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Medicine

अलगाव और वयस्क चूहे Cardiomyocytes की खेती

Published: October 19, 2017 doi: 10.3791/56634
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institute of Physiology, Justus Liebig University Giessen

Summary

यहाँ, हम वयस्क चूहे वेंट्रिकुलर cardiomyocytes (ARVC) के अलगाव और खेती के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । पृथक ARVC छोटी और लंबी अवधि की खेती के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । अलगाव और ARVC की खेती हृदय रोगों के लिए नए उपचार परहेजों को विकसित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकते हैं ।

Abstract

एक बरकरार दिल में, आसंन कोशिकाओं वयस्क cardiomyocytes प्रभाव । वयस्क cardiomyocytes के अलगाव और खेती की विधि के साथ, विशिष्ट उपचार और वातावरण के तहत इन कोशिकाओं के व्यवहार की एक सटीक जांच संभव है । यह पांडुलिपि वयस्क चूहे वेंट्रिकुलर cardiomyocytes (ARVC) के सफल अलगाव और खेती के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है ।

चूहे गहरी संज्ञाहरण के तहत गर्भाशय ग्रीवा के विस्थापन द्वारा बलिदान है । फिर, दिल निकाला जाता है और महाधमनी का पर्दाफाश किया है । इसके बाद, कैल्शियम की कमी और collagenase उपचार के साथ Langendorff छिड़काव प्रणाली पर छिड़काव किया जाता है । बाद में, वेंट्रिकुलर ऊतक भरती हो जाता है, फिर से परिचालित, और फ़िल्टर, CaCl के क्रमिक अलावा के साथ तीन केंद्रापसारक कदम द्वारा पीछा किया2 जब तक शारीरिक कैल्शियम एकाग्रता तक पहुँच जाता है. ARVC सेल कल्चरल डिश पर चढ़ाया जाता है । कोशिका संस्कृति माध्यम को ताजा करने के बाद ARVC सीरम युक्त संस्कृति माध्यम को बदले बिना छह दिनों तक खेती की जा सकती है. ARVC का अलगाव एक कैल्शियम संवेदनशील प्रक्रिया है । intracellular कैल्शियम एकाग्रता में छोटे परिवर्तन की गुणवत्ता और अलग कोशिकाओं की व्यवहार्यता में कमी के कारण ।

हौसले से पृथक ARVC रॉड के आकार के हैं । खेती के पहले दिन के भीतर वे रॉड के आकार आकृति विज्ञान और फार्म pseudopodia तरह संरचनाओं (प्रसार) खो देते हैं । इस रूपात्मक गठन के दौरान ARVC शुरू में actin तनाव फाइबर और de नोवो sarcomerogenesis के माध्यम से एक सुधार के बाद उनके सिकुड़ा तत्वों नीचा. खेती के एक सप्ताह के बाद, सबसे ARVC एक स्पष्ट रूप से पता लगाने के पार striation के साथ एक व्यापक रूप दिखा । इस प्रक्रिया को intracellular कैल्शियम एकाग्रता के प्रति संवेदनशील है, ionomycin के साथ उपचार के रूप में क्षीणन फैल. de-और पुन: विभेद की इस प्रक्रिया में कुंजी मार्कर β-मायोसिन भारी श्रृंखला (β-MHC), oncostatin M (OSM), और swiprosin-1 (EFHD2) हैं । हाल के अध्ययनों से सुझाव दिया है कि कार्डिएक फिर से और de-भेदभाव संस्कृति की स्थिति के तहत होने वाले हृदय remodeling के दौरान vivo में देखा सुविधाओं की नकल । इसलिए, अलगाव और ARVC की खेती cardiomyocytes के जीव विज्ञान को समझने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं ।

Introduction

vivo में वयस्क cardiomyocytes myocytes के बीच सेल-सेल संपर्कों के आधार पर एक इलेक्ट्रिकल syncytium के रूप में काम करते हैं । इसके अलावा, वे कार्डियक fibroblasts, endothelial कोशिकाओं, न्यूरॉन्स, और भड़काऊ कोशिकाओं की तरह आसन्न कोशिकाओं से प्रभावित कर रहे हैं1. आदेश में cardiomyocytes की क्षमता का अध्ययन करने के लिए अपने intracellular संगठन के अनुकूलन के लिए बदल लोड की स्थिति, के रूप में कार्डियक अतिवृद्धि, जो एक प्रारंभिक दिल की विफलता के लिए अग्रणी कदम है के दौरान देखा, अलगाव और वयस्क वेंट्रिकुलर चूहे की खेती cardiomyocytes (ARVC)2,3,4आवश्यक है । ऐतिहासिक, cardiomyocytes पहले भ्रूण चिकी दिल5,6से अलग थे । कुछ साल बाद, टर्मिनल विभेदित cardiomyocytes के पहले अलगाव कैल्शियम कमी7का उपयोग करके वर्णित किया गया था । हालांकि, इन वयस्क cardiomyocytes कैल्शियम सहिष्णु नहीं थे और इसलिए कार्यात्मक परख के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है । अंत में, १९७६ में एक नया प्रोटोकॉल पावेल और मोड़ सक्षम करने के लिए शारीरिक शर्तों8के तहत वयस्क वेंट्रिकुलर cardiomyocytes की जांच । पहले कदम के रूप में, वे कम कैल्शियम सांद्रता के तहत वयस्क cardiomyocytes अलग और उसके बाद एक stepwise प्रक्रिया में शारीरिक सांद्रता के लिए कैल्शियम वृद्धि हुई । आज, इस कैल्शियम प्रोटोकॉल के साथ अलगाव और वयस्क cardiomyocytes काम की खेती के लिए सबसे प्रोटोकॉल और घने सेल-सेल संपर्क के एंजाइमी पाचन के लिए collagenase का उपयोग करें1।

एक सफल खेती के लिए, भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS) या oncostatin एम (OSM) की आवश्यकता है । ARVC sarcomere और सुधार सहित व्यापक संरचनात्मक परिवर्तन के साथ एक de-और फिर से भेदभाव प्रदर्शन9,10,11,12। इस प्रक्रिया को एक पुनः के साथ है भ्रूण प्रकार जीन की अभिव्यक्ति, β-मायोसिन भारी श्रृंखला (β-MHC) की तरह, के रूप में अतिवृद्धि से जाना जाता है, और pseudopodia की तरह संरचनाओं के एक गठन, भी प्रसार कहा जाता है4,11, 13. इसके अलावा, swiprosin-1 (EFHD2), एक नव पहचान प्रोटीन, फिर से खेती ARVC11के अंतर की प्रक्रिया में एक प्रमुख भूमिका निभाता है । नतीजतन, संस्कृति में ARVC व्यापक, बहुरूपी कोशिकाओं है, जो अनायास संस्कृति में दो से तीन सप्ताह के बाद संकुचन दिखाने के2,4,14में परिणत ।

हाल ही में खोजों से पता चला है कि कार्डिएक पुनः और de-भेदभाव के रूप में यह संस्कृति की स्थिति के तहत होता है vivo में कार्डिएक remodeling10,15के दौरान देखा सुविधाओं नकल । कार्डियक रिमॉडलिंग हृदय रोगों के दौरान एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया है16. के रूप में हृदय रोग अभी भी औद्योगिक समाजों में मौत का मुख्य कारण हैं, वयस्क cardiomyocytes के जीवविज्ञान की एक बेहतर समझ (जो; २०१५) महत्वपूर्ण है । अलगाव और ARVC की खेती के लिए नई रणनीतियों और हृदय रोगों के उपचार के लिए दवाओं के विकास में मदद कर सकते हैं । इस पांडुलिपि के साथ, अलगाव और ARVC की खेती के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान की जाती है । इसके अलावा, इस विधि के कुछ महत्वपूर्ण भागों चर्चा अनुभाग में उजागर कर रहे हैं ।

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Protocol

< p class = "jove_content" > जांच अमेरिका के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (NIH प्रकाशन No. 85-23, संशोधित १९९६) द्वारा प्रकाशित प्रयोगशाला पशुओं की देखभाल और उपयोग के लिए मार्गदर्शिका के अनुसार आयोजित की जाती है । सामांय में, पुरुष wistar 3 से 4 महीने की उंर के चूहों और २५०-३५० जी के एक औसत वजन के साथ इस प्रोटोकॉल के लिए उपयोग किया जाता है । एक चूहे का दिल 20 संस्कृति व्यंजन के लिए पर्याप्त है (पकवान प्रति 1 मिलीलीटर; भीतरी व्यास: ३५ मिमी) १.५ x 10 4 कोशिकाओं की अनुमानित कोशिका घनत्व के साथ/1000 mm 2 .

< p class = "jove_title" > 1. मीडिया और रिएजेंटों की तैयारी

  1. Creatine-carnitine-taurine मध्यम (CCT माध्यम)
    नोट: CCT मध्यम Creatine, carnitine, और taurine के अलावा के साथ मध्यम १९९ पर आधारित एक जटिल माध्यम है ।
    1. तैयार 1 एल के मध्यम १९९: जोड़ें ३.६ g Hepes और 1 एच के लिए मिश्रण । फिर जोड़ें ६५५.५ मिलीग्राम creatine (5 मिमी), ३९५.४ मिलीग्राम carnitine (2 मिमी), और ६२५.५ मिलीग्राम taurine (5 मिमी). Carnitine व taurine बदल pH ते & #60; 7. किसी भी प्रदूषित कोशिकाओं के विकास को बाधित करने के लिए, जैसे endothelial कोशिकाओं या fibroblasts, जोड़ 10 & #181; M cytosine & #946;-d-arabinofuranoside यम. NaOH के साथ पीएच समायोजित करें (2 मिमी) करने के लिए ७.४ और बाँझ फिल्टर माध्यम. CCT मीडियम पर 4 & #176; ग.
  2. पॉवेल मीडियम
    1. 1 L पॉवेल मीडियम के लिए, भंग ६.४३ g NaCl (११० mm) के साथ ०.१९ g KCl (२.५ mm), ०.१६ g KH 2 पो 4 (१.२ mM), ०.३ g MgSO 4 7H 2 O (१.२ मि.), ५.९६ जी Hepes (25 मि.), व १.९८ जी डी (+ )-एक्वा बाँझ में ग्लूकोज मोनोहाइडे (10 मि. ग्रा.). NaOH के साथ पीएच समायोजित करें (2 एम) करने के लिए ७.४ और बाँझ फिल्टर माध्यम. स्टोर पॉवेल मीडियम पर 4 & #176; ग.
  3. कैल्शियम क्लोराइड (CaCl 2 )
    1. तैयार एक १०० mM CaCl 2 सॉल्यूशन (५० mL) और तैयार aliquots युक्त ५०० & #181; L CaCl 2 . फ्रीज aliquots-20 & #176; ग.
  4. तयारी करण्याचा कल्चरल माध्यम
    1. तीन सेल संस्कृति माध्यमों तैयार: पूर्व चढ़ाना माध्यम, मध्यम चढ़ाना, और धोने के माध्यम । सभी तीन माध्यमों ( Table 1 ) के आधार के रूप में CCT मीडियम का प्रयोग करें । संस्कृति पकवान प्रति 1 मिलीलीटर के साथ CCT माध्यम की गणना । इसलिए, 20 संस्कृति व्यंजन (इनर व्यास: ३५ मिमी) के लिए 20 मिलीलीटर CCT मध्यम तैयार करें ।
    2. सेल कल्चर प्लेट्स: कोट प्रत्येक कोशिका संस्कृति प्लेट (भीतरी व्यास: ३५ मिमी) 1 मिलीलीटर पूर्व चढ़ाना माध्यम के साथ । लेपित प्लेटों को ३७ & #176; C रात भर में या उपयोग करने से पहले कम से 2 h पर संग्रहीत कर ᱶ ।
< p class = "jove_title" > 2. अलगाव के वयस्क Cardiomyocytes

  1. की तैयारी Langendorff छिड़काव प्रणाली
    1. हीट चढ़ाना मध्यम और वाशिंग मीडियम से ३७ & #176; ग. ५०० & #181 की एक ट्यूब फ्रीज; L CaCl 2 और बकरों की 25 मिलीग्राम में collagenase.
    2. फ्लश एक्वा बाँझ के साथ Langendorff छिड़काव प्रणाली, बाद में पावेल मध्यम 5 मिनट के लिए प्रणाली प्रसारित करते हैं ।
    3. ८० मिलीलीटर पावेल माध्यम के साथ Langendorff छिड़काव प्रणाली को बिना किसी हवाई बुलबुले के भरें और ९५% ऑक्सीजन के माध्यम से मध्यम गैस ।
    4. एक ट्यूब (५० एमएल) को ४० मिलीलीटर पॉवेल मीडियम से तैयार करें, इसे ३७ & #176; सी को गरम करें, और इसे ९५% ऑक्सीजन के साथ गैस करें ।
    5. प्रवेशनी के लिए निकाल दिया दिल संलग्न करने के लिए लंबाई में लगभग 25 सेमी का एक धागा तैयार करते हैं ।
    6. शराब (मात्रा से ७०%) के साथ एक उस्तरा ब्लेड चिकना और यह हेलिकॉप्टर को जकड़ना । हेलिकॉप्टर में एक प्लास्टिक डिस्क दबाना ।
  2. दिल का निष्कर्षण
    1. Anesthetize एक पुरुष wistar चूहा 4% से 5% isoflurane के साथ और यह गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के साथ बलिदान । एक उदर कतरनी के साथ पसलियों के बीच चाप के पीछे पेट खुला और, कैंची के एक ही जोड़ी के साथ, डायाफ्राम के माध्यम से कट वक्ष गुहा खोलने के लिए ।
    2. निकालें, फेफड़े और थाइमस के साथ एक साथ, वक्ष गुहा में थाइमस अत्यधिक कपाल के ऊपर से काट कर । बर्फ के लिए सामग्री स्थानांतरण-ठंडा खारा समाधान तुरंत ।
    3. एक विदारक कैंची (बड़े) के साथ दिल से फेफड़े और थाइमस निकालें और कैप्सूल संदंश के साथ सामग्री का निर्धारण करके, एक नया खारा समाधान करने के बाद स्थानांतरण ।
  3. अलगाव
    1. कैप्सूल थाइमस और एक विदारक कैंची (बड़े या छोटे) का उपयोग दिल से श्वासनली, संदंश, वसा, और संयोजी ऊतक के अवशेषों की तरह अतिरिक्त ऊतक, निकालें । महाधमनी को उजागर और यह एक विदारक कैंची के साथ तोड़ (बड़े या छोटे) पहली और दूसरी शाखात्मक मेहराब के बीच ।
    2. Langendorff छिड़काव प्रणाली की टपकाव शुरू । Langendorff छिड़काव प्रणाली के प्रवेशनी पर दिल प्लेस और यह एक मगरमच्छ दबाना के साथ पहले और बाद में तैयार धागे के साथ निर्धारण । जब तक यह खून से मुक्त है दिल कुल्ला ।
    3. भंग 25 मिलीग्राम Collagenase में 5-6 मिलीलीटर उष्ण पावेल मध्यम और जोड़ १२.५ & #181; L CaCl 2 (30 & #181; M).
    4. एक गिलास कीप, जो Langendorff छिड़काव प्रणाली के साथ टपकाव का दिल से जुड़ा है और छिड़काव प्रणाली को हल collagenase जोड़ने चलती द्वारा बंद संचलन । प्रति सेकंड 1 ड्रॉप की एक बूंद वेग के साथ 25 मिनट के लिए छिड़काव शुरू करो ।
      नोट: छिड़काव के दौरान, दिल प्रफुल्लित और एक मोमी उपस्थिति प्राप्त होगा ।
    5. 25 मिनट के बाद छिड़काव रोकें और Langendorff छिड़काव सिस्टम से दिल हटा दें । महाधमनी, atria, और हृदय से संयोजी ऊतक निकालें और सही और वाम निलय खुला ।
    6. काट कर दिल को दो बार ९० के कोण पर & #176; (चौड़ाई काटना: ०.७ mm; वेग: ०.१५ cm/ इस प्रक्रिया को मैंयुअल रूप से दोहराएं 10 एस के लिए दो नश्तर के साथ हर तरफ ।
    7. छिड़काव माध्यम के 12 मिलीलीटर एक नई ट्यूब (५० मिलीलीटर) में स्थानांतरण । इस मध्यम और पचाने वाली कोशिकाओं में सेल घोल डालो ३७ पर एक और पांच मिनट के लिए & #176; C. समाधान हर मिनट मिश्रण ।
    8. एक नायलॉन जाल के माध्यम से पचा दिल के साथ समाधान फ़िल्टर (२०० & #181; m) एक नई ट्यूब (५० मिलीलीटर) में.
    9. 3 मिनट के लिए 29 x g पर फ़िल्टर्ड समाधान केंद्रापसारक । supernatant को त्यागें और 6 मिलीलीटर उष्ण पॉवेल माध्यम जोड़ें जिसमें १२.५ & #181; L CaCl 2 (२५० & #181; M) को सेल गोली. चिकनी मिलाते आंदोलनों के माध्यम से गोली reसस्पेंड । 2 मिनट के लिए 29 एक्स जी में फिर से केंद्रापसारक । supernatant को छोड़ें और 6 मिलीलीटर गर्म पावेल को 25 & #181 के साथ प्रतिस्थापित करें; L CaCl 2 (५०० & #181; M). कोमल झटकों आंदोलनों के माध्यम से सेल गोली भंग और १२० & #181 सहित 12 मिलीलीटर गर्म पावेल मध्यम जोड़ें; L CaCl 2 (1 mM). 1 मिनट के लिए 16 एक्स जी में एक तीसरी बार के लिए केंद्रापसारक । फिर से, supernatant.
      10. निकालें
    10. मिश्रण पूर्व गर्म चढ़ाना मध्यम के साथ सेल गोली ।
    11. संस्कृति प्लेटों से पूर्व चढ़ाना मध्यम निकालें । प्रत्येक संस्कृति प्लेट के लिए अलग cardiomyocytes सहित 1 मिलीलीटर चढ़ाना मध्यम, स्थानांतरण । ३७ & #176; ग के लिए 1 ज.
      12. पर नई अलग cardiomyocytes की मशीन
    12. संस्कृति प्लेटों से चढ़ाना माध्यम निकालें । प्रत्येक कल्चर प्लेट में 1 मिलीलीटर वाशिंग मीडियम जोड़ें और प्लेटों को ३७ & #176 पर स्टोर करें, मीडियम को बदले बिना छह दिनों तक.
      13. ARVC पर विभिन्न रसायनों और उपचार के प्रभाव की जांच के लिए
    13. , पहले ताजा चढ़ाना मध्यम धोने और उसके बाद विभिन्न रसायनों को जोड़ने के माध्यम से.
      नोट: प्रकाश माइक्रोस्कोपी के साथ मूल्यांकन: प्रत्येक सेल तैयारी के साथ, १५० से ३०० cardiomyocytes प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रति दिन निगरानी की जानी चाहिए. प्रतिभाग सभी गिने cardiomyocytes समूहों में उनकी शक्ल के अनुसार ( उदा, & #34; रॉड के आकार का & #34;, & #34; राउंड डाउन & #34;, & #34; फैल & #34;, व & #34; असामान्य प्रकटन & #34;). श्रेणी & #34; फैल & #34; pseudopodia-जैसी संरचनाओं वाले सभी cardiomyocytes शामिल हैं । & #34; असामान्य प्रकटन & #34; एक अनियमित सतह और कोई detectable बरकरार कोशिका झिल्ली के साथ सभी ARVC शामिल हैं ।
< p class = "jove_title" > 3. उदाहरण गडबड

  1. प्रतिदीप्ति/इम्यूनोफ्लोरेसेंस के दाग वयस्क cardiomyocytes
    1. का विश्लेषण रूपात्मक और ARVC के संरचनात्मक रूपांतरणों फोकल लेजर माइक्रोस्कोपी द्वारा खेती के दौरान । & #34 में F-actin संरचनाओं की जांच के लिए Phalloidin-TRITC का उपयोग करें; रॉड के आकार का & #34;, & #34; राउंड डाउन & #34;, व & #34; फ़ैलाने & #34; ARVC. निर्माता के अनुसार दाग प्रदर्शन & #39; एस प्रोटोकॉल । Phalloidin-TRITC दाग के लिए एक उदाहरण के संदर्भ में दिया जाता है Nippert एट अल. < सुप वर्ग = "xref" > ११ . with प्रतिदीप्ति/इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला, प्रयोगात्मक उपचार के बीच खेती वयस्क सिकुड़ा में de-और cardiomyocytes तंत्र के पुनः भेदभाव में अंतर ( उदा, Swiprosin-1, ionomycin) की जांच की जा सकती है ।
  2. वास्तविक समय मात्रात्मक RT-पीसीआर (qRT-पीसीआर)
    1. विभिन्न जीन की qRT अभिव्यक्ति में परिवर्तन की जाँच करने के लिए mRNA-पीसीआर ( जैसे, OSM, Swiprosin-1, & #946;-MHC) की खेती के दौरान ARVC. पर्याप्त नमूना आकार के लिए, 2 मिलीलीटर की मात्रा के साथ बड़ा संस्कृति व्यंजन (भीतरी व्यास: ६० मिमी) का उपयोग करें । ARVC के पांच संस्कृति व्यंजन एक नमूना पैदावार । mRNA के अलगाव और सीडीएनए के परिवर्तन के अनुसार प्रदर्शन निर्माता & #39; s प्रोटोकॉल.
  3. Immunoblot
    1. की खेती के दौरान प्रोटीन एक्सप्रेशन ( eg, for Swiprosin-1) में परिवर्तन की जांच करने के लिए पश्चिमी दाग प्रदर्शन करते हैं । एक संस्कृति पकवान का प्रयोग करें (1 मिलीलीटर) प्रति नमूना ।

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Representative Results

संस्कृति में वयस्क cardiomyocytes: चित्रा 1 पिछले धोने के बाद हौसले से अलग वयस्क cardiomyocytes 2 एच का अवलोकन दिखाता है । सभी cardiomyocytes के लगभग ७५% एक रॉड के आकार आकृति विज्ञान था । शेष 25% एक गोल आकृति विज्ञान और कोई detectable बरकरार सेल झिल्ली (चित्रा 1) के साथ एक असामान्य उपस्थिति दिखाया. खेती के अंत में (6 दिन), सभी cardiomyocytes के 15% तक फैल दिखाया, के बारे में 10% pseudopodia की तरह संरचनाओं के बिना एक दौर आकृति विज्ञान में बने रहे, और सभी cardiomyocytes के ७५% एक अनियमित सतह के साथ एक असामांय रूप प्रस्तुत किया और एक के बिना detectable बरकरार कोशिका झिल्ली (डेटा नहीं दिखाया गया है) ।

Figure 1
चित्रा 1: हौसले से अलग चूहे cardiomyocytes का अवलोकन । हौसले से पृथक cardiomyocytes जो एक रॉड के आकार आकृति विज्ञान दिखाया cardiomyocytes के ७५% की राशि के अंश, औसत पर । शेष 25% कोशिकाओं के एक अनियमित सतह और कोई detectable बरकरार कोशिका झिल्ली के साथ एक असामांय उपस्थिति प्रस्तुत किया । रिकॉर्डिंग प्रकाश माइक्रोस्कोपी 2 एच द्वारा हौसले से अलग cardiomyocytes धोने के बाद आयोजित किया गया था । प्रकाश माइक्रोस्कोपी 2x बढ़ाई । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

प्रकाश माइक्रोस्कोपी के साथ, हौसले से अलग ARVC आकार में रॉड और लगभग १०० µm (चित्रा 2a) के आकार दिखाई दिया । हौसले से पृथक ARVC कि अनुबंध अनायास कैल्शियम सहिष्णु नहीं थे. सभी कोशिकाओं है कि दौर थे और एक जासूस बरकरार कोशिका झिल्ली के बिना क्षतिग्रस्त और व्यवहार्य नहीं थे (चित्रा 2a-बी) । निंनलिखित दिनों में, छड़ी के आकार ARVC के अधिकांश इस आकृति विज्ञान खो दिया है । कोशिकाओं को एक जासूस बरकरार कोशिका झिल्ली के साथ गोल मिला । ये ARVC व्यवहार्य थे । दिन में शुरू तीन उत्तरार्द्ध कोशिकाओं pseudopodia संरचनाओं की तरह का गठन किया । इन ARVC के कुछ (चित्रा बी) प्रसार के दौरान अपने गोल उपस्थिति रखा । दूसरों के फ्लैट में परिवर्तित, बहुरूपी ARVC (चित्रा बी) ।

Figure 2
चित्रा 2: पृथक चूहा cardiomyocytes । (क) हौसले से पृथक ARVC आम तौर पर रॉड के आकार के थे । (ख) संस्कृति में छः दिनों के बाद अब गोल ARVC में pseudopodia-जैसी संरचनाओं (फ़ैलाने) का स्पष्ट रूप से पता लगाया गया. कुछ ARVC पूरी तरह से एक व्यापक आकृति विज्ञान के लिए बदल गया । एक असामांय उपस्थिति के साथ ARVC एक अनियमित सतह और कोई detectable बरकरार कोशिका झिल्ली प्रदर्शित । प्रकाश माइक्रोस्कोपी 10x आवर्धन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

हौसले से पृथक ARVC आम तौर पर एक स्पष्ट रूप से दिखाई पार striation (चित्रा 3, 0 दिन) के साथ आकार रॉड थे । संस्कृति में निंनलिखित दिनों के दौरान कक्ष आकृति विज्ञान में परिवर्तन देखा गया । सबसे पहले, ARVC अपने सभी सिकुड़ा तत्वों (चित्रा 3, दिन 1 और 2) खो दिया है । यह एक सुधार के बाद किया गया था, de नोवो sarcomerogenesis फंसाने । रिफॉर्म pseudopodia की तरह संरचनाओं के गठन से पहले किया गया था (प्रसार, चित्रा 3, दिन 3 से 6) । De नोवो sarcomerogenesis actin तनाव फाइबर (चित्रा 3, दिन 3) की उपस्थिति के साथ शुरू कर दिया । इसके अतिरिक्त, actin बंडलों perinuclear क्षेत्र में दिखाई दिया और नव इकट्ठे sarcomeres (चित्रा 3, 4 दिन और 5) का गठन किया । बाद की परिधि में पहिले actin तनाव तंतुओं के साथ बढ़ी (चित्रा 3, 6 दिन) । खेती की अवधि के अंत में (दिन 6a), प्रसार ARVC में नव इकट्ठे sarcomeres से एक ठेठ पार striation मनाया गया ।

Figure 3
चित्रा 3: प्रतिदीप्ति धुंधला । 20% FCS के साथ संस्कृति में ARVC का de-और re-भिंनता दिखाया गया है । उनके ठेठ रॉड आकार (0 दिन) के साथ हौसले से पृथक ARVC संस्कृति के पहले दिन (1 दिन) के दौरान अपमानजनक sarcomeres द्वारा दौर बन गया । वे अपने सभी सिकुड़ा तत्वों (2 दिन) के गठन के बाद खो pseudopodia की तरह संरचनाओं (फैल; 3-5 दिन) और उनके सिकुड़ा de नोवो sarcomerogenesis (6 दिन) का संकेत तत्वों के बाद सुधार । संस्कृति में छह दिन में, पार striation स्पष्ट रूप से फिर से पता लगाने की थी (दिन 6a) । निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार Phalloidin-TRITC के साथ धुंधला; "तीर": pseudopodia की तरह संरचनाओं (दिखाया उदाहरण); *: perinuclear क्षेत्र में actin बंडलों (अनुकरणीय दिखाया) । इस आंकड़े के पार्ट्स 11 में प्रकाशित हुए हैं. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

चित्रा 4 खेती के दौरान प्रसार प्रक्रिया के काइनेटिक प्रदर्शित करता है । परीक्षा के प्रत्येक समय में pseudopodia की तरह संरचनाओं दिखा ARVC के अंश% में फैल के रूप में दिया जाता है (चित्रा 4) । तीन दिन के आसपास फैल शुरू कर दिया और खेती के समय के दौरान लगातार वृद्धि हुई । सभी गिने ARVC के १४.७% ± १.३९% की खेती में छह दिनों के बाद pseudopodia की तरह संरचनाओं दिखाया ।

Figure 4
चित्र 4: pseudopodia के साथ cardiomyocytes में फैल काइनेटिक वृद्धि-सभी गिना cardiomyocytes को सामान्यीकृत संरचनाओं (% में खेती समय के छह दिनों (n = ३३ सेल की तैयारी) के दौरान फैल । डेटा के रूप में प्रस्तुत कर रहे है ± SEM । यह आंकड़ा11में प्रकाशित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

ARVC के फैलने पर ionomycin का प्रभाव: अलगाव और ARVC की खेती एक कैल्शियम संवेदनशील प्रक्रिया1,8है । ionomycin (1 µ एम), जो intracellular कैल्शियम एकाग्रता बढ़ जाती है के साथ ARVC के उपचार, एक महत्वपूर्ण (पी ≤ ०.०१) के गठन में कमी pseudopodia की तरह संरचनाओं की तुलना में नियंत्रण (चित्रा 5) । जब सीधे तुलना में, १७.१९% ± सभी गिना ARVC के २.४५% नियंत्रण की स्थिति में फैल दिखाया लेकिन केवल ९.८७% ± सभी गिना ARVC का गठन २.७७% ionomycin की उपस्थिति में संरचना की तरह (खेती के दिन 6) । इस प्रकार, ionomycin ४२.५८% द्वारा फैल कम ।

= "jove_content" फो: रख-जुलकर । भीतर-पृष्ठ = "1" >Figure 5
चित्रा 5: ionomycin के साथ उपचार के तहत कैनेटीक्स फैल । ionomycin के साथ उपचार (1 µ m) दिन 0 पर नियंत्रण की तुलना में प्रसार सेल में एक अत्यधिक महत्वपूर्ण कमी हुई । डेटा के रूप में प्रस्तुत कर रहे है ± SEM; n = 4 सेल की तैयारी; मान-Whitney-U test; * p ≤ ०.०५; * * पी ≤ ०.०१ कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

साथ ही, ionomycin नियंत्रण स्थितियों (चित्र 6) की तुलना में एक असामांय प्रकटन के साथ ARVC का प्रतिशत बढ़ा । छह दिन में, ७१.११% ± सभी गिना ARVC ionomycin के साथ इलाज के ४.६५% एक असामांय उपस्थिति दिखाया । हालांकि, नियंत्रण शर्तों के तहत, केवल ५१.३५% ± ३.५५% ARVC इस समूह में वर्गीकृत किया गया था ।

Figure 6
चित्रा 6: एक अस्वस्थ उपस्थिति के साथ ARVC. ionomycin के साथ उपचार (1 µ m) दिन 0 पर ARVC, जो एक असामांय उपस्थिति दिखाया की संख्या में एक महत्वपूर्ण वृद्धि हुई । 6 दिन में, नियंत्रण और ionomycin के साथ इलाज ARVC के बीच का अंतर महत्वपूर्ण था । डेटा के रूप में प्रस्तुत कर रहे है ± SEM; n = 4 सेल की तैयारी; मान-Whitney-U test; * पी ≤ ०.०५ कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

खेती के 3 दिन में, ionomycin के साथ उपचार के तहत, qRT-पीसीआर β-MHC की mRNA अभिव्यक्ति में कमी (पी ≤ ०.०१) और OSM, जो दोनों ARVC के de-भेदभाव में एक अलग भूमिका निभाने का पता चला (चित्रा 7A और सी) । Swiprosin-1, पुनः के लिए एक मार्कर ARVC के अंतर काफी downregulated था, भी (चित्रा 7B) ।

Figure 7
चित्रा 7: ionomycin के साथ उपचार के तहत De-और फिर से खेती ARVC के भेदभाव
(1 µ m) दिन में 0 oncostatin m (OSM) और β-MHC, जो दोनों वयस्क cardiomyocytes के de-विभेद में मुख्य भूमिका निभाते की एक घटी हुई mRNA अभिव्यक्ति की वजह से । इसके अतिरिक्त, Swiprosin-1 की mRNA अभिव्यक्ति, वयस्क cardiomyocytes के पुनः विभेदन में एक प्रमुख खिलाड़ी, ionomycin उपचार से भी कमी आई. खेती का दिन 3; डेटा के रूप में प्रस्तुत कर रहे है ± SEM; n = 30 प्रति समूह सेल संस्कृति प्लेटें; मान-Whitney-U test; * p ≤ ०.०५; * * पी ≤ ०.०१ कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

पूर्व चढ़ाना मध्यम
20 मिलीलीटर CCT मध्यम
2% Vol. पेनिसिलिन/Streptomycin (४०० μL)
4% Vol. FCS (८०० μL)
मध्यम चढ़ाना
20 मिलीलीटर CCT मध्यम
2% Vol. पेनिसिलिन/Streptomycin (४०० μL)
धुलाई मध्यम
20 मिलीलीटर CCT मध्यम
2% Vol. पेनिसिलिन/Streptomycin (४०० μL)
नोट: पूर्व-चढ़ाना मध्यम में 4% vol. FCS 1 vol.-% laminin (०.५ μg/cm2) द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है । इसके अतिरिक्त, कई दिनों के लिए cardiomyocytes खेती के लिए धुलाई मध्यम करने के लिए 20 Vol.-% FCS जोड़ें । भंडारण चढ़ाना मध्यम और धोने के माध्यम से 4-8 डिग्री सेल्सियस का उपयोग कर जब तक ।

तालिका 1: संस्कृति मीडिया cardiomyocyte अलगाव के लिए इस्तेमाल किया

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Discussion

vivo में वयस्क cardiomyocytes का व्यवहार अन्य कोशिकाओं (जैसे, न्यूरॉन्स, endothelial कोशिकाओं, fibroblasts, भड़काऊ कोशिकाओं) और विद्युत syncytium जो वे फार्म1के साथ कई बातचीत से प्रभावित है. इसलिए, वयस्क cardiomyocytes का अध्ययन तनाव अनुकूलन विशेष रूप से अलगाव और ARVC की खेती की आवश्यकता है । अलग और ARVC खेती के मुख्य प्रभाव हैं: 1) extracellular मैट्रिक्स और सेल-सेल संपर्कों से उन्हें तोड; 2) सिकुड़ा उत्तेजनाओं से उन्हें तोड; 3) उंहें दो आयामी परिवेश के लिए एक तीन आयामी ऊतक से अनुकूलन के लिए मजबूर । इन शर्तों के तहत, ARVC शुरू de-और फिर से भेदभाव के रूप में ऊपर वर्णित है और कई रूपांतरों, जो भी vivo में कार्डिएक remodeling के दौरान देखा जाता है प्रदर्शन (β-adrenoceptor संवेदीकरण, sarcomeres के विधानसभा, आदि) 4. इसलिए, वयस्क cardiomyocytes के अलगाव इन कोशिकाओं और विभिंन उपचार के लिए उनकी प्रतिक्रिया की जांच करने के लिए एक वैध विधि का प्रतिनिधित्व करता है । इन अंतर्दृष्टि बाद में vivo प्रयोगों, जो अनावश्यक प्रयोगों से बचने और परीक्षण जानवरों की संख्या को कम करने में सहायता करेगा के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । निश्चित रूप से, कुछ विट्रो में देखा निष्कर्षों vivo में (जैसे, pseudopodia संरचनाओं के गठन नहीं हो जाएगा) । मौजूदा सेल-सेल-संपर्क विद्युत syncytium के भीतर शारीरिक शर्तों के तहत अत्यधिक विकास में बाधा होगी17. फिर भी, पृथक और खेती ARVC वयस्क cardiomyocytes के व्यवहार की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इसके अतिरिक्त, मानव में हृदय रोगों के खिलाफ नए उपचार रणनीतियों के पहले परीक्षण ARVC के साथ आयोजित किया जा सकता है ।

वयस्क cardiomyocytes के अलगाव और खेती के लिए वर्णित विधि में कुछ महत्वपूर्ण बिंदु होते हैं. सफल परिणाम प्राप्त करने के लिए निम्न मदों पर विचार करना होगा ।

1. कैल्शियम सहिष्णुता: ऐतिहासिक रूप से, वयस्क cardiomyocytes के कैल्शियम सहिष्णुता एक सफल अलगाव और वयस्क cardiomyocytes1,7की खेती के लिए अग्रणी कारकों में से एक था, 8. आजकल, प्रोटोकॉल शारीरिक कैल्शियम की स्थिति1,3के तहत खेती सुनिश्चित करने के लिए स्थापित कर रहे हैं । इस पांडुलिपि अलग ARVC की गुणवत्ता पर एक बदल intracellular कैल्शियम एकाग्रता के प्रभाव से पता चलता है । Ionomycin, जो intracellular कैल्शियम सांद्रता बढ़ जाती है, प्रसार में एक महत्वपूर्ण कमी और एक असामांय रूप के साथ cardiomyocytes की संख्या में एक महत्वपूर्ण वृद्धि हुई । इसके अलावा, यह कार्डियक डे और पुन: विभेदन के लिए प्रमुख मार्करों के एक downregulation का कारण बना-β-MHC, OSM, और Swiprosin-1 । इसलिए, खेती के दौरान intracellular कैल्शियम एकाग्रता को बदलने के लिए नए वातावरण के अनुकूल करने के लिए ARVC की क्षमता में बाधा । हालांकि कुछ ARVC प्रसार और अनुकूलन करने में सक्षम थे (९.८७% ± २.७७% सभी गिने ARVC के; चित्रा 5), इन शर्तों के तहत ARVC की एक सटीक जांच संभव नहीं है । नतीजतन, एक सटीक अलगाव और ARVC के एक स्थापित कैल्शियम प्रोटोकॉल की खेती के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए । इसके अतिरिक्त, यह सुनिश्चित किया जाना चाहिए कि जांच के उपचार में से कोई भी ARVC के कैल्शियम रक्तस्तम्भन के साथ हस्तक्षेप ।

2. Collagenase: Collagenase के विभिन्न बैचों उपलब्ध हैं । प्रत्येक बैच की गुणवत्ता और प्रभावशीलता में अंतर दिखाता है1। इसलिए, लेखकों आदेश और विभिन्न बैचों के नमूने परीक्षण की सिफारिश. इसके अतिरिक्त, पाचन के समय और प्रत्येक नए बैच के collagenase की राशि का अलग से मूल्यांकन किया जाना चाहिए । तदनुसार, एकाग्रता और पाचन के समय वर्णित प्रोटोकॉल में अंय प्रोटोकॉल के लिए थोड़ा अलग कर सकते हैं ।

3. दिल छिड़काव जब तक समय: ARVC की एक उच्च गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए, शरीर से दिल निकालने और Langendorff प्रणाली के साथ छिड़काव की शुरुआत के बीच समय के रूप में संभव के रूप में कम होना चाहिए । लंबे समय तक गैर-व्यवहार्य ARVC की एक उच्च संख्या में दिल और परिणाम को नुकसान का कारण बनता है ।

इसके अतिरिक्त, 5 मिनट के लिए छिड़काव और पाचन के दौरान छिड़काव समाधान वार्मिंग ऊतक काटने के बाद एक अच्छा परिणाम उपज के लिए आवश्यक है । जैविक ऊतकों की अनावश्यक क्षति से बचने के लिए, यह सब समय बिंदुओं पर ध्यान से नियंत्रित किया जाना चाहिए । इसके अलावा, यह बताया जाना चाहिए कि OSM या FCS के कम सांद्रता के साथ उपचार भी de-और पुन: अंतर करने के लिए ARVC को सक्षम करें4,10,18,19। हालांकि, इन पोषक उपचार के बिना, ARVC कुछ दिनों के भीतर पतित2।

अंत में, अलगाव और ARVC की खेती एक संवेदनशील तरीका है कि विशेष रूप से वयस्क cardiomyocytes के व्यवहार की जांच संभावनाओं की एक किस्म प्रदान करता है ।

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Disclosures

परिणाम दिखाया Franziska Nippert के डॉक्टरेट थीसिस का हिस्सा हैं ।

Acknowledgments

लेखकों ने तकनीकी सहायता के लिए Woitasky और पीटर Volk को धन्यवाद दिया । इसके अतिरिक्त, लेखकों ने पांडुलिपि तैयार करने में उसकी मदद के लिए श्रीमती क्लाउडिया Lorenz (चिकित्सा लेखक, ACCEDIS) का शुक्रिया अदा किया । यह पांडुलिपि DFG (Schlu 324/7-1) द्वारा आर्थिक रूप से समर्थित थी ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Langendorff perfusion system inhouse construction double-walled with a water
based heating system
Tissue chopper Mc Ilwain Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd.
Aortic Cannula, OD 1,8 mm inhouse construction
Abdominal shears Aeskulap BC772R
Capsule forceps Eickemeyer 171307
Dissecting scissor large Aeskulap BC562R
Dissecting scissor small Aeskulap BC163R
Mash with Polyamid Neolab 4-1413 mash size 200 μm
plastic disc Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd.
Collagenase Typ II Worthington LS004177

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References

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चिकित्सा अंक १२८ वयस्क cardiomyocytes कैल्शियम सेल संस्कृति ionomycin चूहा swiprosin-1 प्रसार
अलगाव और वयस्क चूहे Cardiomyocytes की खेती
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