Summary
在这里, 我们提出了一个分离和培养成年大鼠心室心肌细胞 (ARVC) 的协议。隔离 ARVC 可用于短期和长期种植。ARVC 的分离和培养可在开发新的心脏疾病治疗方案中发挥关键作用。
Abstract
在一个完整的心脏, 相邻的细胞影响成年心肌细胞。利用成人心肌细胞的分离和培养方法, 对其在特定的治疗和环境下的行为进行精确的研究是可行的。本论文提出了一种成功的成年大鼠心室心肌细胞 (ARVC) 的分离和培养方案。
大鼠在深麻醉下被宫颈脱位所牺牲。然后, 心脏被提取, 主动脉被发现。随后, 对共生灌注系统进行钙耗和胶原酶处理。随后, 心室组织得到切碎, 循环, 并筛选, 随后三离心步骤, 逐步增加 CaCl2 , 直到达到生理钙浓度。ARVC 被镀在细胞培养皿上。在对细胞培养基进行清爽后, ARVC 可在不改变含血清培养基的情况下培养六天。ARVC 的分离是一个钙敏感的过程。细胞内钙离子浓度的微小变化会导致分离电池的质量和生存能力下降。
新鲜地被隔绝的 ARVC 是杆形状。在耕种的第一天他们丢失了杆形状的形态学并且形成伪足象结构 (传播)。在这种形态学形成过程中, ARVC 最初降低其收缩元素, 然后通过肌动蛋白应力纤维和de 从头sarcomerogenesis 进行改革。经过一个星期的耕种, 大多数 ARVC 显示一个广泛的外观与一个明确的检测交叉条纹。这个过程是敏感的细胞内钙浓度, 作为治疗与 ionomycin 减弱传播。de-and re-differentiation 的关键标志是β-肌球蛋白重链 (β-MHC)、oncostatin M (OSM) 和 swiprosin-1 (EFHD2)。最近的研究表明, 在培养条件下发生的心脏 re-and de-differentiation 模仿心脏重塑过程中出现的体内的特征。因此, ARVC 的分离和培养在了解心肌细胞生物学方面起着关键的作用。
Introduction
成年心肌细胞在体内的工作, 作为一个电子合的基础上细胞细胞之间的联系。此外, 它们受邻近细胞的影响, 如心脏成纤维细胞、内皮细胞、神经元和炎症细胞1。为了研究心肌细胞适应其细胞内组织改变负荷状况的能力, 心肌肥厚是导致心力衰竭的最初步骤, 成年心室大鼠的分离和培养心肌细胞 (ARVC) 是必需的2,3,4。从历史上看, 心肌细胞首先从胚胎小鸡心脏中分离出来5,6。几年后, 首次分离的终末分化心肌细胞使用钙消耗7描述。然而, 这些成年心肌细胞不能耐受钙, 因此不能用于功能性化验。最后, 在 1976年, 一项新的协议使鲍威尔和扭转在生理情况下调查成年心室心肌细胞8。作为第一步, 他们在低钙浓度下分离成年心肌细胞, 然后在逐步的过程中增加钙对生理浓度。今天, 大多数用于分离和培养成年心肌细胞的协议与此钙协议一起使用, 胶原酶用于酶消化致密细胞-细胞接触1。
为成功的耕种, 胎儿小牛血清 (FCS) 或 oncostatin M (OSM) 是需要的。ARVC 执行 de-and re-differentiation 与广泛的结构变化, 包括肌拆卸和改革9,10,11,12。这一过程伴随着重新的胎儿型基因, 如β-肌球蛋白重链 (β-MHC), 如已知的肥大, 和形成的伪足样结构, 也称为传播4,11,13. 此外, swiprosin-1 (EFHD2), 一个新发现的蛋白质, 发挥了重要作用的过程中 re-differentiation 栽培 ARVC11。结果, ARVC 在文化中转化为广泛的多态细胞, 在培养的两个到三周后自发地出现收缩2,4,14。
最近的发现表明, 心脏 re-and de-differentiation, 因为它发生在文化条件下模仿功能在心脏重塑10,15期间看到的在体内。心脏重塑是心脏疾病的一个关键过程16。由于心脏疾病仍然是工业化社会的主要死亡原因, 对成人心肌细胞生物学的更好的了解是重要的 (卫生组织; 2015)。ARVC 的分离和培养有助于制定新的治疗心脏疾病的策略和药物。通过这份手稿, 为 ARVC 的分离和培养提供了一个协议。此外, 该方法的某些关键部分在讨论部分中进行了突出显示。
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Protocol
这项调查是根据美国国立卫生研究院 (NIH 出版物 No. 85-23, 修订 1996) 所出版的实验室动物的护理和使用指南进行的。通常, 雄性大鼠年龄在3到4月, 平均重量为 250-350 克, 用于本协议。一只老鼠的心脏是足够为20文化菜 (1 毫升每盘; 内径:35 毫米) 与近似细胞密度 1.5 x 10 4 cells/1000 mm 2 .
1. 培养基和试剂的制备
- 肌酸-肉碱-牛磺酸培养基 (cct 培养基)
注: cct 培养基是一种以培养基199为基础的复合肌酸、肉碱和牛磺酸的培养基。- 准备 1 L 中 199: 添加3.6 克 Hepes 和混合为 1 h。然后添加655.5 毫克肌酸 (5 毫米), 395.4 毫克肉碱 (2 毫米), 和625.5 毫克牛磺酸 (5 毫米)。肉碱和牛磺酸改变 pH 值和 #60; 7。为了抑制任何污染细胞的生长, 例如 内皮细胞或成纤维细胞, 增加10和 #181; M 胞嘧啶和 #946; d-arabinofuranoside 到培养基。调整 pH 值与氢氧化钠 (2 毫米) 到7.4 和无菌过滤器媒介。将 CCT 介质存储在4和 #176; C.
- 鲍威尔介质
- 为 1 L 鲍威尔介质, 溶解 6.43 g 氯化钠 (110 毫米) 与 0.19 g 氯化钾 (2.5 毫米), 0.16 克 2 PO 4 (1.2 mm), 0.3 g MgSO 4 7H 2 O (1.2 mm), 5.96 g Hepes (25 mm), 和 1.98 g D (+)-水中无菌的葡萄糖一水合物 (10 毫米)。用氢氧化钠 (2 米) 调节 pH 值 7.4, 无菌过滤介质。在4和 #176 存储鲍威尔介质; C.
- 氯化钙 (CaCl 2 )
- 准备 100 mM CaCl 2 解决方案 (50 mL), 并准备包含500和 #181 的等分; L CaCl 2 。在-20 和 #176 冻结等分; C.
- 准备培养基
- 准备三细胞培养基: 镀培养基、电镀介质和洗涤介质。使用 CCT 介质作为所有三介质的基础 ( 表 1 )。计算每个培养皿1毫升的 CCT 介质。因此, 为20培养皿准备20毫升 CCT 培养基 (内径:35 mm).
- 细胞培养板: 将每个细胞培养板 (内径:35 毫米) 与1毫升镀培养基涂层。将涂覆的盘子储存在37和 #176; C 隔夜或至少2小时前使用.
2。成人心肌细胞的分离
- 共生灌注系统的制备
- 热镀介质和洗涤介质到37和 #176; 解冻500和 #181 的管子; CaCl
- 2 , 重25毫克胶原酶.
- 冲洗共生灌注系统与 aqua 无菌, 事后让鲍威尔介质循环系统5分钟.
- 用80毫升鲍威尔培养基填充共生灌注系统, 不带任何气泡, 用95% 氧气将介质充气.
- 用40毫升的鲍威尔培养基制备试管 (50 毫升), 将其加热到37和 #176; C, 用95% 的氧气将其充气.
- 准备一个长度约25厘米的螺纹, 用于将卸下的心脏连接到套管.
- 脱脂的刀片与酒精 (70% 按体积) 和固定它的菜刀。将塑料盘夹入菜刀.
- 提取心脏
- 麻醉4% 到5% 异氟醚的雄性大鼠, 并将其与颈椎脱位一起牺牲。用腹式剪开腹部后侧的肋弓, 用同样的剪刀, 切开隔膜打开胸腔.
- 取出心脏, 连同肺和胸腺, 通过在胸腔上方切除胸腺高颅。立即将物料转移到 ice-cold 盐水溶液中.
- 从心脏取出肺和胸腺, 用解剖剪刀 (大) 和用胶囊钳固定材料, 将后者转移到新的盐水溶液中.
- 隔离
- 从心脏取出多余的组织, 如胸腺、气管、脂肪和结缔组织的残留物, 使用胶囊钳和解剖剪刀 (大或小)。发现主动脉和切断它与解剖剪刀 (大或小) 之间的第一和第二鳃弓.
- 启动共生灌注系统的滴水。将心脏放在共生灌注系统的套管上, 然后先用鳄鱼钳夹住它, 之后再用准备好的螺纹。冲洗心脏, 直到它没有血液.
- 溶解25毫克胶原酶在 5-6 毫升温暖鲍威尔培养基和添加12.5 和 #181; L CaCl 2 (30 和 #181; M).
- 关闭循环通过移动一个玻璃漏斗, 这是连接与共生灌注系统, 在滴水的心脏和添加解决胶原酶的灌注系统。开始灌注25分钟, 滴速为每秒1滴.
注: 在灌注过程中, 心脏会肿胀并出现蜡状. - 停止灌注25分钟后, 从共生灌注系统中取出心脏。从心脏中取出主动脉、心房和结缔组织, 并打开右心室和左侧脑室.
- 在90和 #176 的角度劈两次心; (切割宽度: 0.7 毫米; 速度: 0.15 厘米/秒)。手动重复此过程, 两个手术刀为十年代的每边.
- 将12毫升的灌注介质转换为新管 (50 毫升)。将细胞浆倒入这种培养基中, 再在37和 #176 消化细胞五分钟; c. 每分钟混合解决方案.
- 通过尼龙网 (200 和 #181; m) 将溶解的心脏过滤到一个新的管子 (50 毫升).
- 离心过滤解决方案在 29 x g, 3 分钟. 丢弃上清, 添加6毫升温暖的鲍威尔培养基, 包括12.5 和 #181; CaCl 2 (250 和 #181; M) 到细胞颗粒。通过平滑的震动运动重颗粒。再次离心 29 x g, 2 分钟丢弃上清, 加入6毫升暖鲍威尔培养基取代25和 #181; L CaCl 2 (500 和 #181; M)。通过轻柔的摇动动作溶解细胞颗粒, 加入12毫升温暖的鲍威尔培养基, 包括120和 #181; L CaCl 2 (1 mM)。离心第三次在 16 x g 为1分钟。再次, 清除上清.
- 将电池颗粒与5ml 电镀介质混合.
- 从区域性板中删除镀介质。转移1毫升电镀介质, 包括分离的心肌细胞, 到每个培养板。在37和 #176 孵育新鲜分离的心肌细胞; C 为 1 h.
- 从培养皿中取出电镀介质。在每种培养基上加入1毫升洗涤培养基, 并在37和 #176 中储存板材; C 最多六天, 不改变培养基.
- 用于调查不同化学品和处理对 ARVC 的影响, 首先通过洗涤介质来刷新电镀介质, 然后添加不同的化学物质.
注: 用光镜评价: 每个细胞准备, 150 至300心肌细胞应监测每天通过光镜。根据它们的外观将所有计数的心肌细胞细分为组 ( 例如, 和 #34; 杆形和 #34; #34; #34; #34; #34; 不寻常的外表和 #34 #34。类别和 #34; 传播和 #34; 包括所有具有伪足样结构的心肌细胞。#34; 不寻常的外表和 #34; 包括所有 ARVC, 表面不规则, 没有可检测的完整细胞膜.
3。例如实验
- 成人心肌细胞的荧光染色/免疫荧光着色
- 实时定量 rt-pcr (qRT pcr)
- 执行 qRT pcr 研究不同基因 ( OSM、Swiprosin-1、#946、MHC) 在 ARVC 培养过程中 mRNA 表达的变化。为充分的样品大小, 使用更大的文化盘子 (内径:60 毫米) 与2毫升容量。ARVC 的五种文化菜肴有一个样品。根据制造商和 #39 的协议, 执行 mRNA 的分离和 cDNA 的转化.
- 免疫技术
- 执行西墨, 以调查在 ARVC 的培养过程中蛋白质表达的变化 (如 Swiprosin-1)。每个样品使用一个培养皿 (1 毫升).
- 在共聚焦激光显微镜下对 ARVC 的形态学和结构转换进行了分析。利用笔 TRITC 研究 #34; 杆形和 #34;; #34; #34;; #34; 传播和 #34; ARVC。根据制造商和 #39 的协议执行染色。在参考 Nippert et al. 中给出了笔-TRITC 染色的一个例子 11 . 利用荧光/免疫荧光染色, 培养成人心肌细胞的 de-and re-differentiation 在实验治疗之间的差异 ( 例如, Swiprosin-1, ionomycin) 可以被调查.
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Representative Results
文化中的成人心肌细胞:图 1显示了最新隔离的成人心肌细胞在最后一次洗涤后2小时的概况。大约75% 的所有心肌细胞都有一个杆状形态。其余的25% 显示了一个不寻常的外观与圆形的形态学和没有可检测完整的细胞膜 (图 1)。在耕种的末端 (天 6), 15% 所有心肌细胞显示传播, 大约10% 保持在一个圆的形态学, 不用伪足象结构, 并且75% 所有心肌细胞提出了异常的出现与不规则的表面和没有可检测的完整细胞膜 (未显示数据)。
图 1: 新近分离的大鼠心肌细胞概述.新近分离的心肌细胞的分数呈杆状形态, 平均为心肌细胞的75%。其余的25% 的细胞呈现出一个不规则的表面不寻常的外观, 没有可检测完整的细胞膜。在冲洗新分离的心肌细胞后2小时进行光镜记录。光学显微镜2X 放大倍数。请单击此处查看此图的较大版本.
用光学显微镜, 新鲜地被隔绝的 ARVC 出现杆形状和大约100µm 在大小 (图 2A)。新鲜地被隔绝的 ARVC 那合同自发地不是钙容忍。所有圆形和无可检测完整细胞膜的细胞均已损坏, 无法存活 (图 2A-b)。在接下来的几天里, 大部分的杆状 ARVC 失去了这种形态。细胞被一个可检测的完整的细胞膜所环绕。这些 ARVC 是可行的。从三天开始, 后者的细胞形成了伪足样的结构。其中一些 ARVC 在传播过程中保持了圆的外观 (图 2B)。其他转换成平面, 多态 ARVC (图 2B)。
图 2: 分离的大鼠心肌细胞.(A)新近分离的 ARVC 通常为杆状。(B)在六天的文化中, 伪足状结构 (传播) 在现在的圆形 ARVC 中明显地被检测到。有些 ARVC 完全地改变了到广泛的形态学。ARVC 不寻常的外观显示不规则的表面, 没有可检测完整的细胞膜。光学显微镜10X 放大倍数。请单击此处查看此图的较大版本.
新鲜地被隔绝的 ARVC 典型地是杆形状与清楚地可看见的发怒条纹 (图 3, 天 0)。在培养后的几天内观察到细胞形态学的变化。首先, ARVC 失去了所有的收缩元素 (图 3, 天1和 2)。随后进行了一场改革, 牵连到了从头sarcomerogenesis。改革前面是伪足状结构的形成 (传播,图 3, 天3到 6)。De 从头sarcomerogenesis 开始于肌动蛋白应力纤维的外观 (图 3, 3 天)。此外, 肌动蛋白束出现在周地区, 并形成新组装的节 (图 3, 天4和 5)。后者生长沿预制肌动蛋白应力纤维到外围 (图 3, 天 6)。在耕种期间 (天 6a) 的结尾, 一个典型的交叉条纹从新的被会集的节在传播 ARVC 被观察。
图 3: 荧光染色.de-and re-differentiation 的 ARVC 在文化与 20% FCS 显示。新鲜地被隔绝的 ARVC 与他们典型的杆形状 (天 0) 在文化的第一天成为了圆由贬低的节 (天 1)。他们丢失了所有他们的收缩元素 (天 2) 然后形成伪足象结构 (传播;天 3-5) 和随后的改革他们的收缩元素指示de 从头sarcomerogenesis (天 6)。在六天在文化, 发怒条纹清楚地再被察觉 (天 6a)。根据制造商的协议笔 TRITC 染色;"箭头": 伪足状结构 (如图所示);*: 肌动蛋白束在周地区 (模范显示)。此图的某些部分在11中发布.请单击此处查看此图的较大版本.
图 4显示了在耕作过程中传播进程的动力学。在每次检查时, ARVC 显示伪足样结构的分数被分配为在% (图 4) 中传播。传播开始了在天三附近并且在耕种期间经常增加。14.7% ±1.39% 所有计数的 ARVC 在六天以后在耕种显示了伪足象结构。
图 4: 在培养时间的六天 (n = 33 细胞制剂) 中, 向所有计数的心肌细胞 (在% 中传播) 的伪足样结构传播的心肌细胞的运动增加.数据被显示为手段± SEM。此图在11中发布。请单击此处查看此图的较大版本.
ionomycin 对 ARVC 传播的影响:ARVC 的分离和培养是钙敏感过程1,8。治疗 ARVC 与 ionomycin (1 µM), 这增加细胞内钙浓度, 导致显着 (p ≤0.01) 减少的形成伪足样结构与对照组 (图 5)。当直接比较时, 17.19% ±2.45% 的所有计数 ARVC 显示在控制条件下蔓延, 但只有9.87% ±2.77% 的所有计数 ARVC 形成伪足状结构在 ionomycin 的存在 (天6耕种)。因此, ionomycin 减少了42.58% 的传播。
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图 5: 传播动力学在治疗下与 ionomycin.治疗与 ionomycin (1 µM) 在0天导致了非常显著减少细胞传播与控制相比。数据显示为手段± SEM;n = 4 细胞制剂;曼-惠特尼 U 测试;* p ≤0.05;** ≤0.01请单击此处查看此图的较大版本.
此外, 与控制条件 (图 6) 相比, ionomycin 增加了具有不寻常外观的 ARVC 的百分比。在六天, 71.11% ±4.65% 的所有计数 ARVC 治疗与 ionomycin 显示了一个不寻常的外观。然而, 在控制条件下, 只有51.35% ±3.55% 的 ARVC 被归类在这个组。
图 6: ARVC 的外观不健康.治疗与 ionomycin (1 µM) 在天0导致了显著增加 ARVC 的数量, 显示异常的出现。6天, 对照与 ARVC 治疗的差异有显著性 ionomycin。数据显示为手段± SEM;n = 4 细胞制剂;曼-惠特尼 U 测试;* p ≤0.05请单击此处查看此图的较大版本.
在3天的耕种, 在 ionomycin 的治疗下, qRT PCR 显示β MHC (p ≤0.01) 和 OSM 的 mRNA 表达下降, 这两者在 de-differentiation ARVC (图 7A和C) 中起着明显的作用。Swiprosin-1, re-differentiation ARVC 的标记也明显 downregulated (图 7B)。
图 7: ionomycin 治疗栽培 ARVC 的脱 re-differentiation
(1 µM) 0 天, 导致 oncostatin M (OSM) 和β-MHC 的 mRNA 表达减少, 这两种基因在成年心肌细胞 de-differentiation 中起关键作用.此外, ionomycin 治疗也减少了 Swiprosin-1 的 mRNA 表达, 这是成年心肌细胞 re-differentiation 中的关键角色。3天耕种;数据显示为手段± SEM;n = 每组30细胞培养板;曼-惠特尼 U 测试;* p ≤0.05;** ≤0.01请单击此处查看此图的较大版本.
| 预镀介质 |
| 20毫升 CCT 介质 |
| 2% Vol. 青霉素/链霉素 (400 μ l) |
| 4% Vol. FCS (800 μ l) |
| 电镀介质 |
| 20毫升 CCT 介质 |
| 2% Vol. 青霉素/链霉素 (400 μ l) |
| 洗涤介质 |
| 20毫升 CCT 介质 |
| 2% Vol. 青霉素/链霉素 (400 μ l) |
| 注: 4%vol 镀培养基中的 FCS 可被 1 Vol.-% 层粘连蛋白 (0.5 微克/cm2) 所取代。此外, 培养心肌细胞数天增加 20 Vol.% 的 FCS 到洗涤介质。用4-8 ° c 贮存电镀介质和洗涤介质。 |
表 1: 用于心肌细胞隔离的培养基
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Discussion
成年心肌细胞的行为在体内受许多与其他细胞的相互作用 (如: 如, 神经元, 内皮细胞, 成纤维细胞, 炎症细胞) 和电合, 他们形成1。因此, 研究成年心肌细胞的应激适应需要 ARVC 的分离和培养。分离和培养 ARVC 的主要作用是: 1) 从细胞外基质和细胞间接触;2) 将它们与收缩刺激断开;3) 迫使他们从三维组织适应 two-dimensional 环境。在这些条件下, ARVC 开始 de-and re-differentiation 如上所述, 并执行多种适应, 这也可以看到在心脏重塑在体内(β-受体脱敏, 重组节,等)4. 因此, 成年心肌细胞的分离是一种有效的方法来研究这些细胞及其对不同处理的反应。这些洞察之后可以用于体内实验, 这将有助于避免不必要的实验和减少测试动物的数量。当然, 有些发现在体外将不会发生在体内(如, 形成类似伪足的结构)。现有的细胞-细胞接触在电合将阻碍过度增长在生理情况下17。然而, 分离和培养的 ARVC 可用于研究成年心肌细胞的行为。此外, 对人类心脏疾病的新治疗策略的首次试验可以用 ARVC 进行。
所描述的成年心肌细胞的分离和培养方法包含一些关键点。要获得成功的结果, 必须考虑下列项目。
1. 钙耐受性: 历史上, 成年心肌细胞的钙耐量是导致成人心肌细胞成功分离和培养的最关键因素之一1,7,8. 目前, 为确保生理钙条件下的培养, 已建立了协议13。这份手稿显示了改变细胞内钙浓度对分离 ARVC 质量的影响。Ionomycin, 增加细胞内钙的浓度, 导致显着减少的传播和显着增加的数量的心肌细胞有一个不寻常的外观。此外, 它引起了心脏 de-and re-differentiation: β-MHC, OSM 和 Swiprosin-1 下调的关键标志物。因此, 在种植过程中改变细胞内钙浓度会阻碍 ARVC 适应新环境的能力。虽然有些 ARVC 能传播和适应 (9.87% ±2.77% 所有计数了 ARVC;图 5), 在这些条件下对 ARVC 的精确调查是不可能的。因此, 为了精确地隔离和培养 ARVC, 应使用既定的钙协议。此外, 应确保没有调查的治疗干预 ARVC 钙止血。
2. 胶原酶: 有不同批次的胶原酶可用。每批显示的质量和有效性的差异1。因此, 作者建议订购和测试不同批次的样品。另外, 每批新批次的消化时间和胶原酶的用量需要单独评估。因此, 所描述的协议中消化的浓度和时间可能与其他协议稍有不同。
3. 心脏灌注的时间: 为了保证高质量的 ARVC, 从体内提取心脏与共生系统开始灌注的时间应尽可能短。长时间造成心脏损伤, 导致不 ARVC。
另外, 在灌注和消化过程中, 在切出组织后的5分钟内, 对灌注液进行加温是产生良好效果的必要条件。为了避免对生物组织造成不必要的损害, 应该在历史的各个方面小心处理。此外, 应该指出的是, 使用 OSM 或更低浓度的 FCS 的治疗也能使 ARVC de-and re-differentiate4,10,18,19。然而, 没有这些营养治疗, ARVC 退化在几天之内2。
总之, ARVC 的分离和培养是一种灵敏的方法, 它为研究成年心肌细胞的行为提供了多种可能性。
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Disclosures
所显示的结果是 Franziska Nippert 博士论文的一部分。
Acknowledgments
作者感谢 Woitasky 和彼得沃尔克的技术援助。此外, 作者还感谢 Mrs. (医学作家 ACCEDIS) 在准备手稿方面的帮助。此手稿由 DFG (Schlu 324/7-1) 资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Langendorff perfusion system | inhouse construction | double-walled with a water based heating system |
|
| Tissue chopper Mc Ilwain | Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd. | ||
| Aortic Cannula, OD 1,8 mm | inhouse construction | ||
| Abdominal shears | Aeskulap | BC772R | |
| Capsule forceps | Eickemeyer | 171307 | |
| Dissecting scissor large | Aeskulap | BC562R | |
| Dissecting scissor small | Aeskulap | BC163R | |
| Mash with Polyamid | Neolab | 4-1413 | mash size 200 μm |
| plastic disc | Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd. | ||
| Collagenase Typ II | Worthington | LS004177 |
References
- Schlüter, K. -D. Cardiomyocytes - Active Players in Cardiac Disease. , Springer International Publishing AG Switzerland. (2016).
- Piper, H. M., Probst, I., Schwartz, P., Hutter, F. J., Spieckermann, P. G. Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes. J. Mol. Cell. Cardiol. 14 (7), 397-412 (1982).
- Schlüter, K. -D., Schreiber, D. Adult ventricular cardiomyocytes: isolation and culture. Protein Tyrosine Kinases: From Inhibitors to Useful Drugs. Fabbro, D., McCormick, F. 290, Humana Press Inc. Totowa, NJ. 305-314 (2005).
- Eppenberger, M. E., et al. Immunocytochemical analysis of the regeneration of myofibrils in long-term cultures of adult cardiomyocytes of the rat. Dev. Biol. 130 (1), 1-15 (1988).
- Burrows, M. T. The cultivation of tissues of the chick-embryo outside the body. JAMA. 55 (24), 2057-2058 (1910).
- Cavanaugh, M. W. Pulsation, migration and division in dissociated chick embryo heart cells in vitro. J Exp Zool A Eco Genet Physiol. 128 (3), 573-589 (1955).
- Muir, A. R. Further observation on the cellular structure of cardiac muscle. J. Anat. 99, 27-46 (1965).
- Powell, T., Twist, V. W. A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium. Biochem. Biophys. Res. Com. 72 (1), 327-333 (1976).
- Schwarzfeld, T. Isolation and development in cell culture of myocardial cells of the adult rat. J. Mol. Cell. Cardiol. 13 (6), 563-575 (1981).
- Kubin, T., et al. Oncostatin M is a major mediator of cardiomyocyte dedifferentiation and remodeling. Cell Stem Cell. 9 (5), 420-432 (2011).
- Nippert, F., Schreckenberg, R., Hess, A., Weber, M., Schlüter, K. -D. The effects of Swiprosin-1 on the formation of pseudopodia-like structures and β-adrenoceptor coupling in cultured adult rat ventricular cardiomyocytes. PLoS ONE. 11 (12), e0167655 (2016).
- Moses, R. L., Claycomb, W. C. Disorganization and reestablishment of cardiac muscle cell ultrastructure in cultured adult rat ventricular muscle cells. J. Ultrastruct. Res. 81 (3), 358-374 (1982).
- Eppenberger-Eberhardt, M., Flamme, I., Kurer, V., Eppenberger, H. M. Reexpression of α-smooth muscle actin isoform in cultured adult rat cardiomyocytes. Dev. Biol. 139 (2), 269-278 (1990).
- Fedak, P. W., Verma, S., Weisel, R. D., Skrtic, M., Li, R. K. Cardiac remodeling and failure: from molecules to man (Part III). Cardiovasc. Pathol. 14 (3), 109-119 (2005).
- Leri, A., Kajstura, J., Anversa, P. Mechanisms of myocardial regeneration. Trends Cardiovasc. Med. 21 (2), 52-58 (2011).
- Cohn, J. N., Ferrari, R., Sharpe, N. Cardiac remodeling-concepts and clinical implications: A consensus paper from an international forum on cardiac remodeling. J. Am. Coll. Cardiol. 35 (3), 569-582 (2000).
- Alberts, B., et al. Molecular biology of the cell. , Garland Science Taylor and Francis Group. New York, NY. (2015).
- Pöling, J., et al. The Janus face of OSM-mediated cardiomyocyte dedifferentiation during cardiac repair and disease. Cell Cycle. 11 (3), 439-445 (2014).
- Decker, M. L., Behnke-Barclay, M., Cook, M. G., Lesch, M., Decker, R. S. Morphometric evaluation of the contractile apparatus in primary cultures of rabbit cardiac myocytes. Circ. Res. 69 (1), 86-94 (1991).
