Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

أورثوتوبيك زرع المبيض إجراءات للتحقيق في تأثير الشيخوخة المبيض في الفئران الإناث مدى الحياة والصحة

Published: February 12, 2018 doi: 10.3791/56638

Summary

الموصوفة هنا أورثوتوبيك بروتوكولات زرع المبيض لتعديل تأثير المبيض على فسيولوجيا الماوس المتلقية. هذه العملية الجراحية يتم استخدامه لفضح الفئران الإناث إلى أنواع مختلفة من التأثير المبيض وقد تشمل عمليات الزرع هيتيروتشرونيك وزرع المبايض التي خضعت للعلاجات المختلفة السابقين فيفو .

Abstract

زرع المبيض أجريت أولاً في جامعة ولاية يوتا في عام 1963. في أعمال أكثر حداثة، يستخدم هيتيروتشرونيك زرع المبايض الثدييات للتحقيق في آثار واقية من صحة الشباب المبايض في الإناث الصغار. الإجراءات الحالية التي تستخدم أسلوب زرع أورثوتوبيك، حيث يتم زرع allogenic المبايض مرة أخرى إلى موضعها الأصلي في الجراب المبيض. هذا على النقيض من زرع أنسجة المبيض/المبيض هيتيروتوبيك أكثر شيوعاً تحت الجلد أو تحت الكبسولة الكلي. وتوفر جميع المواقع الثلاثة عودة التوعي فعالة لزرع الأنسجة. ومع ذلك، زرع أورثوتوبيك يوفر المبيض مع البيئة الطبيعية أكثر مما يشير إلى وهو الإجراء الوحيد الذي يتيح الفرصة للحيوان استنساخها بطبيعة الحال قد. واحد يجب أن تأخذ الرعاية لإزالة جميع أنسجة المبيض الذاتية أثناء إجراء أوفاريكتومي. إذا تبقى أي الأنسجة الذاتية أو إلا إذا تمت إزالة المبيض واحد، زرع الأنسجة سوف تظل نائمة حتى يصبح مسن الأنسجة القائمة. حين عودة التوعي زرع المبيض يحدث بسرعة كبيرة، المستلم زرع الأعضاء يمكن أن يستغرق قدرا كبيرا من الوقت للتكيف مع محور (HPG/A) طائي/الغدة النخامية/جوندال/الكظرية جديدة مما يشير إلى نظام المقترنة زرع الأنسجة. وهذا يأخذ عادة حوالي 100 يوم في الماوس. ولذلك، ينبغي تصميم تجارب زرع لاستيعاب هذه الفترة التكيف. وستشمل النتائج النموذجية مع زرع المبيض التغيرات في الصحة للمستلم الذي يعكس عصر زرع المبيض، بدلاً من سن chronological المستلم.

Introduction

تأثير الاستنساخ على الصحة ومدى الحياة عن طريق الخطأ غالباً ما يعتقد كما تقتصر فقط على الفترة التي تشمل الكفاءة التناسلية. بينما نمط الحياة وتعمل المرتبطة بمرحلة التناسل المختصة على مدى الحياة بسهولة التفريق في مراحل ما قبل وبوستريبرودوكتيفي، مركز الإنجاب يؤثر على صحة طوال جميع مراحل العمر. فترة الكفاءة التناسلية غالباً ما يشار إلى فترة الحياة الإنجابية، تمييز نفسه عن العمر الزمني. هذه المصطلحات يفسح المجال لفصل مصطنع للتسميات عمر اثنين عندما في الواقع، وكلاهما عن كثب مرتبطة ببعضها البعض مع الأحداث التي تؤثر على واحد، أكثر الأحيان، التي تؤثر على الأخرى، وكذلك.

الأدلة على مدى العقد الماضي تشير إلى أن الحالة الإنجابية للفرد يرتبط بزيادة خطر النامية الظروف الصحية المزمنة1. دراسة واحدة موثقة اقتران بين يمتد أقصر للحياة وعدم الإنجاب لجماعة من الرجال2. الرابطة حتى أكثر بروزا في المرأة. أمراض القلب والأوعية الدموية نادرة في النساء قبل انقطاع الطمث3، ولكن فشل المبيض يزيد من أمراض القلب والأوعية الدموية انخفاضا حادا في سن إلياس4 وشابات من السابق لأوانه فشل المبيض5. فقدان6 والعظام مقاومة الأنسولين زيادة في انقطاع الطمث7 وهي تقريبا ثلثي الأميركيين مع مرض الزهايمر النساء8. التغييرات لاتكفي في المبيض مما يشير إلى علامة الانتقال من دولة قبل انقطاع الطمث، ومقاومة للأمراض، إلى دولة بعد سن إلياس، وأعباء المرض. هذه مرحلة انتقالية مستقرة، فرصة للتعرف على الآليات التي تعجل بمخاطر المرض في الشيخوخة.

وقد استخدمت مؤخرا، زرع أنسجة المبيض cryopreserved لاستعادة الخصوبة في المرأة التي تخضع للإجراءات الطبية التي قد تعرض للخطر الخلايا الجرثومية الخط، مثل العلاج الكيميائي. يمكن أيضا استخدام زرع أنسجة المبيض لإنتاج ذرية قابلة للحياة في الحيوانات بالعقم على أساس غير المبيض، بما في ذلك الفئران المعدلة وراثيا9. زرع المبيض طريقة فعالة لفصل تأثير وظيفة الإنجاب أو الشيخوخة الإنجابية من الشيخوخة الزمني في حد ذاته.

دور داعم الراسخة لهرمونات المبيض في العديد من جوانب صحة الإناث تورط الخسائر في إنتاج هرمون من ركوب الدراجات بنشاط الخلايا الجرثومية، كالسبب الرئيسي لمخاطر المرض زيادة في انقطاع الطمث. بينما قيمة هرمونات المبيض في صحة الإناث لا يرقى إليها الشك، الاستعاضة عن هذه الهرمونات في المناطق المحيطة بالمدن-والمرأة بعد سن إلياس قد لا يمكن الاعتماد عليها في استعادة الفوائد الصحية التي تتمتع بها المرأة الشابة المبايض الشباب. تتم استعادة هذه الفوائد الصحية موثوق بها هيتيروتشرونيك زرع المبايض الشباب للفئران الإناث بوستريبرودوكتيفي10،،من1112،،من1314.

ينبغي تحديد الحالة الإنجابية للفئران المانحة والمتلقية على حد سواء قبل وبعد زرع الأعضاء أو إجراءات أوفاريكتومي. مفترض من الفئران بوستريبرودوكتيفي التي تعرض علامات جوندال المدخلات قبل الجراحة في غضون 12 شهرا عمر مستبعدة من هذه التجارب. الإدخال gonadal يتحدد بعلم الخلايا المهبلية. يتم جمع البيانات في الخلايا المهبلية لجراحة قبل أيام متتالية على الأقل 10 لضمان دولة بوستريبرودوكتيفي في الفئران المستفيدة وركوب الدراجات بنشاط المبيض في الفئران المانحين. يظهر أحد دورة استروس يعرف بأنه الفترة من اليوم المنبسطة الخلايا الظهارية أولاً (أي، بروستروس) في اليوم السابق لمظهر القادم من الأنوية الخلايا الظهارية في اللطاخة المهبلية، شريطة أن يكون هناك فترة من ليوكوسيتيك الوجود (أي، ديستروس) بينهما. السفاد يتحدد بوجود الخلايا الظهارية كبيرة، صدفية، مع أو بدون نوى. الفئران التي عرضها أي نشاط دوري لمدة عشرة أيام قبل أو بعد الجراحة مصممون على أن أي مدخلات جوندال للفترة المذكورة. الفئران التي عرض واحد على الأقل من الدورة الشبقية الكاملة في فترة عشرة أيام قبل أو بعد الجراحة مصممون أن يكون الإدخال جوندال للفترة المذكورة. ينبغي أن يضم حضور ذكور الفئران الفئران الإناث أو تتعرض للأسرة المتسخة من قفص الذكور لضمان التعرض تتسق بدوره يحفز المحفزات.

يتم إنجاز هذه الإجراءات زرع الأعضاء الأكثر كفاءة مع اثنين من الجراحين العمل في نفس الوقت على البلدان المانحة والمتلقية من الفئران. بيد يتم إنجاز الإجراءات بسهولة بجراح واحد، مع المبايض المانحة المستردة في أغلب الأحيان قبل بداية الإجراء أوفاريكتومي على الماوس المتلقية. ويصف هذا البروتوكول الإجراء لجراح واحد. عادة يتم التعرض للمسالك التناسلية وإغلاق الموقع دون مجهر، بينما يتم إزالة واستبدال المبايض تحت مجهر. مواقع شق مع تعلم أي إجراء العمليات الجراحية، قد يكون أكبر، وقد يستغرق وقتاً أطول في حين تعلم أول الإجراء العمليات الجراحية وعموما وسوف ينخفض مع التجربة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ووضعت جميع الأساليب الموصوفة هنا تحت "مجلس البحوث الوطني في" المبادئ التوجيهية الموجودة في الدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية، وأقرتها لجنة الاستخدام ورعاية الحيوان يوتا الدولة جامعة المؤسسية.

ملاحظة: إجراءات زرع المبيض قد تنطوي على الفئران (سلالة CBA/J) من 21 يوما عمر 18 شهرا من العمر. أصبحت فئران سلالة CBA/ي المختصة التناسل بين 45 و 60 يوما من العمر ومسن التناسل بين 10 و 12 شهرا من العمر.

1-زرع المبايض سليمة للفئران الذين تتراوح أعمارهم بين

ملاحظة: هذا البروتوكول الأول يصف الإجراءات المتبعة أثناء نقل المبيض من ماوس شباب (60 يوما عمر) إلى بوستريبرودوكتيفي الإناث (12 شهرا عمر) من نفس السلالة الفطرية. يتم استخدام نفس الإجراء لزرع المبيض بين أي اثنين من الفئران الإناث.

  1. تزن وتخدير الحيوان المانح بداخل (القائمة، 27 ألجأ الإبرة) الحقن، على سبيل المثال باستخدام مزيج من الكيتامين وإكسيلازيني وأسيبرومازيني (الكيتامين 65 مغ/كغ، 13 مغ/كغ إكسيلازيني 2.0 مغ/كغ، أسيبرومازيني؛ وكوكتيل الجرعة-6.5 مل/كغ). إرجاع الحيوان إلى القفص المنزل ساخنة حتى اتخذت التخدير تأثير.
  2. بمجرد تخديره، إزالة الحيوان من قفص المنزل ومكان على مناشف ورقية ساخنة. لوس أنجليس كليبرز (#40 بليد المفضل)، إزالة الشعر عدد قليل مم الأفقي لخط الوسط على كل جانب، ابتداء من أسفل أضلاعه ونقل ديستالي، إعداد قص 'التصحيح' حوالي 2-3 سم في ساحة على جانبي الماوس المعرضة لترك قطاع من الشعر باستخدام 1-2 سم تقريبا تغطي خط الوسط.
  3. طفيفة مسح المناطق المقطوعة مع الإيثانول 70 في المائة، وتطبيق الحل تدين بموقع المقطوعة مع مسحه القطن ذات الرؤوس.
  4. تطبيق هلام المضادات الحيوية لحماية العين وإدارة ميلوكسيكام (2.0 مغ/كغ) تحت الجلد (الليبي، 27 ألجأ إبرة) على الجانب الأفقي للرقبة الحيوان لتخفيف الألم بعد العمل الجراحي.
  5. وضع الحيوان في موقف المعرضة في حقل جراحة معقمة ساخنة، ومسح المنطقة المقطوعة مع شاش القطن غارقة في الإيثانول 2 سم × 2 سم 70%.
  6. جعل شق بارالومبار 1.0-1.5 سم وصراحة تشريح الجلد من اللفافة الكامنة. جعل شق آخر من خلال اللفافة. صراحة تشريح جانبياً تحت هذه اللفافة سطحي ممكن حتى وصلت إلى تجويف البطن
  7. مكان ثني جراحية صغيرة على شق (قطع من الشاش 2 سم × 2 سم) والرطب ثني مع المحلول الملحي المعقم.
  8. استخدام الملقط الصغيرة، حدد موقع الأنسجة الدهنية التي تحيط بالمبيض في تجويف البطن ولطف استخراج لوحة الدهون والمبيض ووضعه على ثني شاش ترطب. سوف تظهر لوحة الدهون المبيض أكثر 'أبيض' من الأنسجة الدهنية المحيطة بها.
  9. وضع المشبك لدغ 1.5 بوصة من على منصة الدهون (مع الحرص على عدم إعاقة الجراب المبيض) لعقد المسالك في المكان أثناء الإجراء.
  10. نقل مجهر تشريح في مكانها وتحدد بوضوح الجراب المبيض. فهم الجراب مع اثنين الساعاتي الملقط وجدا الجراب المبيض مقابل هيلم المبيض لفضح المبيض. إذا كان هو الغاية vascularized منطقة الوصول إلى المقصود من الجراب، تطبيق قطره أدرينالين (1: 100، 000) بحقنه إلى السطح بورسال للحد من النزيف في وقت تمزق.
  11. بلطف إزالة المبيض من الجراب المبيض والمكوس المبيض لقط في هيلوم المبيض مع ملقط الساعاتي منع النزيف.
  12. وضع المبيض المانحين في مشاهدة الزجاج مليئة سالين معقم 4 درجات مئوية وفضفاضة تغطي جانبا حتى جاهزة للزرع. ومن الناحية المثالية، مكان الزجاج يشاهد تحت مجهر تشريح إضافية حتى يمكن اغتنامها المبايض بسهولة بالجراح في الوقت لزرع الأعضاء.
  13. عند هذه النقطة، أما euthanize أو جانبا الماوس المانحة (يجب أن تكون باستمرار رصد) لتلقي زرع مبيض والأنسجة والخلايا أو حبة زجاج العنصر نائب في مرحلة لاحقة في وقت.
  14. مع حقل جراحية نظيفة والصكوك، أوفاريكتوميزي الحيوان المتلقي كما ذكر أعلاه. تميل إلى أن تكون زيادة كمية الأنسجة الدهنية الفئران الأكبر سنا وقد تحتاج مخدر زيادة جرعة (تصل إلى 20 ٪).
  15. بعد استئصال المبيض من المستلم، ضع قطعة صغيرة من لوحة الرغوة مرقئ داخل الجراب فارغاً التحكم في النزيف والمعونة في تخثر الدم ووضع قطعة صغيرة من الشاش غارقة في المياه المالحة عبر الموقع يتعرض.
  16. تحديد موقع مبيض مانحة (أو الأنسجة، الخلايا، حبة الزجاج نائبا) مع الساعاتي الملقط في واحدة من ناحية، والانتقال إلى المجال مجهر للعرض. مع الملقط آخر في الجهة المقابلة، إزالة الشاش وفي نفس الوقت إزالة لوحة الرغوة مرقئ من الجراب بينما وضع المبيض جديدة داخل الجراب.
  17. إذا لم يتم احتواء المبيض جديدة داخل الجراب المتلقية، قطع المبيض المانحين في النصف (أو 1/3 أو 1/4) ووضع في بورسا في القطع. إذا كان الجراب لا تغطي تماما المبيض كامل، وضع خياطة من خلال الجراب والمبيض مرة أخرى من خلال بورصة لعقد المبيض في مكان (انظر القسم المناقشة).
    ملاحظة: يمكن صعوبة في التعامل مع الملقط الساعاتي الخرز مالك مكان الزجاج.
  18. عند وضع حبة زجاج داخل الجراب، تلتقط حبة مع الملقط أكبر وإسقاط على رأس لوحة الدهون في جوار الجراب المبيض. لفة حبة في الجراب.
  19. التقاط حامل إبرة كاستروفيجو محملة مسبقاً بإبرة مدبب وخياطة شعيرات 9-0 أو 10-0 وتحديد موقع الحافة ممزقة من الجراب وإغلاق بورصة استخدام خيوط Halsted واحد أو اثنين.
    ملاحظة: خياطة يمكن بدلاً من ذلك أن يؤديها مع الساعات أو الملقط الصغيرة الأخرى.
  20. ري الموقع طفيفة مع المحلول الملحي المعقم وإزالة الدهون-لوح المشبك والعودة في لوح المبيض/الدهون في البطن.
  21. إزالة ثني وإغلاق جدار البطن مع القناة الهضمية الكروميك أو فيكريل 6-0. هذه الخطوة يمكن أن يتم مع أو بدون المجهر.
  22. نقل المجهر جانبا (إذا لم نقل في الخطوة السابقة) وإغلاق الجلد مع مقاطع عيار 9 ملم الجرح.
  23. وضع الحيوان في قفص انتعاش ساخنة مظللة من الضوء ومراقبة الحيوان بشكل مستمر حتى التعافي من التخدير. ويمكن استخدام ميلوكسيكام إضافية 24 ساعة قد إذا بينت. إزالة القصاصات الجرح حوالي تسعة أيام قد.
    ملاحظة: تستخدم لا تقنيات كآبته، وتم الكشف عن أي دليل على الاختلاس – مقابل – المضيف المرض بعد زرع الأعضاء أو عند الوفاة.

2-زرع الخلايا الجرثومية المنضب المبايض للفئران سليمة.

ملاحظة: هذا البروتوكول ينطوي على نقل المبيض من ماوس الصغار، واستنفاد الخلايا الجرثومية لأنثى بوستريبرودوكتيفي. في هذا البروتوكول، المستلمين المبيض وإجراءات أوفاريكتومي وزرع الأعضاء، كما هو مذكور أعلاه بالاستثناء أنه تم زرع المبايض كيميائيا استنفاد الخلايا البدائية والأولية المسام/الجرثومية. تبقى المسام الثانوية و antral سيخضع للتوظيف/الكبدية ترك المبيض خالية من الخلايا الجرثومية. يتم استنفاد الخلايا الجرثومية مع 4-فينيلسيكلوهيكسيني ديبوكسيدي (سي دي) وصفاً جيدا16. تتكون من مادة سامة. لأنه يتم يجري زرع المبايض تعامل VCD لماوس غير المعالجة، فوائد هذا الإجراء من مبيض معاملة تتكون في ماوس لا تتعرض للآثار السامة لأقراص الفيديو. ويصف هذا البروتوكول الإجراء الخاص باستنفاد الخلايا الجرثومية في الشباب، والمانحين المبيض الفئران.

  1. تمييع VCD (64 ملغ/مل) في زيت السمسم للحقن ومخزن في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
  2. حقن المانحين المبيض مرة واحدة يوميا مع VCD القائمة (160 ملغ/كغ) لمدة 15 يوما ابتداء من 28 يوما عمر. حقن الفئران التحكم مع زيت السمسم بعد نفس الجدول الزمني.
  3. في 50 يوما عمر، تحقق من الفئران المعالجة بأقراص الفيديو والنفط فقط تعامل لوقف سيكليسيتي الإنجابية لمدة 10 أيام كما ذكر أعلاه. يجب عرض الفئران المعالجة بأقراص الفيديو في 60 يوما عمر، أي دليل الإدخال gonadal الخلوية.
  4. استرداد المبايض من الفئران عمرها 60 يوما، وزرع الأعضاء المذكورة أعلاه.
  5. تحديد نجاح زرع المبايض المنضب الخلية الجرثومية بالكشف عن عدم ركوب الدراجات الإنجابية وزيادة مستويات تداول التشتوستيرون. نسب الاندروجين: الإستروجين زيادة كبيرة بعد استنفاد الخلايا الجرثومية مع VCD17.
  6. بدء الخلايا المهبلية بعد 10-14 يوما وجمع البيانات لمالا يقل عن 10 أيام متتالية التأكد من تحديد دقيق سيكليسيتي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

أوفاريكتومي في 21 يوما عمر سوف تجنب التنظيم حتى الرئيسية للجهاز التناسلي في بداية سن البلوغ والقضاء على التأثيرات الأخرى قد الغدد التناسلية الإناث بالإضافة إلى ذلك إلى الآثار المباشرة للهرمونات جوندال. عادة ما يبدأ انخفاض التناسلية في الفئران CBA/ي مع دورات غير منتظمة في سن 8-10 أشهر. في 11 شهرا عمر، توصلت معظم الإناث في هذا الخط من الفئران نقطة فشل التكاثر15 مع خسارة كاملة من بويضات تستجيب قبل 12 شهرا عمر. وتختلف هذه الإعمار في سلالات مختلفة من الفئران. زرع أوفاريكتومي الثنائية/المبيض عادة النتائج في تنشيط المبيض المزروعة في غضون أيام قليلة. سيؤدي الفشل في إزالة كلا المبيضين الذاتية (هيمي-أوفاريكتومي) الخاص بالمستلم قبل زرع المبيض المزروعة تبقى نائمة حتى تتم إزالة المبيض الذاتية المتبقية. وتجري العمليات الجراحية في أغلب الأحيان في حقل مفتوح (اكستيريوريزينج في المسالك) وتحت مجهر تشريح (الإجراءات أوفاريكتومي وزرع).

تمديد عمر
متوسط العمر الافتراضي للفئران الإناث CBA/ي من أيام 64418. واختيرت الفئران التي أجريت له عملية جراحية (الشام [إزالة المبيض والاستبدال الفوري] أو زرع) للعيش على الأقل إلى وقت الجراحة. اعتماداً على التجربة، وكان هذا بين 11 و 18 شهرا من العمر. في الأولى تجارب19وأجريت عملية جراحية في 11 شهرا عمر والفئران الشام عاش في متوسط 728 يوما (393 يوما بعد وقت الجراحة) وسليمة الفئران التي تتلقى المبايض جديد عاش أيام 811 (476 أيام الماضي عملية جراحية، GC-تكساس-1، الشكل 1). في تجربة أكثر حداثة، أجريت عملية جراحية في 17 شهرا عمر وعاشت الفئران التي تتلقى المبايض الجديدة أيام 798 (281 يوما في الماضي عملية جراحية، GC-تكساس-2). الفئران التي تلقت الخلية الجرثومية المنضب المبايض تمديد هذا إلى مدى الحياة يعني أيام 880 (363 يوما قد).

تمديد فترة الصحة
تمتد الفئران أن المبايض الجديد، الذي يحتوي على الخلية الجرثومية تلقي عرض انخفض إلى حد كبير من أمراض القلب والشرايين10 و11 من أمراض العظام وأظهرت تحسنا كبيرا من الصحة عدة معلمات. بوستريبرودوكتيفي الفئران التي تلقت المبايض الجديدة في غضون 12 شهرا عمر، وتم اختباره في 16 شهرا عمر، أظهرت sarcopenia انخفاض12،13من تحسين وظيفة المناعة والكلى، وتحسين السلوك المعرفي والحسية الدالة14 .

تحقق استنفاد الخلايا الجرثومية
معاملة الإناث البالغ من العمر اليوم 28 CBA/ي الفئران لمدة 15 يوما مع VCD يؤدي استنفاد المسام البدائية والأولية (التي تحتوي على الخلايا الجرثومية). الفئران CBA/ي تحليل سوى 37 يوما بعد الشروع في وقف العلاج معروضة بالفعل تتكون من سيكليسيتي الإنجابية (كورنيفيكيشن المهبلية المستمرة)، تخفيض الأوزان المبيض (1.7 مغ في النفط فقط مقابل 0.9 ملغ في تعامل VCD) واستنزفت البدائي و الابتدائي جراب المبيض، مقارنة مع الضوابط (الشكل 2).

Figure 1
رقم 1: تأثير المبايض الشباب على مدى الحياة في المستلمين بوستريبرودوكتيفي. الشباب المبايض زرعها إلى 11 شهرا الفئران تمتد مدى الحياة بنسبة 11 في المائة (GC-تكساس-1 ن = 14، تلقي 60 يوم من العمر، المبايض الجديد الذي يحتوي على الخلية الجرثومية في 11 شهرا عمر). زرع المبايض الشباب في 17 شهرا عمر تنتج أي تغيير في تمديد عمر (GC-تكساس-2 ن = 5، 60 يوما من العمر، وتلقى المبايض الجديد الذي يحتوي على الخلية الجرثومية في 17 شهرا عمر). المستنفدة للخلايا الجرثومية من المبايض الشباب قبل زرع تضاعف تمديد عمر 21 في المائة (ن ش ج-Tx = 5، تلقي 60 يوم من العمر، خلية جرثومية نفدت المبايض الجديدة في 17 شهرا عمر). العمر عند الوفاة: عاد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: نفاد تتكون من المسام الصغيرة في الفئران CBA/ي. ح & المقاطع الملون ه (25 س) تظهر المسام الصغيرة الوفيرة (A) في التعامل مع النفط (n = 6) الفئران، (ب) خفض إعداد من المسام الصغيرة في تعامل VCD (n = 4) الفئران، و (ج) واختلافات كبيرة في البدائي والابتدائية أرقام جريب. تشير الأسهم إلى المسام البدائية والأولية. تمثل أشرطة الخطأ ذاته. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وأجريت أوفاريكتومي وزرع المبايض سليمة واستنفاد الخلايا الجرثومية في الفئران تتراوح من 21 يوما إلى 18 شهرا عمر. عند تنفيذ أوفاريكتومي حيث أنه من المستصوب الاحتفاظ بالجراب المبيض سليمة، يجب توخي الحذر عند إينسيسينج الأنسجة بورسال. في الفئران التي مضى عليها أكثر من ستة أشهر من العمر، كثير من الجراب يصبح مضافين مع لوحة الدهون، مما يحد من المجالات التي يمكن أن تستخدم للوصول إلى. وفي هذه الحالات، غالباً مفيد للدموع الجراب مفتوح القريبة من الحدود لوحة الدهون. وكثيراً ما يترك هذا الأسلوب أكثر سهولة 'جيب' من الأنسجة بورسال 'لزمه' المبيض جديدة داخل الجراب. يمكن أن يتطلب هذا النهج أيضا أقل خياطة لإغلاق الأنسجة بورسال. الدورية فتح في الجراب جانبياً يمكن أن يساعد أيضا في الحفاظ المبيض الجديد في المكان أثناء خياطة.

في بعض الأحيان، تحتاج الأنسجة بورسال لفتح على نطاق واسع بسبب تغطية لوحة الدهون المفرطة، والتوجه غير عادية من المسالك أو لاسترداد أجزاء أنسجة المبيض صعوبة استرداد. وفي هذه الحالات، المبيض الجديد قد لا فعلياً يكون 'مدسوس' في الجراب. إذا تم تعيين المبيض أعلى الجراب مفتوح وأكثر من نصف المبيض مغطى بنسيج بورسال المتبقية، يوضع خياطة محفظة-سلسلة جيدا بعيداً عن حافة ممزقة من الجراب والمحيطة بالمبيض. كما شددت المحفظة-السلسلة ببطء، المبيض هو الضغط باستمرار إلى بقية الجراب والجراب هو إغلاق ما يكفي لإبقاء المبيض في مكان، ولكن قد لا تغلق تماما. إذا تم تعيين المبيض أعلى الجراب مفتوح وأقل من نصف المبيض مغطى بنسيج بورسال المتبقية، خياطة وضعها جيدا بعيداً عن حافة ممزقة من الجراب على جانب واحد، عن طريق المبيض، من خلال الجراب على الجانب المعاكس وحياكة أكثر من أعلى من المبيض. هذا الأسلوب قد تتطلب خيوط متعددة ولن تسفر عن تغطية كاملة المبيض قبل النسيج بورسال. ومع ذلك، هذا الأسلوب سوف عقد المبيض في مكان والسماح بعودة التوعي تتسم بالكفاءة وإمكانية استئناف نشاط المبيض.

عند تنفيذ أوفاريكتومي حيث أنه من المستصوب الاحتفاظ بالجراب المبيض سليمة، يجب أيضا الحرص على ضمان هو إزالة كافة أنسجة المبيض الذاتية. وهذا يمكن أن يكون صعباً مع مبيض ذاتية كبيرة. للحفاظ على الأنسجة بورسال كثير ممكن، يمكن إزالة المبايض كبيرة في القطع. ومع ذلك، عند استخدام هذا الأسلوب، يجب استخدام الحذر لضمان إزالة جميع أنسجة المبيض الذاتية. وهذا يمكن أن يكون صعباً بعد أن تتم إزالة جزء من المبيض وقد ملأت الجراب مع الدم. يمكن وضع قطعة صغيرة من لوحة الرغوة مرقئ إلى الجراب مفتوح لتحل محل الدم والمساعدة في تخثر داخل الجراب. بعد 30-60 ثانية، تتم إزالة لوحة الرغوة مرقئ ويتم تفتيش الجراب (الجراب يجوز أيضا أن تشطف طفيفة مع المالحة) لوجود أي الأجزاء المتبقية في المبيض.

زرع المبيض يتطلب أن زرع المبيض يمكن فصلها عن إمدادات الدم المعمول به وليس عودة التوعي المبيض في وطنه الجديد فورا. وبسبب هذا، يخضع زرع المبيض بعض نخر، شملت أساسا المسام ناضجة و/أو المعينين. بيد أن الغالبية العظمى من زرع المبايض عرض نشاط دوري بعد وقت قصير من الزرع وبعض المستلمين زرع سيواصل دورة حتى الموت. ولذلك، لا يظهر فقدان المسام بسبب نخر زرع التأثير بقوة على إنشاء للاندماج في المبيض زرع مضيفة جديدة.

رأي السائد في الشيخوخة الثدييات أن الإستروجين يمثل تأثير الإنجابية الهامة فقط على الصحة. ولاحظ التغيرات الهائلة التي حدثت في مجال الصحة القديمة الفئران التي تلقت المبايض جديدة يمكن أن توصف بسهولة استعادة بسيطة لتعميم مستويات الإستروجين. ومع ذلك، في دراسة أجريت مؤخرا، بثلاثة مختبرات20، تكرارها بشكل مستقل قد 17-α-استراديول أي تأثير على عمر الإناث عندما تتغذى من 10 أشهر عمر. هذه ليست بالتأكيد هذا الهرمون نفسه كأكثر معروفة 17-بيتا-الاستراديول، ولكن العديد من الآثار الصحية المرتبطة الإستروجين قد تم المسند 17-α-استراديول مما يشير إلى21. العلاج بالاستروجين أظهرت أن التأثيرات الإيجابية والسلبية على السواء في العديد من الأمراض المرتبطة بالسن في النساء بعد سن إلياس، ووضوح لا تملك التأثير نفسه في المرأة بعد سن إلياس كما هو الحال في النساء الشابات. بينما إنتاج الإستروجين تحفيز الخلية الجرثومية حاسم بالنسبة للإنجاب في سن إلياس، المبايض المنضب الخلية الجرثومية لا تزال تمتلك سمات تعزيز الصحة، إزالة المبيض بوستريبرودوكتيفي كذلك مع ازدياد معدلات الوفيات، بما في ذلك 22من الأمراض المرتبطة بالعمر. وقد الفئران ovariectomized يمتد حياة أقصر قليلاً من الشام جراحة الفئران (715 أيام مقابل 728 يوما، على التوالي19). إذا تقحم هي المحافظة الآليات التي تؤثر على طول العمر، تدفع الأدلة من طراز الكائنات الحية ضد تفسيراً الإستروجين فقط للصحة تمتد التمديد في الثدييات.

أعاد زرع المبايض مع و بدون نشاط الخلايا الجرثومية الفوائد الصحية إلى مستوى الذي ناضل العلاج بالهرمونات وحدها لتحقيق. العديد من جوانب الصحة، والتي تتأثر تأثرا سلبيا بالشيخوخة في الإناث، يمكن أن يتأثر إيجابيا بإعادة إنشاء وظيفة المبيض النشط في الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين. بيد أن الدراسات التجريبية التي أجريت مؤخرا تشير إلى أن هذه الآثار قد تكون، إلى حد ما، مستقلة عن هرمونات المبيض الخلية الجرثومية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

كان دعم البحوث الواردة في هذا المنشور بهبة سخية من الفئران CBA الإناث 14 شهرا من المعهد الوطني للشيخوخة، و "الذين تتراوح أعمارهم بين مستعمرة القوارض" (نانسي نادون) وجامعة ولاية يوتا، كلية الطب البيطري، إدارة شؤون الحيوانات، ومنتجات الألبان والعلوم البيطرية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dissecting microscope Any dissecting scope with an adjustable working distance.
Warm Water Recirculator and appropriate pad for your size surgical/recovery field. Stryker/Gaymar TP700 Circulating water pads produce even and consistent temperature operating and recovery fields.
Surgical instruments-dissection instruments for access to the reproductive tract Choice of specific surgical instruments is highly surgeon-specific
Surgical instruments-fine instruments for the transplantation procedure. Choice of specific surgical instruments is highly surgeon-specific
Suture material for abdominal wall eSutures G3756K: 6-0 MILD CHROMIC GUT 18" HE-7 CUTTING, DOUBLE ARMED
Suture material for ovarian bursa eSutures 2809G: 9-0 or 2810G: 10-0 ETHILON BLACK 5" BV130-5 TAPER 10-0 suture can be difficult to locate if dropped on the surgery field.
Absorbable gelatin sponge PFIZER. Gelfoam- PFIZER 09-0315-08. cut into small (~2mm) pieces under sterile conditions.
Staples for skin closure Becton Dickinson MikRon Autoclip 9mm (BD 427631)
Eye ointment. MWI Veterinary Supply Co. Puralube sterile opthalmic ointment
Syringes for anesthesia, analgesia and epinephrine MWI Veterinary Supply Co. BD 305536 27g x 3/8in,Intradermal Bevel 1/2ml
Syringes for saline. MWI Veterinary Supply Co. BD 309657. 3ml syringe, luer-lok tip, 27g needle
Clippers/blade Andis Super AGR+™ Cordless Detachable Blade Clipper and a CeramicEdge® #40 blade. Any clippers with a fine blade.
Ethanol University chemical supply dilute to 70% for use.
Betadine solution MWI Veterinary Supply Co. 003233
2x2 gauze pads MWI Veterinary Supply Co. 003073 autoclaved with surgery packs
Borosilicate glass beads Sigma-Aldrich Co. Z273619 Autoclave in sintilation vials
4-vinylcyclohexene diepoxide Sigma-Aldrich Co. 94956
Sesame oil Sigma-Aldrich Co. S3547

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. National Institutes of Health, Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, Fertility and Infertility Branch. 'Fertility Status as a Marker of Overall Health'. "Support studies that investigate fertility status as a marker of overall health for both men and women". New Research Priorities. , (2016).
  2. Eisenberg, M. L., Li, S. F., Behr, B., Cullen, M. R., Galusha, D., Lamb, D. J., Lipshultz, L. I. Semen quality, infertility and mortality in the USA. Hum. Reprod. 29 (7), 1567-1574 (2014).
  3. Thom, T., et al. American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Heart disease and stroke statistics - 2006 update - A report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 113 (6), E85-E151 (2006).
  4. Shuster, L. T., Rhodes, D. J., Gostout, B. S., Grossardt, B. R., Rocca, W. A. Premature menopause or early menopause: Long-term health consequences. Maturitas. 65 (2), 161-166 (2010).
  5. Jacobsen, B. K., Knutsen, S. F., Fraser, G. E. Age at natural menopause and total mortality and mortality from ischemic heart disease: The Adventist health study. J Clin Epidemiol. 52 (4), 303-307 (1999).
  6. Kulaksizoglu, M., et al. Risk Factors for Diabetes Mellitus in Women with Primary Ovarian Insufficiency. Biol Trace Elem Res. 154 (3), 313-320 (2013).
  7. Johnell, O., Kanis, J. A. An estimate of the worldwide prevalence and disability associated with osteoporotic fractures. Osteoporos Int. 17 (12), 1726-1733 (2006).
  8. Rosario, E. R., Chang, L., Head, E. H., Stanczyk, F. Z., Pike, C. J. Brain levels of sex steroid hormones in men and women during normal aging and in Alzheimer's disease. Neurobiol Aging. 32 (4), 604-613 (2011).
  9. Cargill, S. L., Medrano, J. F., Anderson, G. B. Infertility in a line of mice with the high growth mutation is due to luteal insufficiency resulting from disruption at the hypothalamic-pituitary axis. Biol Reproduction. 61 (1), 283-287 (1999).
  10. Mason, J. B., et al. Transplantation of young ovaries restored cardioprotective influence in postreproductive-aged mice. Aging Cell. 10 (3), 448-456 (2011).
  11. Mason, J. B., Terry, B. C., Merchant, S. S., Mason, H. M., Nazokkarmaher, M. Manipulation of Ovarian Function Significantly Influenced Trabecular and Cortical Bone Volume, Architecture and Density in Mice at Death. Plos One. 10 (12), 15 (2015).
  12. Peterson, R. L., Parkinson, K. C., Mason, J. B. Manipulation of Ovarian Function Significantly Influenced Sarcopenia in Postreproductive-Age Mice. J. Transplant. , (2016).
  13. Peterson, R. L., Parkinson, K. C., Mason, J. B. Restoration of immune and renal function in aged females by re-establishment of active ovarian function. Reprod. Fertil. Dev. , (2017).
  14. Parkinson, K. C., Peterson, R. L., Mason, J. B. Cognitive behavior and sensory function were significantly influenced by restoration of active ovarian function in postreproductive mice. Exp. Geront. 92, 28-33 (2017).
  15. Cargill, S. L., Carey, J. R., Muller, H. G., Anderson, G. Age of ovary determines remaining life expectancy in old ovariectomized mice. Aging Cell. 2 (3), 185-190 (2003).
  16. Brooks, H. L., Pollow, D. P., Hoyer, P. B. The VCD Mouse Model of Menopause and Perimenopause for the Study of Sex Differences in Cardiovascular Disease and the Metabolic Syndrome. Physiology. 31 (4), 250-257 (2016).
  17. Rivera, Z., Christian, P. J., Marion, S. L., Brooks, H. L., Hoyer, P. B. Steroidogenic Capacity of Residual Ovarian Tissue in 4-Vinylcyclohexene Diepoxide-Treated Mice. Biol. Reprod. 80 (2), 328-336 (2009).
  18. Yuan, R., et al. Aging in inbred strains of mice: study design and interim report on median lifespans and circulating IGF1 levels. Aging Cell. 8 (3), 277-287 (2009).
  19. Mason, J. B., Cargill, S. L., Anderson, G. B., Carey, J. R. Transplantation of Young Ovaries to Old Mice Increased Life Span in Transplant Recipients. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 64 (12), 1207-1211 (2009).
  20. Harrison, D. E., et al. Acarbose, 17-alpha-estradiol, and nordihydroguaiaretic acid extend mouse lifespan preferentially in males. Aging Cell. 13 (2), 273-282 (2013).
  21. Manay, K., et al. 17α-Estradiol Attenuates Neuron Loss in Ovariectomized Dtg AβPP/PS1 Mice. J. Alzheimers Dis. 23 (4), 629-639 (2011).
  22. Parker, W. H., et al. Ovarian conservation at the time of hysterectomy and long-term health outcomes in the nurses' health study. Obstet Gynecol. 113, 1027-1037 (2009).

Tags

الإنمائية البيولوجيا، العدد 132، عمر، تمتد الصحة، طول العمر، أوفاريكتومي، زرع، التلاعب جوندال، فشل التكاثر، وانقطاع الطمث، المبيض، الشيخوخة، الإنجابية فيما بعد، استنفاد الخلايا الجرثومية
أورثوتوبيك زرع المبيض إجراءات للتحقيق في تأثير الشيخوخة المبيض في الفئران الإناث مدى الحياة والصحة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mason, J. B., Parkinson, K. C.,More

Mason, J. B., Parkinson, K. C., Habermehl, T. L. Orthotopic Ovarian Transplantation Procedures to Investigate the Life- and Health-span Influence of Ovarian Senescence in Female Mice. J. Vis. Exp. (132), e56638, doi:10.3791/56638 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter