Summary
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Isolierung und Kultivierung von Erwachsenen Ratte ventrikuläre Kardiomyozyten (ARVC). Isolierte ARVC kann für kurz- und langfristige Anbau verwendet werden. Die Isolierung und Kultivierung ARVC können eine Schlüsselrolle bei der Entwicklung von neuen Behandlungsschemata für kardiale Erkrankungen spielen.
Abstract
In einem intakten Herzen beeinflussen benachbarte Zellen adulten Kardiomyozyten. Mit der Methode der Isolierung und Kultivierung von adulten Kardiomyozyten ist eine genaue Untersuchung des Verhaltens dieser Zellen unter bestimmten Behandlungen und Umgebungen möglich. Diese Handschrift enthält ein Protokoll für erfolgreiche Isolierung und Kultivierung von Erwachsenen Ratte ventrikuläre Kardiomyozyten (ARVC).
Die Ratte ist durch zervikale Dislokation Tiefe Narkose geopfert. Dann, das Herz wird extrahiert und die Aorta ist aufgedeckt. Anschließend wird die Perfusion auf dem Langendorff Perfusion System mit Kalzium Erschöpfung und Kollagenase-Behandlung durchgeführt. Danach bekommt ventrikuläre Gewebe gehackt, wieder in Umlauf gebracht, und gefiltert, gefolgt von drei Zentrifugation Schritte mit allmählicher Zugabe von CaCl2 bis physiologischer Calcium-Konzentration erreicht ist. ARVC sind beschichtet, auf Zelle Kultur Gerichte. Nach dem Aktualisieren der Zellkulturmedium, können ARVC kultiviert bis zu sechs Tage lang ohne Änderung der Serum-haltigen Kulturmedium. Isolierung von ARVC ist ein Kalzium sensibler Prozess. Kleine Änderungen in der intrazellulären Calcium-Konzentration führen eine Abnahme in der Qualität und Rentabilität der isolierten Zellen.
Frisch isolierte ARVC Rod geformt sind. In den ersten Tagen des Anbaus verlieren sie die stabförmige Morphologie und Form Pseudopodien-ähnliche Strukturen (Verbreitung). Während dieser morphologischen Bildung ARVC zunächst verschlechtern ihre kontraktile Elemente, gefolgt von einer Reformation durch Aktin Stress Fasern und de Novo Sarcomerogenesis. Nach einer Woche des Anbaus die meisten ARVC zeigen eine weit verbreitete Erscheinung mit einem eindeutig nachweisbar Kreuz Streifenbildung. Dieser Prozess ist empfindlich auf intrazellulären Calcium-Konzentration, wie Behandlung mit Ionomycin Ausbreitung vermindert. Wichtigsten Marker in diesem Prozess der de - und re - differentiation sind β-Myosin heavy Chain (β-MHC), Oncostatin M (OSM) und Swiprosin-1 (EFHD2). Jüngste Studien haben vorgeschlagen, dass kardiale Re und de differentiation Auftritt unter Kulturbedingungen Funktionen gesehen in Vivo bei kardialen remodeling imitiert. Isolierung und Kultivierung ARVC spielen daher eine Schlüsselrolle für das Verständnis der Biologie der Herzmuskelzellen.
Introduction
Adulten Herzmuskelzellen in Vivo Arbeit als eine elektrische Synzytien nach Zell-Zell-Kontakten zwischen Myozyten. Darüber hinaus werden sie von benachbarten Zellen wie kardialen Fibroblasten, Endothelzellen, Neuronen und Entzündungszellen1beeinflusst. Um die Fähigkeit der Kardiomyozyten Anpassung ihrer intrazellulären Organisation zu studieren verändert Lastbedingungen, wie gesehen in Herzhypertrophie, die ein erster Schritt zur Herzinsuffizienz, die Isolierung und Kultivierung von Erwachsenen ventrikuläre Ratte führt Herzmuskelzellen (ARVC) ist notwendig2,3,4. In der Vergangenheit wurden Kardiomyozyten zunächst isoliert von embryonalen Küken Herzen5,6. Wenige Jahre später, wurde die erste Isolierung der unheilbar differenzierter Herzmuskelzellen mit Kalzium Erschöpfung7beschrieben. Allerdings diese adulten Kardiomyozyten waren nicht Kalzium tolerant und daher nicht für funktionelle Assays verwendet werden konnten. Schließlich, im Jahr 1976 ein neues Protokoll aktiviert Powell und Twist Erwachsenen ventrikuläre Herzzellen unter physiologischen Bedingungen8zu untersuchen. Als ersten Schritt isoliert sie Erwachsene Herzzellen unter niedrigen Kalzium-Konzentrationen und danach erhöhte Kalzium zu physiologischen Konzentrationen in einem schrittweisen Verfahren. Heute die meisten Protokolle zur Isolierung und Kultivierung von adulten Kardiomyozyten arbeiten mit diesem Kalzium-Protokoll und Kollagenase für die enzymatische Verdauung von dichten Zell-Zell Kontakte1verwenden.
Für einen erfolgreichen Anbau ist fetalen Kälberserum (FCS) oder Oncostatin M (OSM) erforderlich. ARVC führen eine de - und re - differentiation mit umfangreichen strukturellen Veränderungen einschließlich Sarkomers Demontage und Reformation9,10,11,12. Dieser Prozess ist durch einen erneuten Ausdruck der fetalen Typ Gene, wie β-Myosin heavy Chain (β-MHC) begleitet, wie man von Hypertrophie und eine Bildung von Pseudopodien-ähnliche Strukturen, auch genannt Verbreitung4,11, 13. Darüber hinaus Swiprosin-1 (EFHD2), ein neu identifizierten Protein spielt eine wichtige Rolle bei der erneuten Differenzierung der kultivierten ARVC11. Infolgedessen ARVC in Kultur verwandeln sich in weit verbreiteten, polymorphe Zellen, die Kontraktionen spontan nach zwei bis drei Wochen in Kultur2,4,14zeigen.
Die jüngsten Entdeckungen haben gezeigt, dass kardiale Re und de differentiation wie sie unter Kulturbedingungen Mimik Auftritt gesehen in Vivo während kardiale Umbau10,15bietet. Kardialen remodeling ist ein Schlüsselprozess bei Herzkrankheiten16. Da Herzerkrankungen noch die häufigste Todesursache in den industrialisierten Gesellschaften sind, ist es wichtig, ein besseres Verständnis der Biologie der adulten Kardiomyozyten (wer, 2015). Isolierung und Kultivierung ARVC können helfen, um neue Strategien und Medikamente für die Behandlung von Herzkrankheiten zu entwickeln. Mit diesem Manuskript ist ein Protokoll für die Isolierung und Kultivierung ARVC zur Verfügung gestellt. Darüber hinaus werden einige kritische Teile dieser Methode in die Diskussion Abschnitt hervorgehoben.
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Protocol
die Untersuchung nach der Anleitung für die Pflege und Verwendung von Labortieren durch die US National Institute of Health (NIH Publikation Nr. 85-23, revidiert 1996) veröffentlicht. In der Regel männliche Wistar-Ratten im Alter von 3 bis 4 Monaten und mit einem durchschnittlichen Gewicht von 250-350 g sind für dieses Protokoll verwendet. Eine Ratte Herz ist ausreichend für 20 Kultur Gerichte (1 mL pro Schale; innen-ø: 35 mm) mit einer ungefähren Zelldichte von 1,5 x 10 4 Zellen/1000 mm 2.
1. Vorbereitung der Medien und Reagenzien
- Kreatin Carnitin Taurin Medium (CCT Medium)
Hinweis: CCT Medium ist ein komplexes Medium basierend auf Medium 199 mit dem Zusatz von Kreatin, Carnitin und Taurin.- Bereiten Sie 1 L Medium 199: 3,6 g Hepes und Mix hinzufügen und für 1 h. Dann fügen Sie 655,5 mg Kreatin (5 mM), 395,4 mg Carnitin (2 mM) und 625,5 mg Taurin (5 mM). Carnitin und Taurin ändern pH bis < 7. Um das Wachstum von kontaminierenden Zellen, z. B. Endothelzellen und Fibroblasten hemmen, fügen Sie 10 µM Cytosin β-D-Arabinofuranoside auf das Medium. Den pH mit NaOH (2 mM) auf 7,4 und steriler Filter das Medium anpassen. Speichern der CCT-Medium bei 4 ° c
- Powell Medium
- für 1 L Powell Medium lösen 6,43 g NaCl (110 mM) mit 0,19 g KCl (2,5 mM), 0,16 g KH 2 PO 4 (1,2 mM), 0,3 g MgSO 4 7 H 2 O (1,2 mM), 5,96 g Hepes (25 mM), und 1,98 g D (+ )-Glucose-Monohydrat (10 mM) in sterilen Aqua. 7.4 und steriler Filter Medium pH mit NaOH (2 M) passen. Shop-Powell-Medium bei 4 ° c
- Kalzium-Chlorid (CaCl 2)
- vorbereiten eine 100 mM CaCl 2-Lösung (50 mL) und bereiten Aliquote mit 500 µL CaCl 2. Einfrieren der Aliquote bei-20 ° c
- Vorbereitung Kulturmedium
- bereiten drei Zelle Nährböden: Pre-Beschichtung, Medium, Beschichtung, und Waschmedium. Verwenden Sie CCT-Medium für alle drei Medien (Tabelle 1) als Grundlage. CCT-Medium mit 1 mL pro Kulturschale zu berechnen. Daher bereiten 20 mL CCT Medium für 20 Kultur Gerichte (Innendurchmesser: 35 mm).
- Zelle Kultur Platten: jede Kultur Zellplatte zu beschichten (Innendurchmesser: 35 mm) mit 1 mL Pre-plating Medium. Die beschichteten Platten bei 37 ° C über Nacht oder mindestens 2 Stunden vor der Verwendung zu speichern.
2. Isolierung von adulten Kardiomyozyten
- Vorbereitung von Langendorff Perfusion System
- erhitzen, Beschichtung und Waschmedium auf 37 ° c ein Rohr von 500 µL CaCl 2 aufzutauen und wiegen 25 mg Kollagenase.
- Bündig Langendorff Perfusion System mit Aqua-steril, danach lassen Sie Powell Medium zirkuliert das System für 5 min.
- 80 mL Powell Medium Langendorff Perfusion System einfüllen, ohne irgendwelche Bläschen und Gas das Medium mit 95 % Sauerstoff air.
- Bereiten Sie eine Tube (50 mL) mit 40 mL Powell Medium, auf 37 ° C erwärmen und mit 95 % Sauerstoff gas.
- Bereiten Sie einen Thread von ca. 25 cm Länge zur Befestigung entfernt mitten auf die Kanüle.
- Entfetten eine Rasierklinge mit Alkohol (70 % nach Volumen) und befestigen Sie ihn an den Häcksler. Klemmen Sie eine Kunststoffscheibe in den Häcksler.
- Extraktion des Herzens
- eine männliche Wistar-Ratten mit 4 % bis 5 % Isofluran zu betäuben und mit zervikale Dislokation zu opfern. Öffnen Sie den Bauch hinter den Rippenbögen mit einem Bauch Scherkräften und mit der gleichen Schere, Schnitt durch die Membran der Brusthöhle öffnen.
- Entfernen Sie das Herz mit der Lunge und Thymus, durch Schneiden oben hoch kranialen Thymus in der Brusthöhle. Übertragen Sie das Material sofort auf eiskalten Salzlösung.
- Der Lunge und Thymus aus dem Herzen mit einer sezierenden Schere (groß) zu entfernen und durch das Material mit der Kapsel Pinzette fixieren, letztere auf eine neue Kochsalzlösung übertragen.
- Isolation
- entfernen überschüssiges Gewebe, wie Rückstände aus Thymus, Luftröhre, Fett und Bindegewebe aus dem Herzen mit Kapsel Zange und einen sezierenden Schere (groß oder klein). Aufdecken die Aorta und trennen Sie es mit einer sezierenden Schere (groß oder klein) zwischen der ersten und zweiten Kiemen Arch
- Starten das Abtropfen von Langendorff Perfusion System. Platzieren Sie das Herz an der Kanüle von Langendorff Perfusion System und fixieren Sie es zuerst mit einem Krokodil-Klemme und später mit dem vorbereiteten Thread. Spülen Sie das Herz, bis es frei von Blut ist.
- 25 mg Kollagenase in 5-6 mL warmen Powell Medium auflösen und Hinzufügen von 12,5 µL CaCl 2 (30 µM).
- Verkehr in unmittelbarer Nähe ein Glastrichter, verbunden mit dem Langendorff Perfusion System, über das tropfende Herz bewegt und die Perfusion System gelöst Kollagenase hinzufügen. Starten Sie die Durchblutung für 25 min mit einer Drop-Geschwindigkeit von 1 Tropfen pro Sekunde.
Hinweis: Während der Perfusion, das Herz wird anschwellen und eine wachsartige aussehen. - Die Perfusion nach 25 min zu stoppen und das Herz aus dem Langendorff Perfusion System entfernen. Der Aorta, Atrien und Bindegewebe aus dem Herzen zu entfernen, und öffnen Sie die Rechte und linke Ventrikel.
- Hacken das Herz zweimal in einem Winkel von 90° (Schnittbreite: 0,7 mm; Geschwindigkeit: 0,15 cm/s). Wiederholen Sie diesen Vorgang manuell mit zwei Skalpelle für 10 s pro Seite.
- 12 mL des Mediums Perfusion überführen in ein neues Gefäß (50 mL). Gießen Sie die Zelle Gülle in dieses Medium und Digest Zellen für weitere fünf Minuten bei 37 ° C. Mix Lösung jede Minute.
- Die Lösung mit dem verdauten Herzen durch eine Nylon-Mesh (200 µm) in ein neues Gefäß (50 mL) zu filtern.
- Zentrifugieren die filtrierte Lösung bei 29 X g für 3 min. verwerfen den Überstand und 6 mL warmen Powell Medium darunter 12,5 µL CaCl 2 (250 µM), die Zelle Pellet hinzufügen. Das Pellet durch glatte zitternden Bewegungen aufzuwirbeln. Zentrifugieren Sie wieder bei 29 X g für 2 min. überstand verwerfen und 6 mL warmen Powell Medium mit 25 µL CaCl 2 (500 µM) ersetzt. Auflösen der Zelle Pellet durch sanftes Schütteln Bewegungen und fügen 12 mL warmen Powell mittlere einschließlich 120 µL CaCl 2 (1 mM). Zentrifuge für ein drittes Mal bei 16 X g für 1 min. Wieder entfernen des Überstands.
- Mischen die Zelle Pellet mit dem vorgewärmten Beschichtung Medium.
- Pre-Beschichtung Medium aus Kultur Platten entfernen. 1 mL Plattieren Medium, einschließlich der isolierten Kardiomyozyten auf jede Kultur-Platte zu übertragen. Inkubieren Sie frische isolierte Kardiomyozyten bei 37 ° C für 1 h
- Entfernen der Beschichtung Medium von Kultur-Platten. Fügen Sie 1 mL Waschmedium auf jede Kultur-Platte und die Platten bei 37 ° C bis zu sechs Tage ohne Ändern des Mediums speichern.
- Zur Untersuchung des Einfluss der verschiedenen Chemikalien und Behandlungen auf ARVC, zuerst aktualisieren Beschichtung Medium indem Waschmedium und danach verschiedene Chemikalien.
Hinweis: Auswertung mit Lichtmikroskopie: mit jeder Zelle Vorbereitung, 150 bis 300 Kardiomyozyten sollte pro Tag von Lichtmikroskopie überwacht werden. Alle gezählte Kardiomyozyten nach ihrem Auftritt in Gruppen zu unterteilen (z. B. " stabförmigen ", " abrunden ", " Verbreitung ", und " ungewöhnliches Aussehen "). Die Kategorie " Verbreitung " umfasst alle Herzmuskelzellen mit Pseudopodien-ähnlichen Strukturen. " Ungewöhnliches Aussehen " umfasst alle ARVC mit einer unregelmäßigen Oberfläche und keine nachweisbaren intakte Zellmembran.
3. Beispiel Experimente
- Analyze morphologischen und strukturelle Umwandlungen von ARVC während des Anbaus durch konfokale Lasermikroskopie Fluoreszenz/Immunfluoreszenz-Färbung der adulten Kardiomyozyten. Mithilfe von Phalloidin-TRITC F-Aktin Strukturen untersuchen " stabförmigen ", " abrunden ", und " verbreiten " ARVC. Führen Sie nach Angaben des Herstellers Färbung ' s-Protokoll. Ein Beispiel für Phalloidin-TRITC Färbung erhält in Referenz Nippert Et al. 11. mit Fluoreszenz/Immunfluoreszenz-Färbung, Unterschiede in der de - und re - differentiation des kontraktilen Apparates in kultivierten adulten Kardiomyozyten zwischen experimentelle Behandlungen (z. B. mit Swiprosin-1, Ionomycin) untersucht werden können.
- Echtzeit-quantitative RT-PCR (qRT-PCR)
- durchführen qRT-PCR um Veränderungen in der mRNA Expression verschiedener Gene zu untersuchen (z. B. OSM, Swiprosin-1, β-MHC) während des Anbaus der ARVC. Für ausreichende Stichprobengröße verwenden größere Kultur Gerichte (Innendurchmesser: 60 mm) mit 2 mL Volumen. ARVC fünf Kultur Gerichte ergibt eine Probe. Isolierung von mRNA und Transformation der cDNA nach Angaben des Herstellers durchführen ' s Protokoll.
- Immunoblot-Techniken
- führen Western Blots, Änderungen im Protein-Expression (z. B. für Swiprosin-1) während des Anbaus der ARVC zu untersuchen. Verwenden einer Kulturschale (1 mL) pro Probe.
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Representative Results
Erwachsenen Herzzellen in Kultur: Abbildung 1 zeigt eine Übersicht über frisch isolierte adulten Kardiomyozyten 2 h nach dem letzten waschen. Etwa 75 % aller Herzzellen hatte eine stabförmige Morphologie. Die restliche 25 % zeigten eine ungewöhnliche Erscheinung mit einer Runde Morphologie und keine nachweisbaren intakte Zellmembran (Abbildung 1). Am Ende des Anbaus (6. Tag), bis zu 15 % der alle Herzmuskelzellen zeigte verbreiten, etwa 10 % blieb in eine Runde Morphologie ohne Pseudopodien-ähnliche Strukturen und 75 % der alle Herzmuskelzellen präsentiert eine ungewöhnliche Erscheinung, mit einer unregelmäßigen Oberfläche und ohne eine nachweisbare intakte Zellmembran (Daten nicht gezeigt).
Abbildung 1: Übersicht über frisch isolierte Ratte Kardiomyozyten. Der Anteil der frisch isolierten Kardiomyozyten zeigte eine stabförmige Morphologie belief sich auf 75 % der Herzmuskelzellen, im Durchschnitt. Die restliche 25 % der Zellen präsentiert eine ungewöhnliche Erscheinung mit einer unregelmäßigen Oberfläche und keine nachweisbaren intakte Zellmembran. Aufnahme wurde durch Lichtmikroskopie 2 h nach dem Waschen die frisch isolierten Herzzellen durchgeführt. Lichtmikroskopie 2 X Vergrößerung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Mit Lichtmikroskopie erschien frisch isolierte ARVC Rod geformt und rund 100 µm groß (Abbildung 2A). Frisch isolierte ARVC, die spontan Vertrag wurden nicht Kalzium tolerant. Alle Zellen, die rund und ohne eine erkennbare intakte Zellmembran wurden beschädigt und nicht lebensfähig (Abbildung 2A-B). In den folgenden Tagen verlor einen Großteil der Stab förmige ARVC diese Morphologie. Zellen haben einen nachweisbaren intakte Zellmembran Runden. Diese ARVC waren lebensfähig. Ab Tag drei letzteren Zellen gebildet Pseudopodien-ähnlichen Strukturen. Einige von diesen ARVC beibehalten ihre abgerundeten Erscheinungsbild bei der Ausbringung (Abb. 2 b). Andere umgewandelt in Wohnung, polymorphe ARVC (Abb. 2 b).
Abbildung 2: isoliert Ratte Kardiomyozyten. (A) frisch isolierte ARVC waren in der Regel stabförmige. (B) nach sechs Tagen in der Kultur waren Pseudopodien-ähnliche Strukturen (Verbreitung) in die nun abgerundete ARVC eindeutig nachweisbar. Einige ARVC umzusteigen komplett auf eine weit verbreitete Morphologie. Eine unregelmäßige Oberfläche und keine nachweisbaren intakte Zellmembran angezeigt ARVC mit einem ungewöhnlichen Auftritt. Lichtmikroskopie 10 X Vergrößerung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Frisch isolierte ARVC waren in der Regel Rute mit einer deutlich sichtbaren Kreuz Streifenbildung (Abbildung 3, Tag 0) geprägt. Veränderungen der Zellmorphologie wurden in den folgenden Tagen in Kultur beobachtet. Zunächst verlor ARVC ihre kontraktile Elemente (Abbildung 3Tage 1 und 2). Es folgten eine Reformation, de Novo Sarcomerogenesis verwickelt. Die Reformation wurde durch die Bildung von Pseudopodien-ähnliche Strukturen (Verbreitung, Abbildung 3Tage 3 bis 6) voraus. De Novo Sarcomerogenesis begann mit dem Auftreten von Aktin Stress Fasern (Abbildung 3, Tag3). Darüber hinaus zusammengebaut Actin-Bündel erschien in der perinukleären Region und neu gebildet Sarkomeren (Abbildung 3Tage 4 und 5). Letztere stieg entlang der vorgeformten Aktin-Stress-Fasern in der Peripherie (Abbildung 3, Tag 6). Am Ende der Anbau-Periode (Tag 6a) war ein typisches Kreuz Rasterung aus neu zusammengesetzten Sarkomeren in der Verbreitung ARVC beobachtet.
Abbildung 3: Fluoreszenz beflecken. Die de - und re - differentiation von ARVC in Kultur mit 20 % FCS wird angezeigt. Frisch isoliert wurde ARVC mit ihrer typischen Stab-Form (Tag 0) Runde durch Abbau von Sarkomeren während der ersten Tage der Kultur (Tag1). Sie verloren alle ihre kontraktile Elemente (Tag2) gefolgt von Bildung von Pseudopodien-ähnliche Strukturen (Verbreitung; 3-5 Tage) und anschließende Reformation der kontraktilen Elemente angibt de Novo Sarcomerogenesis (Tag 6). Am sechsten Tag in Kultur, Kreuz Streifenbildung war wieder eindeutig nachweisbar (Tag 6a). Färbung mit Phalloidin-TRITC laut Protokoll des Herstellers; "Pfeile": Pseudopodien-ähnliche Strukturen (Beispiel); *: Actin-Bündel in der perinukleären Region (beispielhaft gezeigt). Teile davon sind veröffentlicht in11. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 zeigt die kinetische des sich ausbreitenden Prozesses während des Anbaus. Der Anteil der ARVC Darstellung von Pseudopodien-ähnliche Strukturen zu jedem Zeitpunkt der Prüfung erhält als breitet sich in % (Abbildung 4). Verbreitung rund um am dritten Tag begonnen und ständig während der Zeit der Anbau erhöht. 14,7 % ± 1,39 % aller gezählten ARVC zeigte Pseudopodien-artige Strukturen nach sechs Tagen im Anbau.
Abbildung 4: Verbreitung kinetische Anstieg der Herzzellen mit Pseudopodien-ähnliche Strukturen auf alle gezählten Kardiomyozyten (Verbreitung in %) während sechs Tagen Kultivierung Zeit normalisiert (n = 33 Zelle Vorbereitungen). Daten werden als ± SEM bedeutet präsentiert Diese Zahl wird in11veröffentlicht. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Wirkung von Ionomycin auf die Verbreitung von ARVC: Die Isolierung und Kultivierung ARVC ist ein Kalzium sensiblen Prozess1,8. Behandlung von ARVC mit Ionomycin (1 µM), die intrazellulären Calcium-Konzentration zunimmt, verursacht eine signifikante Abnahme (p ≤0.01) bei der Bildung von Pseudopodien-ähnlichen Strukturen im Vergleich zu Kontrollen (Abbildung 5). Direkt gegenüber, 17.19 % ± 2,45 % aller gezählten ARVC zeigte Verbreitung unter Kontrolle Bedingungen aber nur 9,87 % ± 2,77 % aller gezählten ARVC gebildet Pseudopodien-ähnlichen Strukturen in Anwesenheit von Ionomycin (Tag 6 der Anbau). So reduziert Ionomycin Verbreitung durch 42.58 %.
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Abbildung 5: Verbreitung von Kinetik unter der Behandlung mit Ionomycin. Behandlung mit Ionomycin (1 µM) am Tag 0 verursacht eine hochsignifikante Verringerung Zelle verbreiten im Vergleich zur Kontrolle. Daten werden präsentiert, als ± SEM bedeutet; n = 4 Zelle Vorbereitungen; Mann-Whitney-U-Test; * p ≤0.05; ** p ≤0.01 Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
Darüber hinaus stieg Ionomycin der Anteil der ARVC mit einem ungewöhnlichen Auftritt im Vergleich zur Kontrolle Bedingungen (Abbildung 6). Am Tag zählte sechs, 71.11 ± 4,65 % aller ARVC mit Ionomycin zeigten eine ungewöhnliche Erscheinung behandelt. Allerdings wurden nur 51,35 % ± 3,55 % der ARVC unter Kontrolle Bedingungen, in dieser Gruppe kategorisiert.
Abbildung 6: ARVC mit einem ungesunden auftritt. Behandlung mit Ionomycin (1 µM) am Tag 0 verursacht eine deutliche Steigerung der Zahl der ARVC, die einen ungewöhnlichen Auftritt zeigte. Am 6. Tag war der Unterschied zwischen Steuerung und ARVC behandelt mit Ionomycin signifikant. Daten werden präsentiert, als ± SEM bedeutet; n = 4 Zelle Vorbereitungen; Mann-Whitney-U-Test; * p ≤0.05 Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
Am Tag 3 des Anbaus unter der Behandlung mit Ionomycin offenbart qRT-PCR eine Abnahme der mRNA Expression von β-MHC (p ≤0.01) und OSM, die beide eine unterschiedliche Rolle bei der de-Differenzierung der ARVC (Abbildung 7A und C spielen). Swiprosin-1, ein Marker für eine Differenzierung der ARVC wurde deutlich herunterreguliert, zu (Abb. 7 b).
Abbildung 7: De - und re - differentiation von kultivierten ARVC unter der Behandlung mit ionomycin
(1 µM) am Tag 0 verursacht eine verminderte mRNA Expression von Oncostatin M (OSM) und β-MHC, welche beide spielen eine wichtige Rolle bei der de-Differenzierung der adulten Kardiomyozyten. Darüber hinaus wurde mRNA Expression von Swiprosin-1, ein wichtiger Akteur bei der erneuten Differenzierung der adulten Kardiomyozyten, auch durch Ionomycin Behandlung verringert. Tag3 der Anbau; Daten werden präsentiert, als ± SEM bedeutet; n = 30 Kultur Zellplatten pro Gruppe; Mann-Whitney-U-Test; * p ≤0.05; ** p ≤0.01 Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
| Vor Beschichtung medium |
| 20 mL CCT medium |
| 2 % Vol Penicillin/Streptomycin (400 μl) |
| 4 Vol.-% FCS (800 μl) |
| Beschichtung-medium |
| 20 mL CCT medium |
| 2 % Vol Penicillin/Streptomycin (400 μl) |
| Waschmedium |
| 20 mL CCT medium |
| 2 % Vol Penicillin/Streptomycin (400 μl) |
| Hinweis: 4 % Vol FCS in Pre-Beschichtung Medium kann durch 1 Vol.-% Laminin (0,5 μg/cm2) ersetzt werden. Darüber hinaus für den Anbau von Kardiomyozyten für mehrere Tage Fügen Sie 20 Vol.-% FCS hinzu, das Waschmedium. Lagern Sie Beschichtung und Waschmedium um 4 bis 8 ° C bis zur Verwendung von. |
Tabelle 1: Kulturmedien verwendet für Cardiomyocyte Isolierung
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Discussion
Das Verhalten der Erwachsenen Herzzellen in Vivo ist beeinflusst durch viele Interaktionen mit anderen Zellen (z.B.Neuronen, Endothelzellen, Fibroblasten, Entzündungszellen) und die elektrischen Synzytien bilden sie1. Studium Stress Anpassung der adulten Kardiomyozyten ausschließlich erfordert daher, die Isolierung und Kultivierung ARVC. Die wichtigsten Auswirkungen der Isolierung und Kultivierung ARVC sind: 1) trennen sie von der extrazellulären Matrix und Zell-Zell Kontakte; (2) trennen sie von kontraktilen Stimuli; (3) zwingen, aus einem dreidimensionalen Gewebe sich zweidimensionale Umgebung anzupassen. Unter diesen Bedingungen ARVC starten de und re differentiation wie oben beschrieben und führen Sie mehrere Anpassungen, die auch beim kardialen umgestaltet in Vivo (β-Adrenoceptor Desensibilisierung, Zusammenbau von Sarkomeren, etc.) zu sehen sind 4. daher die Isolation der adulten Kardiomyozyten repräsentiert eine gültige Methode, diese Zellen und ihre Reaktion auf verschiedene Behandlungen zu untersuchen. Diese Erkenntnisse können danach für in Vivo Experimente, die helfen würden, vermeiden unnötige Experimente und Verringerung der Zahl der Versuchstiere verwendet werden. Sicherlich, einige Ergebnisse gesehen in Vitro nicht in Vivo (z.B. die Bildung von Pseudopodien-ähnlichen Strukturen) erfolgen. Die bestehenden Zelle-Zelle-Kontakte innerhalb der elektrischen Synzytien werden übermäßiges Wachstum unter physiologischen Bedingungen17behindern. Isoliert und kultiviert ARVC ist allerdings lässt sich das Verhalten der Erwachsenen Kardiomyozyten zu untersuchen. Zusätzlich können erste Versuche neue Behandlungsstrategien gegen Herzerkrankungen bei Menschen mit ARVC durchgeführt werden.
Das beschriebene Verfahren zur Isolierung und Kultivierung von adulten Kardiomyozyten enthält einige kritische Punkte. Um erfolgreiche Ergebnisse zu erzielen, sind folgende Punkte zu beachten.
1. Kalzium Toleranz: historisch, die Kalzium-Toleranz von adulten Kardiomyozyten war einer der kritischsten Faktoren führt zu einer erfolgreichen Isolierung und Kultivierung von adulten Kardiomyozyten1,7, 8. heute Protokolle sind festgelegt, um Anbau unter physiologischen Kalzium Bedingungen1,3zu gewährleisten. Diese Handschrift zeigt den Einfluss der eine geänderte intrazellulären Calcium-Konzentration auf die Qualität der isolierten ARVC. Ionomycin, die intrazellulären Calcium-Konzentration erhöht, verursacht eine signifikante Abnahme der Verbreitung und eine deutliche Zunahme der Zahl der Herzzellen mit einem ungewöhnlichen Auftritt. Darüber hinaus verursacht es eine Herunterregulierung der wichtigsten Marker für kardiale de - und re - differentiation: β-MHC, OSM und Swiprosin-1. Änderung der intrazellulären Calcium-Konzentration während des Anbaus behindert daher die Fähigkeit der ARVC, Anpassung an neue Umgebungen. Obwohl einige ARVC waren in der Lage, zu verbreiten und anpassen (9,87 % ± 2,77 % aller gezählten ARVC; ( Abbildung 5), ist eine genaue Untersuchung der ARVC unter diesen Bedingungen nicht möglich. Daher sollte für eine präzise Isolierung und Kultivierung ARVC eine etablierte Kalzium-Protokoll verwendet werden. Darüber hinaus sollte sichergestellt werden, dass keiner der untersuchten Behandlungen mit Kalzium Blutstillung von ARVC beeinträchtigen.
2. Collagenase: gibt es verschiedene Chargen der Kollagenbildung. Jede Charge zeigt Unterschiede in Qualität und Wirksamkeit1. Daher empfehlen die Autoren bestellen und Proben verschiedener Chargen. Darüber hinaus nutzte die Zeit der Verdauung und die Höhe der Kollagenbildung jeder neuen Charge muss separat ausgewertet werden. Dementsprechend können die Konzentration und die Zeit der Verdauung im Protokoll beschrieben, andere Protokolle leicht abweichen.
3. Zeit bis zum Herzen Perfusion: um eine hohe Qualität der ARVC zu gewährleisten, sollte die Zeit zwischen extrahieren das Herz aus dem Körper und dem Beginn der Perfusion mit dem Langendorff-System so kurz wie möglich sein. Ein längerer Zeitraum schädigt das Herz und führt zu einer höheren Anzahl von nicht-lebensfähige ARVC.
Darüber hinaus Erwärmung die Perfusion-Lösung bei der Durchblutung und Verdauung für 5 Minuten nach dem Hacken des Gewebes wichtig, was ein gutes Ergebnis ist. Zur Vermeidung von unnötigen Beschädigungen des biologischen Gewebes sollte es an all-time-Punkten vorsichtig umgegangen werden. Darüber hinaus es sei darauf hingewiesen, dass die Behandlung mit OSM oder niedrigere Konzentrationen von FCS ermöglichen auch ARVC, de - re differentiate4,10,18,19. Aber ohne diese nutritiven Behandlungen, ARVC entartete innerhalb von ein paar Tagen2.
Zusammenfassend, ist die Isolierung und Kultivierung ARVC eine empfindliche Methode, die bietet eine Vielzahl von Möglichkeiten, um das Verhalten der Erwachsenen Kardiomyozyten ausschließlich zu untersuchen.
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Disclosures
Die dargestellten Ergebnisse sind Teil der Doktorarbeit von Franziska Nippert.
Acknowledgments
Die Autoren danken Nadine Woitasky und Peter Volk für technische Hilfe. Darüber hinaus danken den Autoren für ihre Hilfe bei der Vorbereitung der Handschrift Frau Claudia Lorenz (medizinische Schriftsteller, ACCEDIS). Dieser Handschrift wurde finanziell unterstützt von der DFG (Schlu 324/7-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Langendorff perfusion system | inhouse construction | double-walled with a water based heating system |
|
| Tissue chopper Mc Ilwain | Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd. | ||
| Aortic Cannula, OD 1,8 mm | inhouse construction | ||
| Abdominal shears | Aeskulap | BC772R | |
| Capsule forceps | Eickemeyer | 171307 | |
| Dissecting scissor large | Aeskulap | BC562R | |
| Dissecting scissor small | Aeskulap | BC163R | |
| Mash with Polyamid | Neolab | 4-1413 | mash size 200 μm |
| plastic disc | Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd. | ||
| Collagenase Typ II | Worthington | LS004177 |
References
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