Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Изоляция и выращивания взрослых крыс кардиомиоцитов

Published: October 19, 2017 doi: 10.3791/56634
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institute of Physiology, Justus Liebig University Giessen

Summary

Здесь мы представляем собой протокол для изоляции и выращивания взрослых крыс желудочков кардиомиоцитов (ARVC). Изолированные ARVC может использоваться для краткосрочной и долгосрочной перспективе выращивания. Изоляции и выращивания ARVC могут играть ключевую роль в разработке новых схем лечения сердечных заболеваний.

Abstract

В неповрежденной сердце смежные ячейки влияние взрослых кардиомиоцитов. С метод изоляции и выращивания взрослых кардиомиоцитов точное расследование поведения этих клеток под конкретные процедуры и сред возможен. Эта рукопись представляет собой протокол для успешной изоляции и выращивания взрослых крыс желудочков кардиомиоцитов (ARVC).

Крыса приносится в жертву шейки матки дислокации глубокой анестезию. Затем сердце извлекается и аорты открыт. Впоследствии перфузии на Langendorff перфузии системы с истощения кальция и коллагеназы лечение проводится. Впоследствии желудочковая ткани получает фарша, повторно распространяется и фильтруют, следуют три центрифугирования шаги с постепенным добавлением CaCl2 до концентрации физиологического кальция. ARVC покрытие на блюдах культуры клеток. После обновления среды культуры клеток, ARVC можно выращивать до шести дней без изменения сыворотки содержащих питательной среды. Изоляция ARVC является сложный процесс кальция. Небольшие изменения внутриклеточной концентрации кальция вызывает снижение качества и жизнеспособность изолированных клеток.

Свеже изолированные ARVC являются стержня в форме. В течение первых дней культивирования они теряют палочковидные морфологии и формы Псевдоподия подобных структур (распространения). При этом морфологическими формирования ARVC первоначально ухудшить их сократительная элементы следуют Реформации через актина стресс волокна и sarcomerogenesis de novo . После одной недели культивирования большинство ARVC показать широкое появление с явно обнаруживаемая крест полосе. Этот процесс является чувствительным к внутриклеточной концентрации кальция, как лечение с ionomycin ослабляет распространения. Ключевые маркеры в этом процессе де и повторно differentiation являются β-миозина тяжелой цепи (β-MHC), oncostatin М (OSM) и swiprosin-1 (EFHD2). Недавние исследования показали, что сердечная ре и де differentiation происходит в условиях культуры имитирует функции видели, в естественных условиях во время Ремоделирование сердца. Таким образом изоляции и выращивания ARVC играют ключевую роль в понимании биологии кардиомиоцитов.

Introduction

Взрослый кардиомиоцитов в естественных условиях работают как электрические синцития, основанный на ячейке контактов между миоцитов. Кроме того они находятся под влиянием соседних ячеек как сердечная фибробластов, эндотелиальных клеток, нейронов и воспалительные клетки1. С целью изучения кардиомиоцитов способность адаптировать их внутриклеточного Организации изменены условия нагрузки, как видно при гипертрофии сердца, что первый шаг приводит к сердечной недостаточности, изоляции и выращивания взрослых желудочков крыса кардиомиоцитов (ARVC) является необходимым2,3,4. Исторически кардиомиоцитов впервые были изолированы от зародышевых куриных сердец5,6. Несколько лет спустя, первый изоляции неизлечимо дифференцированной cardiomyocytes был описан с помощью истощения кальция7. Однако эти взрослые кардиомиоцитов были не кальция терпимая(ый) и поэтому могут не использоваться для функциональных анализов. Наконец в 1976 году новый протокол включен, Пауэлл и твист расследовать взрослых кардиомиоцитов желудочков при физиологических условиях8. В качестве первого шага они изолированы взрослых кардиомиоцитов под низким содержанием кальция концентрации и затем увеличение кальция физиологические концентрации в ступенчатой процедуры. Сегодня большинство протоколов для изоляции и выращивания взрослых кардиомиоцитов работать с настоящим Протоколом кальция и использовать коллагеназы для ферментативного пищеварения плотной ячеек контактов1.

Для успешного выращивания требуется плода телячьей сыворотки (FCS) или oncostatin М (OSM). ARVC выполняет де - и повторно - differentiation с обширной структурных изменений, включая Саркомер разборки и Реформации9,10,,1112. Этот процесс сопровождается повторного экспрессии генов плода типа, как тяжелые цепи β-миозина (β-MHC), как известно из гипертрофия и формирование Псевдоподия как структуры, также называемые распространяя4,,11, 13. Кроме того, swiprosin-1 (EFHD2), недавно выявленных белков, играет важную роль в процессе восстановления дифференциация культивируемых ARVC11. В результате ARVC в культуре превратить в широко распространенной, полиморфные клетки, которые спонтанно Показать схватки после двух-трех недель в культуре2,4,14.

Недавние открытия показали, что сердца ре и де differentiation как это происходит в условиях культуры имитирует особенности видели в естественных условиях при сердечной ремоделирования10,15. Ремоделирование сердца — это ключевой процесс во время болезни сердца16. Как сердечно-сосудистых заболеваний по-прежнему являются основной причиной смерти в промышленно развитых обществах, более глубокое понимание биологии взрослых кардиомиоцитов важно (который; 2015). Изоляции и выращивания ARVC может помочь в разработке новых стратегий и лекарства для лечения сердечных заболеваний. С этой рукописи предоставляется протокол для изоляции и выращивания ARVC. Кроме того в разделе обсуждение выделяются некоторые критические части данного метода.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

расследование проводится согласно руководству для ухода и использования лабораторных животных, опубликованных нами национального института здравоохранения (низ публикация № 85-23, редакция 1996). В целом крыс Вистара мужчин в возрасте от 3 до 4 месяцев и с средний вес 250-350 g используются для этого протокола. Одно сердце крысы является достаточным для 20 культуры блюд (1 мл на блюдо, внутренний диаметр: 35 мм) с плотностью приблизительное клеток 1,5 х 10 4 клетки/1000 мм-2.

1. Подготовка СМИ и реагентов

  1. креатин карнитин таурина среднего (ЧМТ средней)
    Примечание: CCT среднего является средством сложные, основанные на среде 199 с добавлением карнитин, креатин и таурин.
    1. Подготовить 1 Л среде 199: добавить 3.6 g Hepes и смеси на 1 ч. Затем добавьте 655.5 мг Креатин (5 мм), карнитин 395.4 мг (2 мм) и 625.5 мг таурина (5 мм). Карнитин и таурина изменить рН для < 7. Для того, чтобы препятствовать росту любой загрязняющих ячеек, например эндотелиальных клеток и фибробластов, добавьте 10 мкм цитозина β-D-arabinofuranoside на носитель. Отрегулируйте пэ-аш с NaOH (2 мм) фильтр 7.4 и стерильной среды. Хранить средство CCT на 4 ° C.
  2. Пауэлл среднего
    1. за 1 Л Пауэлл средний, растворить 6,43 г NaCl (110 мм) с 0,19 г KCl (2,5 мм), 0,16 г х 2 PO 4 (1,2 мм), 0,3 г MgSO 4 7 H 2 O (1,2 мм), 5.96 g Hepes (25 мм) и 1,98 g D (+ )-Глюкозы моногидрата (10 мм) в Aqua стерильные. Отрегулируйте пэ-аш с NaOH (2 М) фильтр 7.4 и стерильной среды. Средний магазин Пауэлл на 4 ° C.
  3. Кальция хлорид (2 CaCl)
    1. приготовляют раствор 100 мм CaCl 2 (50 мл) и подготовить аликвоты, содержащий 500 мкл CaCl 2. Заморозить аликвоты при -20 ° с.
  4. Приготовления питательной среды
    1. подготовить три клетки культуры средах: Предварительное покрытие среднего, обшивка средних и стиральные среднего. CCT среды можно используйте в качестве основы для всех трех сред (Таблица 1). Рассчитайте средний ЧМТ с 1 мл на культуры блюдо. Таким образом, подготовить 20 мл ЧМТ средней для 20 культуры блюд (внутренний диаметр: 35 мм).
    2. Клетки культуры пластин: Пальто каждой пластины культуры клеток (внутренний диаметр: 35 мм) с 1 мл Предварительное покрытие среднего. Хранить пластины с покрытием при 37 ° C на ночь или по крайней мере 2 часов перед использованием.

2. Изоляция от взрослых кардиомиоцитов

  1. перфузии системы подготовки Langendorff
    1. тепла покрытия средних и стиральные среднего до 37 ° C. размораживать трубки 500 мкл CaCl 2 и весят в 25 мг коллагеназы.
    2. Флеш Langendorff перфузии системы с aqua стерильные, потом пусть Пауэлл среднего распространить систему для 5 минут
    3. Заполнения Langendorff перфузии системы с 80 мл Пауэлл среднего, без воздушных пузырьков и газ в среду с 95% кислорода.
    4. Подготовить трубку (50 мл) с 40 мл средний Пауэлл, нагреть ее до 37 ° C и газа с 95% кислорода.
    5. Подготовить нить длиной около 25 см для крепления удалены сердце канюли.
    6. Обезжирить лезвием бритвы с алкоголем (70% по объему) и закрепите его на вертолете. Хомут пластиковый диск в измельчитель.
  2. Экстракции сердца
    1. анестезировать мужской wistar Крыса с 4% до 5% изофлюрановая и пожертвовать его с шейки матки дислокации. Откройте живота позади реберной дуги с брюшной сдвига и с же пара ножницами, вырезать через диафрагму, чтобы открыть грудной полости.
    2. Удаления сердца, легких и тимуса, резки выше тимуса высоко черепа в грудной полости. Немедленно передать ледяной физиологическим раствором материала.
    3. Удалить легких и тимуса из сердца с рассечения ножниц (большой) и по фиксирующий материал капсулы пинцетом, передать последний новый физиологический раствор.
  3. Изоляции
    1. удаления избыточной ткани, как остатки тимуса, трахеи, жира и соединительной ткани из сердца с помощью капсула щипцы и рассечения ножниц (большие или малые). Раскрыть аорты и разорвать его рассечения ножниц (большие или малые) между первой и второй жаберных arch.
    2. Начать капать Langendorff перфузии системы. Сердце на канюля Langendorff перфузии системы и фиксировать его сначала с Зажим крокодил и позднее с подготовленной потоком. Промойте сердце до тех пор, пока это бесплатно крови.
    3. 25 мг коллагеназы в 5-6 мл теплой среде Пауэлл растворить и добавить 12,5 мкл CaCl 2 (30 мкм).
    4. Закройте циркуляции, перемещая стекло воронки, который связан с системой Langendorff перфузии, через сердце капает и добавьте выполнено коллагеназы перфузии системы. Запустите перфузии для 25 мин с 1 капля в секунду скорость падения.
      Примечание: Во время перфузии, сердце будет набухать и получить вид восковой.
    5. Остановить перфузии после 25 минут и удалите сердце из Langendorff перфузии системы. Удаление аорты, предсердиями и соединительной ткани из сердца и открыть правого и левого желудочков.
    6. Чоп сердце два раза под углом 90 ° (Ширина вырезывания: 0.7 мм; скорость: 0,15 см/сек). Повторите этот процесс вручную с двумя скальпели для 10 s каждая сторона.
    7. Передача 12 мл перфузии среды в новой трубки (50 мл). Залить суспензии клеток в этой среде и дайджест клетки еще пять минут при 37 ° C. Mix решение каждую минуту.
    8. Фильтр решение с переваривается сердца через нейлоновая сетка (200 мкм) в новой трубки (50 мл).
    9. Центрифуга отфильтрованных решение на 29 g x 3 мин удалить супернатант и добавить 6 мл теплой Пауэлл среднего включая 12,5 мкл CaCl 2 (250 мкм) клетки Пелле. Ресуспензируйте Пелле через гладкой пожимая движения. Центрифуга снова на 29 g x 2 мин удалить супернатант и добавить 6 мл теплой Пауэлл среднего замещенных с 25 мкл CaCl 2 (500 мкм). Растворяют гранулы клетки через нежный пожимая движения и добавить 12 мл теплой Пауэлл средних включая 120 мкл CaCl 2 (1 мм). Центрифуги для в третий раз в 16 x g за 1 мин. Опять же, удалить супернатант.
    10. Смесь гранул ячейки с подогретым обшивка среднего.
    11. Удаление Предварительная обшивка среднего из культуры пластин. Передача 1 мл, обшивка среднего, включая изолированных cardiomyocytes, для каждой культуры пластины. Инкубировать свежие изолированных cardiomyocytes при 37 ° C за 1 ч.
    12. Удалить средство покрытия из культуры пластин. Добавьте 1 mL, мытье среднего для каждой культуры пластины и хранить пластины при 37 ° C до шести дней без изменения среднего.
    13. Для изучения влияния различных химических веществ и лечения на ARVC, сначала обновить обшивка среднего мытья среднего и затем добавив различных химических веществ.
      Примечание: Оценки с световой микроскопии: С каждой ячейки подготовка 150 до 300 кардиомиоцитов должно контролироваться в день световой микроскопии. Разделить все подсчитано кардиомиоцитов в группы согласно их внешний вид (например, " палочковидные ", " раунд вниз ", " распространение ", и " необычный внешний вид "). Категория " распространение " включает в себя все кардиомиоцитов с Псевдоподия подобных структур. " Необычный внешний вид " включает в себя все ARVC с Неровная поверхность и не поддающиеся обнаружению нетронутыми клеточной мембраны.

3. Пример Эксперименты

    1. Анализ морфологической и структурные преобразования ARVC во время культивирования Конфокальная лазерная микроскопия флуоресцирования/иммунофлюоресценции окрашивание взрослых кардиомиоцитов. Использовать Фаллоидин-TRITC для изучения F-актина структуры в " палочковидные ", " раунд вниз ", и " распространение " ARVC. Выполняют окрашивание по заявлению производителя ' протокол s. Пример для окрашивания Фаллоидин-TRITC приводится в справочнике Нипперт и др. 11. с флуоресцентным/иммунофлюоресценции окрашивание, различия в де - и повторно - differentiation сократительная аппарата в культивируемых взрослых кардиомиоцитов между экспериментальные методы лечения (например, с Swiprosin-1, ionomycin) могут расследоваться.
  2. В реальном времени количественного RT-PCR (qRT ПЦР)
    1. выполняют qRT ПЦР для изучения изменений в выражение mRNA различных генов (например, OSM, Swiprosin-1, β-MHC) во время выращивания ARVC. Для достаточного размера выборки, используйте большие блюда культуры (внутренний диаметр: 60 мм) с объемом 2 мл. ARVC пять блюд культуры дает один образец. Выполнение изоляции мРНК и трансформация cDNA, по словам производителя ' протокол s.
  3. Immunoblot методы
    1. выполнения западных помарок для изучения изменений в выражении протеина (например, для Swiprosin-1) во время выращивания ARVC. Использование одной культуры блюдо (1 мл) на сэмпл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Взрослый кардиомиоцитов в культуре: Рисунок 1 показывает обзор свежевыделенных взрослых кардиомиоцитов 2 ч после последней промывки. Приблизительно 75% всех cardiomyocytes был палочковидные морфологии. Оставшиеся 25% показали необычный внешний вид с круглой морфологии и не обнаруживаемых нетронутыми клеточной мембраны (рис. 1). В конце выращивания (день 6), до 15% всех кардиомиоцитов показали распространения, около 10% оставался в круглой морфология без Псевдоподия как структуры, и 75% всех кардиомиоцитов представил необычный внешний вид с Неровная поверхность и без Обнаруживаемая нетронутыми клеточной мембраны (данные не показаны).

Figure 1
Рисунок 1: обзор свежевыделенных крыса кардиомиоцитов. В среднем 75% кардиомиоцитов, составил часть свежевыделенных кардиомиоцитов, который показал палочковидные морфологии. Оставшиеся 25% клеток представил необычный внешний вид с Неровная поверхность и не поддающиеся обнаружению нетронутыми клеточной мембраны. Запись была проведена световой микроскопии 2 ч после мытья свежевыделенных кардиомиоцитов. Световой микроскопии 2 крат. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

С световой микроскопии свежевыделенных ARVC появился в форме стержня и около 100 мкм в размер (рисунок 2A). Свеже изолированные ARVC, что контракт спонтанно не были терпимая(ый) кальция. Все ячейки, которые были круглые и без обнаружению нетронутыми клеточной мембраны были повреждены и не жизнеспособным (рисунок 2A-B). В последующие дни большинство из стержня в форме ARVC потеряли этот морфологии. Клетки получил округлые с обнаруживаемыми нетронутыми клеточной мембраны. Эти ARVC были жизнеспособными. Начиная день три последних клеток формируется Псевдоподия подобных структур. Некоторые из этих ARVC держали их округлый внешний вид во время распространения (рис. 2B). Другие превращается в квартиру, полиморфных ARVC (рис. 2B).

Figure 2
Рисунок 2: изолированные крыса кардиомиоцитов. (A) свежевыделенных ARVC были обычно палочковидные. (B) после шести дней в культуре, Псевдоподия подобных структур (распространение) были явно обнаруживаемая в настоящее время округлые ARVC. Некоторые ARVC полностью изменили широко морфологии. ARVC с необычной внешностью отображается неровная поверхность и не поддающиеся обнаружению нетронутыми клеточной мембраны. Световой микроскопии 10 крат. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Свеже изолированные ARVC были обычно стержня в форме с отчетливо видна крест полосе (рис. 3, день 0). В последующие дни в культуре были отмечены изменения в морфологии клеток. Во-первых ARVC потерял все свои сократительных элементов (рис. 3, дней 1 и 2). Это последовало Реформации, подразумевающие sarcomerogenesis de novo . Реформация предшествовало формирование Псевдоподия подобных структур (распространение, рис. 3, 3 дней до 6). De novo sarcomerogenesis началось с появлением актина стресс волокон (рис. 3, 3 дня). Кроме того актина расслоения появились в регионе perinuclear и сформировали недавно собрал sarcomeres (рис. 3, дней 4 и 5). Последний росли вдоль волокон стресс преформированных актина в периферии (рис. 3, 6 день). В конце периода культивирования (день 6a) наблюдалась типичная крест полосе от недавно собрал sarcomeres в распространении ARVC.

Figure 3
Рисунок 3: пятнать флуоресцирования. Де - и повторно - differentiation из ARVC в культуре с 20% FCS показано. Свеже изолированных ARVC с их типичный род формы (день 0) стали круглые унижающего достоинство sarcomeres в первые дни культуры (1 день). Они потеряли все их сократительная элементы (день 2) следуют формирования Псевдоподия подобных структур (распространение; 3-5 дней) и последующего реформирования их сократительных элементов, указав sarcomerogenesis de novo (день 6). В день шесть в культуре, крест полосе был явно обнаруживаемая снова (день 6a). Окрашивание с Фаллоидин-TRITC по данным производителя протокол; «стрелки»: Псевдоподия как структуры (пример показан); *: актина связки в регионе perinuclear (образцовый показано). Части этой фигуры публикуются в11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4 показывает кинетической распространения процесса во время выращивания. Фракция ARVC, показывая Псевдоподия подобных структур на каждом экспертизы дается как распространение в % (рис. 4). Распространяя начал вокруг дней три и увеличение постоянно во время выращивания. 14,7% ± 1,39% всех сосчитанный ARVC показал Псевдоподия как структуры после шести дней в выращивании.

Figure 4
Рисунок 4: распространение кинетические увеличения кардиомиоцитов с Псевдоподия подобных структур нормированы все подсчитано кардиомиоцитов (распространение в %) в течение шести дней культивирования времени (n = 33 ячейки препараты). Данные представлены как средства ± SEM. Эта цифра публикуется в11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Эффект ionomycin на распространение ARVC: Изоляции и выращивания ARVC является1,кальция в сложный процесс8. Лечение ARVC с ionomycin (1 мкм), который увеличивает внутриклеточной концентрации кальция, вызвал значительное снижение (p ≤0.01) в формировании Псевдоподия подобных структур, по сравнению с элементами управления (рис. 5). При сравнении непосредственно, 17.19% ± 2,45% всех сосчитанный ARVC показал распространение контрольных условиях, но лишь 9,87% ± 2,77% всех сосчитанный ARVC формируется Псевдоподия как структуры в присутствии ionomycin (6 день выращивания). Таким образом ionomycin сократилось, распространяя на 42,58%.

= «jove_content» fo:keep-together.within-страницы = «1» >Figure 5
Рисунок 5: распространение кинетики под лечение с ionomycin. Лечение с ionomycin (1 мкм) в день 0 вызвало весьма значительное сокращение в ячейке распространение по сравнению с контролем. Данные представлены как средства ± SEM; n = 4 ячейки препаратов; Манна-Уитни-U испытания; * p ≤0.05; ** p ≤0.01 пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Кроме того ionomycin увеличилась доля ARVC с необычной внешностью, по сравнению с условиями управления (рис. 6). В день шесть, 71.11% ± 4,65% всех насчитал ARVC, лечили ionomycin, показан необычный внешний вид. Однако в условиях контроля, только 51,35% ± 3,55% ARVC были классифицированы в этой группе.

Figure 6
Рисунок 6: ARVC с нездоровый вид. Лечение с ionomycin (1 мкм) в день 0 вызвало значительное увеличение числа ARVC, который показал необычный внешний вид. В день 6 разница между элементом управления и ARVC, с ionomycin был значительным. Данные представлены как средства ± SEM; n = 4 ячейки препаратов; Манна-Уитни-U испытания; * p ≤0.05 пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

В день 3 культивирования, при лечении с ionomycin qRT ПЦР выявили снижение экспрессии мРНК β-MHC (p ≤0.01) и OSM, которые играют определенную роль в де дифференциация ARVC (Рисунок 7а и C). Swiprosin-1, маркер для повторного дифференциации ARVC был значительно downregulated, тоже (рис. 7B).

Figure 7
Рисунок 7: Де - и повторно - differentiation из культивируемых ARVC под лечение с ionomycin
(1 мкм) в день 0 вызвало снижение мРНК выражение oncostatin М (OSM) и β-MHC, которые оба играют ключевую роль в де дифференциация взрослых кардиомиоцитов. Кроме того выражение mRNA Swiprosin-1, ключевым игроком в повторной дифференциация взрослых кардиомиоцитов, также уменьшился на ionomycin лечения. День 3 выращивания; Данные представлены как средства ± SEM; n = 30 пластин ячейки культуры каждой группы; Манна-Уитни-U испытания; * p ≤0.05; ** p ≤0.01 пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Предварительное покрытие среднего
20 мл ЧМТ средней
2% vol. пенициллина/стрептомицина (400 мкл)
4% vol. FCS (800 мкл)
Обшивка среднего
20 мл ЧМТ средней
2% vol. пенициллина/стрептомицина (400 мкл)
Стиральная среднего
20 мл ЧМТ средней
2% vol. пенициллина/стрептомицина (400 мкл)
Примечание: 4% Vol. FCS в среде предварительного покрытия могут быть заменены 1 Vol.-% Ламинин (0,5 мкг/см2). Кроме того для выращивания кардиомиоцитов несколько дней добавьте 20 Vol.-% FCS Стиральная среднего. Хранить покрытия средних и стиральные среднего по 4-8 ° C до использования.

Таблица 1: Культура СМИ используются для изоляции cardiomyocyte

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Поведение взрослых кардиомиоцитов в vivo находится под влиянием многих взаимодействия с другие ячейки (например, нейроны, эндотелиальных клеток, фибробластов, воспалительных клеток) и электрические синцития, который они формируют1. Таким образом изучая стресс адаптация взрослых кардиомиоцитов исключительно требует изоляции и выращивания ARVC. Основные эффекты изоляции и выращивания ARVC: 1) отключения их от внеклеточного матрикса и ячеек контактов; 2) отключения их от сократительной раздражителей; 3) вынуждены адаптировать от трехмерные ткани для двумерных окрестности. В этих условиях ARVC начать де и повторно differentiation как описано выше и выполнить несколько адаптации, которые также видели во время сердечного ремоделирования в vivo (β-адренорецепторов десенсибилизации, сборка sarcomeres и т.д.) 4. Таким образом, изоляция взрослых кардиомиоцитов представляет действительный метод расследовать эти клетки и их реакции на различные виды лечения. Эти идеи могут впоследствии использоваться для в естественных условиях экспериментов, которые поможет избежать ненужных экспериментов и сокращения числа подопытных животных. Конечно некоторые выводы, которые видели в vitro будет не происходит в естественных условиях (например, формирование Псевдоподия подобных структур). Существующие клетки клетки контакты в рамках электрических синцития будет препятствовать чрезмерному росту при физиологических условиях17. Тем не менее изолированные и культивируемых ARVC может использоваться для изучения поведения взрослых кардиомиоцитов. Кроме того первые испытания новых стратегий лечения против сердечно-сосудистых заболеваний в организме человека могут проводиться с ARVC.

Описан метод для изоляции и выращивания взрослых кардиомиоцитов содержит некоторые критические точки. Для получения успешных результатов, следующие пункты должны быть рассмотрены.

1. кальция терпимости: исторически, кальция терпимость взрослых cardiomyocytes был одним из наиболее важных факторов, ведущих к успешной изоляции и выращивания взрослых кардиомиоцитов1,7, 8. в настоящее время, протоколы устанавливаются для обеспечения выращивания под физиологических кальция условия1,3. Этот манускрипт показывает влияние изменения внутриклеточной концентрации кальция на качество изолированных ARVC. Ionomycin, который увеличивает концентрацию внутриклеточного кальция, вызвал значительное снижение в распространении и значительное увеличение числа кардиомиоцитов с необычной внешностью. Кроме того, это вызвало Даунрегуляция ключевых маркеров для сердца де и повторно differentiation: β-MHC, OSM и Swiprosin-1. Таким образом изменения внутриклеточной концентрации кальция во время выращивания препятствует ARVC возможность приспособиться к новой среде. Хотя некоторые ARVC смогли распространения и адаптации (9,87% ± 2,77% всех сосчитанный ARVC; Рисунок 5), расследование Точная ARVC в этих условиях невозможно. Следовательно для точного изоляции и выращивания ARVC следует использовать протокол установленного кальция. Кроме того следует обеспечить, что ни один из обследованных лечения вмешиваться кальция гемостаз ARVC.

2. коллагеназы: доступны различные пакеты коллагеназы. Каждый пакет показывает различия в качестве и эффективности1. Таким образом авторы рекомендуют заказа и тестирование образцов различных партий. Кроме того время пищеварения и количество коллагеназы каждой новой партии использовать потребности оцениваются отдельно. Соответственно концентрация и время пищеварения в протоколе описаны могут незначительно отличаться для других протоколов.

3. время до перфузия сердца: для обеспечения высокого качества ARVC, время между извлечения из тела и началом перфузии с системой Langendorff сердце должно быть как можно более коротким. Длительное время вызывает повреждение к сердцу и приводит в большее количество нежизнеспособных ARVC.

Кроме того потепление решения перфузии при перфузии и пищеварение на 5 минут после того, как измельчение ткань имеет важное значение для приносит хороший результат. Чтобы избежать ненужного ущерба биологической ткани, он должен обрабатываться тщательно небывало точках. Кроме того следует отметить, что лечение с OSM или более низкие концентрации FCS также позволяют ARVC де и повторно differentiate4,10,18,19. Однако без этих питательный лечения, ARVC вырожденный в течение нескольких дней2.

В заключение изоляции и выращивания ARVC является чувствительным методом, который предлагает множество возможностей для изучения поведения взрослых кардиомиоцитов исключительно.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Результаты показали являются частью докторской диссертации Franziska Нипперт.

Acknowledgments

Авторы благодарят Надин Woitasky и Питер волк для оказания технической помощи. Кроме того Авторы благодарят г-жа Клаудия Лоренц (медицинские писатель, ACCEDIS) за помощь в подготовке рукописи. Эта рукопись была финансово поддержана DFG (Schlu 324/7-1).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Langendorff perfusion system inhouse construction double-walled with a water
based heating system
Tissue chopper Mc Ilwain Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd.
Aortic Cannula, OD 1,8 mm inhouse construction
Abdominal shears Aeskulap BC772R
Capsule forceps Eickemeyer 171307
Dissecting scissor large Aeskulap BC562R
Dissecting scissor small Aeskulap BC163R
Mash with Polyamid Neolab 4-1413 mash size 200 μm
plastic disc Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd.
Collagenase Typ II Worthington LS004177

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schlüter, K. -D. Cardiomyocytes - Active Players in Cardiac Disease. , Springer International Publishing AG Switzerland. (2016).
  2. Piper, H. M., Probst, I., Schwartz, P., Hutter, F. J., Spieckermann, P. G. Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes. J. Mol. Cell. Cardiol. 14 (7), 397-412 (1982).
  3. Schlüter, K. -D., Schreiber, D. Adult ventricular cardiomyocytes: isolation and culture. Protein Tyrosine Kinases: From Inhibitors to Useful Drugs. Fabbro, D., McCormick, F. 290, Humana Press Inc. Totowa, NJ. 305-314 (2005).
  4. Eppenberger, M. E., et al. Immunocytochemical analysis of the regeneration of myofibrils in long-term cultures of adult cardiomyocytes of the rat. Dev. Biol. 130 (1), 1-15 (1988).
  5. Burrows, M. T. The cultivation of tissues of the chick-embryo outside the body. JAMA. 55 (24), 2057-2058 (1910).
  6. Cavanaugh, M. W. Pulsation, migration and division in dissociated chick embryo heart cells in vitro. J Exp Zool A Eco Genet Physiol. 128 (3), 573-589 (1955).
  7. Muir, A. R. Further observation on the cellular structure of cardiac muscle. J. Anat. 99, 27-46 (1965).
  8. Powell, T., Twist, V. W. A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium. Biochem. Biophys. Res. Com. 72 (1), 327-333 (1976).
  9. Schwarzfeld, T. Isolation and development in cell culture of myocardial cells of the adult rat. J. Mol. Cell. Cardiol. 13 (6), 563-575 (1981).
  10. Kubin, T., et al. Oncostatin M is a major mediator of cardiomyocyte dedifferentiation and remodeling. Cell Stem Cell. 9 (5), 420-432 (2011).
  11. Nippert, F., Schreckenberg, R., Hess, A., Weber, M., Schlüter, K. -D. The effects of Swiprosin-1 on the formation of pseudopodia-like structures and β-adrenoceptor coupling in cultured adult rat ventricular cardiomyocytes. PLoS ONE. 11 (12), e0167655 (2016).
  12. Moses, R. L., Claycomb, W. C. Disorganization and reestablishment of cardiac muscle cell ultrastructure in cultured adult rat ventricular muscle cells. J. Ultrastruct. Res. 81 (3), 358-374 (1982).
  13. Eppenberger-Eberhardt, M., Flamme, I., Kurer, V., Eppenberger, H. M. Reexpression of α-smooth muscle actin isoform in cultured adult rat cardiomyocytes. Dev. Biol. 139 (2), 269-278 (1990).
  14. Fedak, P. W., Verma, S., Weisel, R. D., Skrtic, M., Li, R. K. Cardiac remodeling and failure: from molecules to man (Part III). Cardiovasc. Pathol. 14 (3), 109-119 (2005).
  15. Leri, A., Kajstura, J., Anversa, P. Mechanisms of myocardial regeneration. Trends Cardiovasc. Med. 21 (2), 52-58 (2011).
  16. Cohn, J. N., Ferrari, R., Sharpe, N. Cardiac remodeling-concepts and clinical implications: A consensus paper from an international forum on cardiac remodeling. J. Am. Coll. Cardiol. 35 (3), 569-582 (2000).
  17. Alberts, B., et al. Molecular biology of the cell. , Garland Science Taylor and Francis Group. New York, NY. (2015).
  18. Pöling, J., et al. The Janus face of OSM-mediated cardiomyocyte dedifferentiation during cardiac repair and disease. Cell Cycle. 11 (3), 439-445 (2014).
  19. Decker, M. L., Behnke-Barclay, M., Cook, M. G., Lesch, M., Decker, R. S. Morphometric evaluation of the contractile apparatus in primary cultures of rabbit cardiac myocytes. Circ. Res. 69 (1), 86-94 (1991).

Tags

Медицина выпуск 128 Взрослый кардиомиоцитов кальция культуры клеток ionomycin крыса swiprosin-1 распространение
Изоляция и выращивания взрослых крыс кардиомиоцитов
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nippert, F., Schreckenberg, R.,… More

Nippert, F., Schreckenberg, R., Schlüter, K. D. Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (128), e56634, doi:10.3791/56634 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter