Summary
여기, 우리는 분리와 성인 쥐 심 실 cardiomyocytes (ARVC)의 재배에 대 한 프로토콜을 제시. 단기 및 장기 재배에 대 한 고립 된 ARVC는 사용할 수 있습니다. 분리와 ARVC의 재배는 심장 질환에 대 한 새로운 치료 regimens 개발에 중요 한 역할을 재생할 수 있습니다.
Abstract
그대로 마음에 인접 한 셀 성인 cardiomyocytes 영향. 격리의 방법 및 성인 cardiomyocytes의 경작, 및 특정 환경에서 이러한 셀의 동작의 정확한 조사 가능 하다. 이 원고는 성공적인 격리와 성인 쥐 심 실 cardiomyocytes (ARVC)의 재배에 대 한 프로토콜을 제공합니다.
쥐 자 궁 경부 전위 깊은 마 취에 의해 희생 이다. 그런 다음 심장 추출 되 고 대동맥 적용 되지 않습니다. 그 후, 관류 칼슘 소모와 콜라 치료 Langendorff 관류 시스템에서 수행 됩니다. 나중에, 심 실 조직 되 면 다진, 다시 유통, 필터링, 생리 적인 칼슘 농도 도달할 때까지 점진적 추가 CaCl2 3 원심 분리 단계 뒤. ARVC 셀 문화 요리에 도금 된다. 세포 배양 후, ARVC 수 재배 최대 6 일 동안 혈 청에 포함 된 문화 매체를 변경 하지 않고. ARVC의 격리 칼슘 민감한 과정 이다입니다. 세포내 칼슘 농도 있는 작은 변화 일으킬 품질 및 고립 된 세포의 생존 능력에 있는 감소.
갓 절연 ARVC 막대 모양입니다. 재배의 첫 번째 일 이내 그들은 손실 막대 모양의 형태와 양식 pseudopodia 같은 구조 (확산). 이 형태 형성 동안 ARVC는 처음 이어서 걸 스트레스 섬유와 드 노 보 sarcomerogenesis 통해 개혁 그들의 수축 성 요소 저하. 재배의 1 주일 후 대부분 ARVC 명확 하 게 감지 크로스 줄무늬와 광범위 한 모습을 보여줍니다. 이 과정은 ionomycin와 치료 약하게 확산으로 세포내 칼슘 농도에 민감 하다. 이 과정을의 드-하 고 다시-differentiation 키 표식은 β myosin 무 겁 사슬 (β-MHC), oncostatin M (OSM), 및 swiprosin-1 (EFHD2) 있습니다. 최근 연구는 심장 개장 동안 기능 본 vivo에서 모방 심장 다시 de differentiation 발생 문화 조건 하에서 제안 했다. 따라서, 절연 및 ARVC의 재배 cardiomyocytes의 생물학 이해에 중요 한 역할을 재생 합니다.
Introduction
Vivo에서 성인 cardiomyocytes는 전기 syncytium myocytes 사이 셀 연락처를 기반으로 작동 합니다. 또한, 그들은 심장 섬유 아 세포, 내 피 세포, 신경 세포, 염증 세포1같은 인접 한 세포에 의해 영향을 받습니다. 초기 단계를 선도 하 고 심장 마비, 분리와 성인 심 실 쥐의 심장 비 대, 동안 본 부하 조건 변경 cardiomyocytes의 능력을 그들의 세포내 조직 적응을 공부 하기 위하여 cardiomyocytes (ARVC)는 필요한2,,34. 역사적으로, cardiomyocytes가 했다 미 발달 병아리 마음5,6에서 격리 된 처음. 몇 년 후, 말기 차별화 cardiomyocytes의 첫 번째 절연 칼슘 고갈7을 사용 하 여 설명 했다. 그러나, 이러한 성인 cardiomyocytes 칼슘 허용 되었고 따라서 하지 사용 될 수 있는 기능 분석 실험. 마지막으로, 1976 년에 새로운 프로토콜 활성화 파월과 트위스트 생리 조건8에서 성인 심 실 cardiomyocytes 조사. 첫 번째 단계로 서, 그들은 낮은 칼슘 농도 및 생리 적인 농도 단계적 절차에서 그 후 증가 칼슘 성인 cardiomyocytes 고립. 오늘, 분리와 성인 cardiomyocytes의 재배에 대 한 대부분의 프로토콜이 칼슘 프로토콜을 사용 하 고 조밀한 셀 연락처1의 효소 소화에 콜라를 사용 합니다.
성공적인 재배 송아지 태아 혈 청 (FCS) 또는 oncostatin M (OSM)가 필요 합니다. ARVC 수행는 데-그리고 다시-differentiation sarcomere 해체와 개혁9,10,,1112를 포함 하 여 광범위 한 구조 변경 합니다. Β-myosin 무거운 체인 (β-MHC) 처럼 태아 형 유전자의 재 식이이 과정 동반 비, 및 pseudopodia 같은 구조, 퍼지는4,11, 이라고의 형성에서 알려진 13. swiprosin-1 (EFHD2), 새로 확인된 된 단백질 재배 ARVC11의 재 분화는 주요 역할을 수행 하는 또한. 그 결과, ARVC 문화에 광범위 하 게, 다형성 셀 문화2,4,14에서 2 ~ 3 주 후 저절로 수축을 표시 하는 변환.
최근의 발견을 심장 다시 de differentiation 모방 문화 조건 하에서 발생 하는 대로 본 기능 vivo에서 심장 개장10,15동안 밝혀졌다. 개장 하는 심장 심장 질환16동안 핵심 과정 이다. 심장 질환은 여전히 산업화 사회에서 죽음의 주요 원인, 성인 cardiomyocytes의 생물학의 더 나은 이해 중요 하다 (누가, 2015). 절연 및 ARVC의 새로운 전략 및 심장 질환의 치료에 대 한 의약품 개발을 도울 수 있다. 이 원고와 분리와 ARVC의 재배에 대 한 프로토콜을 제공 합니다. 또한,이 방법의 몇 가지 중요 한 부분 토론 섹션에서 강조 표시 됩니다.
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Protocol
조사 관리 및 사용의 실험실 동물은 미국 국립 보건원 (NIH 간행물 번호 85-23, 개정 1996)에 의해 출판에 대 한 가이드에 따라 실시 됩니다. 일반적으로, 남성 wistar 쥐 3 ~ 4 개월을 세 고 250-350 g의 평균 무게와 더불어이 프로토콜에 대 한 사용 됩니다. 한 쥐 마음은 20 문화 요리에 대 한 충분 한 (접시 당 1 mL; 내부 직경: 35mm) 10 4 셀/1000 m m 2 x 1.5의 대략적인 셀 밀도와.
1. 미디어의 준비 및 시 약
- Creatine-carnitine-황소자리 매체 (CCT 매체)
참고: CCT 매체는 매체 199 creatine, carnitine, 그리고 황소자리의 추가 따라 복잡 한 매체 이다.- 매체 199의
- 준비 1 L: 3.6 g Hepes, 1 시간에 대 한 믹스에 추가. 다음 655.5 mg creatine (5mm), 395.4 mg carnitine (2mm), 625.5 mg 황소자리 (5 m m)를 추가 합니다. Carnitine와 황소자리에 pH를 변경 < 7. 어떤 오염 셀, 예를 들면 내 피 세포 또는 섬유 아 세포의 성장을 억제 하기 위해 매체에 10 µ M 시 토 신 β-D-arabinofuranoside를 추가 합니다. 7.4 및 살 균 필터 매체를 NaOH (2 mM)와 pH를 조정 합니다. CCT 매체 저장 4 ° c.
- 파월 매체
- 1 L 파월 매체에 대 한 해산 6.43 g NaCl (110mm) 0.19 g KCl (2.5 m m), 0.16 g KH 2 포 4 (1.2 m m), 0.3 g MgSO 4 7 H 2 O (1.2 m m), 5.96 g Hepes (25 m m), 그리고 1.98 g (+ D )-아쿠아 살 균에서 포도 당 monohydrate (10 mM). 7.4 및 살 균 필터 매체를 NaOH (2 M)와 pH를 조정 합니다. 스토어 파월 매체 4 ° c.
- 칼슘 염화 물 (CaCl 2)
- 100mm CaCl 2 솔루션 (50 mL)을 준비 하 고 포함 된 500 µ L CaCl 2 aliquots를 준비. Aliquots-20에서 동결 ° c.
- 문화 매체의 준비
- 준비 3 셀 문화 매체: 매체, 도금 매체, 및 세척 매체 중 도금. CCT 매체를 사용 하 여 모든 3 개의 매체 (표 1)에 대 한 기준으로. CCT 매체 문화 접시 당 1 mL로 계산 합니다. 따라서, 20 문화 요리 20 mL CCT 매체를 준비 (내부 직경: 35mm).
- 셀 문화 접시: 각 셀 문화 플레이트 코트 (내부 직경: 35mm) 사전 도금 매체 1 mL와 함께. 사용 하기 전에 적어도 2 시간 또는 하룻밤 37 ° C에서 코팅된 판 저장.
2. 성인 Cardiomyocytes의 절연
- Langendorff 준비 관류 시스템
- 열 도금 매체 및 세척 매체 37 ° C. Defreeze 500 µ L CaCl 2의 튜브와 콜라의 25 mg에 무게.
- 플러시 Langendorff 관류 시스템과 아쿠아 살 균, 이후에 파월 중간 5 분에 대 한 시스템을 순환 하 게
- Langendorff 관류 시스템을 80 mL 파월 매체 채울 없이 어떤 공기 거품 및 가스 95% 산소 매체.
- 40 mL 파월 매체와 튜브 (50 mL)를 준비 하 고, 37 ° C에가 열 하 고 95% 산소 가스.
- 길이 약 25 ㎝의 스레드는 정 맥을 제거 마음을 연결에 대 한 준비.
- Degrease 면도날 알코올 (볼륨 70%) 하 고 헬기에 그것을 건다. 헬기에 플라스틱 디스크 클램프.
- 심장의 추출
- 4% ~ 5 %isoflurane 남성 wistar 쥐를 Anesthetize 하 고 자 궁 경부 전위와 희생. 늑 골 아치 뒤에 복 부는 복 부 전단으로 열고, 흉 강 여 다이어 프 램을 통해 잘라가 위의 동일한 쌍.
- 흉 강에 매우 두개골 thymus 위에서 절단 하 여 폐와 흉 선, 심 혼을 제거합니다. 얼음 처럼 차가운 소금물에 자료를 즉시 전송.
- 해 시저 (대형)와 심장에서 폐와 흉 선 제거 및 캡슐 집게와 자료를 편집증으로 전송 후자 새로운 염.
- 격리
- 캡슐 집게 해 시저 (크거나 작은)을 사용 하 여 심장에서 thymus, 기관, 지방, 결합 조직의 잔류물 처럼 과잉 조직을 제거. 대동맥을 폭로 하 고 첫 번째 및 두 번째 아가미 arch. 사이 해 시저 (크거나 작은)와 그것을 끊다
- 는 Langendorff 관류 시스템의 떨어지는 시작. Langendorff 관류 시스템의 정에 마음을 놓고 먼저 준비 스레드 나중 악어 클램프와 그것을 흥분 시키는. 그것은 혈액의 무료 때까지 마음을 린스.
- 25mg 콜라 5-6 mL 따뜻한 파월 매체에 녹이 고 12.5 µ L CaCl 2 (30 µ M).
- 는 떨어지는 마음 위에 Langendorff 관류 시스템과 연결 되어 유리 깔때기를 이동 하 여 순환 닫고 관류 시스템 해결된 콜라를 추가 합니다. 초당 1 방울의 드롭 속도 25 분 동안 관류 시작.
참고: 관류, 하는 동안 심장 팽창 되며 밀랍 모양의 얻을. - 25 분 후 관류를 중지 하 고 마음 Langendorff 관류 시스템에서 제거. 심장에서 대동맥, 심 방, 및 결합 조직 제거 하 고 오른쪽과 왼쪽 심 열.
- 잘라 두 번 90 °의 각도에서 심장 (절단 폭: 0.7 m m, 속도: 0.15 cm/s). 10 두 scalpels와 수동으로이 과정을 반복 s 각 면.
- 새 튜브 (50 mL)에 관류 매체의 12 mL를 전송합니다. 37 또 다른 5 분 동안이 매체 및 다이제스트 셀에 셀 슬러리를 붓고 ° C. 믹스 솔루션 매분마다.
- 새 튜브 (50 mL)에 나일론 메쉬 (200 µ m)를 통해 소화 마음으로 솔루션 필터.
- 원심 29 x g 3 분 삭제에 필터링된 솔루션은 상쾌한 고 12.5 µ L CaCl 2 (250 µ M) 셀 펠 릿을 포함 하 여 6 mL 따뜻한 파월 매체를 추가 합니다. 부드러운 진동 운동을 통해 펠 릿 resuspend 다시 2 분 삭제는 상쾌한 29 x g에서 원심을 6 mL 따뜻한 파월 매체 대체 25 µ L CaCl 2 (500 µ M)를 추가 합니다. 부드러운 진동 운동을 통해 셀 펠 릿을 녹이 고 12 mL 따뜻한 파월 중간 포함 120 µ L CaCl 2 (1 mM) 추가. 1 분 16 x g에서 3 시간 동안 원심 분리기. 다시는 상쾌한 제거.
- 미리 따뜻하게 도금 매체와 셀 펠 릿 혼합.
- 배양 배지에서 사전 도금 매체를 제거합니다. 전송 매체, 절연된 cardiomyocytes 각 문화 접시를 포함 하 여 도금 1 mL. 1 헤 37 ° C에서 신선한 절연된 cardiomyocytes 품 어
- 배양 배지에서 도금 매체를 제거합니다. 각 문화 접시를 세척 1 mL를 추가 하 고 매체를 변경 하지 않고 6 일 37 ° C에서 접시를 저장.
- 다른 화학 물질과 ARVC에 치료의 영향 조사, 먼저 매체를 세척 하 고 그 후 다른 화학 물질을 추가 하 여 도금 매체를 새로.
참고: 가벼운 현미경 검사 법 평가: 각 셀 준비, 150 ~ 300 cardiomyocytes 모니터링 해야 하루 가벼운 현미경 검사 법에 의해. 모든 계산된 cardiomyocytes 그들의 모양에 따라 그룹으로 세분화 (예를 들어, " 막대 모양 ", " 다운 라운드 ", " 확산 ", 및 " 특이 한 모양을 "). 카테고리 " 확산 " pseudopodia와 같은 구조를 가진 모든 cardiomyocytes 포함. " 특별 한 모양을 "는 불규칙 한 표면 가진 모든 ARVC 및 없음 감지 그대로 세포 막.
3. 예를 들어 실험
- 분석 형태학 및 구조 변환 ARVC의 공초점 레이저 현미경 검사 법에 의해 재배 중 형광/면역 형광 성인 cardiomyocytes의 얼룩. Phalloidin-TRITC를 사용 하 여 F-말라 구조 조사 " 막대 모양 ", " 다운 라운드 ", 및 " 확산 " ARVC. 제조 업체에 따라 얼룩 수행 ' s 프로토콜. Phalloidin-TRITC 얼룩에 대 한 예로 참조 Nippert 외에 주어진 11. 면역 형광 형광/얼룩과 차이에 드-하 고 다시-differentiation 재배 성인 cardiomyocytes 실험적 치료 (예를 들어,와 사이에서 수축 성 기구의 Swiprosin-1, ionomycin) 조사 수.
- 실시간 양적 RT-PCR (qRT-PCR)
- 다른 유전자의 mRNA 표현에서 변화를 조사 하기 위해 qRT-PCR을 수행 (예를 들어, OSM, Swiprosin-1, β-MHC) ARVC의 재배 중. 충분 한 샘플 크기에 대 한 더 큰 문화 요리 사용 (내부 직경: 60 m m) 2 mL 볼륨. 5 문화 요리 ARVC 한 샘플을 생성합니다. MRNA의 절연 및 변환 제조 업체에 따르면 cDNA의 수행 ' s 프로토콜.
- Immunoblot 기법
- 수행 서 몰아내고 단백질 식 (예를 들어, Swiprosin-1) ARVC의 경작 동안에 변화를 조사. 샘플 당 하나의 문화 접시 (1 mL)을 사용 하 여.
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Representative Results
문화에서 성인 cardiomyocytes: 그림 1 마지막 세척 후 갓 절연된 성인 cardiomyocytes 2 h에 대 한 개요를 보여 줍니다. 모든 cardiomyocytes의 약 75%는 막대 모양의 형태를 했다. 나머지 25%는 둥근 형태와 전혀 감지 그대로 세포 막 (그림 1) 특이 한 모습을 보여주었다. 최대 재배 (6 일)의 끝에 pseudopodia 같은 구조 없이 둥근 형태에 남아 약 10% 15% 모든 cardiomyocytes의 보여주 확산, 및 모든 cardiomyocytes의 75%는 불규칙 한 표면와 없이 특이 한 모습을 제시를 감지 그대로 세포 막 (데이터 표시 되지 않음).
그림 1: 신선 하 게 고립 된 쥐 cardiomyocytes의 개요. 막대 모양의 형태를 보여준 갓 격리 cardiomyocytes의 일부분은 평균 cardiomyocytes의 75%에 도달 했다. 셀의 나머지 25%는 불규칙 한 표면와 아무 감지 그대로 세포 막 특이 한 모습을 제시. 녹음 갓 격리 cardiomyocytes 세척 후 가벼운 현미경 2 h에 의해 실시 됐다. 가벼운 현미경 검사 법 2 배 확대. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
가벼운 현미경 검사 법, 갓 격리 된 ARVC는 막대 모양 및 크기 (그림 2A)에서 약 100 µ m 나타났다. 갓 절연 자발적 계약 ARVC 칼슘 허용 되지 않았습니다. 라운드와 감지 그대로 세포 막 없이 모든 세포 손상 되었고 하지 가능한 (그림 2A-B). 다음 일에 ARVC 모양 막대의 대부분이이 형태를 잃었다. 셀 있어 감지 그대로 세포 막으로 반올림 됩니다. 이 ARVC 가능한 했다입니다. 하루 3 후자 셀부터 pseudopodia 같은 구조 형성. 이러한 ARVC의 일부는 그들의 둥근된 모양 (그림 2B)를 확산 하는 동안 보관. 다른 평면으로 변환 다형 ARVC (그림 2B).
그림 2: 절연 쥐 cardiomyocytes. (A) 갓 격리 된 ARVC은 일반적으로 막대-모양. (B) 6 일 후에 문화, pseudopodia 같은 구조 (확산) 지금 둥근된 ARVC에서 명확 하 게 감지 했다. 일부 ARVC 광범위 한 형태학을 완전히 변경. 특이 한 모양으로 ARVC 표시는 불규칙 한 표면 없음 감지 그대로 세포 막. 가벼운 현미경 10 배 확대. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
갓 절연 ARVC 일반적으로 (그림 3, 0) 명확 하 게 보이는 크로스 줄무늬 모양 막대 했다. 셀 형태학에 있는 변화는 문화에서 다음 일 동안 관찰 되었다. 첫째, ARVC는 그들의 모든 수축 성 요소 (그림 3, 일 1, 2)를 잃었다. 이 데 노 보 sarcomerogenesis 연루, 개혁에 선행 되었다. 개혁 (확산, 그림 3, 6 일 3) pseudopodia와 같은 구조의 형성에 의해 선행 되었다. 드 노 보 sarcomerogenesis 걸 스트레스 섬유 (그림 3, 3 일)의 모습으로 시작 했다. 또한, 말라 번들 perinuclear 지역에 등장 하 고 새로 형성 sarcomeres (그림 3, 4 일 및 5) 조립. 후자의 성장 미리 형성한 걸 스트레스 섬유에 따라 (그림 3, 주 6) 주변으로. 재배 기간 (하루 6a) 끝에 확산에 새로 조립된 sarcomeres에서 전형적인 크로스 줄무늬 ARVC 관찰 되었다.
그림 3: 형광 얼룩. 데-그리고 다시-differentiation ARVC의 fcs가 20% 문화에 표시 됩니다. 갓 고립 된 그들의 일반적인 막대 모양 (0 일) ARVC 문화 (1 일)의 첫 번째 일 동안 sarcomeres 저하에 의해 라운드 되었다. 그들은 모든 그들의 수축 성 요소 (주 2) pseudopodia (확산; 구조로의 형성에 의해 따라 잃었다 3-5 일) 및 그들의 수축 성 요소를 나타내는 데 노 보 sarcomerogenesis (주 6)의 후속 개혁. 하루 6 문화에서, 크로스 줄무늬는 명확 하 게 감지할 수 다시 (하루 6a). 제조 업체의 프로토콜;에 따라 Phalloidin TRITC와 얼룩 "화살표": pseudopodia 같은 구조 (예제); *: perinuclear 지역에서 말라 번들 (모범적인 표시). 이 그림의 부분에 간행 된다11. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 는 재배 기간 동안 확산 과정의 운동 표시 됩니다. 시험의 각 시간에 pseudopodia와 같은 구조를 보여주는 ARVC의 분수 % (그림 4)에 확산으로 제공 됩니다. 확산 하루 3 시작 하 고 경작의 시간 동안 지속적으로 증가. 14.7 모든 계산된 ARVC의 % ± 1.39%는 경작에 있는 6 일 후 pseudopodia 같은 구조를 보여주었다.
그림 4: 재배 시간 6 일 동안 모든 계산된 cardiomyocytes (%에 확산)으로 정규화 pseudopodia 같은 구조와 cardiomyocytes에 운동 증가 확산 (n = 33 셀 준비). 데이터는 ± SEM.를 의미 하는 대로 표시 됩니다. 이 수치는11에 게시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
ARVC의 확산에 ionomycin의 효과: 분리와 ARVC의 재배는 칼슘 민감한 프로세스1,8입니다. 세포내 칼슘 농도 증가, ionomycin (1 µ M), ARVC의 치료는 컨트롤 (그림 5)에 비해 pseudopodia와 같은 구조의 형성에 중요 한 (p ≤0.01) 감소를 발생 합니다. 직접 비교, 17.19% ± 2.45% 모든 계산된 ARVC의 제어 조건 하에서 확산을 보여주지만 ionomycin (재배의 주 6)의 pseudopodia 모양의 구조를 형성 하는 모든 계산된 ARVC의 유일한 9.87% ± 2.77%. 따라서, ionomycin 42.58% 확산 감소.
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그림 5: ionomycin와 치료에서 속도 론 확산. 0에서 ionomycin (1 µ M)과 치료 제어에 비해 셀 확산에 매우 중요 한 감소를 발생 합니다. 데이터는 ± SEM; 의미 하는 대로 표시 됩니다. n = 4 셀 준비; 맨-휘트니 U 테스트; * p 0.05; * * p ≤0.01 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
또한, ionomycin 제어 조건 (그림 6)에 비해 특이 한 모습으로 ARVC의 비율을 증가 했다. 하루에 6, 모든 71.11% ± 4.65% ARVC ionomycin 특이 한 모습을 보여 치료를 계산. 그러나, 제어 조건 하에서 유일한 51.35% ± 3.55%는 ARVC의이 그룹에 분류 했다.
그림 6: 건강 하지 못한 모습으로 ARVC. 치료 ionomycin (1 µ M)를 0에서 특이 한 모습을 보여준 ARVC의 수가 크게 증가 발생 합니다. 6 일에 제어 및 ARVC ionomycin와 치료의 차이 중요 했다. 데이터는 ± SEM; 의미 하는 대로 표시 됩니다. n = 4 셀 준비; 맨-휘트니 U 테스트; * p 0.05 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
재배 ionomycin, 치료에서의 3 일에서 qRT-PCR 공개 mRNA 표현의 β-MHC (p ≤0.01)와 OSM, ARVC (그림 7A와 C)의 탈 분화에 뚜렷한 역할을 감소. Swiprosin-1, ARVC의 재 분화에 대 한 마커 크게 downregulated, 너무 했다 (그림 7B).
그림 7: 드-하 고 다시-differentiation ionomycin와 치료에서 경작된 ARVC의
(1 µ M) oncostatin M (OSM)의 하루 0 발생 감소 mRNA 표현 및 β-MHC, 모두 핵심 역할 성인 cardiomyocytes의 탈 분화에. 또한, Swiprosin-1, 성인 cardiomyocytes의 재 분화에 중요 한 선수의 mRNA 표정 또한 ionomycin 처리에 의해 감소 했다. 3 일 경작; 데이터는 ± SEM; 의미 하는 대로 표시 됩니다. n = 그룹; 당 30 세포 배양 배지 맨-휘트니 U 테스트; * p 0.05; * * p ≤0.01 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 중 도금 매체 |
| 20 mL CCT 매체 |
| 2 %vol. 페니실린/스 (400 μ) |
| 4 %vol. FCS (800 μ) |
| 도금 매체 |
| 20 mL CCT 매체 |
| 2 %vol. 페니실린/스 (400 μ) |
| 세척 매체 |
| 20 mL CCT 매체 |
| 2 %vol. 페니실린/스 (400 μ) |
| 참고: 사전 도금 매체에 4 %vol. FCS 1 Vol.-% laminin (0.5 μ g/c m2)으로 교체할 수 있습니다. 또한, 몇 일 동안 cardiomyocytes 양성을 위한 세척 매체 20 Vol.-% FCS를 추가 합니다. 사용 하 여까지 도금 매체 및 4-8 ° C에 의해 세척 매체를 저장 합니다. |
표 1: 문화 미디어 cardiomyocyte 격리 사용
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Discussion
성인 cardiomyocytes에 vivo에서 의 행동은 다른 셀 (예:신경 세포, 내 피 세포, 섬유 아 세포, 염증 세포)와 그들이 형성 하는 전기 syncytium 많은 상호 작용에 의해 영향을1. 따라서, 성인 cardiomyocytes의 스트레스 적응을 독점적으로 공부 해야 분리와 ARVC의 재배 합니다. 분리 하 고 ARVC를 재배의 주요 효과: 1) 기질과 셀 연락처;에서 그들을 분리 2) 수축 자극;에서 그들을 분리 3) 3 차원 조직에서 2 차원 환경에 적응 하도록 강요. 이러한 조건 하에서 ARVC 드와 다시 differentiation 위에서 설명한 대로 있고 또한 심장 개장 vivo에서 (β-adrenoceptor 둔감, 리어셈블리 sarcomeres, 등) 동안 본 여러 각 색 한을 수행 4. 따라서, 성인 cardiomyocytes의 이러한 셀 및 다른 치료에 그들의 응답을 조사 하는 유효한 방법을 나타냅니다. 이러한 통찰력은 실험에 대 한 vivo에서 , 불필요 한 실험을 피하 하 고 시험 동물의 수를 감소에 도움 것 이라고 이후에 사용할 수 있습니다. 물론, 일부 연구 결과 본 체 외에서 발생 하지 않습니다 vivo에서 (예를 들어, pseudopodia와 같은 구조의 형성). 기존 셀-셀-연락처 전기 syncytium 내에서 생리 적 조건17에서 과도 한 성장을 방해 합니다. 그럼에도 불구 하 고, 절연 및 재배 ARVC 성인 cardiomyocytes의 동작을 조사 하기 위해 사용할 수 있습니다. 또한, 인 간에 있는 심장 질환에 대 한 새로운 치료 전략의 첫 번째 재판 ARVC 함께 수행할 수 있습니다.
분리와 성인 cardiomyocytes의 재배에 대 한 설명된 방법에는 몇 가지 중요 한 포인트 포함 되어 있습니다. 성공적인 결과 얻으려면 다음 항목 간주 해야 합니다.
1. 칼슘 관용: 역사적으로, 성인 cardiomyocytes의 칼슘 허용 했다 성공적인 격리 및 성인 cardiomyocytes1,7, 의 가장 중요 한 요소 중의 하나 8. 요즘, 프로토콜 생리 적인 칼슘 조건1,3에서 재배 되도록 설정 됩니다. 이 원고는 고립 된 ARVC의 품질에 변경 된 세포내 칼슘 농도의 영향을 보여 줍니다. Ionomycin, 세포내 칼슘 농도 증가 하는 특이 한 모습으로 cardiomyocytes의 수에 확산에 상당한 감소와 상당한 증가 발생 합니다. 또한, 그것은 마커의 키 위한 심장 드-하 고 다시-differentiation downregulation 발생: β-MHC, OSM, 및 Swiprosin-1. 따라서, 새로운 환경에 적응 하는 ARVC의 기능 지장을 초래할 수 재배 중 세포내 칼슘 농도 변화. 비록 일부 ARVC 확산 하 고 적응할 수 있었다 (9.87% ± 2.77% 모든 계산된 ARVC; 그림 5) 이러한 조건 하에서 ARVC의 정확한 조사는 불가능합니다. 따라서, 정확한 절연 및 ARVC의 재배에 대 한 설립된 칼슘 프로토콜 사용 되어야 한다. 또한, 그것은 조사 처리 중 ARVC의 칼슘 hemostasis 방해가 보장 되어야 합니다.
2. 콜라: 콜라의 다른 배치가 있습니다. 각 일괄 처리 품질 및 효과1에서 차이 보여 줍니다. 따라서, 저자는 주문 하 고 다른 배치의 샘플 테스트를 권장 합니다. 또한, 소화와 각 새로운 배치의 콜라의 양이 시간 별도로 평가를 필요 사용. 따라서, 농도 및 시간 설명 하는 프로토콜에서 소화의 다른 프로토콜에 약간 달라질 수 있습니다.
3. 심장 관류까지 시간: ARVC의 높은 품질을 보장 하기 위해, 가능한 한 짧게 해야 몸과 Langendorff 시스템과 관류의 시작에서 마음을 추출 사이의 시간. 머리말 붙인된 시간 심장에 손상을 원인과 가능한 비 ARVC의 높은 숫자에 결과.
또한, 관류와 소화 후 좋은 결과 매우 저조한 필수적 이다 조직을 자르고 5 분 동안 관류 솔루션을 온난 화. 생물 학적 조직의 불필요 한 손상을 방지 하려면 그것은 모든 시간 지점에서 신중 하 게 처리 되어야 합니다. 또한, 그것은 그 치료 OSM 지적 한다 또는 FCS의 낮은 농도 또한 드와 다시 differentiate4,10,,1819ARVC을 활성화. 하지만, 하지 않고 이러한 영양 치료, ARVC2는 몇 일 이내 중복 제거.
결론적으로, 분리와 ARVC의 재배 독점적으로 성인 cardiomyocytes의 동작을 조사 하는 가능성의 다양 한 제공 하는 중요 한 방법입니다.
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Disclosures
표시 된 결과 프란체스카 Nippert의 박사 논문의 일부입니다.
Acknowledgments
작가 나 딘 Woitasky와 피터 볼 크 기술 지원에 대 한 감사. 또한, 저자는 원고를 준비 하 고 그녀의 도움에 대 한 부인 클 라우 디 아 로렌스 (의료 작가, ACCEDIS)을 감사 합니다. 이 원고 DFG (Schlu 324/7-1)에 의해 재정적으로 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Langendorff perfusion system | inhouse construction | double-walled with a water based heating system |
|
| Tissue chopper Mc Ilwain | Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd. | ||
| Aortic Cannula, OD 1,8 mm | inhouse construction | ||
| Abdominal shears | Aeskulap | BC772R | |
| Capsule forceps | Eickemeyer | 171307 | |
| Dissecting scissor large | Aeskulap | BC562R | |
| Dissecting scissor small | Aeskulap | BC163R | |
| Mash with Polyamid | Neolab | 4-1413 | mash size 200 μm |
| plastic disc | Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd. | ||
| Collagenase Typ II | Worthington | LS004177 |
References
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