Summary
이 문서에서는 설명 합니다 인간의 myometrium의 수축 비보 전 약물 발견. 에 그들의 응용 프로그램을 공부 하 고 실험 프로토콜을 이 기술은 myometrial 생리학과 소설 연구 조사에서 약리 데이터 유효성 검사로 이상 뿐만의 이해를 개선 하는 데 사용 됩니다 또는 마약 리드.
Abstract
발견과 새로운 제약 화합물 또는 생 화 확 적인 프로브의 강력 하 고 순수 관련 분석 결과 시스템에 의존합니다. Ex vivo myometrium 수축 측정 하는 방법을 설명 합니다. 이 분석 결과 요소를 조사 하는 데 사용할 수 있습니다 및 분자 변조 myometrial 수축 및 그들의 흥분 성의 또는 금지 행동을 결정 하 고 따라서 그들의 치료 가능성 비보. Biopsies는 cesarean 섹션 배달을 동의 받은 여성에서 얻을 수 있습니다. 좋은 스트립 myometrium의 해 부, 클립 및 1 mL 기관 탕 37 ° c.에 생리 식 염 수 솔루션 superfused 이내 힘 변환기에 연결 된 스트립 세트 긴장에서 2-3 h 이내 자발적 수축 개발 하 고 많은 시간 동안 안정적으로 유지 (> 6 h). 스트립 또한 같은 내 생 호르몬 옥 시 토 신과 vasopressin, 수축 주파수의 농도 의존 변조 발생, 강제 하 고 기간 더 많은 유사한 수축 노동에서 계약을 자극 수 있습니다. 따라서, 자연과 주 작동 근 유도 수축에 알려진된 새로운 약물 리드의 효과 테스트할 수 있습니다.
이 프로토콜은 특히이 분석 결과 사용 하 여 인간 myometrial 수축의 다양 한 매개 변수에 대 한 그들의 효과 측정 하 여 알려진된 소설 대리인의 힘을 결정 하는 방법을 자세히 설명 합니다. 우리 옥 시 토 신 및 V1a 수용 체 길 항 제, atosiban 및 SR49059 옥 시 토 신 그리고 vasopressin 유도 수축 억제 하 고이 메서드를 사용 하 수 보완 하 고 유효성을 검사 하는 방법을 설명 하는 알려진된 화합물의 예를 사용 하 여 약리 데이터 약물 개발 원조 세포 기반 분석 실험에서 얻은. 옥 시 토 신과 vasopressin에 비해 소설 촉진제의 효과 특징 또한 있습니다. 우리는 oxytocin의 예제를 사용 하는 동안 바소 시스템,이 방법은 또한 수 / 다른 수용 체 및 자 궁 수축과 이완을 인간의 자 궁 생리 및 병 태 생리학의 이해를 사전에 역할을 재생 하는 이온 채널을 연구 하는 데 사용.
Introduction
약물 발견의 목표 생산 소설, 강력한, 그리고 매우 선택적 ligands 활성화 하거나 세포 신호 경로 억제 하 여 치료 응답을 생성 하는 것입니다. 이는 안정적이 고 강력한, 관련 결과1리드 화합물을 테스트 하는 적절 한 분석 결과 시스템이 필요 합니다. 리간드-수용 체 바인딩 및 기능적인 분석 실험 등 약리 기법 자주 분리 셀 기반 시스템, overexpress 수용 체는 존재2되지 않을 것 이라고 설계를 사용 합니다. 이러한 기술을 수용 체의 약리학 및 초기 신약 개발에 대 한 귀중 한 통찰력을 제공 하는 동안 가져온 데이터 진정한 vivo에서 시나리오를 반영 되지 않을 수 있습니다. 그러므로 세포 기반 분석 실험에서 약리 데이터 순수 관련 모델 또한 유효성 중요 하다.
자 궁 평활 근 (myometrium) 조부 자 궁 경부 팽창 하 고 태아3를 제공 하는 노동 하는 동안 수축에 책임 있는 자 궁의 근육 층을 구성 합니다. 축의 myometrium은 자연 스러운; 그것은 호르몬 또는 신경 입력4계약 필요 하지 않습니다. 수축에 대 한 전압 운영 캘리포니아2 +의 개통에 지도 하는 myometrial 세포 막의 자발적인 도발은 가져온 있습니다-채널 (L 형 채널) 및 캘리포니아2 + 셀5으로 유입. 칼슘 calmodulin와 단지 차례로 myosin 말라와 수축과 교차 다리 주기 형성을 활성화 phosphorylates myosin 경 쇄 키 활성화. 휴식은 myosin, myosin 인산 가수분해 효소와의 셀 또는 격리 sarcoplasmic 그물에 (SR)5,6의 압출을 통해 캘리포니아2 + 농도 감소의 탈 인 산화에 의해 일반적으로 중재 ,7.
Myometrial 기능 부전, 자궁내 압력 카 테 터, vivo에서 내부 및 외부 tocography를 myometrial 근원8의 변형 또는 불멸 하 게 세포의 생성을 공부 하 고 여러 가지 방법이 개발 되었습니다. ,,910,,1112. 세포 배양 시스템 물질 세포 수준에서 역할을 할 수 있는지 여부를 감지할 수 있습니다, 하는 동안 조직 기관 탕 내에서 스트립 약리 약 전체 조직의 기능 응답 측정을 도구로 사용할 수 있습니다. 전통적인 기관 목욕 일반적으로 생리 식 염 수 (PSS)의 5와 50 mL 사이 지주 수 있는 대형 온수 유리 챔버입니다. 이러한 큰 챔버 내 스트립은 일반적으로 산소와 대량의 PSS 통 기 통풍이 필요합니다. 직물의 스트립은 해 부 챔버 내에 입욕 중단 고 수축 하는 동안 같은 긴장에 있는 변화를 측정 하는 힘 변환기에 연결 된. 17,18myometrium 인간을 포함 하 여, 기니 돼지13, 마우스14, 쥐15,16, 토끼 등 동물의 제거, 검사 연구 그룹의 숫자에 의해 사용 되었습니다 myometrial 생리학과 병리학, preterm와 기능 장애 노동력을 포함에 관련 된 많은 질문. 예를 들어 myometrial 스트립 규제 및 조직적 활동19,,2021수정, SR22등의 세포 기관이 함수를 결정 하는 요소를 식별 하기 위해 사용 되었습니다 뿐만 아니라 이온의 변조기를 조사23,,2425,26, 펌프와 교환기27 myometrial 생리학에 있는 그들의 역할을 결정 하는 채널.
이 비보 전 기술 있게 조직 수축 성능 평가 및 수축 매개 변수에서 다른 대리인의 직접 효과 측정 등, 수축 힘 (강도), 주파수 및 기간, 뿐만 아니라 총 일 (평균 정수 힘 또는 AUC 곡선 아래의 영역)의 인덱스를 생성 하기 위해 이러한 값의 통합입니다. 격리 된 조직 스트립 준비 하나 이상의 셀 형식의 모델 구성, 전체 조직의 생리 적인 응답을 측정할 수 있습니다. 기관 목욕 및 고립 된 조직 스트립 따라서 셀 문화 작업 및 전체 동물 사이 다리를 제공 하는 유용한 도구는vivo에서 작동 /. 따라서, 약물 발견, 그들의 흥분 성의 측면에서 새로운 대리인의 효과의 분야에서에서 (즉, 자극) 또는 금지 (즉, 휴식) 잠재적인 vivo에서 평가 될 수 있다 더 밀접 하 게. 이 기술은 성공적으로 옥 시 토 신-과 V1a의 개발에 사용 되었다-진통 수축 억제 및 지연 조산 tocolytic 요원으로 (OTR 및 V1aR) 수용 체 길 항 근 atosiban. 옥 시 토 신 (OT)을 크게 줄일 수 적에 게 발견 생체 외에서 myometrial 지구에 atosiban의 테스트-수축28,,2930유도. 중요 한 것은 이러한 연구 atosiban의 변환 값의 유효성을 검사 하는 데 도움이 하 고 필요한 데 앞으로 임상 시험31,,3233,34-의 증거-개념 데이터 생성 . Atosiban는 지금 널리 이용 된다 선택의 약으로 유럽에서 노동 지연. 비슷한 개념 증명 연구 산 후 출혈35,,3637예방 치료 잠재력을 보여 oxytocin 아날로그 carbetocin에 대 한 실시 했다. 이 분석 결과 함께 개발 중인 현재 다른 리드 화합물38 retosiban (GSK221149A) 및 nolasiban (되지 않은 데이터)를 포함 합니다. 이러한 메서드는 또한 환자 그룹39,40,41,,4243,44, 사이 비교를 성공적으로 이용 되었다 45,,4647 내 종 차이 대 한 검사.
우리가 어떻게이 방법을 보완 하 고 약리 데이터 셀 기반 분석 실험에서 얻은 유효성 검사 사용할 수 있습니다 설명 하기 작은 (1 mL) 주문 품 기관 탕 내 임신 인간의 myometrium에서 조직 스트립 절연 ex vivo 의 사용을 설명 하는 여기 . 생 검 조직 것입니다가지고 노출 되지 하 고 그들은 계획 된 수술을 하 고 그러므로 쉽게 생 컬렉션 일정, myometrium에 쉽게 액세스할 미리 노동 선택 제왕 절 개 (CS) 배달을 받은 여성에서 크게 가져온 uterotonic 자극 또는 수술 전에 relaxants입니다. 그러나, biopsies 완전히 환자 동의 충분 한 시간을 제공 하는 노동에서 계획된 (긴급) CS 배달을 받은 여성에서 또한 얻을 수 있습니다. 그러나 그것은 또한 위 세그먼트48,49에서 샘플을 얻을 수 대부분 biopsies의 수술 절 개 사이트에 더 낮은 자 궁 세그먼트에서 수술 하는 동안 얻을 수 있습니다. 몇 가지 경우 다음 질 배달, placental 침대에서 생 검 펀치도 되어 입수50. 그러나, 이것은 대부분의 기존 경로 이며 검색 myometrial 조직 양의 작은. 비 임신 myometrium 양성 부인과 조건에 대 한 자 군 절제를 받은 전 또는 폐 경 후 여성에서 얻어질 수 있다. 전체 두께 생 검, 자 궁 경부에서 낮은 코 퍼스에서 샘플링된 후 병 리 검사 이며 myometrium serosal 자궁내 막 표면 피하 자 궁 벽의 중간에서 가져온 것입니다.
Protocol
인간의 조직 실험에 대 한 적절 한 제도적, 윤리적 검토 보드 및 안전 승인 어떤 인간 조직 작업 하기 전에 장소에 있어야 합니다. 모든 작업 설명 로컬 연구 윤리 위원회에서 여기 수신된 승인 (리버풀 동쪽, REC Ref 10/H1002/49)와 연구 및 개발 부서, 리버풀 여자의 병원 및 리버풀의 대학의 제도적 리뷰 보드.
참고:이 프로토콜에서 설명 하는 모든 biopsies 참여 사전 노동 선택 CS 납품 리버풀 여자의 병원 및 각 여자에 게 서 면 통지 해준 동의 받은 여성에서 얻은 했다.
1입니다. 솔루션
- 다음 구성 수정된 Krebs 생리 염 분 해결책 (PSS) 준비: 154 mM NaCl, 5.6 m KCl m, 1.2 m MgSO4m, 7.8 m m 포도 당, 10.9 mM HEPES, 및 2.0 m m CaCl2.
참고: 만들어질 볼륨 작업 (1 mL/min), 시스템의 유량에서에서 조직의 수에 따라 결정 되 고 실험 평형 및 세척 시간 등의 길이 예상. - PH를 7.4 4 M NaOH를 사용 하 여 조정 합니다.
2. 조직 목욕 설정
- ~ 45 ° c 55-60 ° c.에 설정 반복 물 목욕을 사용 하 여 조직 목욕 시스템 저수지를 예 열
참고: 기구의 기초에 물 공기 통 ~ 45 ° C, 열 교환에 연동 튜브를 통해, 실행 PSS에 대 한 허용 후 PSS 조직 목욕에서 37 ° c.에가 열 설정 온도를 일부 조정 조직 목욕에 PSS의 온도 37 ° c.에 도달 하도록 필요할 수 있습니다. 이 장치를 사용 하 고 유량을 설정에 따라 달라 집니다. - 수동으로 증폭기, 데이터 수집 및 기록 시스템, 흡입 펌프 등 다른 필요한 장비를 켠다.
- 연동 펌프 헤드의 롤러 주위 각 연동 피더 관 (1 관 목욕 당)를 배치 합니다. 보안 유지 중지 및 압축 카메라 강화 및 튜브 주위 키 잠금. PSS의 1 L 용기에 무료 연동 피더 튜브 끝을 놓고 조직 목욕으로 지속적으로 perfuse를 PSS 수 있도록 펌프를 시작 합니다.
- 목욕으로 흐름의 속도 제거의 속도 목욕에 있는 솔루션의 수준을 일정은 흡입 펌프 제대로 작동 확인 합니다. 조직 목욕에 PSS의 수준 모델러의 점토를 사용 하 여 욕조에 흡입 관의 깊이 조작 하 여 조정할 수 있습니다.
- 힘 변환기 변환기 훅에 알려진된 무게 (1 millinewton (미네소타, 힘의 단위)에 해당)을 배치 하 고 수집 소프트웨어에 의해 감지 하는 편향도 기록 하 여 보정.
참고: 값을 기록 하는 값만 분석 하는 동안 어떤 추가 변환을 수행할 필요가 negating 자동 변환 됩니다 소프트웨어에서 조정할 수 있습니다. 힘 변환기의 교정 조직 장착 하기 전에 수행 되어야 합니다.
3. 조직 준비 및 스트립의 해 부
- 아기의 태 반 배달 후 CS에서 생 검 임신 인간의 myometrium (1-2 cm3)의 수집 합니다. (일반) 전체 두께 biopsies에 decidua (자 궁의 가장 안쪽 층)와 perimetrium (자 궁의 외부 serosa 레이어)는 현재를 얻을. Myometrial 조직 (중앙 근육 층)만 사용 합니다. 그림 1A-B를 참조 하십시오.
- 이러한 조직 myometrial 수축 변경할 수 있는 물질을 생산 알려져 있습니다 (필수) decidua 및 어떤 부착 태아 막 (있는 경우)을 제거 합니다.
참고: 수술, 샘플 행 크 스 균형 소금 솔루션 (HBSS) 또는 신선한 PSS에 배치 및 4 ° c.에 저장 그러나 연구 후 4 ° C51에 저장 된 컬렉션의 18 h 수축에 아무 해가 이상적으로 조직 수술, 12-16 h 내에서 사용 되어야 한다. 4 ° c.에 장기간된 보관 후 조직 생존 능력 및 기능을 확인 하려면 적절 한 컨트롤을 수행 해야 합니다. 여기에 샘플 더 낮은 자 궁 세그먼트 절 개 사이트의 상단 가장자리에서 및 위 세그먼트에서 가져옵니다. 자 궁의 하위 및 상위 세그먼트48마찬가지로 계약 표시 되었습니다, 따라서 더 낮은 세그먼트 biopsies 간주 됩니다 위 세그먼트 myometrial 활동의 좋은 반영.
- 이러한 조직 myometrial 수축 변경할 수 있는 물질을 생산 알려져 있습니다 (필수) decidua 및 어떤 부착 태아 막 (있는 경우)을 제거 합니다.
- 절 개 지역 등 필요한 악기를 준비: 큰 해 부가 위, 작은 욕실이 해가 위, 두 해 집게, 절 개 핀, 및 알루미늄 조직 클립 고정 둘 다 해 부 현미경 및 확대/축소 확대입니다.
- 명확한 실리콘 기반 해 부 접시에 생 샘플 ( 재료의 표참조) 가득 PSS 신중 하 게 장소 찾으시는 생 검 serosa decidua 가장자리 식별 되도록 그림 1B.
- 접시의 기지로 생을 확보 하 여 핀을 사용 합니다. 조직 해 부 과정을 통해 PSS와 수 화 된 남아 확인 합니다.
- 수동으로 현미경 광원에 스위치와 myometrium 흉터 조직, serosa, decidua, 및 있는 경우 모든 부착 태아 막의 영역을 식별 하기 위해 10 배 확대에 현미경 조직 검사.
- 큰 해 부가 위를 사용 하 여 공개 두 평면이 나 근육의 2 개의 인접 조직 층을 분리 하는 무딘 해 부를 수행 합니다.
참고: 그것은 종종 쉽게 분리 하려면 조직 계층 간의 작은 주머니를 찾을 수 있지만 주의 '주머니'에 대 한 오해 될 수 있다 생 검 가장자리에 작은 혈관을 피하기 위해 해야 합니다. - 그것을 확보 하는 조직의 각 모서리에 핀 해 부 장소. 병렬로 실행 하는 섬유와 근육의 지역에 대 한 찾고 근육의 시트를 검사 합니다.
참고: 지역 식별은 작은 모세 혈관 조직을 통해 perfusing의 방향에 따라 주 었 될 수 있습니다. 부드러운 조직 가장자리에 당기 식별할 수 있습니다 또한 섬유 여행 하는 방향. - 직물의 스트립을 버려야 ~ 2mm 폭 x 8 m m 긴 x 1 m m 두꺼운 작은 해 부가 위를 사용 하 여 근육 섬유의 방향으로 정렬 하는 세로 축 따라.
참고: 합니다 주의을 조직 손상을 방지 하려면 초기 잘라 가장자리에 의해. - 실험에 대 한 필요한 스트립의 수 해 부 과정을 반복 합니다.
- 제대로 하 고 접시, 스트레칭 이상 하지 않도록 돌보는 조직 확보를 양쪽 끝에 각 스트립을 고정 합니다.
- 그들 사이 조직은 알루미늄 조직 클립 양쪽 끝을 연결 ~ 5mm 길고 신중 하 게 버려야 어떤 초과 조직 (그림 1C).
- PSS 장착을 위한 준비로 가득 깨끗 한 접시에 전송.
4. 장착 욕탕 조직
- 실험 조직 목욕에 스트립을 전송 합니다. (같이 전통적인 기관 목욕) 가로 보다는 세로로 스트립을 탑재 (그림 2B).
- 조직 수축 측정, 힘 변환기를 클립에 의해 각 스트립의 한쪽 끝을 연결 하 고 고정 하는 다른 챔버 내에 조직 둘 다에 연결.
참고: 조직 목욕의 용량 ~ 1 mL는 스트립은 욕조에 완전히 빠져들 수 있도록 충분히 큰입니다. - 스트립은 목욕에서 각 연결의 기지에서 확인 합니다.
- 소프트웨어 아이콘에 더블 클릭 하 여 레코딩 소프트웨어를 엽니다.
- 채널 창에서 보기에 각 채널에 대 한 녹음을 조정 한다.
- 마우스 오른쪽 클릭 하 여 Y 축, 선택 '규모' 와/숫자 입력 최소 및 최대 값은 0과 10, 각각 0-10 V (0-10 미네소타 게시물 교정에 해당) 사이 읽을 수 Y 축 눈금을 조정 합니다. '확인'을 선택 합니다. 각 채널 녹음에 대해 반복 합니다.
- 라이브 녹음을 하려면 소프트웨어에 '기록'을 누릅니다.
참고: 스트립은 각 연결의 기지에 보안 되지, 그들은 녹음 '노치'으로 나타나는 수축 동안 풀 수 있습니다. 세트 긴장 됩니다 변경 하 고 따라서 수축 후 공전 다를 수 있습니다. - 각 변환기에 연결 된 micromanipulators를 수동으로 설정 하 여 각 욕실에는 조직 스트레칭. 화면에 기준선에서 위쪽 조직 움직임에 따라 고 초기 긴장 0.2 g (~ 2만)에 도달할 때까지 micromanipulators을 계속 합니다.
참고: 조직 즉시 시작 됩니다 긴장 (초기 긴장에 있는 하락에 의해 지적), 일반적으로 0.5-1 사이 지속적인 긴장에 도달 미네소타. 이 정의 된 긴장은 우리의 실험 조건에이 크기의 조직 스트립에 대 한 최적화 되었습니다. 다른 크기의 조직을 사용할 수 있다면, 그것은 적절 한 길이 긴장 관계 조사 적용할 쉬고 힘을 최적화 하기 위해 수행 됩니다 필수적입니다. - 조직에 대 한 equilibrate 하 수 ~ 자연 스러운 수축 발생 될 때까지 2 시간.
참고: 기준선 긴장에 있는 작은 상승 일반적으로 관찰 하 고 조직 생존의 좋은 표시 이다 그리고 그것은 수축 됩니다.
5. 도전 40 mM 칼륨 (높은 K+)와 조직
- 없는 자연 스러운 수축 장착의 2 시간에 따라 발생 하는 경우는 칼륨 상승 40 m m KCl 위한 NaCl의 isosmotic 대체 하 여 높은 칼륨 소금 솔루션 스트립 도전 한다. 높은 k+(mM)에 다음을 추가: 119.6 NaCl, 40 KCl, 1.2 MgSO4, 7.8 포도 당, 10.9 HEPES, 및 2.0 CaCl2.
참고: myometrium 같은 부드러운 근육에 높은 K+ 의 응용 하면 수축 운영 전압 칼슘 채널 조직 세포에 캘리포니아2 + 의 최대 유입에 지도 직접 열어. 높은 K+ 따라서 최대한 조직 응답의 측정을 달성 뿐만 아니라 조직의 무결성의 일반 인덱스를 테스트 하는 수단으로 사용할 수 있습니다.- 목욕 1-2 분에 대 한 높은 K+ 를 포함 하는 유리 실험실 병에 도전 하는 스트립을 포함의 피더 튜브를 놓습니다.
- PSS의 컨테이너 피더 튜브를 반환 합니다.
- 높은 K+ 에 대 한 응답을 달성 하 고, 어디 계속 추가 1 시간에 대 한 스트립을 모니터링. 높은 k+ 수축 응답 또는 elicited 자발적인 활동이 높은 K+ 응답을 게시 하는 경우 스트립 폐기.
참고:는 실험 또한 있이 필요가 알고 죽은 공간 (시간은 조직 목욕을 도달 하는 솔루션에 대 한) 높은 K+에 대 한 응답을 평가 하기 전에 피더 튜브에. 이 2-3 분을 걸릴 수 있고 유량에 따라 달라 집니다. - 후속 기동을 영향을 미칠 수, 목욕 및 피더 관에서 높은 K+ 의 완전 한 유실 되도록 자발적 수축 진행 하기 전에 사전 높은 K+ 진폭 돌아올 때까지 기다릴 더 실험.
6. Myometrial 수축에 알려지고 소설 화합물의 효과 테스트
참고: 자연 (그림 3A) 또는 주 작동 근 자극 수축 (그림 3B-C)에 myometrial 기능에는 새로운 약 및 시 약의 효과 테스트 하는 실험을 수행할 수 있습니다. 주 작동 근에 대 한 자극 수축, OT 또는 아르기닌 vasopressin (부사장)는 0.5의 농도 게 PSS에 추가 nM 실험 (그림 3B-C)에 걸쳐 사용 됩니다. OT의 농도 자연40,52phasic 수축 제공이 분석 결과 대 한 최적화 되었습니다. 보다 오래 지속, 지속적인 (토 닉) 수축 (Ref41,44 예 참조)에서 발생할 수 있습니다 큰 촉진제의 농도 다양 한 에이전트의 효과 평가 하기 어려운 및 실험 기간 개별 수축과 감소의 증가 기간 주파수에 맞게 크게 확장 될 필요가 있다. 이 예제에서는 실험 OT 또는 부사장 추가 됩니다 그래서 수축 자극 하는 적개심 알려진된 OTR 및 V1aR 길 항 제, atosiban 및 SR49059, 또는 우리의 소설 화합물 [D-Arg8]-inotocin ([D-Arg8] INT), 평가 될 수 있다.
- PSS에 테스트 compound(s)의 농도 준비 (또는 없이 0.5 nM OT/부사장) 최소 1/1000 희석, 농도의 넓은 범위는 최대 초과 하는 농도에 대 한 응답을 유도 하지 않는 하는 포함 됩니다 보장에 희석 응답입니다.
- 차량 (예, 디 메 틸 sulfoxide, 이기, 또는 증류수)의 동일한 볼륨을 포함 하는 희석의 동일한 세트를 준비 합니다.
참고: 그것은 종종 가장 높은 농도, 즉, 10-6 M (10-3 M의 재고)에서 준비 하 고 다음 (예를 들어, 10-6-10-10 M) 눈금 따라 직렬 희석을 수행 하는 가장 쉬운. 시 약의 25 분 애플리케이션과 1 mL/min의 유량에 대 한 응용 프로그램, 장치, 및 검사에 스트립의 수, 예를 들어, 유량의 시간에 따라 다릅니다 볼륨을 준비, 조직 목욕 당 각 농도의 25 mL의 최소는 필수적인 에 드입니다. - 원하는 농도에서 시 약을 포함 하는 유리 실험실 병으로 조직 목욕의 피더 튜브를 배치 하 여 화합물의 처음 농도 조직에 적용 됩니다.
참고:이 행해져야 한다 자연 또는 OT/부사장 자극 수축의 꾸준한 기준 달성 되 면. - 두 번째 목욕을 같은 방식으로 해당 차량 제어 솔루션을 적용 합니다.
- 응용 프로그램 (즉, 피더 튜브 변경 된 경우)의 시간을 기록 합니다.
- 시리즈에서 다음 농도 포함 하는 유리 실험실 병에 피더 튜브를 순차적으로 배치 하 여 각 농도 대 한 과정을 반복 하 고 반복 하 여 모든 농도 적용 된.
각 농도의 응용 프로그램 15 그리고 30 분 사이 수 있지만 각 농도 적용 한 실험 사이 일관 되어야 한다. OT 또는 부사장 자극 수축 그 응용 프로그램의 긴 기간 (예를 들어, 25 분) 자극에서 관찰 하는 수축 주파수에 감소를 요구 하는 경향이 있다. 최적의 응용 프로그램 시간을 결정 하기 위해 예비 실험 테스트 되 고 어떤 새로운 시 약으로 사전 수행 되어야 한다. - PSS (없든 OT/부사장)를 희미하게 피더 튜브를 반환 합니다.
- 라이브 녹음 끝 ' 중지'를 클릭 합니다. 즉시 적절 한 폴더에 데이터를 저장 하 고 버전 '.mat' 파일로 내보내기.
7. 데이터 분석
참고: 데이터를 캡처하고에서 상업적으로 사용 가능한 데이터 수집 소프트웨어 패키지의 분석을 수행할 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용 되는 소프트웨어의 내용은 테이블의 자료 를 참조 하십시오. 수축 성 활동의 정확한 평가, 수축 측정의 매개 변수를 포함: i) 수축 진폭, 수축, 수축, 및 iv) 평균 힘 적분 (그림 4)의 기간 iii)의 ii) 주파수. 평균 힘 통합 수축 곡선 아래의 영역에 해당 이며 따라서 조직 스트립에 의해 지정된 된 시간에 수행 하는 전체 작업의 인덱스입니다. 일부 또는 모든 매개 변수를 분석할 수 있습니다. 최소, 평균 필수 힘 및 수축 진폭 분석된53는 것이 좋습니다. 여기서 설명 하는 실험에서 수축과 곡선 아래 면적의 진폭에 있는 변화를 측정 했습니다.
- 분석 소프트웨어에 the.mat 파일을 가져옵니다.
- 샘플링 간격 주파수를 고려 하는 실험 시간을 반영 하기 위해 X 축에 해당 하는 열을 조정 합니다. 실험 10 샘플/s 또는 600 샘플/분에 해당 하는 10 Hz에서 일반적으로 기록 됩니다.
- X-Y 협조 그래프 사용 하 여 프로그램으로 데이터 "플롯 | 선"기능입니다.
- '수직 번역' 기능을 사용 하 여 소프트웨어에 수 축의 기준선을 0.
- 적절 한 제어 기간을 선택 합니다.
참고:이 첫 번째 농도의 리 젠 트 하지만 시 (그림 4A)의 응용 프로그램의 기간에 동등한의 응용 프로그램을 바로 앞 시간의 기간입니다. 예를 들어, 마약 X의 응용 프로그램은 25 분, 25 분 이전 컨트롤로 마약 X의 첫 번째 응용 프로그램을 사용 합니다. - Y 축에서 선택 하는 기간에 발생 하는 각 축의 최대 피크에서 수축 진폭 (힘)을 기록 읽었고 평균 값을 계산.
- 시작 및 각 축의 끝에 X 축에서 읽어서이 최대 피크의 50%에서 수 축의 기간을 측정 하 고 평균 값을 기록.
- 수축 주파수에 대 한 값을 생성 하는 시간 프레임에서 발생 수를 계산 합니다.
- AUC를 계산 하는 '통합' 함수를 사용 하 여 (임의의 단위로 거리) 선택한 시간 동안.
참고: AUC를 정확 하 게 기록 하는 데 필수적 이다 수축의 기준선 Y 축에는 0에서 설정 됩니다. - 순차적으로 농도의 각각을 통해 이동 하 고 수축의 다른 매개 변수를 기록 합니다.
- 컨트롤 데이터를 100%로 설정 및이의 시 약의 각 농도에서 얻은 값 즉,제어 하는 표현, 자극에 대 한 값 이어야 합니다 > 100% 휴식 해야 하는 동안 < 100%.
참고:이 방식으로 데이터 정규화 스트립 및 약리 치료 결과 비교 하는 사용자를 허용 해야 합니다. - 각 실험에 대 한 반복 하 고 그래픽 패키지를 데이터를 전송.
Representative Results
이 모델을 사용 하 여, 다양 한 촉진제 및 길 항 근 수축 뿐만 아니라 알려진 또는 알 수 없는 함수의 소설 에이전트 응답 검사 고 정량. 시 약 농도, 예를 들어, 10-5– 10-9 M의 넓은 범위에서 사용 되 고 따라 농도 증가에 추가 하는 경우 EC50 IC50 값 등 표준 약리 매개 변수 산출 될 수 있다는 로그 규모입니다.
옥 시 토 신 수용 체 길 항 근 농도 응답 실험
이 실험에서 인간의 myometrium 짝된 스트립 위에서 설명한 대로 잘라 그림 1, 그림 2에서 같이 조직 온천에 탑재 그리고 동등한 진폭의 안정적인 수축 생산 equilibrate 수 고 주파수입니다. 스트립 다음 생 OTR 길 항 제, OT에 노출 되었다 (0.5 nM) 수축 자극 하. OT (일반적으로 45 분)에서 안정적인 활동의 기간 후에 atosiban는 눈금 (10-9– 10-6 M)에 따라 농도 증가 한 스트립에 적용 되었습니다. 두 번째 스트립이 버려졌습니다 OT에 혼자 시간 제어로. Atosiban에 대 한 응답의 예는 그림 5A에서 볼 수 있습니다. 복용 직전 제어 (100%)로 atosiban의 처음 농도 수축, 진폭 및 적용 각 농도 대 한 AUC 계산 했다 그림 4와 같이. 시간 제어 실험에 대 한 실험 훈련 해당 시간 측정 했다. 데이터 표시 다음 했다 하며 곡선 그래픽 소프트웨어 패키지 (그림 5B-C)에 비-선형 회귀 함수를 사용 하 여. 억제 효과 계산에서 atosiban의 상대 힘 농도 일으키는 절반 최대한 (50%) 금지 응답은 IC50 을 측정 하 여 계산 됩니다. 같은 촉진제 또는 수축 자극 할 수 있습니다. 이 경우에 화합물의 힘 EC50 (절반 최대한 물질로 응답 농도)에서 계산 됩니다.
소설 화합물에 대 한 응답을 조사 하 고 그들의 수용 체 선택도 테스트
축의 비보 전 인간 myometrial이 순수 관련 모델 [D-Arg8] 새로 합성된 화합물의 대립 효과 검사을 사용 하는 우리-inotocin ([D-Arg8] INT) 수축에 네이티브 V로 자극 1a R 주 작동 근, 부사장, 또는 네이티브 OTR 길 항 제, OT. 우리는이 분석 결과 확인 했다 이전 결정 약리 셀 기반 방법으로 V1aR 하지만 OTR54에 적대 하는 [D-Arg8] INT의 수용 체 선택도 사용.
이 실험에서 인간 myometrial 스트립 0.5 nM VP 또는 0.5 nM OT 1 시간 약에 대 한 우리의 소설 화합물 [D-Arg8] INT (그림 6A 와 그림 농도 증가에 추가 하기 전에 그림 3에서 같이 수축 자극에 노출 됐다 6 C).이 다음 상업적으로 이용 가능한, 알려진 V1aR 길 항 근, SR49059에 비해 (그림 6B). 그림 6A [D-Arg8] int 농도 증가 함께 인간의 myometrial 부사장 자극 수축 농도 의존 감소를 보여 줍니다. 수축 진폭에 대 한 데이터와 각 농도 대 한 AUC 그림 6Aii-iii에 요약 되어 있습니다. 효과 알려진된 V1aR 억제제, SR49059, 그림 6Bi-iii에서의 농도 증가 대 한 표시 된 것과 비슷합니다. [D-Arg8] INT V1aR을 향해만 하지는 OTR 쪽으로 선택도 [D-Arg8] INT 진폭 및 AUC 하지 감소 인간 myometrial 수축 OT (그림 6 c)와 자극은 사실에 의해 설명 된다 남아 안정 (그림 6Cii-iii).
그림 1: 인간 myometrial 생 검 해 부. (A) A의 인간 자 궁 자 궁 벽을 구성 하는 세 가지 조직 레이어 다이어그램. 안쪽 층 endometrium (임신, 빨간색 화살표에 decidua) 중간 계층은 수축, 생성 myometrium (근육 레이어, 검은 화살표) 이며, 가장 바깥쪽 층은 perimetrium (또는 serosal 막, 파란색 화살표)는 형태는 자 궁 주위 보호 코트입니다. 생 검 샘플링에 대 한 관심이 검은 사각형에 의해 묘사 된다. 제왕 절 개 하는 동안 임신한 여자에서 예 생 검에 decidua 및 myometrial 레이어 강조 (serosa 보이지 않는)와 (B)에 표시 됩니다. 다른 조직 레이어 myometrium의 스트립 제대로 실험을 위해 해 부를 식별 됩니다 필수적 이다. 해 부 되 고 잘린 myometrium의 예제 스트립 (C)에 표시 됩니다. 일반적으로, 2-6 스트립 잘라 이며 같이 잘립니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 다중 기관 목욕 실험 세트를 인간의 myometrium의 수 축을 측정 하는 데 사용. (A) 스트립 myometrium의 작은 (1 mL) 기관에 배치 된 목욕 챔버 (i) 온수 저수지 상단에 배치 되며 생리 염 분 해결책 (PSS) 통해 연동 펌프 (ii)와 superfused. 저수지는 순환 물 목욕 (iii)를 통해 설정된 온도에 유지 됩니다. 각 스트립 힘 변환기 (4), 긴장 수축 동안에 변화를 기록에 첨부 됩니다. (V) transbridge 증폭기에 의해 증폭 이며 관련된 수집 소프트웨어를 실행 하는 컴퓨터 시스템 (vii)에 기록 되는 디지털 신호 (vi)로 변환 합니다. (B) 확대 이미지는 기관 목욕 챔버의 인간의 myometrium에 제자리에 (빨간색 화살표), 스트립 한쪽 끝으로 PSS에 목욕 힘 변환기 및 고정된 후크 하는 다른에 연결. (C) 설정의 도식 개요. 조직 실 PSS로 가득는 지속적으로 (45 ° C에서 보관) 욕조와 55 ° c.에 설정 순환 물 펌프 아래 온수 물 저수지와 열 교환을 통해 37 ° C에서 따뜻하게 PSS 함께 끼얹는다 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 인간의 myometrium의 자연과 주 작동 근 자극 수축 생체 외에서. 주 작동 근 무료 조건에서 자발적 수축 진폭 또는 지역-에서--곡선 (AUC) (좋아, Aiii)의 뜻깊은 손실 없이 녹음의 3 시간 이상 안정적으로 유지 조사에 대 한이 모델의 견고성을 보여주는 자연 스러운 수축에 다양 한 에이전트의 응용 프로그램입니다. 안정적이 고 자연 스러운 수축에 설정한 후 0.5 nM oxytocin (B, OT) 또는 바소 (C, 부사장) 생리 염 분 해결책 (PSS)에 추가 되었습니다. 자극에서 수축 수축 진폭 (Bii, Cii) 또는 AUC (Biii, Ciii)의 뜻깊은 손실 없이 시간 수에 대 한 안정적인 유지 또한 활성화 될 다양 한 수축 성 대리인의 효과 myometrial 주 작동 근의 조사. 데이터의 의미 (SEM)으로 평균 ± 표준 오차 표시 됩니다. 참고, 주 작동 근 자극 수축 (B, C), 제어 기간 (100%)은 촬영의 주 작동 근, 응용 프로그램의 첫 번째 45 분 후 수축 안정 되 면. 모든 경우에, 스트립은 37 ° C, pH 7.4 (Reproduced에서 애로 외 에 PSS 함께 superfused 40 허가 생식 과학 및 디 Giglio 외. 54 과학적 보고서 크리에이 티브 일반적인 오픈 액세스 라이센스 허가). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 데이터 분석. (A) 빨간색으로 표시 하는 적절 한 제어 기간 수축 바로 앞 (약 X) 테스트 화합물의 응용 프로그램을 선택 하 여 결정 했다. 이 제어 기간은 또한 마약 X (예를 들어,이 예제에서 40 분)의 응용 프로그램을 시간에 동등한. 에 대 한 값을 측정 제어 기간 100%로 설정 됩니다. 모든 후속 측정 다음 컨트롤의 백분율로 표현 됩니다. (B) 수축 측정 될 수 있는 4 가지 매개 변수는: (i) 진폭 수축 수축 강도 (힘, 미네소타), (ii) 수축 수축, 수축 기간 (iii)의 속도 측정 하는 주파수를 측정 하 수축, 및 (iv) 지역 전체 일의 측정을 주는 곡선 (일컬어 힘 통합, 임의의 단위)의 절반 최대 피크에서 측정 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 인간의 myometrium oxytocin 유도 수축에 atosiban의 대립 효과 녹음. 일단 자발적 수축 설립 되었다 옥 시 토 신 수용 체 길 항 제, 옥 시 토 신 (OT)와 수축 자극 했다. 수축 추가 45 분 (A)는 V1a 및 OT 수용 체 길 항 제에 대 한 자극에서 안정 하는 것이 허용 되었다, atosiban 증가 하는 로그 눈금 (10-9-10-5M) 따라 농도에 적용 했다. Atosiban의 처음 농도 선행 하는 기간 동안 수축 측정 하 고 제어 (100%)로 촬영 했다. 각 후속 농도에서 활동 측정 하 고 컨트롤에 대 한 비율로 표시 했다. 같은 스트립 OT 혼자 사용 하 여 실험 기동 해당 시간에 노출에 대 한 수행 했습니다. 데이터 그래픽 소프트웨어에서 표시 했다: (B, C) 표시 atosiban의 대립 효과 대 한 농도-응답 곡선 (파란색) OT 유도 myometrial 수축 진폭에 차량 (회색, 시간 제어)의 희석을 적절 한 하 고 곡선 (AUC), 지역 각각. 데이터는 진폭의 평균 (SEM) 비율 (atosiban 적용)을 사용 하기 전에 제어 활동의 AUC의 평균 ± 표준 오류로 표시 됩니다. 줄 농도는 수축과 힘 적분 (AUC)의 진폭에 대 한 절반 최대한 억제 (50%) 응답은 애로 외 에서 달성된 (Reproduced IC50 값 다음 계산 40 생식 과학허가). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: 소설 인간 myometrial 수축에 화합물의 효과 및 수용 체 선택도 테스트. 인간의 myometrium의 자발적 수축 했다 설립 후 수축 vasopressin 수용 체 주 작동 근, 바소 (부사장) (Ai, Bi) 또는 옥 시 토 신 수용 체 길 항 제, 옥 시 토 신 (OT) (Ci) 자극 했다. [D-Arg8]의 효과-inotocin ([D-Arg8] INT) 상용 V1aR 적, 부사장에 의해 자극된 수축에 SR49059 화합물의 농도가 증가 적용 하 여 평가 되었다. 전형적인 응답 (Ai, Bi)에 표시 됩니다. 진폭과 곡선 (AUC) 아래 지역 (ii)에 표시 됩니다에 대 한 연결 된 분석 데이터 및 (iii) 각각 어디 효과 표현 되었습니다 제어의 백분율로 활동 (100%). [D-Arg8] INT와 알려진된 V1aR 적 SR49059 진폭 및 AUC, 인간의 myometrium V1aR 수용 체 길 항 근으로 [D-Arg8] INT의 역할을 지 원하는 복용량 의존 감소를 발생 합니다. 반면, [D-Arg8] INT에 의해 자극 OT (Ci-iii), 따라서 유사 하 게 우리의 발견에 세포 기반 분석에서 수축에 영향을 주지 않았다, [D-Arg8] INT도에서는 V1aR으로 선택도 인간의 myometrium (데이터 디에서 재현 Giglio 외. 54 과학적 보고서 크리에이 티브 일반적인 오픈 액세스 라이센스 허가). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
대부분 약물 개발은 인간의 장애의 치료를 위한, 하는 동안 가장 기본적인 연구 동물의 조직에서 주로 수행 됩니다. 여기, 우리는 다양 한 중요 한 질문 자 궁 관련 된 생리학과 병리학, 주소 뿐 아니라 기능적인 응답의 유효성을 검사 하는 사용 될 수 있는 수술에서 얻은 인간 myometrium의 수축 비보 전 을 조사 하는 방법 설명 신약 개발을 돕기 위해 약리 에이전트 알려진 고 소설 특히, 우리는 알려진된 OTR 및 V1aR 경쟁 길 항 근, 임신 myometrial OT 유도 수축에 atosiban 응답 및 수용 체를 확인할의 대립 응답을 조사 하는이 분석 결과 사용 하 여 강조 새로 개발된 된 선택적 V1aR 적, [D-Arg8] 국제의 선택도 시연 EC50 등 IC50 중요 한 pharmacokinetic 매개 변수 계산 수는 잘 약리학 셀 기반 데이터와 함께 정렬 합니다.
동시에 여러 스트립을 사용 하 여 여러 에이전트 효과, 길 항 근, 그리고 적절 한 시간 및 차량 제어 경쟁 실험의 직접적인 비교에 대 한 수 있습니다. 지구 2, 4, 또는 8의 그룹에서 종종 준비가,이 기술은 적당 한 처리량을, (생 검) 당 6-8 (누적) 농도에서 2-4의 테스트 활성화 제공 합니다. 효과 빨리 평가 될 수 있다 고 프로토콜 조정 될 수 있도록이 메서드는 또한 실시간 데이터를 제공 합니다. 또한,이 기술은 관심 있는 화합물을 테스트 하는 데 사용할 수 있습니다 그리고 myometrial 생리학 및 약물 발견에 초점을 맞춘 연구 그룹의 숫자에 의해 성공적으로 사용 되었습니다. 이 문서에 설명 된 대로 순수 화합물을 분석, 게다가 자 궁 수축 모델 또한 되 고 혼합물에서 소설 uterotonic 화합물과 같은 화면에 성공적으로 이용 될 수 있다7 전통 의학 초본 준비 , 55 , 56.
이 모델은 기술적으로 강력 하 고 좋은 재현성을 보여줍니다, 하지만 몇 가지 제한이 있다: 해 부 그 조직에 익숙하지 어려울 수 있습니다 또는 해 부 장비를 사용 하 여, 따라서 새로운 사용자 필요 합니다 조직을 최적화 하는 데 시간이 준비와 프로토콜입니다. 그것은 그 인간의 myometrium 쥐와 쥐 같은 다른 모델과 외관에서 상당히 다릅니다 주목 해야한다. 대부분 설치류 uteri 두 개의 튜브와 같은 자 궁 뿔의 구성, 각 난소 한쪽 끝에 완전 한 자 궁 경부에 합류 했다. 각 혼은 명확 하 게 분리 될 수 있다 쉽게 해 부에 인간의 myometrium에 다른 섬유 종류 자주 형성 '메쉬' 얽혀있다 동안 경도 원형 근육 층을 정의 했다. 또한, 인간의 myometrium의 수축 프로필 설치류에 매우 다르다. 특히, 인간의 myometrium에 수축 기간에 덜 자주 하지만 더 있습니다. 인간의 myometrium 작업에 대 한 실험 시간 프레임을 따라서 자주 많이 설치류 모델 이상. 종 사이 수용 체 식 차이 주 작동 근 응답에 꽤 표시 차이에 기여할 수 있다 그리고이 종에 걸쳐 결과 추정 하는 경우 마음에 부담 한다.
이 시스템에서 출력을 극대화 하기 위해 고려를 해야 하는 단계 수 있습니다. 중요 한 단계는 조직의 생존을 절 개 하는 동안 불필요 한 손해를 피하기 위해 조직을 처리 하거나 장착을 돌보는 등의 보존을 포함 합니다. 숙련 된 눈은 자 궁 근육, 근육 섬유의 방향에는 경도 방향 및 조직, 비행기 다음으로 흉터 조직, decidua, 및 작은 혈관을 피하는 보장의 정밀한 스트립을 해 부 합니다. 일단 표본 실험실에 오리엔테이션 목적을 투입, 그것은 decidual 가장자리에서 serosal 가장자리 윤곽을 그리 다 생의 1 개의 측에 컬렉션의 시간에 (작은 수술 스티치) 같은 태그를 추가할 수 있습니다.
조직 유지 되어야 한다 안정 36-37 ° C에서 실험 중 온도 변화에 따라 조직 기능으로. 이 실험실 내에서 강력한 공기 조화 단위 달성 될 수 있다. 따뜻하게 PSS의 지속적인 관류 수축에서 폐기물 제품 홍 조 뿐만 아니라 온도 유지 보장 합니다. 기관 욕조 내 온도 유량을 변경 하거나 물 목욕 온도 직접 조정 하 여 변경할 수 있습니다. 전통적인 5-50 mL 탕에 비해 작은 욕조 크기 PSS의 상대적으로 빠른 회전율과 시 약의 희미하게 보장 합니다. 소형된 기관 목욕 여기에 설명 된 대로 또한 감소 시킨다 PSS의 볼륨 및 관심 필요, 따라서 비용을 최소화 하 고 소중한 살려주는, 새로 개발 된 화학 시 약. 또한, 때문에 작은 욕조 크기와 HEPES 기반 버퍼를 사용 하 여,이 시스템 요구 하지 않는다 산소 예를 들어, carbogen와 PSS를 버블링 하 여. 스트립에 적용 되는 긴장의 표준화도 중요 하다. 이 크기 (5 m m x 2 m m x 1 m m)의 스트립,이 약 2 mN (~0.2 g에 해당) 해야 합니다. 대체 방법은 최대한 수축과 수축이 최대의 절반으로 유도 하는 높은 칼륨 솔루션의 응용 프로그램을 포함 합니다. 그러나 주의 되어야 한다, 그 긴장 적용 vivo에서 다를 수 있습니다.
주요 과제는 인간의 과목에서 조직 취득 포함 하지만 부담 스러운, 비록 인간의 조직 명확 하 게 나타내는 가장 순수 인간의 질병 및 약물 발견에 자 궁 수축 공부 관련 (고 보람) 모델. 그러나 스트립 할 하지 반드시 동일시 vivo에서 조직에 그들은 예를 들어 호르몬의 면제 및 신경 입력, 수축에 대 한 중요 하지 비록 격리 된 조직 수축 비보변조 됩니다. 그러나이 분석 결과 myometrial 수축 제어 방식으로, 이러한 영향에서 분리 분석 하는 기회를 제공 한다. 그것은 또한 수 있습니다 (예를 들어, OT, 부사장, prostaglandins, 등을 통해) 수축 호르몬 제어 같은 요인의 영향에 대 한 조사를 myometrial 기능의 규정에 단서를 제공 하. 으로 조직의 다른 여성, 자연스럽 게 표본 간의 자발적 수축 프로필에 약간 변이 이다. 따라서 그것은 종종 많은 수에서 실험을 수행 하는 데 필요한 (~ n = 10) 일부 데이터 집합53에 편차를 최소화 하기 위해 샘플의. 이 때 가장 중요 한 다른 환자 그룹 사이의 수축 활동을 비교. 표준화 활동을 제어 주 작동 근 길 항 근의 응답 (즉, 제어 활동 또는 높은 K+의 비율로 표현)이 변화의 일부를 감소 시킨다. 또한, 간 스트립 편차를 줄이기 위해, 데이터 그들의 길이 무게 게시물 실험41를 측정 하 여 크로스 단면적을 제거 하기 위해서 정규화 될 수 있습니다. 다른 환자 그룹 사이의 수축 패턴을 비교할 때 특히 유용 합니다.
이 기술의 한계는 또한 병원 직원 들, 특히 극장 직원 들과 좋은 작업 관계를 요구 하는 신선한 조직에 액세스를 포함 하 고 그 동의 과정에 참여. 지역 연구 윤리 위원회 및 연구소 또는 병원 검토 위원회에서 윤리적인 사용 권한을 또한 장소에 있이 필요 합니다. 인간의 myometrium의 컬렉션은 가장 가능성이 기증자는 수술 때 CS 전달 중 수행 합니다. 생 검 아기를 전달 하기 위해 만든 같은 자 궁 절 개 사이트에서 가져온 것입니다 하 고 따라서 환자를 더 추가 절차를 받아야 필요 하지 않습니다. 극장 직원 및 생 검을 수행 하는 외과 의사는 조직의 후속 사용 알게 될 필요가 그리고 그들은에 배치 될 통 솔루션 같은 병 리 부서에 보내는 서 하지 않습니다. 긴 실험 기간 또 다른 고려 사항이 다. 인간의 조직 실험 걸릴 많은 시간 (일반적으로 > 6 h) (2-3 h 쥐 또는 마우스의 자 궁에서 비슷한 실험에 대 한), 반대로 수축 및 조직 설치와 자연의 설립 사이 2-3 h 지연 시간 느린 주파수 때문 수축입니다. 그러나, 우리 같이, 인간의 조직 수축은 강력한, 그리고 때 상당한 피로40없이 많은 시간 동안 계약 하실 수 있습니다.
이 시스템은 또한 다른 도전의 vivo에서 작업 임신 조직에 제약 시 약을 테스트 하는 기능을 포함 하 여 극복할 수 있습니다. 이 기술은 다른 종 마우스 초기 결과 진행 하기 전에 확인 하는 수 있다 그것에 의하여를 포함 하 여 쉽게 추정 될 수 전체 동물 연구에서 더. 온도 제어 변경, superfusate (PSS), 그리고 pH의 구성 다른 시나리오에 vivo에서 모방 복합 행동에 이러한 변경의 효과 분석을 쉽게 만들 수 있습니다. 있으 나 myometrial 스트립에서 아이소메트릭 긴장 측정의 기본 원리 형광 Ca 또는 pH (H+) 지표 및 장비 검색을 사용 하 여 동시 세포내 칼슘 농도 또는 pH 변화를 측정 하는 것 또한 확장 될 수 있다 고 형광57,,5859,60을 기록 합니다.
전반적으로, 인간의 myometrium을 특성화 하 고 소설 치료 화합물 신약에 강력 하 고 순수 관련 모델을 나타냅니다-순수 화합물 및 혼합물. 우리 OT/부사장 시스템에 관하여 약물 발견에 그것의 사용의 예를 제공 하 고 OTR과 v 1는는R 길 항 근이이 모델을 사용 하 복합 효능와 정의 된 목표에 힘을 결정 하 고 리간드 선택도 유효성을 검사 하는 방법을 보여에 초점을 맞춘. 그러나,이 기술은 관심 또는 myometrial 수축 (이완)로 이어지는 통로의 어떤 표적 든 지 공부 하로 새로운 목표와 경로의 약물 발견을 돕기 위해 사용할 수 있는 myometrial의 우리의 이해를 미리 마음에 부담 한다 생리학 그리고 이상입니다.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 연구 프로젝트 I3243 통해 오스트리아 과학 기금 (FWF) 및 유럽 연합의 지평선 2020 연구 및 혁신 프로그램 (부여 계약 아니오 714366)에서 유럽 연구 회의 (ERC)에 의해 지원 되었습니다. CWG 오스트레일리아 연구 위원회 (아크) 미래 친교 (FT140100730)에 의해 및 m M 아크 발견 초기 경력 연구원 (DECRA) 친교 (DE150100784)에 의해 지원 되었습니다. SA는 여성 웰빙, 영국에 의해 관리 해리스-웰빙 Preterm 출생 연구 센터 그랜트에 의해 지원 됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Origin software | Origin Lab | 2015 version | |
| Labscribe Software | WPI | Formally Datatrax | |
| GraphPad Prism graphical software | GraphPad Prism | PRISM 5 | |
| LabTrax 4-Channel Data Acquisition | WPI | LAB-TRAX-4 | |
| Transbridge Transducer Amplifier | WPI | SYS-TBM4M | |
| Force-displacement Transducer | WPI | FORT10g | 10 g |
| BNC to BNC Cable | WPI | 500184 | |
| Magnetic Clamp stand | WPI | M10 | |
| Micrometer | Reconditioned from microscopes | ||
| Peristaltic pump | Gilson | MINIPULS3 | R4 Standard pump head |
| Suction pumps | Various | AP2 air pump | |
| Circulating Water bath | Grant Instruments | TC120 | 5L |
| Perspex Tissue Bath | Custom made | ||
| Water reservoir container | the reallyusefulbox | 7L | |
| Tissue Hooks (fixed) | Hand made in house | ||
| Peristaltic tubing | Gilson | F117948 | PVC 2.79 mm internal diameter |
| Tygon Tubing | Fisher Scientific | various diameters | R-3603 |
| Aluminium clips | Laser services, USA | custom made | |
| Stereo Zoom binocular microscope | WPI | PZMIV | |
| Microscope Fiber-optic Light Source | WPI | PHOTONIC PL 2000 | |
| Dissecting Dishes | Handmade with Sylgard | ||
| Sylgard Silicone Elastomer kit | Dow Corning | Sylgard 170 Kit | |
| Vannas Scissors | WPI | 50086 | 8.5 cm, straight edge |
| Iris Forceps | WPI | 15914 | 10 cm, straight edge (serrated) |
| Dissecting scissors | WPI | 14393 | 10 cm, straight |
| Dissecting pins | SIGMA | Z192341 | B-D precision guide syringe needle 30G |
| HBSS | SIGMA | H9269 | |
| Physiological Salt Solution | SIGMA | various | PSS |
| Oxytocin acetate salt | SIGMA | O6379 | |
| [Arg8]-vasopressin acetate salt | SIGMA | V9879 |
References
- Hughes, J. P., Rees, S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. Principles of early drug discovery. Br J Pharmacol. 162 (6), 1239-1249 (2011).
- Michelini, E., Cevenini, L., Mezzanotte, L., Coppa, A., Roda, A. Cell-based assays: fuelling drug discovery. Anal Bioanal Chem. 398 (1), 227-238 (2010).
- Wray, S. Insights into the uterus. Exp Physiol. 92 (4), 621-631 (2007).
- Wray, S., Kupittayanant, S., Shmygol, A., Smith, R. D., Burdyga, T. The physiological basis of uterine contractility: a short review. Exp Physiol. 86 (2), 239-246 (2001).
- Matthew, A., Shmygol, A., Wray, S. Ca2+ entry, efflux and release in smooth muscle. Biol Res. 37 (4), 617-624 (2004).
- Wray, S., et al. Calcium signaling and uterine contractility. J Soc Gynecol Investig. 10 (5), 252-264 (2003).
- Gruber, C. W., O'Brien, M. Uterotonic plants and their bioactive constituents. Planta medica. 77 (3), 207-220 (2011).
- Maul, H., Maner, W. L., Olson, G., Saade, G. R., Garfield, R. E. Non-invasive transabdominal uterine electromyography correlates with the strength of intrauterine pressure and is predictive of labor and delivery. J Matern Fetal Neonatal Med. 15 (5), 297-301 (2004).
- Newman, R. B. Uterine contraction assessment. Obstet Gynecol Clin North Am. 32 (3), 341-367 (2005).
- Haran, G., Elbaz, M., Fejgin, M. D., Biron-Shental, T. A comparison of surface acquired uterine electromyography and intrauterine pressure catheter to assess uterine activity. Am J Obstet Gynecol. 206 (5), 412-e415 (2012).
- Condon, J., et al. Telomerase immortalization of human myometrial cells. Biol Reprod. 67 (2), 506-514 (2002).
- Soloff, M. S., et al. Immortalization and characterization of human myometrial cells from term-pregnant patients using a telomerase expression vector. Mol Hum Reprod. 10 (9), 685-695 (2004).
- Buxton, I. L., Vittori, J. C. Cholesterol depletion enhances both spontaneous and agonist-evoked uterine smooth muscle contractions in a reversible manner. Proc West Pharmacol Soc. 48, 126-128 (2005).
- Matthew, A., Kupittayanant, S., Burdyga, T., Wray, S. Characterization of contractile activity and intracellular Ca2+ signalling in mouse myometrium. Journal of the Society for Gynecologic Investigation. 11 (4), 207-212 (2004).
- Heaton, R. C., Taggart, M. J., Wray, S. The effects of intracellular and extracellular alkalinization on contractions of the isolated rat uterus. Pflugers Arch. 422 (1), 24-30 (1992).
- Hutchings, G., Deprest, J., Nilius, B., Roskams, T., De Ridder, D. The effect of imatinib mesylate on the contractility of isolated rabbit myometrial strips. Gynecol Obstet Invest. 62 (2), 79-83 (2006).
- Wilson, R. J., Allen, M. J., Nandi, M., Giles, H., Thornton, S. Spontaneous contractions of myometrium from humans, non-human primate and rodents are sensitive to selective oxytocin receptor antagonism in vitro. BJOG. 108 (9), 960-966 (2001).
- Choudhury, S., Garg, S. K., Singh, T. U., Mishra, S. K. Functional and molecular characterization of maxi K+ -channels (BK(Ca)) in buffalo myometrium. Anim Reprod Sci. 126 (3-4), 173-178 (2011).
- Smith, R. C., McClure, M. C., Smith, M. A., Abel, P. W., Bradley, M. E. The role of voltage-gated potassium channels in the regulation of mouse uterine contractility. Reprod Biol Endocrinol. 5, 41 (2007).
- Jones, K., Shmygol, A., Kupittayanant, S., Wray, S. Electrophysiological characterization and functional importance of calcium-activated chloride channel in rat uterine myocytes. Pflugers Arch. 448 (1), 36-43 (2004).
- Popescu, L. M., et al. Imatinib inhibits spontaneous rhythmic contractions of human uterus and intestine. Eur J Pharmacol. 546 (1-3), 177-181 (2006).
- Taggart, M. J., Wray, S. Contribution of sarcoplasmic reticular calcium to smooth muscle contractile activation: gestational dependence in isolated rat uterus. J Physiol. 511 (Pt 1), 133-144 (1998).
- McCallum, L. A., Pierce, S. L., England, S. K., Greenwood, I. A., Tribe, R. M. The contribution of Kv7 channels to pregnant mouse and human myometrial contractility. J Cell Mol Med. 15 (3), 577-586 (2011).
- Bernstein, K., et al. Calcium-activated chloride channels anoctamin 1 and 2 promote murine uterine smooth muscle contractility. Am J Obstet Gynecol. , (2014).
- Khan, R. N., Morrison, J. J., Smith, S. K., Ashford, M. L. Activation of large-conductance potassium channels in pregnant human myometrium by pinacidil. Am J Obstet Gynecol. 178 (5), 1027-1034 (1998).
- Phillippe, M., Basa, A. Effects of sodium and calcium channel blockade on cytosolic calcium oscillations and phasic contractions of myometrial tissue. J Soc Gynecol Investig. 4 (2), 72-77 (1997).
- Ausina, P., et al. Effect of inhibition of the electrogenic Na+/K+ pump on the mechanical activity in the rat uterus. Fundam Clin Pharmacol. 10 (1), 38-46 (1996).
- Melin, P., Trojnar, J., Johansson, B., Vilhardt, H., Akerlund, M. Synthetic antagonists of the myometrial response to vasopressin and oxytocin. J Endocrinol. 111 (1), 125-131 (1986).
- Hahn, D. W., et al. Evaluation of 1-deamino-[D-Tyr(Oethyl)2, Thr4, Orn8] vasotocin, an oxytocin antagonist, in animal models of uterine contractility and preterm labor: a new tocolytic agent. Am J Obstet Gynecol. 157 (4 Pt 1), 977-982 (1987).
- Demarest, K. T., et al. Profile of an oxytocin antagonist, RWJ 22164 for treatment of preterm labor in laboratory models of uterine contractility. American journal of perinatology. 6 (2), 200-204 (1989).
- Goodwin, T. M., et al. The pharmacokinetics of the oxytocin antagonist atosiban in pregnant women with preterm uterine contractions. Am J Obstet Gynecol. 173 (3 Pt 1), 913-917 (1995).
- Goodwin, T. M., et al. The effect of the oxytocin antagonist atosiban on preterm uterine activity in the human. Am J Obstet Gynecol. 170 (2), 474-478 (1994).
- Goodwin, T. M., et al. Treatment of preterm labor with the oxytocin antagonist atosiban. American journal of perinatology. 13 (3), 143-146 (1996).
- Romero, R., et al. An oxytocin receptor antagonist (atosiban) in the treatment of preterm labor: a randomized, double-blind, placebo-controlled trial with tocolytic rescue. Am J Obstet Gynecol. 182 (5), 1173-1183 (2000).
- Norstrom, A., Andersson, A., Vilhardt, H. Contractile effect of oxytocin and 1-deamino-1-carba-2-tyrosine (0-methyl)-oxytocin in myometrial tissue from non-pregnant and term pregnant women. Acta Endocrinol (Copenh). 122 (5), 566-568 (1990).
- Atke, A., Vilhardt, H. Uterotonic activity and myometrial receptor affinity of 1-deamino-1-carba-2-tyrosine(O-methyl)-oxytocin. Acta Endocrinol (Copenh). 115 (1), 155-160 (1987).
- Hunter, D. J., Schulz, P., Wassenaar, W. Effect of carbetocin, a long-acting oxytocin analog on the postpartum uterus. Clin Pharmacol Ther. 52 (1), 60-67 (1992).
- Moraitis, A. A., Cordeaux, Y., Charnock-Jones, D. S., Smith, G. C. The Effect of an Oxytocin Receptor Antagonist (Retosiban, GSK221149A) on the Response of Human Myometrial Explants to Prolonged Mechanical Stretch. Endocrinology. 156 (10), 3511-3516 (2015).
- Al-Qahtani, S., et al. Diabetes is associated with impairment of uterine contractility and high Caesarean section rate. Diabetologia. 55 (2), 489-498 (2012).
- Arrowsmith, S., Neilson, J., Bricker, L., Wray, S. Differing In Vitro Potencies of Tocolytics and Progesterone in Myometrium From Singleton and Twin Pregnancies. Reprod Sci. 23 (1), 98-111 (2016).
- Arrowsmith, S., Quenby, S., Weeks, A., Burdyga, T., Wray, S. Poor spontaneous and oxytocin-stimulated contractility in human myometrium from postdates pregnancies. PloS one. 7 (5), e36787 (2012).
- Arrowsmith, S., Robinson, H., Noble, K., Wray, S. What do we know about what happens to myometrial function as women age? J Muscle Res Cell Motil. 33 (3-4), 209-217 (2012).
- Quenby, S., Matthew, A., Zhang, J., Dawood, F., Wray, S. In vitro myometrial contractility reflects indication for caesarean section. BJOG. 118 (12), 1499-1506 (2011).
- Turton, P., et al. A comparison of the contractile properties of myometrium from singleton and twin pregnancies. PloS one. 8 (5), e63800 (2013).
- Zhang, J., Bricker, L., Wray, S., Quenby, S. Poor uterine contractility in obese women. BJOG. 114 (3), 343-348 (2007).
- Higgins, C. A., et al. Maternal obesity and its relationship with spontaneous and oxytocin-induced contractility of human myometrium in vitro. Reprod Sci. 17 (2), 177-185 (2010).
- Crankshaw, D. J., O'Brien, Y. M., Crosby, D. A., Morrison, J. J. Maternal body mass index and spontaneous contractility of human myometrium in pregnancy. J Perinatol. 37 (5), 492-497 (2017).
- Luckas, M. J., Wray, S. A comparison of the contractile properties of human myometrium obtained from the upper and lower uterine segments. BJOG. 107 (10), 1309-1311 (2000).
- Chapman, N. R., Kennelly, M. M., Harper, K. A., Europe-Finner, G. N., Robson, S. C. Examining the spatio-temporal expression of mRNA encoding the membrane-bound progesterone receptor-alpha isoform in human cervix and myometrium during pregnancy and labour. Mol Hum Reprod. 12 (1), 19-24 (2006).
- Robson, S. C., Simpson, H., Ball, E., Lyall, F., Bulmer, J. N. Punch biopsy of the human placental bed. Am J Obstet Gynecol. 187 (5), 1349-1355 (2002).
- Popat, A., Crankshaw, D. J. Variable responses to prostaglandin E(2) in human non-pregnant myometrium. Eur J Pharmacol. 416 (1-2), 145-152 (2001).
- Arrowsmith, S., Neilson, J., Wray, S. The combination tocolytic effect of magnesium sulfate and an oxytocin receptor antagonist in myometrium from singleton and twin pregnancies. Am J Obstet Gynecol. 215 (6), 789-e789 (2016).
- Crankshaw, D. J., Morrison, J. J. Methodology and pharmacological analysis of effects of uterotonic compounds in human myometrium in vitro. Am J Obstet Gynecol. 205 (2), 155-e156 (2011).
- Di Giglio, M. G., et al. Development of a human vasopressin V1a-receptor antagonist from an evolutionary-related insect neuropeptide. Sci Rep. 7, 41002 (2017).
- Attah, A. F., et al. Ethnobotanical survey of Rinorea dentata (Violaceae) used in South-Western Nigerian ethnomedicine and detection of cyclotides. J Ethnopharmacol. 179, 83-91 (2016).
- Koehbach, J., et al. Oxytocic plant cyclotides as templates for peptide G protein-coupled receptor ligand design. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (52), 21183-21188 (2013).
- Taggart, M. J., Burdyga, T., Heaton, R., Wray, S. Stimulus-dependent modulation of smooth muscle intracellular calcium and force by altered intracellular pH. Pflugers Arch. 432 (5), 803-811 (1996).
- Luckas, M. J., Taggart, M. J., Wray, S. Intracellular calcium stores and agonist-induced contractions in isolated human myometrium. Am J Obstet Gynecol. 181 (2), 468-476 (1999).
- Parratt, J. R., Taggart, M. J., Wray, S. Functional effects of intracellular pH alteration in the human uterus: simultaneous measurements of pH and force. J Reprod Fertil. 105 (1), 71-75 (1995).
- Taggart, M., Wray, S. Simultaneous measurement of intracellular pH and contraction in uterine smooth muscle. Pflugers Arch. 423 (5-6), 527-529 (1993).
