 ° C. Lave la muestra dos veces con PBS helado. Recoger las células fijas por centrifugación para 5 minat 1.000 x g a 4 ° C. Mantener las muestras en hielo de ahora en adelante.
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Paso crítico: Añadir 700 μl de tampón de lisis (+ inhibidor de la proteasa) e incubar la muestra durante 15 min a 4 ° C. Vórtice de la muestra cada 5 minutos esquileo la cromatina de las células sometidas a lisis 3 x 10 min en el sonicador (pulso 30 de s, 30 s pausa) a máxima potencia.
- Asegúrese de que el volumen no exceda de 350 μl por tubo. Vórtice las muestras cada 10 minutos comprobar el lisado para núcleos restantes con un microscopio de contraste de fase.
Nota: Es importante obtener resultados de corte óptimos (Comparar con figura 1B) para su posterior análisis. En caso de utilizar otros métodos para el corte de la cromatina, optimiza el corte de fragmentos de cromatina de tamaño entre 200-500 bp.
- Asegúrese de que el volumen no exceda de 350 μl por tubo. Vórtice las muestras cada 10 minutos comprobar el lisado para núcleos restantes con un microscopio de contraste de fase.
- Pellets de restos celulares para 13.000 x g, 10 min, 4 ° C. Utilice el sobrenadante del paso preclearing 5.2. Congelación de la muestra a-20 ° C para uso posterior, si es necesario.
4. preparación de los granos y Preclearing
- Lavar 45 μl proteína A granos/viruta magnética y granos magnéticos 20 μl/la muestra con 1 mL PBS helado que contiene 0,02% Tween tres veces utilizando un soporte magnético. Luego, añadir 1 mL de PBS helado a los granos.
- Añadir a 1 mL PBS helado y 45 μl granos/ChIP, 3 μg de anticuerpo/ChIP (H3K79me2 o IgG de conejo). Incubar las muestras durante 2 h a 4 ° C en un agitador para los anticuerpos se unen a los granos. Dependiendo de los anticuerpos, usar ~ 3 μg de anticuerpo y virutas.
- Lavar los granos de anticuerpo enlazado tres veces con 1 mL PBS helado que contiene 0,02% Tween. Añadir el volumen de grano apropiado (a partir de volumen de perlas magnéticas utilizadas) de PBS helado a los lavados anticuerpo acoplado en granos.
- Añadir 600 μl de tampón de dilución y 20 μl de lavado bolas magnéticas a la muestra para preclearing (μL volumen total 1.320) e incubar por 2 h a 4 ° C en un agitador. Quitar los granos con un soporte magnético. Tomar 5% (33 μL) de los lisados como entradas muestras y congelarlas a-20 ° C.
5. inmunoprecipitación de cromatina
- El extracto de precleared se dividen en dos tubos (μL aproximadamente 643.5), agregar el mismo volumen de tampón de dilución y el anticuerpo-limite-perlas (45 μl/muestra; H3K79me2 o IgG de conejo). Incubar las muestras a 4 ° C durante la noche en un agitador.
- Lavar los granos con buffer de viruta helada 1, buffer ChIP 2 y ChIP buffer 3 por 10 min a 4 ° C en un agitador. Luego, lave tres veces con tampón TE por 5 min a 4 ° C en un agitador.
- Eluir los granos con tampón de elución por 1 h a 1.400 rpm en un agitador a temperatura ambiente.
- Añadir 10 μg Rnasa (1 mg/mL) por cada muestra de ChIP y 5 μg a las muestras de entrada e incubar las muestras durante 30 min a 37 ° C (1.400 rpm).
- Añadir 100 μg de proteinasa K (20 μg/μl) por muestra y 50 μg por la entrada de la viruta e incubar durante una noche a 65 ° C a 1.400 rpm.
6. purificación de las muestras de ChIP
- Purificar el ChIP y la entrada de las muestras con una purificación de DNA kit (véase Tabla de materiales) según el manual. Utilizar más columnas de purificación cuando se espera que más de 5 μg de ADN. Eluir la muestra con 2 x 15 μl del buffer de elución de ADN proporcionado en el kit.
- Realizar la cuantificación de las muestras (use 1 μl) mediante un visualización fluoróforo y un fluorospectrometer (véase Tabla de materiales).
7. Análisis de muestras de la viruta mediante qPCR
- Diseño de cartilla para el análisis de qPCR, recuperar secuencias genómicas de interés desde el navegador de visor de genómica Integrativa (IGV)34. Diseño de primers alrededor del sitio de inicio transcripcional (TSS) de un gen, ya que H3K79me2 es probable que se encuentra allí. Como control, considere no codificante genomic regiones o regiones aproximadamente 10 Kb de subida de la TSS o 10 Kb de bajada del final transcripcional sitio (TES).
- Generar los cebadores con https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ usando un tamaño de producto entre 70 y 200 bp y una óptima temperatura de la precolocación de 60 ° C. Para fines de prueba, utilizar Imprimaciones para las regiones genomic Aft4 Ddit3, Scd1, Aft3 y Npm1 enumerados en la tabla 1.
- Prueba nuevo diseñadas cartillas con el siguiente programa de qPCR, mezcla principal y un gradiente de temperatura de recocido entre 58 ° y 63 ° C y seleccionar la temperatura de recocido con la mayor cantidad de producto y calidad.
- Aplicar electroforesis del gel de DNA para controlar el tamaño del producto esperado. Para el análisis de qPCR, utilizar un sistema de detección de PCR en tiempo real (véase Tabla de materiales).
- Preparar la mezcla principal con 10 μl ADN polimerasa principal mezclar 0,5 μl la cartilla hacia adelante (10 μm), 0,5 inversa la cartilla μl (10 μm), 4 μL de agua libre de nucleasas y 5 μl ADN (1 ng/μL).
- Utilizar un programa de qPCR paso 2 como sigue: 5 min a 95 ° C, 50 x (30 s a 95 ° C, 30 s a 58 ° C a 63 ° C) y el gradiente de desnaturalización constantemente a 4 ° C.
- Crear una serie de diluciones de las muestras de ADN genómicas, esquiladas, purificadas (2 ng/μl, 1 ng/μl, 0.5 ng/μl, 0.25 ng/μl y 0,125 ng/μL) y 5 μL para una prueba de eficiencia utilizando qPCR. Determinar la pendiente de la curva estándar y calcular la eficiencia de la cartilla por la siguiente fórmula:
Eficiencia (%) = (10^(-1/slope)-1) * 100.- Utilizar cebadores con eficiencias entre 90% y 105% en un caso ideal, o al menos con eficiencias entre 85 y 115%.
- Para analizar el ChIP y la entrada muestras, aplicar 0.1-1 ng de DNA ChIP mezclado con respectivo adelante y cartilla reversa, agua libre de nucleasas y polimerasa de la DNA master mix en un volumen final de 20 μl de cada reacción de qPCR.
- Determinar los valores de umbral de ciclo (Ct) de la viruta y las muestras de entrada y normalizar la muestra Ct a Ct valores de entrada para el cálculo de enriquecimiento (entrada %) con la siguiente fórmula. Valores de uso Ct obtenidos control de IgG para determinar el nivel de fondo.
% entrada = 100-2^(norma − entrada normal. Viruta)
norma. entrada = Ct (entrada) − log2(factor de dilución)
norma. ChIP = Ct (ChIP) − log2(factor de dilución)
Nota: norma. = normalizado
8. Análisis de muestras de la viruta a través de la secuencia
- Transferir las muestras de ChIP (entrada y immunoprecipitated muestra de ADN) a un centro de secuenciación.
- Para preparar un uso previamente, biblioteca una preparación de biblioteca apropiado kit (véase Tabla de materiales) y convertir 2 ng de la entrada del ADN y todo lo de la DNA immunoprecipitated en librerías indexadas para próxima generación multiplexan la secuencia en la indica la plataforma (véase Tabla de materiales).
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Paso crítico: Siguiendo las instrucciones del kit, ligan adaptadores de secuencia (con una concentración de trabajo de 15 μm) para poner fin a repararse y cola dA fragmentos de ADN. Para adaptadores de secuenciación y la PCR primers utilizan oligos apropiado (véase Tabla de materiales). Para esta cantidad de DNA de entrada, use 6-9 ciclos PCR para enriquecer adaptador unen fragmentos de ADN.
Nota: Normalmente, no es necesario realizar una selección del tamaño de ADN adaptador ligada. Es mejor usar ciclos PCR como pocos como sea posible, desde muchos PCR resultado de ciclos de amplificación en PCR duplicados y un alto sesgo de GC. - Para una comprobación final de la biblioteca, tomar 0,5 μl de la reacción total de análisis para visualizar la distribución del tamaño de un dispositivo apropiado (véase Tabla de materiales). Para la cuantificación, utilizar un medio de contraste visualizado en combinación con un fluorospectrometer u otros métodos (véase Tabla de materiales).
- Ya que H3K79me2 parece ser una modificación de las histonas, que se extiende ampliamente por regiones genómicas más grandes, la secuencia de muestras emparejadas-final con una longitud de lectura de 50 bp y con una profundidad de secuenciación de 75 Mio Lee.
- Analizar los datos del ChIP-seq con el servidor Galaxy/Uni de Freiburg (galaxy.uni-freiburg.de).
- Realizar control de calidad con ChIPseq obtenido con FastQC y, si procede, los mapas directamente con Bowtie2 versión 2.2.035 con o sin corte. Asamblea del genoma de referencia usa mm9 o la más reciente versión mm10; y como anotación de referencia Ensembl FTP 79.
- Opcional: Quitar Lee duplicados utilizando Picard MarkDuplicates (http://broadinstitute.github.io/picard) antes de llamar al pico.
- Llamar a picos con MACS2 versión 2.1.036 usando la opción 'amplia' para H3K79me2.
- Para obtener una Registro2 relación entre ChIP y muestra de entrada, Registro2 del número de lecturas de la Lee cociente de ambas muestras utilice BamCoverage y BamCompare.
- Para todos otros ChIP-seq específico análisis en profundidad, aplicar deepTools2 versión 2.3.5 o 2.4.137, es decir, para generar archivos de pista de cobertura (bamCoverage para el ChIP sólo, bamCompare para la comparación de la viruta a la entrada), para estimar el ChIP rendimiento utilice plotFingerprint y para generar una visión general computeMatrix, plotHeatmap. Seleccione K-significa agrupamiento durante el proceso de computeMatrix a regiones genómicas según la distribución de H3K79me2.
- Uso datos de ChIP-seq publicados como H3K79me2 de E14.5 DT depositado en NCBI para propósitos de prueba (número de accesión: SRP057733).
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Representative Results
Régimen general de progenitoras neurales aislamiento, cultivo, métodos de análisis de H3K79me2 ChIP y ChIP: La figura 1 muestra un diagrama de flujo para realizar H3K79me2 ChIP de células progenitoras cortical en diferentes momentos durante el desarrollo embrionario del cerebro o de progenitores de neuronas granulares cerebelosas en etapas postnatales. Como primer paso, el cerebro tiene que ser aislado y el telencéfalo (entre E11.5 y E14.5) o el cerebelo (P5-P7) tiene que ser obtenido. Es posible analizar las distintas regiones del telencéfalo dividiéndolo en la DT y VT Luego el tejido se homogeneizaron y segregación social de los progenitores neuronales. Ahora, es posible que las células progenitoras de la cultura y tratarlos con inhibidores de la DOT1L. Otra posibilidad es fijar los progenitores directamente y sujeto al procedimiento de ChIP. Para el ChIP, la cromatina se cortado en fragmentos de 200-500 bp e incubada posteriormente con el anticuerpo acoplado de granos magnéticos contra H3K79me2. Después de lavar los granos y recuperar el ADN, el ADN precipitado se puede analizar mediante secuenciación o mediante qPCR (figura 1A). Es esencial tener una distribución de buen tamaño de los fragmentos de cromatina después de corte, por lo que es conveniente revisar el tamaño del fragmento con electroforesis en gel de DNA o con otros métodos (ejemplos en la figura 1B). Al elegir la secuenciación del genoma, ChIP-seq-lecturas para la ocupación de H3K79me2 se prestará como un fichero fastq para su posterior análisis (figura 1). La calidad de la secuencia Lee deben evaluarse mediante la aplicación de FastQC y, si es necesario, pueden recortarse fastq-archivos usando TrimGalore. Traz el genoma de Mus musculus mm9 o mm10 puede ser realizado con Bowtie2 y controlado a través de PlotFingerprint. Es aconsejable eliminar duplicados con MarkDuplicates y normalizar la Lee por BamCoverage y comparar el ChIP a las muestras de entrada con BamCompare. El ChIP-seq Lee posteriormente puede ser visualizado genoma amplio en heatmaps o gene-wise en las sesiones del explorador visor de genómica Integrativa (IGV).
CPC cultura e inhibición de la DOT1L: CPCs fueron aislados y tratados con el inhibidor de DOT1L de 5 μm SGC0946 en el día 0 y día 2. El DMSO solvente fue utilizada como control. En el día 3, CPC fueron cosechada, las proteínas fueron aisladas, cuantificadas y analizadas mediante inmunoblot (figura 2A). Figura 2A muestra que H3K79me2 niveles son efectivamente disminuidos después de tres días de cultivo de CPC y la inhibición de DOT1L garantizar un esquema de tratamiento efectivo inhibidor. La cantidad de proteína de H3, GAPDH o alfa tubulina que sirven como controles de carga tal modo no fue deteriorada. Immunostaining del CPC fijo con anticuerpos contra activo caspasa 3 (CASP3 +) para la detección de apoptosis y HuC/D para la visualización de las células neuronales indica que el tratamiento de CPC con inhibidor de la DOT1L creciente de la célula muerte después de tres días en la cultura, como se muestra en la figura 2B. Cuantificación de las células que son CASP3 + / DAPI + o HuC/D + / DAPI + dentro de la cultura CPC reveló un aumento significativo de células CASP3 + revelando programado muerte celular por inhibición de la DOT1L. El número de neuronas del HuC, D-positivo, sin embargo, permaneció sin cambios (figura 2).
H3K79me2 ChIP-qPCR de Aft4, Ddit3, Scd1, Aft3 y Npm1 de CPCs tratados con inhibidor de la DOT1L: para comprobar si el tratamiento del inhibidor de SGC0946 de DOT1L fue eficiente y conducido a una reducción de H3K79me2 en específico genes, se realizó un análisis de viruta seguido por qPCR de la CCP tratado durante 3 días. IgG de conejo fue utilizado como un control de la viruta. Ya se sabe que la H3K79me2 se encuentra en los genes sensibles estrés endoplasmatic Aft4, Ddit3, Scd1 y Aft3 así como en el gen Npm133,38de transporte nuclear, se utilizó cartillas de qPCR cubriendo el TSS, TES y regiones genómicas en los órganos de la gene para determinar diferencias en la distribución de H3K79me2 después de DOT1L la inhibición (Figura 3A). Genes con altos niveles de H3K79me2 en primer lugar como Atf4, Ddit3 y Npm1 más responsivo al tratamiento inhibidor para que tres días de la inhibición de DOT1L condujo a una significativa disminución del H3K79me2. Genes con una menor cobertura de H3K79me2, como Atf3 Scd1, no mostraron ningún cambio significativo en los niveles de H3K79me2.
Análisis de Resumen de H3K79me2 ChIP-seq: Análisis del genoma de los niveles de H3K79me2 en CPC de E14.5, realizado y analizado según los esquemas presentados y protocolos (figura 1), reveló un ChIP de muy alta calidad. Mientras que las cuentas desechadas, clasificadas según su frecuencia de la entrada lee la huella digital la mancha blanca /negra (Figura 4A), se distribuyeron uniformemente, las cuentas de H3K79me2 demostraron enriquecimiento en regiones específicas (cubos con 1), que se muestra exitosa acumulación de fragmentos de cromatina modificado en H3K79. Un heatmap de H3K79me2 a lo largo de genes entre la TSS y sus TES y +-10Kb por aguas arriba o aguas abajo (Figura 4B) muestra H3K79me2 picos alrededor del TSS y disminuidas a los TES en general. Hay genes, que están completamente cubiertos de H3K79me2, y genes, que tienen un pico sólo en la región de TSS. Endoplasmatic estrés relacionado con genes como Atf4, Ddit3 y el nucleophosmin Npm1 puerto, por ejemplo, un alto nivel de H3K79me2 en el TSS, que es sólo ligeramente disminuido a lo largo del cuerpo del gene entero (figura 4). Por el contrario, Scd1 tiene una baja ocupación de H3K79me2 en el TSS y no H3K79me2 dentro del cuerpo de la gen. Atf3 como un último ejemplo tiene diferentes agudos y bajo nivel H3K79me2 picos a lo largo del cuerpo del gene.
Figura 1: esquema del Protocolo de H3K79me2 ChIP de CPCs aislados o CGNPs y diagrama de flujo del análisis de la secuencia. (A) Descripción del protocolo presentado. Para el aislamiento de la CPC, primer E14.5 cerebros será aislados y las cortezas se pueden dividir en DT y VT, si es necesario. Para CGNPs, cerebelli de tiene que ser obtenido de ratones P5-P7. El tejido será homogeneizada, los progenitores separados, y entonces las células pueden ser cultivadas y tratadas con un inhibidor apropiado o utilizadas directamente para el ChIP. Para ChIP, fijación de la cromatina es seguida por la corte y la inmunoprecipitación con anticuerpos anti-H3K79me2 y IgG de conejo como control. Después de la purificación de DNA, muestras de ChIP pueden ser analizadas a través de la secuencia y la preparación de la biblioteca o pueden ser analizadas mediante qPCR. (B) ejemplos de la cromatina de calidad apropiado e inapropiado. En bpse muestra la distribución de fragmento de ADN. (C) resultados de ChIP-seq pueden ser sometidos a una tubería de análisis en el servidor de Freiburg/galaxia. Después de un control de calidad (FastQC), Lee puede adornado con TrimGalore y luego asignada vía Bowtie2 al genoma del ratón (en los casos presentados mm9). PlotFingerprint evalúa la calidad de la viruta. Para definir los picos de H3K79me2, se puede aplicar MACSpeaks. Para la normalización BamCoverage y para la comparación a la entrada BamCompare es usable. Para visualizar los resultados IGV navegador y heatmaps son adecuados. Formatos de archivo que están en cursiva. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: cultura progenitora Cortical y la inhibición de la DOT1L. Immunoblots de (A) Mostrar H3K79me2 niveles en CPC en E14.5 después de la inhibición de la DOT1L durante 3 días (día 3, n = 3-11) en comparación con el control de DMSO. H3, GAPDH y tubulina alfa fueron utilizados como controles de carga. (B) Immunocytological tinción de una cultura CPC en los días 2 y 3. Activación de caspasa 3 (CASP3 verde)-células y neuronas (HuC/D: rojo) fueron manchadas positivas. DAPI (azul) fue utilizado para visualizar los núcleos celulares. Barra de escala: 100 μm. (C) la cuantificación de los immunostainings presentada en (B). La proporción de células positivas para CASP3 + / DAPI + o HuC/D + / DAPI + porcentaje se da. Para el análisis estadístico, se realizaron t-pruebas sin par del estudiante. p < 0.01 **. Esta figura fue modificada de Roidl et al. 33 , 38 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: H3K79me2 ChIP-qPCR de Aft4, Ddit3, Aft3, Scd1 y Npm1 de CPCs tratados con inhibidor de la DOT1L. (A) derivado de E14.5 CPCs fueron tratados con el inhibidor de DOT1L de 5 μm 4-5 h después de aislamiento y por segunda vez en el día 2 en la cultura. CPC se fijaron en el día 3, que fue seguida por la extracción de la cromatina, experimento de ChIP y qPCR. Resultados se representan como el % de promedio (+/-SEM) de entrada (n = 3). IgG se utilizó como control negativo. La media del nivel de IgG es representada como línea discontinua. Para el análisis estadístico, se aplicó ANOVA de dos vías. p < 005 *; p < 0.01 **, p < 0.001 ***; Sitio de inicio transcripcional de TSS, TES final transcripcional sitio. Esta figura fue modificada de Roidl et al. 33 , 38 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Análisis de H3K79me2 ChIP-seq. (A) de la huella digital de H3K79me2 ChIP-seq de CPCs E14.5 derivados en comparación con la entrada muestra un enriquecimiento de los fragmentos de la DNA, para H3K79me2, asegurando una alta calidad de ChIP-seq. (B) H3K79me2 ChIP-seq resultados graficados en un mapa de calor. Regiones genómicas fuertemente enriquecidas se presentan en azul. Escala 0 (rojo oscuro) - 45 (azul oscuro). H3K79me2 picos de cerca del TSS y disminuye en la dirección 3´ a TES. (C) H3K79me2 ChIP-seq Lee fueron asignado al genoma mm9 y visualizar con el visor de genoma integrante (IGV). La ocupación de H3K79me2 de un gen se muestra como log2 del número de lecturas relación entre ChIP y Lee entrada por kilobase por millones (escala: 9:50). Estructura de genes refseq se representa mientras que un cuadro rojo indica el primer exón incluyendo el TSS. Se muestran los genes Aft4, Ddit3, Scd1, Aft3 y Npm1 . Para la comparación, se muestra una señal H3K4me3 de la misma región genómica. Sitio de inicio transcripcional de TSS, TES final transcripcional sitio. Esta figura fue modificada de Roidl38. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Gene | Región | Primer forward 5' - 3' | Primer revés 5' - 3' | ||
| Aft4 | TSS | GGACGATCTCTAACGCCACA | GCCCTAAACCCGCCCTTTAT | ||
| Aft4 | TSS + 1500 | CTCCCGAATATGACATGAACCG | TCCATTCGAAACAGAGCATCG | ||
| Aft4 | TES | CCGTAATAGGGTAGTCAGGTGC | AAAGAATGACACTGAAAACCCACA | ||
| Ddit3 | TSS | GTACTGGCTCCGTCTAACCC | CAAGAGAGGGCCTGTAAGCA | ||
| Ddit3 | TSS + 2500 | TCAAGCAGCCGGTCTCATAG | CTCAGATCCCCCAATGGCTT | ||
| Ddit3 | TSS + 4500 | GAGCTGGAAGCCTGGTATGA | TCACCTCTTCGTTTCCTGGG | ||
| Ddit3 | TES | CACCAAGCATGAACAGTGGG | GTACCGTCTATGTGCAAGCC | ||
| Aft3 | TSS | AACTGAGAGCGCAACTCCTC | GCTGCCGTTCTTAGCTGGTA | ||
| Aft3 | TES | CTGTTGGCACAAAGTGGCTC | GGGATCTGCCATGGTGGAAA | ||
| Scd1 | TSS | TAGTGACCACACACAAAAGCTC | CCCAAGTGTAATTTGGATGATTTCC | ||
| Npm1 | TSS | TCCCCCTCCAGTCAGTTACC | CGTCCTTTCCTTGGCGTGA | ||
| Npm1 | TES | AGGGACATACTTAAGACAAGCCAG | AGGATTGAGGCAGACTGTCAAT | ||
| TSS: sitio de inicio transcripcional | |||||
| TES: sitio transcripcional final | |||||
Tabla 1: Lista de cebadores utilizados para ChIP-qPCR.
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Discussion
Hay dos maneras principales de inmunoprecipitación de cromatina para detectar la ocupación genómica de modificaciones de las histonas, factores de transcripción, lectores de código de las histonas, escritores o gomas de borrar. Uno es el método de ChIP nativo con nucleasa digerida, la cromatina nativa para la inmunoprecipitación, y el otro es el método presentado con cromatina PFA-fijo, esquilada, en el que los nucleosomas y otras proteínas ADN Unido están covalentemente al ADN 39. ChIP nativo con su tasa de detección de anticuerpos alta debe ser aplicable para la metilación de la histona desde la cromatina y metilaciones de las histonas son relativamente estables a lo largo de la viruta. Pero puesto que es necesario una gran cantidad de material de partida, no es aplicable para el estudio de desarrollo cortical y cerebeloso, donde se limita generalmente el número de células de cerebro de ratón. Aunque los anticuerpos generalmente se levantan contra material no fijo, podría demostrar que el anticuerpo detecta específicamente H3K79me2 desde inhibición específica de DOT1L conduce a una señal de H3K79me2 disminuida en análisis de qPCR ChIP y immunoblots (figura 2A y Figura 3A). ChIP usando material reticulado puede ser ineficiente, pero asegura que el protocolo presentado material específicamente lo suficientemente enriquecido para qPCR y análisis de la secuencia.
Un ChIP eficaz, la concentración de SDS del tampón de lisis puede ser crucial, puesto que el SDS desnaturaliza las proteínas y los hace accesibles para Unión de anticuerpos. Esta característica es especialmente importante para los H3K79me2, que es una modificación de las histonas situada dentro del dominio globular de la histona 3 y dentro del núcleo del nucleosoma de cromatina más pequeña unidad22. Así, para H3K79me2, es necesaria una mayor concentración de SDS (aproximadamente 0.3% w/v) durante el ensayo para asegurar accesibilidad óptima antigene. Con esta concentración de SDS, altamente podríamos enriquecer H3K79me2 controles de IgG (figura 3) y entrada (figura 4). Así, la calidad de la material de la viruta para la secuencia era apropiada y el enriquecimiento sobre entrada comparable a la de H3K4me3 (figura 4). Esperamos que la misma concentración de SDS se necesitarían para el ChIP de la marca mono o trimetilación de H3K79. En general, más estrictos el búfer de ChIP, los fragmentos de cromatina menos falsos positivos immunoprecipitated, si la calidad del anticuerpo no es afectada por el detergente utilizado. Para el futuro, podría ser factible de aplicar el protocolo presentado a otras modificaciones de las histonas en el dominio globular de las histonas.
Si los anticuerpos son convenientes para el ChIP y son estables a altas concentraciones de detergente, el protocolo contiene principalmente dos pasos críticos. En primer lugar, la fijación de las células y el corte posterior de la cromatina deben optimizarse para cada tipo de células y cada ultrasonicador. Cross-linking prolongada conduce a artefactos de fijación y puede reducir la tasa de detección de anticuerpos como antígenos pueden ser enmascarados. La cromatina de corte necesario para conducir una distribución del tamaño de ADN entre 200 y 500 bp (figura 1B). Nucleosomas contienen 147 bp de DNA. Fragmentos de cromatina que son demasiado largos dará lugar a resultados falsos positivos en qPCRs. Durante la secuencia del genoma, una distribución incorrecta dará lugar a resultados falsos negativos, puesto que se consideran a menudo solamente pequeños fragmentos. El segundo paso crítico es la preparación de la biblioteca para la secuenciación del genoma. Un paso de amplificación de ADN debe realizarse con 6-9 ciclos de PCR. Evitando numerosos ciclos PCR es esencial ya que pueden conducir a un sesgo de GC alto y muchos duplicados PCR. Con el protocolo presentado, se puede recuperar suficiente ADN para mantener bajo el número de ciclos PCR necesarios.
Tejido cerebral consiste en una cantidad muy diversa de tipos de células como neuronas, oligodendrocitos y células de glia4. Durante el desarrollo de estas células derivan de células madre neurales y construcción áreas específicas en el cerebro en una manera dependiente del tiempo y del lugar del3. Neurogénesis de la corteza cerebral, por ejemplo, ocurre entre E11.5 y E18.5 en ratones. En etapas más tempranas como E11.5 y E12.5 casi todas las células tienen progenitora identidad1, pero posteriormente celular diversidad debe tenerse en cuenta. Por lo tanto, un ChIP de tejido cortical en E14.5 puede revelar H3K79me2 o cualquier otra modificación de las histonas en ese punto de tiempo específico, pero no puede mostrar características de cromatina específica de tipo celular. Este problema puede resolverse por el enriquecimiento de células específicas con celular activado por fluorescencia (FACS) de clasificación o clasificación (ordenación de MaCS)40, que es factible después de la homogeneización del cerebro la célula activada por el magnético. Con clasificación MaCS células progenitoras neurales llevar marcadores de superficie celular específicos pueden ser etiquetadas con bolas magnéticas y luego aislaron usando un soporte magnético40. Luego las células pueden ser cultivadas o utilizadas directamente para el ChIP. El protocolo presentado puede utilizarse no sólo para las células progenitoras neurales, sino también para otras poblaciones de células homogéneas. Con adición de FACS o MaCS, el protocolo puede ser aplicado para todas las celdas isolatable dentro de un organismo.
Tomados en conjunto, el protocolo presentado hace posible investigar la modificación de histonas H3K79me2 en diferentes momentos del desarrollo cortical y cerebeloso en forma eficiente y reproducible. Pueden ser aplicable a otras modificaciones de las histonas situados dentro del núcleo de histonas y puede aplicarse a otros tipos de células homogéneas dentro del organismo. Puesto que H3K79me2 es una modificación de histonas conservado23, el protocolo también puede ser conveniente analizar H3K79me2 no sólo en ratones, sino a través de diferentes especies.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten
Acknowledgments
Agradecemos a Henriette Bertemes para ayudar a establecer el protocolo de cultivo de CGN dentro del laboratorio. Este papel de método fue apoyada por la DFG financió CRC992 médico epigenética por financiación a TV. Los autores reconocen el apoyo del equipo galaxia Freiburg: Pavankumar Videm, Björn Grüning y Prof. Rolf Backofen, bioinformática, Universidad de Freiburg, Alemania financiado por colaboración investigación 992 centro médico epigenética (grant DFG SFB 992/1 de 2012) Ministerio Federal alemán de educación e investigación (BMBF grant 031 A538A RBC (de. NBI)).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-GAPDH | Abcam | ab8245 | Category: Antibody Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:5000 |
| Anti-H3 | Abcam | ab1791 | Category: Antibody Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:3000 |
| Anti-H3K79me2 | Diagenode | pAb-051-050 | Category: Antibody Abbreviation/Comment: ChIP antibody |
| Anti-H3K79me2 | Abcam | ab-051-050 | Category: Antibody Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:1000 |
| Anti-rabbit-IgG | Diagenode | C15410206 | Category: Antibody Abbreviation/Comment: ChIP Ctrl antibody |
| Anti-Tubulin alpha | Abcam | ab108629 | Category: Antibody Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:3000 |
| Apo-Transferrin (1 mg/ml) | Sigma-Aldrich | T1147 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CCM |
| B27 Supplement (50x) | Life Technologies | 17504044 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CCM |
| Bioanalyzer | Agilent technologies | G2940CA | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For analysis of sheared chromatin |
| Bioruptor NextGen | Diagenode | B01020001 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: Ultrasonicator |
| Boric acid pH 8.4 | Sigma Aldrich | B6768 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CPC culturing |
| CFX Connect RT PCR Detection System | Bio-Rad | 1855201 | Category: ChIP Analysis Abbreviation/Comment: Detection system for qPCR |
| DMEM-F12 | Life Technologies | 11320-033 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CGM |
| Dynabeads Protein A | Invitrogen | 10001D | Category: ChIP Abbreviation/Comment: Magnetic beads, for ChIP |
| EPZ-5676 | Selleckchem | S7062 | Category: DOT1L inhibition Abbreviation/Comment: For DOT1L inhibition in cell culture |
| Ethylenediamine tetraacetic acid | SERVA | 39760.01 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: EDTA |
| Fetal Bovine Serum 10% (v/v) | Gibco | 10082147 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CPC isolation and CGM |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CGNP isolation |
| Glutathione (1.25 mg/ml) | Sigma-Aldrich | G4251 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CCM |
| Glycine | Carl Roth | 3187 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For cell fixation |
| GoTaq mastermix | Promega | A6002 | Category: ChIP Analysis Abbreviation/Comment: DNA polymerase master mix for qPCR |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025-100 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: HBSS |
| L-glutamine (200 mM) | Life Technologies | 25030081 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CCM |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CPC culturing |
| Lithium chloride | Sigma-Aldrich | L4408 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: LiCl |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502048 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CGM |
| NanoDrop 3300 | Thermo Fisher | 3300 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: Fluorospectrometer for DNA quantification |
| NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | NEB | E7645S | Category: ChIP Analysis Abbreviation/Comment: Kit for Library preparation |
| NEBNext Multiplex Oligos for Illumina | NEB | E7335 | Category: ChIP Analysis Abbreviation/Comment: Oligos for Library preparation |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CCM |
| NP-40 Alternative | Calbiochem | 492016 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For ChIP buffer |
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 335 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: PFA, for cell fixation |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin 1% (v/v) | Life Technologies | 15640055 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: PSN, for CCM and CGM |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 10010023 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: PBS, for CPC isolation |
| PicoGreen Kit | Thermo Fisher | P11496 | Category: ChIP Analysis Abbreviation/Comment: Visualizing dye for DNA quantification |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CGNP isolation |
| Poly-L-ornithine hydrobromide | Sigma Aldrich | P3655 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CPC culturing |
| Potassium chloride | Thermo Fisher | AM9640G | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: KCl, for CGM |
| Protease inhibitor | Roche | 4693159001 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For ChIP |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | 3115879001 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For ChIP |
| Qiagen MinElute | Qiagen | 28004 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: Kit for DNA purification |
| RNAse | Sigma-Aldrich | R6513 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For ChIP |
| SGC0946 | Selleckchem | S7079 | Category: DOT1L inhibition Abbreviation/Comment: For DOT1L inhibition in cell culture |
| Sodium bicarbonate | Carl Roth | 8551.1 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: for Elution buffer |
| Sodium chloride | Carl Roth | 9265 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: NaCl, for ChIP buffer |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For ChIP |
| Sodium dodecylsulfate | Carl Roth | 183 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: SDS, for ChIP |
| Sonic hedgehock (SHH) | Sigma-Aldrich | SRP6004 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CGNP isolation |
| Superoxide dismutase (1mg/ml) | Sigma-Aldrich | S7571 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CCM |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Carl Roth | 9090 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: TRIS, for ChIP buffer |
| Triton X-100 | Carl Roth | X100 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For ChIP buffer |
| Trypsin-EDTA 0,05% (w/v) | Sigma Aldrich | 59417C | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CPC isolation |
| Tween20 | Carl Roth | 28320 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For bead preparation |
| Other Lab devices: Neubauer counting chamber, Incubator, Rotator, Shaker, Disection set, Water bath | |||
| CCM: Cortical cell medium | |||
| CGM: CGNP cell culture medium |
References
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